由于酵母菌利用淀粉的能力很弱.有人将地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶基因转入酵母菌中经筛选得到了可高效利用淀粉的工程菌菌种. (1)图甲中.过程①需要的酶有 .为达到筛选目的.平板内的固体培养基应以 作为唯一碳源.②.③过程需要重复几次.目的是 . (2)某间学尝试过程③的操作.其中一个平板经培养后的菌落分布如图乙所示.该同学的接种方法是 , 题目和参考答案——精英家教网——
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10．（12分）由于酵母菌利用淀粉的能力很弱，有人将地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶基因转入酵母菌中经筛选得到了可高效利用淀粉的工程菌菌种（过程如图甲所示）。
(1)图甲中，过程①需要的酶有_____________。为达到筛选目的，平板内的固体培养基应以____________作为唯一碳源。②、③过程需要重复几次，目的是______________。 (2）某间学尝试过程③的操作，其中一个平板经培养后的菌落分布如图乙所示。该同学的接种方法是_____________________；推测该同学接种时可能的操作失误是______________。 (3）以淀粉为原料，用工程酵母菌和普通酵母菌在相同的适宜条件下密闭发酵，接种________菌的发酵罐需要先排气，其原因是__________________________。 （4）用凝胶色谱法分离α一淀粉酶时，在色谱柱中移动速度较慢的蛋白质，相对分子质量较________。
【答案】： && （1）限制性内切酶和DNA连接酶&&&&& 淀粉&&& 分离纯化（PS：关键点在第二步操作中的“选取”） && （2）稀释涂布法&&&& 菌液稀释浓度较大 && （3）工程酵母菌&&&& 工程酵母菌利用淀粉能力更强，产生CO2速率更快 && （4）较小
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科目：高中生物
来源：2013年普通高等学校招生全国统一考试四川卷理综生物
由于酵母菌利用淀粉的能力很弱，有人将地衣芽孢杆菌的α－淀粉酶基因转入酵母菌中经筛选得到了可高效利用淀粉的工程菌菌种（过程如图甲所示）。
（1）图甲中，过程①需要的酶有________。为达到筛选目的，平板内的固体培养基应以________作为唯一碳源。②、③过程需要重复几次，目的是________。
（2）某间学尝试过程③的操作，其中一个平板经培养后的菌落分布如图乙所示。该同学的接种方法是________；推测该同学接种时可能的操作失误是________。
（3）以淀粉为原料，用工程酵母菌和普通酵母菌在相同的适宜条件下密闭发酵，接种________菌的发酵罐需要先排气，其原因是________。
（4）用凝胶色谱法分离α一淀粉酶时，在色谱柱中移动速度较慢的蛋白质，相对分子质量较________。
科目：高中生物
（2013四川卷）10．（12分）由于酵母菌直接利用淀粉的能力很弱，有人将地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶基因转入酵母菌中经筛选得到了可高效利用淀粉的工程酵母菌菌种（过程如图甲所示）。
（1）图甲中，过程①需要的酶有_____________。为达到筛选目的，平板内的固体培养基应以____________作为唯一碳源。②、③过程需要重复几次，目的是______________。 （2）某同学尝试过程③的操作，其中一个平板经培养后的菌落分布如图乙所示。该同学的接种方法是_____________________；推测该同学接种时可能的操作失误是______________。 （3）以淀粉为原料，用工程酵母菌和普通酵母菌在相同的适宜条件下密闭发酵，接种________菌的发酵罐需要先排气，其原因是__________________________。 （4）用凝胶色谱法分离α一淀粉酶时，在色谱柱中移动速度较慢的蛋白质，相对分子质量较________。
科目：高中生物
来源：学年新疆乌鲁木齐地区高三第二次诊断测验生物卷（解析版）
题型：综合题
由于酵母菌利用淀粉的能力很弱，有人将地衣芽抱杆菌的α-淀粉酶基因转入酵母菌中，经筛选得到了可高效利用淀粉的工程菌菌种（过程如图甲所示）。（1）图甲中，过程①需要的酶有????????????? ???????? 。为达到筛选目的，平板内的固体培养基应以????????????? ?????? 作为唯一碳源。②、③过程需要重复几次，目的是????????????? ????? 。（2）某同学尝试过程③的操作，其中一个平板经培养后的菌落分布如图乙所示。该同学的接种方法是 ?????????????
