[转载]药理学实验
第一章&&&&&&&&&&&&&&&
药理学实验的基础知识
药理学实验课的目的和要求
药理学实验课的目的在于通过实验，使学生掌握进行药理学实验的基本方法，了解获得药理学知识的科学途径，验证药理学中的重要基本理论，更牢固地掌握药理学的基本概念。在实验课中还应培养学生科学工作的严肃的态度、严格的要求、严密的工作方法和实事求是的作风，并初步具备客观地对事物进行观察、比较、分析、综合和解决实际问题的能力。
为了达到上述目的，要求做到下列事项：
实验前（1）仔细阅读实验指导，了解实验目的、要求、方法和操作步骤，领会其设计原理；（2）结合实验内容，复习有关药理学和生理学、生化学等方面理论知识达到充分理解；（3）估计实验中可能出现的情况和发生的问题。
实验中（1）将实验器材妥善安排，正确装置；（2）严格按照实验指导书上的步骤进行操作，准确计算给药量，防止出现差错意外；（3）认真、细致地观察实验过程中出现的现象，随时记录药物反应的出时间、表现以及最后转归，联系课堂讲授内容进行思考；（4）注意节约实验材料。
实验后（1）整理实验结果，经过分析思考，写出实验报告，按时交给指导教师；（2）整理实验器材，洗净擦干，妥为安放。将存活和死亡动物分别送至指定处所。做好实验室的清洁卫生工作。
实验动物的捉持和给药法
实验1.1& 蛙和蟾蜍的捉持和给药法
[目的] 学习蛙和蟾蜍的捉持和淋巴囊给药法。
[材料] 蛙或蟾蜍；注射器、针头、生理盐水。
[方法] 1.捉持法&&
通常以左手握持，用食指和中指夹住左前肢，用拇指压住右前肢，将下肢拉直，用无名指及小指夹住。
2.淋巴囊内注射法&&
蛙及蟾蜍皮下有多个淋巴囊，注入药物后易于吸收。通常将药物注射于胸、腹或股淋巴囊。蛙及蟾蜍的皮肤很薄，缺乏弹性，注射后药物易自针眼漏出，故作胸部淋巴囊注射时应将针头插入口腔，由口腔底部穿过下颌肌层而达胸部皮下；作股淋巴囊注射时，应由小腿皮肤剌入，通过膝关节而达大腿部皮下。这样才可避免药液外漏。注入药液量一般为0.25ml&#ml试以生理盐水作胸淋巴囊和股淋巴囊注射练习。
实验1.2& 小鼠的捉持和给药法
[目的] 学习小鼠的捉持和各种给药法。
[材料] 小鼠3∽4只；鼠笼、天平、注射器、针头、灌胃针头、小鼠尾静脉注射用固定筒、生理盐水。
[方法]　１.捉持法&
以右手提鼠尾，将小鼠放于鼠笼或其它粗糙面上，将鼠尾向后轻拉，使小鼠固定在粗糙面上，以左手的拇指及屈成“V”状的食指捏其双耳及头颈部皮肤，无名指、小指和掌心夹其背部皮肤和尾部，这样便可将小鼠完全固定，并可保持头颈部平直。
2. 灌胃法&
以左手捉持小鼠，使其头部朝上，颈部拉直。右手持配有灌胃针头（以16号输血针头磨去针尖后制成）的注射器，自口角插入口腔，再从舌面紧沿上腭进入食道。如手法正确，不难成功。若遇阻力，应退出后再插，不能用力强插，以免刺破食道或误入气管，使动物致死。灌胃的药液量一般为0.1&#ml/10g。试以生理盐水作灌胃练习。
3.&&&&&&&&&&
可由两人合作。一人左手抓住小鼠头部皮肤，右手拉住鼠尾。另一人左手捏起背部皮肤，右手持注射器（5号或6号针头），将针头刺入背部皮下。如由一人操作，可按前法捉持小鼠，右手持注射器，针尖从右侧肋缘上穿入皮下，向前推至右前肢腋下部位，将药液推入即可。小鼠皮下注射的药液量一般为0.05&#ml/10g。试以生理盐水进行练习。
4．肌内注射&
可由两人合作。一人左手抓住小鼠头部皮肤，右手拉住鼠尾。另一人持注射器（4号或5号针头），将针头刺入后肢外侧部肌肉。如一人单独操作，以左手拇指和食指抓住小鼠头部皮肤，小指、无名指和掌部夹住鼠尾及一侧后肢，右手持注射器刺入后肢肌肉给药。注射器每腿不宜超过0.1ml。试以生理盐水进行练习。
5．腹腔注射&
以左手抓住小鼠，使腹部在上面，头部下倾，右手持注射器（5号或6号针头），取30度角将针头从一侧下腹部向头端刺入腹腔。进针部位不宜太高，刺入不能太深，以免伤及内脏。注射量一般为0.1&#ml/10g。试以生理盐水进行练习。
6．尾静脉注射&
将小鼠置特制的固定筒内（或倒置的大漏斗、乳钵下），使鼠尾露出在外。用酒精（或二甲苯）棉球涂擦尾部，或将鼠尾在50℃热水中浸泡半分钟，使血管扩张。用左手拉住尾尖，从左右两侧尾静脉中，选择一条扩张最明显的尾静脉，右手持注射器（4号针头），将针头刺入血管，推入药液。如推注时有阻力，且局部肿胀变白，表明针头没有刺入血管，应拨出后重新穿刺。穿刺血管时宜从鼠尾末端开始，以便失败后可在第一次穿刺点的近心端重新进行。小鼠尾静脉注射的药液量一般为0.1&#ml/10g。试以生理盐水作尾静脉注射练习。
实验1.3& 家兔的捉持和给药法
[目的] 学习家兔的捉持和各种给药法。
[材料] 家兔1∽2只；兔固定箱、兔开口器、磅称、导尿管、注射器、
[方法]& 1．捉持法&&
用一手抓住家兔颈背部皮肤，将兔提起，另一手托其臀部，使兔呈坐位姿势。
需由两人合作进行。一人取坐位，用两腿夹持兔身，左手握家兔双耳，右手抓住两前肢，另一人将木制开口器横插家兔口内，压住舌头，并固定之。取8号导尿管，从开口器中部小孔插入食道，深约15∽18cm。插管时易误入气管。区别方法主要在于谨慎观察插管后动物的反应。插入气管时将引起剧烈挣扎和呼吸困难。也可将导尿管的外端浸入水中，如有气泡吹出，表示已误入气管内，此时应拨出重插。在判明导尿管确定插在食道内以后，取注射器接在导尿管上，将药液推入。再推注少量空气，使导尿管中不致有药液残留。然后抽出导尿管，取出开口器。如用兔固定箱，亦可一人操作。左手将开口器固定于兔口内，右手将导尿管插入食道。家兔灌胃给药时的药液容量一般为5∽20ml/kg。试以生理盐水进行练习。
3．皮下、肌内及腹腔注射&&