????????????? ；推测该同学接种时可能的操作失误是????????????? ??????? 。原因是：在????????????? ????????????? 足够高的菌液里， 聚集在一起的酵母菌将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成????????????? 的菌落。（3）以淀粉为原料，用工程酵母菌和普通酵母菌在相同且适宜的条件下密闭发酵，接种工程酵母菌的发酵罐需要先排气，其原因是????????????? ??????????????? 。 
科目：高中生物
来源：2014届江苏扬州中学高三开学检测生物卷（解析版）
题型：综合题
（8分）由于酵母菌利用淀粉的能力很弱，有人将地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶基因转入酵母菌中经筛选得到了可高效利用淀粉的工程菌菌种（过程如图甲所示）。(1)图甲中，过程①需要的酶有_____________。为达到筛选目的，平板内的固体培养基应以____________作为唯一碳源。②、③过程需要重复几次，目的是______________。(2）某间学尝试过程③的操作，其中一个平板经培养后的菌落分布如图乙所示。该同学的接种方法是___________________；推测该同学接种时可能的操作失误是______________。(3）以淀粉为原料，用工程酵母菌和普通酵母菌在相同的适宜条件下密闭发酵，接种________菌的发酵罐需要先排气，其原因是__________________________。&
精英家教网新版app上线啦！用app只需扫描书本条形码就能找到作业，家长给孩子检查作业更省心，同学们作业对答案更方便，扫描上方二维码立刻安装！高产α-淀粉酶地衣芽孢杆菌的筛选及重组质粒的构建--《湖北工业大学》2014年硕士论文
高产α-淀粉酶地衣芽孢杆菌的筛选及重组质粒的构建
【摘要】：本研究以从白云边高温大曲中筛选得到16株嗜热芽孢杆菌为出发菌株，再从中进一步筛选出高产α-淀粉酶芽孢杆菌，并对其产酶特性进行研究。为了从分子水平上研究该菌的产香或产酶机制和构建该菌的突变体库，本课题构建了一个含有氨苄青霉素抗性基因转座子的质粒。主要研究结果如下：
（1）通过淀粉-碘液平板法初步检测16株嗜热芽孢杆菌的α-淀粉酶酶活，筛选出产α-淀粉酶酶活较高的菌株，再通过改良的Yoo法进一步准确测定该菌株的α-淀粉酶酶活大小，通过最适酶反应温度测定得到该菌株产α-淀粉酶的最适反应温度为70℃，确定为高温α-淀粉酶生产菌株。通过观察产α-淀粉酶芽孢杆菌的菌落形态并结合其16S rDNA序列对比将该菌鉴定为地衣芽孢杆菌，并命名为BG14。
（2）对产α-淀粉酶地衣芽孢杆菌BG14的酶活特性进行研究，由BG14的生长曲线和产酶曲线可见，0h~2h是菌株BG14的生长迟缓期，2h~18h为其对数生长期，在其生长至42h时产α-淀粉酶的活性达到最大。BG14产耐高温α-淀粉酶的最适pH值为7.5，最适培养温度为40℃，最适装液量为20%，最适转速为180rpm。对BG14发酵培养基进行正交实验得到的最优培养基为：黄豆粉0.7%，可溶性淀粉0.5%，麸皮1.0%，蛋白胨1.0%，K2HPO40.5%，pH7.0~7.5。耐高温α-淀粉酶活力达到334.32U/mL，比初始发酵培养基的酶活力提高43.09%.