给药方法基本上同小白鼠，唯针头可稍大（6号或7号），给药量可稍多（皮下与肌内0.5&#ml/kg，腹腔1.0&#ml/kg）。
4．静脉注射&
将家兔置固定箱内，拨去耳壳外缘的毛，选择一条比较明显的耳缘静脉，用酒精棉球涂擦皮肤，使血管显露。用左手拇指和中指捏住兔的耳尖，以食指垫在兔耳拟进针部位的下面，右手持注射器（6号），从近耳尖处将针头刺入血管。如见到针头确在血管内，即以左手将针头固定在兔耳上，将药液推入。推注时如有阻力，局部出现肿胀，表明针头不在血管内，应立即拨针重新穿刺。家兔的静脉注射量，一般药液为0.2&#ml/kg，等渗药液可达10ml/kg。试以生理盐水进行练习。
附：其他动物的给药法
大鼠&的捉持和给药法
将大鼠放于粗糙面上，用右手拉其尾部，左手戴保护手套，以拇指和食指捉其头部，其余三指夹住背部腹部。对于身体特大或凶狠易咬人的大鼠，可先以布巾包裹全身（露出口、鼻），然后进行操作。
给药法& 大鼠的各种给药法基本上同小鼠，唯所用的给药工具可稍大，给药量也可稍多。
豚鼠的捉持和给药法
豚鼠性温和，一般不咬人，用手握住身体即可。
皮下、肌内及腹腔注射&&
方法基本上同小鼠，给药量可稍多。
静脉注射&&
可选用后脚掌外侧的静脉或外颈静脉进行注射。作后脚掌外侧静脉注射时，可由一人捉豚鼠并固定一条后腿，另一人剪去注射部位的毛，用酒精棉球涂擦后脚掌外侧的皮肤使血管显露，再将连在注射器上的小儿头皮静脉输液针头刺入血管。作外颈静脉注射时需先剪去一点皮肤，使血管暴露，然后将连在注射器上的小儿头皮静脉输液针头刺入。豚鼠的静脉管壁脆弱易破，操作时需特别小心。
猫的给药法
皮下、肌内及腹腔注射&&
方法基本上同家兔。给性情暴躁的猫注射麻醉药时，可先将猫装在布袋内，然后逐渐收缩布袋，将猫推到袋角，按住头部和躯体，隔着布层作腹腔内注射。
狗的给药法
给药前处置&&
对于未经驯服的狗，需先以特制铁钳夹住颈部，将其按倒，以绳索捆扎狗嘴，然后才可作给药操作。但是对于已经驯养，用于慢性实验的狗，切不可用铁钳夹颈。否则狗的性情将由此变得暴躁而难以操作。
灌胃、皮下、肌内和腹腔注射& 方法上基本上同家兔，用具和给药量应相应增大。
静脉注射&&
常用的注射部位是后肢小隐静脉，该血管由外踝前侧走向外上侧。也可选用前肢的皮下头静脉，该血管在脚爪上方背侧的正前位。注射时先局部剪毛，以酒精涂擦皮肤，一人捏紧注射肢体的上端，阻断血液回流，使静脉充盈，以便看清其走向，另一人持注射器进行静脉穿刺，将药液注入。
实验动物的性别鉴别、编号和处死法
(一)实验动物的性别鉴别
1．小鼠和大鼠&&
两性的区别要点有三：雄鼠可见阴囊，站位时阴囊内睾丸下垂，热天尤为明显，成熟雌鼠的腹部可见乳头；雄鼠的尿道口与肛门距离较远，雌鼠的阴道口与肛门比较靠近；肛门和生殖器间有沟的为雌鼠，无沟的为雄鼠。
2．豚鼠&& 与小鼠和大鼠基本相同。
雄兔可见阴囊，两侧各有一个睾丸；用拇指和食指按压生殖器部位，雄兔可露出阴茎；雌兔的腹部可见乳头。
4．其它较大动物，性别特点明显，不难辨认。
(二)实验动物的编号
较大的动物如猫、狗、猴等，可用号码牌挂在动物颈部，或将特制的铝质标牌固定在耳壳上。小鼠、大鼠及家兔一般用1%苦味酸溶液（以稀醇配制）涂于体表不同部位的毛上。方法不尽相同，以能明显区别为原则。例如1号涂在左前肢，2号涂在左后肢，3号涂右前肢，4号涂右后肢，5号涂头部，6号涂背部，7号涂尾部，8号涂头及背部，9号涂头及尾部，10号不涂色等。
(三)实验动物的处死法
1．蛙和蟾蜍&&
可以断头处死。也可用探针经枕骨大孔破坏其脑和脊髓。
小鼠和大鼠&
也常以断头处死。对于小鼠，还可用颈椎脱臼法处死，即用左手的拇指和食指紧按其头部，右手捉其尾根，向后猛拉，就可使其致死。
兔、猫及狗&
静脉注射空气10到30毫升，可使动物因血管气栓而死。静脉注射大剂量戊巴比妥钠等麻醉药，则更可使动物在死前免受痛苦。
四、实验动物给药量的计算
在要给动物给药的时侯，常常会遇到两个问题：（1）给予&&&&
多少剂量才恰当？（2）应配成何种浓度的药液，给予多少毫升才合适？现分述其处理方法。
（一）&& 给药剂量的决定
药物对于某种动物的适当剂量得自实践经验，不能凭空推算。在我们为了某一目的准备给某种动物用药而需要解决剂量问题时，首先应该查阅该药的有关文献（学报、文摘、手册和专著等），了解前人的经验。如能查到为了同一目的，给相同种类动物用药的记录，那就可以直接照试。有时侯查不到治疗剂量，但能找到致死量（LD50或MLD），可先用1/5&#的致死量进行尝试。
如果查不到待试动物的剂量，但知道其它动物的剂量或人用剂量，这就需要加以换算。关于不同种类动物间用药剂量的换算，一般认为不能简单的按体重比例增减，而需按单位体重所占体表面积的比值来换算，其具体方法详见附录五。但换算而得的剂量仍有可能偏大或偏小，也只能当作一个参考值。
（二）&& 药液浓度的考虑与给予药液容量的计算
决定了给药剂量以后，应该怎样考虑将要配制药液的适当浓度呢？这时侯就应当从在供试动物身上，以某种特定途径给药时的最适给药容量入手，现举例加以说明：
已知戊巴比妥钠给家兔静脉注射时的适当剂量为25mg/kg，问宜将戊巴比妥钠配成何种浓度的溶液，方便于给药？
解：家兔静脉注射时的药液容量以1ml/kg较较恰当。现在即已决定采用25mg/kg的剂量，这就是说每1ml药液中以含戊巴比妥钠25mg为宜。25mg/ml的浓度如用百分浓度表示，就是2.5%。因此当需要给家兔按25mg/kg静脉注射戊巴比妥钠时，宜将药液配成2.5%的浓度。
在需要按照预定剂量，利用现成药液给药的时侯，又该怎样计算每个动物应当给予的毫升数呢？现再举例说明：
例２　盐酸吗啡给小鼠腹腔注射时的剂量为15mg/kg。现有药液的浓度为0.1%,17g体重的小鼠应注射此种药液多少毫升?
解：按15mg/kg的剂量计算，17g体重的小白鼠应给药0.255mg，0.1%的药液每100ml含药100mg，即每1ml含药1mg。所以该小鼠应注射盐酸吗啡溶液0.26ml.
在某些药理试验中，也按摩尔浓度配制药液，如将1摩尔质量的药物溶于溶剂中，配成1L的溶液（其它浓度依此类推），表示为1mol/L,余类推。
五、实验结果的整理和实验报告的撰写
整理实验结果和撰写实验报告就是做完每项实验以后的总结工作。通过良好的总结，可使我们在实验过程中获得的感性认识提高到理性认识，明确已经取得的成果，尚未解决的问题以及工作中的优缺点。实验报告是向他人提供研究经验及供本人日后查阅的重要资料。应当充分认识在校学习期间学会做这一道科学研究工作中关键性工序的重要性。
（一）&&&&&&&&
实验结果的整理
实验结束以后应对原始记录进行整理和分析。药理实验结果有测量资料（如血压值、心率数、瞳孔大小、体温变化、生化测定数据和作用时间等），记数资料（如阳性反应或阴性反应数、死亡或存活数等），描记曲线、心电图、脑电图、照片和现象记录等。凡属测量资料和计数资料，均应以恰当的单位和准确的数值作定量的表示，不能笼统提示。必要时应作统计处理，以保证结论有较大的可靠性。尽可能将有关数据列成表格或绘制统计图，使主要结果有重点地表达出来，以便阅读、比较和分析。作表格时，一般将观察项目列在表内左侧，由上而下逐项填写，而将实验中出现的变化，按照时间顺序，由左而右逐格填写。绘图时，应在纵轴和横轴上画出数值刻度，表明单位。一般以纵轴表示反应强度，横轴表示时间或药物剂量，并在图的下方注明实验条件。如果不是连续性变化，也可用柱形图表示。凡有曲线记录的实验，应及时在曲线图上标注说明，包括实验题目，实验动物的种类、性别、体重、给药量和其他实验条件等。对较长的曲线记录，可选取有典型变化的段落，剪下后粘贴保存。这里需要注意的是必须以绝对客观的态度来进行裁剪工作，不论预期内的结果或预期外的结果，均应一律留样。
（二）&&&&&&&&
实验报告的写作
每次实验后应写好报告，交负责老师批阅。实验报告要求结构完整、条理分明、用词规范、详略得宜、措辞注意科学性和逻辑性。一般包括下列内容：
实验方法&&
当完全按照实验指导上的步骤进行时，也可不再重述。如果实验方法临时有所变动，或者发生操作技术方面的问题，影响观察的可靠性时，应作简要说明。
4. 实验结果&
实验结果是实验报告中最重要的部分，需绝对保证其真实性。应随时将实验中观察到的现象在草稿本上记录，实验告一段落后立即进行整理。不可单凭记忆或搁置了长时间之后再作整理，否则易致遗漏或差错。实验报告上一般只列经过归纳、整理的结果。但原始记录应予保存备查。
应针对实验中所观察到的现象与结果，联系课堂讲授的理论知识，进行分析和讨论。不能离开实验结果去空谈理论。要判断实验结果是否为预期的。如果属于非预期的，则应该分析其可能原因。
实验结论是从实验结果归纳出来的概括性判断，也就是对本实验所能说明的问题、验证的概念或理论的简要总结。不必再在结论中重述具体结果。未获证据的理论分析不能写入结论。
药理学总论
实验2.1　药物的局部作用与吸收作用
［目的］观察药物对动物机体的局部作用和吸收作用
［材料］兔子１只；兔固定箱、镊子、注射器、兔用麻醉口罩；
松节油、0.1％硝酸士的宁、麻醉乙醚、5%水合氯醛注射液
1、取兔一只放于兔固定箱内，对光观察兔耳血管粗细及颜色等情况，然后对一只兔耳涂擦松节油，待两分钟后对比两只兔耳有何不同？
2、将兔称重，先观察正常活动，用镊子轻击四肢和背部，看有何反应。
（1）给兔皮下注射0.2%硝酸士的宁注射液0.2ml/kg，用药后每隔二分钟用镊子轻击四肢，观察兔有何反应。
（2）待兔出现典型的士的宁中毒症状（表现为全身痉挛，角弓反张，呼吸暂停等）后，立即套上有麻醉乙醚的兔口罩，再观察兔的反应。
（3）当兔的中毒状态消失后，除去麻醉口罩，静注水合氯醛注射液2ml/kg。
［讨论题］
记录实验结果，说明哪种作用是局部作用？哪种作用是吸收作用？
实验2.2　药物的协同作用和拮抗作用
［目的］　观察激动剂与拮抗剂之间的相互作用
［材料］　兔子１只；　0.05%硫酸阿托品注射液,0.1%盐酸肾上腺素注液,0.2%硝酸毛果芸香碱注射液。
1、取兔放于兔固定箱内固定，避免阳光直射眼睛，用毛剪剪去兔两眼睫毛，然后用瞳孔量尺测量瞳孔大小，连续三次，取平均值。
2、在兔左眼滴入０.2%毛果芸香碱3滴，滴药时用姆指和食指将下眼睑提起,使成囊状,再用中指压住鼻泪管开口处,防止药液流入鼻泪管而不起作用，再用右手滴入药液。15分钟后再测量瞳孔大小，连续三次，取平均值，并进行比较。
3、滴入毛果芸香碱20分钟后，分别在两眼滴入0.1%肾上腺素3滴，15分钟后测量两瞳孔大小，连续3次，取平均值并进行比较。
4、滴入肾上腺素15分钟后，分别于两眼滴入0.05%硫酸阿托品注射液3滴，15分钟后观察两眼瞳孔变化，并测量其大小，连续3次，并取平均值。
毛果芸香碱
［讨论题］
从实验结果中如何说明药物的协同作用和拮抗作用？
实验2.3　不同给药途径对药物作用的影响
［目的］　观察不同途径给药对药物效应的影响
［材料］　小白鼠５只；注射器、小白鼠灌胃器、钟罩、电子秤、镊子、3.5%硫酸镁溶液、5%炭末阿拉伯胶混悬液、0.3%戊巴比妥钠。
一、灌胃和腹腔注射给硫酸镁的药效比较
取禁食12h的昆明种小鼠3只，称重，分别标为对照组、灌胃组和腹腔注射组按以下给药：
A：对照组：灌胃给生理盐水0.2ml/10g；
B：灌胃组：灌胃给3.5％硫酸镁溶液0.2ml/10g；
C：腹腔注射组：腹腔注射给3.5％硫酸镁溶液0.2ml/10g。