（3）利用BG14制备功能性强化麸曲模拟酒厂的固态发酵过程，通过基酒的理化指标测定结果可以看出加入BG14强化麸曲的基酒比普通基酒的出酒率高，总酸和总酯含量也较高。通过气相色谱分析可以看出加入BG14强化麸曲的基酒中与酱香型白酒风味成分相关的糠醛、异戊醛和β-苯乙醇含量比普通基酒高出很多。
（4）经验证本实验室筛选的BG14对壮观霉素（Spc）敏感性不高，而对氨苄青霉素（Amp）非常敏感。本研究构建的重组质粒pMarA-4T-2载体有氨苄青霉素和红霉素双重耐受性，而高产α-淀粉酶BG14在氨苄青霉素高于50μg/mL时，耐受性极弱，不生长；在红霉素浓度高于25μg/mL时，则耐受性极弱，不生长。故在后续筛选中抗生素的浓度分别为氨苄青霉素50μg/mL、红霉素浓度25μg/mL。构建的重组质粒pMarA-4T-2能在E.coli/DH5α稳定复制和遗传，pMarA-4T-2可以用来研究BG14的产酶机理和突变体的构建。
【关键词】：
【学位授予单位】：湖北工业大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2014【分类号】：TQ925.1【目录】：
摘要4-5Abstract5-6目录6-9第1章 引言9-19 1.1 α-淀粉酶9-11
1.1.1 α-淀粉酶的分类9
1.1.2 耐高温α-淀粉酶白酒酿造中的应用9-10
1.1.3 耐高温α-淀粉酶的生产菌及其研究现状10-11 1.2 淀粉酶强化曲在白酒中的应用11-14
1.2.1 白酒发展的现状11-12
1.2.2 芽孢杆菌在白酒生产中的作用12-14 1.3 pMarA333 的背景14-16
1.3.1 mini-Tn10 转座子14
1.3.2 mini-Tn10 衍生载体在芽袍杆菌中的应用14-15
1.3.3 质粒 pMarA33315-16 1.4 课题研究目的、内容、意义16-18
1.4.1 课题研究目的16-17
1.4.2 主要研究内容17
1.4.3 课题研究的意义17-18 1.5 研究技术路线18-19第2章 高产α-淀粉酶芽孢杆菌的筛选鉴定及其产酶条件优化19-33 2.1 实验材料19-22
2.1.1 菌株19
2.1.2 培养基19-20
2.1.3 主要试剂20-21
2.1.4 实验仪器21-22 2.2 实验方法22-25
2.2.1 高产α-淀粉酶菌株筛选22
2.2.2 高产α-淀粉酶菌株鉴定22-23
2.2.3 α-淀粉酶酶活测定23
2.2.4 酶反应最适温度23
2.2.5 生长曲线与产酶曲线的测定23-24
2.2.6 发酵条件优化24-25 2.3 结果与分析25-32
2.3.1 高产α-淀粉酶芽孢杆菌菌株的筛选结果25-26
2.3.2 高产α-淀粉酶芽孢杆菌菌株的鉴定结果26-28
2.3.3 酶反应最适温度的测定28
2.3.4 生长曲线与产酶曲线的测定28-29
2.3.5 发酵条件优化29-31
2.3.6 正交试验31-32 2.4 本章小结32-33第3章 BG14 强化曲固态发酵研究33-44 3.1 实验材料33-34
3.1.1 菌株33
3.1.2 培养基33
3.1.3 主要试剂33-34
3.1.4 实验仪器34 3.2 实验方法34-38
3.2.1 细菌麸曲的制作34-35
3.2.2 模拟固态发酵35-37
3.2.3 酒醅淀粉含量及基酒各指标的检测37-38
3.2.4 气相色谱定量分析基酒中香味成分38 3.3 结果与分析38-43
3.3.1 酒醅淀粉含量及基酒各指标的检测38-40
3.3.2 气相色谱测定结果40-43 3.4 本章小结43-44第4章 重组质粒的构建44-57 4.1 实验材料44-46
4.1.1 菌株和质粒44
4.1.2 培养基44-45
4.1.3 主要试剂45-46
4.1.4 实验仪器46 4.2 实验方法46-52
4.2.1 pMarA333 质粒的提取及验证46-48
4.2.2 pGEX-4T-2 质粒的提取及验证48