给药后注意观察动物的活动情况，是否有肌肉松弛的表现。15min后每只小鼠均灌胃给予5%炭末阿拉伯胶混悬液0.2ml。炭末灌胃后15min，将小鼠脱臼处死，剖开腹腔，取出胃肠道。剪去附着在肠管上的肠系膜,将肠管不加牵引地轻轻地平铺在玻璃板上(玻璃板上滴少许盐水)。以幽门为起点,测量炭末在肠管内的移动距离和小肠(自幽门至回盲部)的全长,计算每只小鼠炭末的移动距离占小肠全长百分率，比较3组动物的活动状况和胃肠炭末推进率有何不同。
炭末推进率计算公式：
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
炭末的移动距离（cm）&&&&&&&&&&&&&
&&&&&&&&&&&
小肠推进率
=&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&&&&&&&&&&&&&&&&&
&&&小肠全长（cm）
药物及剂量&&
给药途径&&
动物反应&& 炭末推进率（%）
二、灌胃、皮下注射、腹腔注射戊巴比妥钠的效应比较
取体重相近的小白鼠３只，称其体重分别放入钟罩内，观察它们的正常活动及翻正反射情况，然后用0.3%戊巴比妥钠溶液0.1ml/10g的量以不同途径给药,甲鼠灌胃，乙鼠皮下注射，丙鼠腹腔注射。观察小白鼠用药后的反应及活动情况，以翻正反射消失时作为麻醉开始指标。记录麻醉开始时间（从给药至翻正反射消失的时间），麻醉维持时间（即从翻正反射消失至翻正反射恢复的时间），麻醉深度有何不同（用镊子夹其后肢看其反应）。
麻醉开始时间
麻醉维持时间
［讨论题］
为什么会有这些不同的结果？
实验2.4　溶液pH值对某些药物吸收速率的影响
［目的］　通过对于不同pH值的阿托品溶液滴眼后作用快慢的比较，了解溶液的pH值对弱碱（或弱酸）性药物穿透生物膜速率的影响。
［材料］　家兔１只；兔子固定箱、滴管、测瞳尺。
　　1、取家兔１只，置箱内固定。观察二眼瞳孔大小（测量瞳孔直径），及测试对光反射是否存在。
　　2、由两人协作，同时拉开左右眼下眼睑，在左眼内滴入pH值为9.0的1%硫酸阿托品溶液3滴，右眼内滴入pH值为5.0的1%硫酸阿托品溶液3滴,让药液在结膜囊内保留2分钟，然后放手。
　　3、立即同时连续观察二眼瞳孔大小的变化，并测试对光反射，直至二眼瞳孔不再扩大，对光反射完全消失为止。测量瞳孔大小。比较两种阿托品溶液产生作用的快慢，并记录结果。
1、测试对光反射的方法为迅速以手电筒光照射兔眼。如瞳孔能随光照而缩小，即认为对光反射存在。如不能缩小，则认为对光反射消失。
2、两种药液的作用差异在滴药后２－５分钟最为明显，应抓住这一时机进行比较。此后由于分泌物的作用，溶液的pH值发生变化，差别就不显著了。
［讨论题］
已知弱碱性药物阿托品在25℃时的pKa值为9.65,根据Henderson-Hasselbalch二氏的pKa=pH+lg
的公式，计算溶液的pH值为５或９时以未解离形式存在于溶液中的阿托品分子占有百分率。
实验2.5　肝脏功能对药物作用的影响
［目的］　观察肝功能损害对药物作用的影响。
［材料］　小白鼠４只；注射器、钟罩、电子秤、0.2%戊巴比妥钠溶液、20%四氯化碳泊剂。
　　取体重近似正常的小白鼠及损坏肝脏的小鼠（实验前２４小时皮下注射２０％四氯化碳０.1ml／10g）各两只，分别由腹腔注射０.2%戊巴比妥钠0.2ml／10g，记录并比较两组小白鼠麻醉持续时间有何差别？
药量（ml）
产生作用时间
　　实验结束后将小鼠拉断颈椎处死，剖取肝脏，比较二组动物肝脏外观之不同。四氯化碳中毒小鼠的肝脏较肿大，有的充血，有的呈灰黄色，触之有油腻感，其小叶比正常肝脏更清楚。
［讨论题］
为什么损坏肝组织的小白鼠在注射戊巴比妥钠后作用时间长？有何意义？
实验2.6　肾功能对药物作用的影响
［目的］观察肾功能损害对药物作用的影响
［材料］小白鼠２只；注射器、钟罩、电子秤；0.1%氯化高汞、5%硫酸链霉素。
　　取正常小白鼠和肾功能已被破坏的小白鼠（实验前２４小时腹腔注射０.1%氯化高汞0.07ml/10g）各２只，称其体重，分别由腹腔注射３％硫酸链霉素0.15ml/10g(375mg/kg)，观察小白鼠的活动情况，比较两组小白鼠的变化有何差别？
药量（ml）
产生作用时间
　　实验结束后可将小鼠处死，比较二组动物肾脏的差别。氯化高汞中毒小鼠的肾脏常明显肿大。如用小刀纵切，可见到皮质部较为苍白，髓质部有充血现象。
［讨论题］
为什么两组小白鼠的表现不同？有何意义？
实验2.7　药物的配伍禁忌
［目的］　了解两种或两种以上的药物配合在一起时，可能产生的配伍禁忌。
［材料］　小白鼠4只、试管架、试管、乳钵、注射器、电子秤、pH广泛试纸、蒸馏水、液体石蜡、水合氯醛、樟脑、１０％磺胺嘧啶钠、维生素Ｂ１注射液、０.1%肾上腺素注射液、５％碳酸氢钠、0.3%戊巴比妥钠、1%安钠咖、4%硫酸镁、1.25%盐酸四环素、5%氯化钙。
一、物理性配伍禁忌
1、樟脑醑1ml+水1ml－→混浊、析出樟脑
2、液体石蜡3ml+水3ml－→分层
3、水合氯醛2g+樟脑2g－→液化
二、化学性配伍禁忌
1、10％磺胺嘧啶钠１ml+维生素B1１ml－→磺胺嘧啶（反应前后均用pH广泛试纸测定pH值）
2、24万u青霉素Ｇ钾溶液１ml＋1.25％盐酸四环素溶液１ml
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3、0.1％盐酸肾上腺素１ml＋５％碳酸氢钠１ml
三、药理性配伍禁忌
1、取小白鼠2只称重，其中1只肌内注射１％安钠咖注射液0.１ml/10g，待５分钟后二鼠分别腹腔注射0.３％戊巴比妥钠液0.２ml/１０g，观察二鼠反应有何不同？
2、取小白鼠２只，均肌内注射４％硫酸镁0.2ml/10g，待出现肌肉松驰现象后，一只立即腹腔注射５％氯化钙0.1ml/10g，观察二鼠反应有何不同？
［讨论题］
用以上实验结果说明药物配伍禁忌的临床实用意义。
实验2 . 8　药物急性LD５０的测定
［目的］　通过实验学习测定LD５０的方法、步骤和计算过程，了解急性毒性实验的常规方法。
［材料］　小鼠（体重20g左右）；测试药物、苦味酸、注射器、小鼠饲养笼
［方法］　（以敌百虫药物为例）
１、预备试验（探索剂量范围）　　取小鼠８-10只，以２只为一组分成４－５组，选择组距较大的一系列剂量，分别按组腹腔注射敌百虫溶液，观察出现的症状并记录死亡数，找出引起０％和100％的死亡率（至少应找出引起20％－80％死亡率）剂量的所在范围（参考剂量：最小300mg/kg，最大1000mg/kg）。
2、正式试验
（１）取小鼠50只，用苦味酸进行编号，用区组随机法进行分组，分为５组，每组１０只小鼠。
（２）在预试所获得的０％和100％的致死量范围内，选用５个剂量（一般用３－５个剂量，按等比级数增减），尽可能使半数组的死亡率都在50％以上，另半数组的死亡率都在50％以下。
（３）完成动物分组和剂量计算后按组腹腔注射给药（最好先从中剂量组开始，以便能从最初几组动物接受药物后的反应来判断两端的剂量是否合适，否则可随时进行调整）。
3、LD５０测定中应观察记录的项目
（1）实验各要素：实验题目，实验日期，室温，检品的批号、规格、来源、理化性状、配制方法及所用浓度等；动物品系、来源、性别、体重、给药方式及剂量（药物的绝对量与溶液的容量）和给药时间等。
（2）给药后各种反应：潜伏期（从给药开始出现毒性反应的时间）；中毒现象及出现的先后顺序、开始出现死亡的时间；死亡集中时间；末只死亡时间；死前现象等。逐日记录各组死亡只数。
（3）尸解及病理切片：从给药时开始记时，凡两小时以后死亡的动物，均及时尸解以观察内脏的病变，记录病变情况。若有肉眼可见变化时则需进行病理检查。整个实验一般要观察７－１４天，观察结束时，对全部存活动物称体重，尸解，同样观察内脏病变并与中毒死亡尸解情况相比较。当发现有病变时，也同样作病理检查，以比较中毒后病理改变及恢复情况。
4、结果记录和处理
（1）结果处理　　实验资料按下表列出：
受试物剂量&&&
对数剂量　　　动物数　　　死亡率　　　概率单位　　　LD50
（mg/kg）&&&&&
(X)&&&&&&&&&&
(只)&&&&&&&
（%）&&&&&&&
及置信限(95%)
（2）结果计算
用简化概率法计算LD50；计算lgLD50的标准误（Sx50）；计算95%的可信限；计算回归直线斜率b；并算出LD10，LD90。
附：戊巴比妥钠半数致死量（LD50）测定的实验示例（寇氏法）
取体重20g左右小白鼠50只，分为5组，每组10只，各组分别腹腔注射不同剂量戊巴比妥钠，注射后24h记录各组出现的死亡鼠数，结果如下所示。按公式：LD50=log-1[Xm-i(ΣP－0.5)]计算，求ＬＤ50。
按公式：LD50=log-1[Xm-i(ΣP－0.5)]计算，求ＬＤ50。
其中：Ｘm＝最大剂量对数值；Ｐ＝动物死亡率（用小数表示）；ΣP＝动物死亡率的总和；i＝相邻两组剂量比值的对数（高剂量作分子）。
求LD50的95%平均可信限：
SLD50＝LD50±4.5 LD50&i&
将实验结果代入上公式：
Ｘm＝Log187.5＝2.273
ΣP＝1.0+0.7+0.6+0.2+0=2.5
i＝log ＝log1.25＝0.0969
LD50＝log-1[Xm- I(Σp-0.5)]
＝log-1[2.273-0.-0.5)]
＝log-1（2.273-0.1938）
&& ＝log-12.0792
&& ＝120mg/kg
［讨论题］
什么叫ＬＤ５０？测定ＬＤ５０的意义和根据是什么？
实验2.9　家兔血和肝中游离磺胺嘧啶浓度的测定
［目的］掌握磺胺药物在动物体组织和血液中浓度测定的方法；了解磺胺嘧啶在体内的分布情况。
［材料］家兔1只；烧杯，试管，漏斗，滤纸，试管架，研钵，注射器，小动物手术台，手术器械，刻度吸管，721分光光度计。
磺胺嘧啶钠注射液，5％三氯醋酸溶液，3％三氯醋酸溶液，0.1%亚硝酸钠溶液，0.5%氨基磺胺溶液，0.1%二盐酸Ｎ（１－萘基）—乙二胺溶液，磺胺嘧啶标准品，95%乙二醇，0.1Ｎ氢氧化钠，4Ｎ硫酸。
　　具有游离氨基的磺胺类药物在酸介质中经重氧化后可与Ｎ－（１－萘基）－乙二胺产生偶合反应，生成红色的偶氮染料，再与同样处理磺胺药标准比较，即可求得体液中磺胺类药的含量，剩余的亚硝酸影响测定，以氨基磺胺钠分解除去。
1、配液：(1)15%的三氯醋酸溶液；(2)空白对照液(3%三氯醋酸溶液)：取15%三氯醋酸溶液，用蒸馏水稀释即得；(3)0.1%亚硝酸钠溶液；(4)0.5%氨基磺胺溶液；(5)0.5%二盐酸Ｎ－（１－萘基）－乙二胺溶液：取二盐酸Ｎ－（１－萘基）－乙二胺0.5g，溶于95%乙醇约400ml中，再加乙醇稀释至500ml,置棕色玻璃瓶中冰箱保存；(6)贮存标准液：精确称取磺胺嘧啶标准品0.125g，溶于0.1N氢氧化钠25ml中，然后加4N硫酸175ml，并用蒸馏水稀释至1000ml；(7)应用标准液：精确吸取上述贮存标准液3.0mll，置100ml容量瓶中，用3%三氯醋酸液稀释至刻度。
　　2、取兔１只，静脉注射10%磺胺嘧啶注射液1ml/kg，半小时后心脏采血，检查血药浓度（游离磺胺测定法）。
3、记录　取全血0.5ml，加蒸馏水15.5ml混匀，放置15分钟；
加15%三氯醋酸溶液4.0ml，混匀，并过滤；