4.2.3 pMarA333 和 pGEX-4T-2 抗生素抗性梯度检测48-49
4.2.4 整合载体 pMarA-4T-2 的构建49-52 4.3 结果与分析52-56
4.3.1 pMarA333 质粒验证结果52-53
4.3.2 pGEX-4T-2 质粒验证结果53-54
4.3.3 pMarA333 和 pGEX-4T-2 抗生素抗性梯度检测结果54-55
4.3.4 整合载体质粒 pMarA333-4T 的酶切电泳图谱55-56 4.4 本章小结56-57第5章 结论与展望57-59 5.1 结论57-58 5.2 创新点58 5.3 展望58-59参考文献59-63致谢63-64发表论文64
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地衣芽孢杆菌在食品工业中的应用
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地衣芽孢杆菌在食品工业中的应用
&&&&摘要：地衣芽孢杆菌是一种公认的安全无毒的革兰氏阳性菌。由于地衣芽孢杆菌能产丰富的蛋白酶,能提高营养利用效率、提高动物免疫功能以及抑制致病菌的效果,在食品工业方面已经有广泛的应用。主要综述地衣芽孢杆菌在食品工业方面的应用及其相关机理研究。 &&&&关键词：地衣芽孢杆菌;蛋白酶;免疫功能;抑菌 &&&&地衣芽孢杆菌是一种广泛分布于土壤和其他自然环境的革兰氏阴性菌。地衣芽孢杆菌具有营养要求简单、对不良环境有极强抵抗能力、产酶种类多且产量高、耐热性强、抑制致病菌以及安全无毒等诸多优良特性，因此比较适合用于工业生产，已经被多个国际机构认定为GRAS工业菌株[1]。地衣芽孢杆菌应用范围较广，能有效预防水产动物肠炎，分解水中有毒有害物质，能促进饲料中营养素降解，能调整肠道菌群失调，减少肠道细菌感染[2]，能产生抗性物质从而抑制致病菌生长繁殖，因此地衣芽孢杆菌在水产业、畜牧业、林业、食品工业和医药行业均有广泛的应用[3]。近年来，地衣芽孢杆菌由于其安全性、产酶丰富以及能抑制致病细菌的特性在食品工业上的应用也越来越多。对地衣芽孢杆菌在食品工业中的应用及相关机理进行综述。 &&&&1·地衣芽孢杆菌基本生物学特征 &&&&地衣芽孢杆菌是一种在土壤中常见的革兰氏阳性嗜热细菌，其最适合生长温度为30℃，但酶的最适合分泌温度为37℃，地衣芽孢杆菌还能产生许多具有热温度性较强的蛋白酶，而且抵抗恶劣环境的能力比较强。 &&&&地衣芽孢杆菌与解淀粉芽孢杆菌的亲缘关系最近，两者DNA同源性在9%~15%。地衣芽孢杆菌培养菌落呈圆形，表面不光滑。镜检菌株为直杆状，两端呈圆形，芽孢有运动能力。能利用丙酸盐是地衣芽孢杆菌才具有的生化特征，地衣芽孢杆菌还具有淀粉水解、利用柠檬酸盐、明胶液化、硝酸盐还原以及精氨酸脱水酶生产能力。根据以上生理生化特征结合16SrDNA序列可以对地衣芽孢杆菌进行鉴定[4]。 &&&&2·地衣芽孢杆菌在食品中的应用 &&&&2.1地衣芽孢杆菌的安全性研究 &&&&地衣芽孢杆菌已经被多家机构认定为GRAS菌株，有关地衣芽孢杆菌致病性案例均为创伤、器官移植等继发性感染病例。目前还没有地衣芽孢杆菌突破皮肤、消化道和呼吸道黏膜等人体天然屏障的报道，因此地衣芽孢杆菌是非人类致病菌。目前几乎未见关于地衣芽孢杆菌引起食物中毒的报道。地衣芽孢杆菌长期应用于生产食品工业用酶制剂[5]，因此地衣芽孢杆菌食品安全性较高。 &&&&1972年地衣芽孢杆菌开始被大规模应用于淀粉酶生产，1981年；地衣芽孢杆菌生产的食品加工用淀粉水解酶和其他蛋白酶被美国食品和药物管理局鉴定为GRAS级；1989年，丹麦卫生部首次给予基因重组地衣芽孢杆菌菌株工业应用的环境认证和生产许可；1991年NIH引入了地衣芽孢杆菌的GLSP标准，以指导其大规模培养。目前，地衣芽孢杆菌工业应用国际标准为：地衣芽孢杆菌作为宿主细胞应该无芽孢突变株，作为遗传操作载体，内源性质粒宿主不包括蜡状芽孢杆菌[1]。 &&&&2.2地衣芽孢杆菌在酿造业中的应用 &&&&地衣芽孢杆菌由于其丰富的产酶能力和良好的环境适应能力而被应用于酿造工业，被认为是酱香型白酒高温大曲中特有的微生物。刘桂君等从牛栏山酒厂生产用大曲中分离纯化得到地衣芽孢杆菌，用所得液体菌株做种子制备麸曲添加到酒醅中，所得地衣芽孢杆菌基酒比普通基酒乙酸乙酯含量提高，酒体协调、自然，说明地衣芽孢杆菌的添加能提高牛栏山二锅头基酒的质量[6]。 &&&&张荣等[7]从酱香型生产用高温大曲中筛选得到3株产酱香地衣芽孢杆菌，以麸皮为培养基，所得地衣芽孢杆菌于55℃发酵6d，发酵液中可检测到乙偶姻、四甲基吡嗪和呋喃扭尔等产酱香细菌发酵产生的特征性产物。 &&&&杨帆等[8]从茅台酒生产用大曲中分离纯化得到两株地衣芽孢杆菌和一株枯草芽孢杆菌，在制曲工艺条件下，对3株芽孢杆菌的固态发酵代谢产物分析得知，其共同的代谢产物为二甲基吡嗪、三甲基吡嗪、四甲基吡嗪、苯乙酸、呋喃扭尔、丁二醇、丁烯酸和异戊酸等酒类风味物质，说明地衣芽孢杆菌对于茅台酒风味的呈现有十分重要的作用。 &&&&2.3地衣芽孢杆菌酶制剂在食品加工中的应用 &&&&地衣芽孢杆菌产生的蛋白酶具有较强的水解能力，因此在动物食品加工及水解大豆产多肽方面应用广泛。大豆是一种优质高蛋白脂肪作物，可制成各类食品，豆粕是大豆提取油后的副产品。其中丰富的蛋白可以采用地衣芽孢杆菌蛋白酶加以利用，制成肽类饮料。乐超银等[9]从土壤中分分离得到高产蛋白酶的地衣芽孢杆菌，用该地衣芽孢杆菌以大豆分离蛋白为原料进行发酵生产，通过对发酵条件进行优化，大豆多肽得率达到70%，其中大豆蛋白多肽含量可达19.2mg/mL，而且所得大豆多肽发酵液具有良好的口感，可作为食品原料，具有较高的营养价值。 &&&&翟瑞文[10]用地衣芽孢杆菌2709碱性蛋白酶水解玉米渣，酶解后可溶性肽的含量明显升高。经过HPLC对酶解产物分析发现酶解后多肽分子量分布范围为Da。他用所得的短肽制备了多肽饮料。李红梅等研究发现，控制地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶对玉米蛋白的水解条件，可以改变玉米蛋白的结构和乳化性能。 &&&&郭敏亮等[11]用2709地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶对高度变性的脱脂豆粕进行水解处理，水解pH为9.7，发现酶用量超过532U/mL时，豆粕的氮溶指数可达80%~90%，最大氮溶指数达90.5%，说明豆粕被地衣芽孢杆菌蛋白酶水解的比较完全。在35℃条件下水解24h，酶浓度高于1000U/mL时对大豆蛋白的最高水解度可达65%，该条件比较有利于多肽饮料的制备。 &&&&吴远根等[12]利用地衣芽孢杆菌作为出发菌株，以提取油后的麻疯树饼粕作为培养基进行固体发酵生产蛋白酶，研究表明，地衣芽孢杆菌于30℃发酵3d，蛋白酶产量达到最大值为7465U/g，对麻疯树饼粕利用较为充分。 &&&&2.4地衣芽孢杆菌在养殖业中的应用 &&&&由于地衣芽孢杆菌对致病菌有一定的抑制作用，而且地衣芽孢杆菌所产生的丰富的蛋白酶能促进肠道消化，因此地衣芽孢杆菌在饲料添加剂方面有较广泛的应用。辛娜等[13]将主要成分为地衣芽孢杆菌的芽孢杆菌制剂添加到蛋鸡饲料中，发现饲料的转化率得到提高，蛋鸡的发病率明显减少，而且鸡蛋的蛋壳硬度相比对照组增加2.55%，产蛋率有所提高并且破蛋率降低，同时还能改善蛋黄颜色。刘晓琳等[14]将地衣芽孢杆菌添加到断奶仔猪的饲料中，结果表明，地衣芽孢杆菌组平均日增重比对照组高13.89%，而且地衣芽孢杆菌料肉比比对照组低15.49%，该组的腹泻率比对照组低17.31%，差异极显著，说明地衣芽孢杆菌的添加能减少仔猪发病，提高其生产性能。123
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【来源】中国食品添加剂应用网
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