(3)在试管中加上述滤液5ml作为测定管，在另一试管中加入空白对照液5ml作为空白管；在另一试管中加入应用标准液5.0ml作为标准管。在以上三管中各加入0.1%亚硝酸钠液，混匀，放置３分钟。
(4)各加入0.5%氨基磺胺溶液0.5ml混合并放置2分钟。
(5)加入0.1%二盐酸Ｎ－(1－萘基)－乙二胺溶液2.5ml，充分混合，放置１０分钟。
(6)用分光光度计或光电比色计于550nm波长处进行比色，以空白管校正光密度到０点，读取标准管和测定管光密度，计算游离磺胺药含量。
例如：标准管光密度为0.5，测定管光密度为0.4，则
3、采血后立即将兔处死，打开腹腔，称取肝组织2g，在研钵中加蒸馏水5ml研磨，取上清液，残渣再加蒸馏水冲洗研钵，并回收于刻度试管，共得16ml，然后加15%三氯醋酸4ml，混匀，静置后过滤，待测定。
测定药物浓度的方法同上。
计算时样品稀释倍数为10，若标准管光密度为0.5，测定光密度为0.4时，则
4、记录并计算
血药浓度——
肝药学浓度——
［讨论题］
试分析磺胺血药浓度和肝药浓度的高低与临床应用的关系。
实验2.10　磺胺嘧啶药动学的生物半衰期的测定
［目的］　了解磺胺嘧啶（ＳＤ）在鸡体内的代谢动力学动态规律并计算出其生物半衰期，为临床用药提供依据。
［材料］　动物：鸡（成年健康家鸡）。
１、１０％磺胺嘧啶钠注射液
２、１５％三氯醋酸
３、0.1％亚硝酸钠（贮存冰箱可保存二周）
４、0.5％氨基横酸铵
５、0.1%二盐酸Ｎ－（１－萘基）乙二胺，取本品0.5g，用95％乙醇400ml溶解，再用乙醇稀释至500ml，置于棕色瓶中，（贮存于冰箱中）。
６、贮存标准液：精确称取被测定的磺胺嘧啶0.125g，溶于蒸馏水中，并稀释至1000ml，因其不易溶于水，可先溶于0.1N氢氧化钠25ml中，然后加4N硫酸175ml，并用蒸馏水稀释至1000ml。
７、应用标准液：精确吸取上述贮存标准液3.0ml，置于100ml溶量瓶中，用3%三氯醋酸稀释至刻度。
器材：721型分光光度计、容量瓶、刻度试管、注射器、吸管、手术器械。
１、动物准备：取健康成年家鸡一只，称体重后，通常用毛巾将鸡裹住，即可被固定。或一手握住两翼根部，一手握着两爪将鸡固定好，暴露并剥离一侧静脉，手插入一根细硬塑料胶管，固定，供采血时用。
２、（１）在注药前，由翼下静脉采血0.5ml，作空白管用。
（２）快速静脉推注10%SD钠（70mg/kg）,注后计时。
３、采血：于注药后的下述时间各采一次，每次0.5ml，分别在5’、10’、15’、20’、30’、45’、60’采血后立即加入15.5ml蒸馏水，使全部溶血，放置15’后，置冰箱保荐（４℃）。
４、加15%三氯醋酸溶液4.0ml，并过滤。
５、在管中加入上述滤液5.0ml作为测定管，在另一管中加入空白全血滤液5.0ml作为空白管，在另一试管中加入应用标准液5.0ml，混合，放置三分钟。
６、各管分别加入0.5%氨基磺酸铵溶液0.5ml，混合，并放置二分钟。
７、各管分别加入0.1%二盐酸N—（１—萘基）乙二胺溶液2.5ml，充分混匀，放置10分钟。
8、721型分光光度计于545—550nm波长处进行比色，以空白管校正光密度到0点,读取标准管和测定管光密度,标出血液中游离磺胺嘧啶的含量(mg/100ml)。
　　９、模型选择与生物半衰期（t1/2）的计算：
（１）模型选择：将测得不同时间的血药浓度取其自然对数为纵座标，以相应时间为横座标绘制Inc—t曲线草图，按直观法（数点法）用计算器回归，求出n与b值，再确定动力学模型（此步略）。
　　（２）按各次血液中ＳＤ的浓度值，求出半衰期（t1/2）：
将多次血药浓度值，用直线回归法求出ＳＤ半衰期；设Ｘ为用药后的时间（以分计算），Ｙ为血液中ＳＤ浓度对数值（浓度mg%计算）得一座标点，各点间连成直线的斜率b：　　
　　消除速率常数Ｋe=b&#　　　
　　在未知初始浓度Ｃ０，而知道任意时间t1和t2时的浓度C1和C2时，可用下式求Ｋ值：　　　 ；　　　　　
［实验记录］
采血时间（t）
号　数（Ｎ）
光密度（Ｅ）
血药浓度（Ｃ）
第三章　各　论
实验3.1　普鲁卡因与丁卡因表面麻醉作用的比较
［目的］　了解普鲁卡因与丁卡因作用的区别。
［材料］　兔１只；０.5%盐酸普鲁卡因溶液、0.6%盐酸丁卡因溶液、兔固定箱、毛剪、滴管。
１、取两眼无眼疾的健康家兔１只，放入固定箱内，用毛剪剪去两眼睫毛。用同一根兔须以相等的力量轻触角膜，试验正常的角膜反射。触及部位可按上、中、下、左、右的顺序，刺激五个点。全部阳性（５次都不霎眼）时记５/５，全部阴性（５次都霎眼）时记０/５，其余类推。
２、用拇指和食指将兔下眼睑拉成囊状，再用中指压住鼻泪管（以兔药液流入鼻腔），然后在两眼滴药，左眼滴入0.5%的普鲁卡因溶液２滴；右眼滴入0.6%的盐酸丁卡因溶液２滴。轻揉眼睑，使药液与角膜充分接触，并在眼中存留１分钟，然后放手。滴药后每隔５分钟测试角膜反射１次，到３０分钟为止。同时观察有无结膜充血等反应，记录并比较两药之作用。
滴药前角膜反射
滴药后角膜反射
［讨论题］
１、影响药物表面麻醉效果的因素有哪些？使用中需注意什么问题？
3.2　肾上腺素对普鲁卡因浸润麻醉作用的影响
［目的］　了解肾上腺素与普鲁卡因联合用药可延长局部麻醉作用的特点。
［材料］　兔子１只；注射器、毛剪、烧杯、酒精棉球；0.2%普鲁卡因注射液、含有１/10万0.2ml肾上腺素的普鲁卡因注射液。
１、取家兔１只，在脊背两侧各选择相互对称，直径２cm左右的部位一块，将毛剪净装于盛水的烧杯里（以免兔毛飞扬），用酒精消毒后，用针头刺皮肤，试其痛觉反应，用手掌紧贴兔背部皮肤，感觉刺激部位肌肉抽缩为痛感指标。刺激方式按左、中、右、上、中、下的顺序进行。全部阳性反应记6/6，全部阴性反应记为0/6，其余类推。
２、于两背部分别用0.2%普鲁卡因注射液2ml和0.2%普鲁卡因肾上腺素注射液2ml作皮下注射。注射后于１min、2min、5min分别刺激注射部位测其痛觉，然后每5min测试一次，并比较两种药液的麻醉作用、维持时间及注射部位皮肤颜色有何不同？
药　　　物
用药前反应
用药后反应
普鲁卡因＋Ａd
［讨论题］
以实验结果说明普鲁卡因与肾上腺素合用的临床意义？
3.3　氯丙嗪镇静作用及其强化麻醉的观察
［目的］观察氯丙嗪的镇静作用和强化麻醉作用。
［材料］家兔３只；注射器；0.5%盐酸氯丙嗪、２％戊巴比妥钠溶液、酒精棉球。
　　每组取家兔１只，称其体重，根据下列规定药物、剂量、用法、并记录反应。
0.5%氯丙嗪注射液
0.2%戊巴比妥钠液
用　　药　　前
用　药　后
注：甲、乙兔各静注氯丙嗪１０分钟后，再给乙、丙兔分别注射戊嘏比妥钠。
［讨论题］
以上结果说明了什么问题？
3.4& 药物的镇痛作用
一、化学刺激法观察药物的镇痛作用
[目的] &观察哌替啶、罗通定的镇痛效应，掌握扭体法镇痛实验方法。
[材料]　小白鼠，体重18～22g；1ml注射器、鼠笼、苦味酸等；生理盐水、 0.2 % 哌替啶溶液、0.2 %
罗通定溶液、0.3 %酒石酸锑钾溶液
[方法]　取健康小白鼠6只，称重，随机分成3组，每组2只，观察各鼠活动情况后，分别腹腔注射0.2 %哌替啶溶液、0.2 %
颅痛定溶液及生理盐水，给药体积均为0.1ml/10g。给药30min后，各鼠分别腹腔注射0.3 %
酒石酸锑钾0.3ml/只，观察10min内产生“扭体”反应的动物数。
药物对小鼠的镇痛作用
扭 不扭 扭 不扭 扭 不扭 扭 不扭 扭 不扭 扭 不扭 扭不扭&
扭 不扭& 扭&& 不扭
汇总全实验室的实验结果，将所测得的结果代入下列公式计算：
&&&&&&&&&&&&&&&&&&
实验组无扭体反应的动物数-对照组无扭体反应的动物数
&&& 药物镇痛百分率 =
————————————————————————— &100%
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
对照组扭体反应的动物数
注：“扭体”反应的标志：腹部内凹，躯体与后腿伸张，同时肢体扭曲，抬臀竖尾等。
二、热板法观察药物的镇痛作用
学习热板法镇痛实验方法；观察哌替啶和罗通定的镇痛作用。
将小鼠置于恒温的热板上，以热刺激小鼠足部产生疼痛反应（舔后爪），通过测定小鼠痛阈（出现疼痛反应即舔后爪时间），比较组与对照组小鼠痛阈的差异，判定药物有无镇痛作用。
[材料]& 小鼠，雌性，体重18~22
g；器材：1ml注射器、鼠笼、天平、智能热板仪；0.2％哌替啶生理盐水溶液、0.2％罗通定生理盐水溶液。
1、准备工作
&&打开智能热板仪，设定温度为55±0.5&C，预热15分钟左右，使其达到恒温。
2、小鼠的选择及正常痛阈的测定&
取小鼠数只，依次放入热板仪上。自放入热板仪至出现舔后足所需的时间（秒）作为该鼠的痛阈值。凡在30秒内不舔足或逃避者弃置不用。取筛选合格的小鼠6只，随机分为3组，各鼠编号后重复测其正常痛阈值一次，将所测两次正常痛阈平均值作为该鼠给药前痛阈值。
3、给药及给药后痛阈值测定&&
按0.1ml/10g腹腔注射给药，第1组给予0.2％哌替啶溶液，第2组给予0.2％罗通定溶液，第3组给予生理盐水作为对照。给药后10min、30min后各测小鼠痛阈值1次。若放入烧杯内60秒仍无反应，应将小鼠取出，痛阈值以60秒计。
4、实验完毕后，按下列公式计算不同时间的痛阈提高百分率：
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
给药后平均痛阈值 & 给药前平均痛阈值
痛阈提高百分率（％）=
———————————————————&& &100％
给药前平均痛阈值
药物对小鼠的镇痛作用
动物数& 给药前平均痛阈值（秒）
给药后平均痛阈值（秒） 痛阈提高（％）
30min&&&&&&
比较两种镇痛的实验方法。根据实验结果讨论镇痛药的镇痛作用。
[注意事项]
小鼠以雌性为好，因雄性小鼠受热后阴囊松弛触及热板，易致过敏反应。
2、& 室温对本实验有一定影响，以15
～20&C为宜，过低小鼠反应迟钝，过高则
鼠过于敏感易引起跳跃，影响结果准确性。
正常小鼠放入热板后易出现不安、举前肢、舔前足、踢后肢等现象，这些动作不能作为疼痛指标，只有舔后足才作为疼痛指标。
解热镇痛药对发热家兔体温的影响
［目的］观察解热镇痛药的解热作用。
［材料］兔２只；电子秤、体温表、注射器；１０％复方氨基比林溶液、10％蛋白胨。
　　［方法］
　　取正常成年兔２只，编号为甲、乙，分别检查并记录正常体温（兔体温在38.5℃－39.5℃者为合适）。于４小时前给乙兔皮下注射10％蛋白胨10ml／kg，体温可比正常时升高１℃以上，则进行试验，甲、乙两兔各腹腔注射１０％复方氨基比林溶液
２ml／kg，给药后分别于0.5小时、1小时、1.5小时测量体温，观察各兔体温的变化。
　　给　药　后　体　温
实验结果说明了什么问题？临床上应用解热镇痛药应注意些什么？
３.6　强心甙对离体蛙心的作用观察
［目的］　学习离体蛙心灌注法，观察强心甙对离体蛙心收缩强度、频率和节律的影响以及强心甙和钙离子的协同作用。
［材料］　蛙或蟾蜍；剪子、蛙板、探针、斯氏蛙心插管、蛙心夹、张力换能器、记录仪、记录装置；任氏液、低钙任氏液（所含CaCl2量为一般任氏液的1/4，其他成分不变）、５％洋地黄溶液、１％氯化钙溶液。
　　１、取蛙１只，用探针破坏脑及脊髓，背位置于蛙板上。先剪开胸部皮肤，再剪除胸部肌肉及胸骨，打开胸腔，剪破心包膜，暴露心脏。
　　２、在主动脉干分支处之下穿一线，打好松结，备结扎插管之用。于左动脉上剪一Ｖ形切口，插入盛有任氏液的蛙心插管，通过主动脉球转向左后方，同时用镊子轻提动脉球，向插管移动的反方向拉，即可使插管尖端顺利进入心室。见到插管内的液面随着心搏而上下波动后，将松结扎紧、固定，然后剪断两根动脉。持插管提起心脏，用线自静脉窦以下把其余血管一起结扎，在结扎处下剪断血管，使心脏离体。用滴管吸去插管内血液，并用任氏液连续换洗，至无血色，使插管内保留１.5ml左右的作氏液。
　　３、用带有长线的蛙心夹夹住心尖，将长线联于张力换能器，在记录仪上记录心脏搏动。
　　４、记录一段正常心搏曲线后，依次换加下列药液。每加一种药液后，密切注意心缩强度、心率、房室收缩的一致性等方面的变化。
（１）&& 换入低钙任氏液。
当心脏收缩显著减弱时，向插管内加入５％洋地黄溶液0.1&#ml（或0.1%毒毛花甙Ｇ溶液0.2ml）。
当作用明显时，再向插管内加入１％氯化钙溶液２～３滴。
［记录］　
剪贴或复制心脏的收缩曲线，图下注明加药、换药、心率、房室收缩的一致性、心室体积变化等方面的说明。
［讨论题］　　
在本实验中可以看到强心甙的哪几种药理作用？
实验3.7　利多卡因对家兔电致颤阈的影响
［目的］　学习用电刺激诱发心律失常的方法，以观察药物的抗心律失常作用。
［材料］　兔；刺激仪、示波器、手术剪、眼科剪、止血钳、持针钳、弯针、丝线、兔固定台、注射器、纱布、棉球；３％戊巴比妥钠溶液、0.8%盐酸利多卡因溶液
　　１、取体重３kg家兔，静脉注射戊巴比妥钠1ml／kg使其麻醉，背位固定。剪去胸颈部毛，切开颈部皮肤分离气管后，插入气管插管。沿胸骨正中线开胸，用拉钩拉开胸骨，暴露心脏，剪破心包膜，用正负两电极分别置于心尖和左心室（接近房室交界处）。休息１５min后进行实验。
　　２、对心脏施以波宽0.5ms，频率50HZ的电刺激，刺激电压在20s内从零边疆递增，直到出现心室颤动，此电压值即为致颤阈。休息5min后，重复一次。两次测得的值不得超过0.5Ｖ，否则需再测。以两次的阈值平均值作为正常室颤阈。
　　休息15min后，耳静脉注射盐酸利多因4mg/kg（0.8%溶液0.5ml／kg），在给药后的１、５、１0、２0、30min时再测电致颤阈。用药后的致颤阈减去用药前的值即得致颤阈的提高值。
　　３、给药后１h，再次耳静脉注射利多卡因8mg／kg（或10mg／kg，12mg／kg），按上法测定致颤阈的提高值。
盐酸利多卡因剂量（mg／kg）
阈值提高值（ ＳＤ）
［讨论题］　
利多卡因的作用机制是什么？对室性心律失常，哪些药物作用较好？
实验3.8　药物对离体家兔（或豚鼠）心脏冠脉流量的影响
［目的］　学习离体心脏冠脉灌流实验的方法，观察几种药物对兔（或豚鼠）心脏冠脉流量、心率和收缩力的影响。
［材料］　家兔１只；灌流瓶、恒压管、电热恒温水浴、蛇形玻管、心脏保温套客、主动脉插管、温度计、换能器、记录仪、供氧装置、手术器械１套、培养皿、漏斗、量筒、小烧杯、注射器、秒表；
10ug/ml盐酸肾上腺素溶液、0.1%维拉帕米溶液、0.1u/ml脑垂体后叶素溶液、１％亚硝酸钠溶液、任洛氏液。
1、调节恒温装置　在恒温水浴槽中加水，调节水温使之恒定在37℃。浴槽中蛇形管的下端与主动脉插管相通（在胶管处备一弹簧夹），上端与稳压管连接。稳压管的另一端则与盛有任洛氏液的灌注瓶连通。调节稳压管的高度，使管内液面高出主动脉根部50cm左右。在全部管道内充满任洛氏液，排出气泡，先用弹簧夹夹住。按40—60个气泡／min的速度通氧。
２、离体心脏制备　取家兔（或豚鼠）１只，用木棒击其后脑致死。剪开胸壁，暴露心脏，剪破心包，轻轻提起心脏，保护好心房，用弯剪剪断与心脏连接的血管，取出心脏。立即将心脏放入４℃的任洛氏液中，轻轻挤压心脏，排出余血。找出主动脉残端，套在主动脉插管上，结扎固定。打开弹簧夹，使任洛氏液由冠脉流经心肌而入右心房，从腔静脉、肺动脉的断端流出。用蛙心夹夹住心尖部，连接换能器与记录仪，记录心缩曲线。在心脏下置一漏斗，下接量筒，以测定冠脉流量。
３、冠脉流量的测定　使心脏适应约10min后，测量连续3min的每min流量。若数值相近，以其平均值作为给药前的正常流速。此后以5∽
10ml／min为宜。可根据心脏大小，适当调节灌流压而加以控制。
４、观察药物的作用　测定正常流量后，从心脏插管的侧支依次注入下述各药，测定注药后５∽１０min内的每分钟流量（根据药物作用维持时间的久暂而定），找出其极值，算出给药后流量的最大境减值。每给一种药物，需待其恢复至正常流量后，才可给予另一种药物。
（１）10ug／ml盐酸肾上腺素溶液0.2ml
（２）0.1%维拉帕米溶液0.2ml
（３）0.1u／ml脑垂体后叶素溶液0.3ml
（４）１％亚硝酸钠0.3ml
收缩力变化
冠　脉　流　量（ml）
冠脉流量增减百分率
给　药　后
流量增加30%以上时可认为有明显的扩张冠脉作用。
3.9　药物对家兔尿量的影响
[目的]了解急性利尿实验方法，观察高渗甘露醇注射液和呋塞米对不麻醉兔的利尿作用。
家兔1只；兔手术台、多道生物信号采集系统、烧杯、注射器；20%氨基甲酸乙酯、1%呋塞米（或2%依他尼酸）溶液、
0.1%肾上腺素、20%葡萄糖注射液（20%甘露醇注射液）、 生理盐水 、斑氏试剂
&1、麻醉与保定：用20%氨基甲酸乙酯（1g/kg）兔耳静脉注射。麻醉后仰卧保定于兔手术台。剪去腹中、下部的毛。
2、输尿管导尿法：在耻骨联合上缘，沿正中线作一长约5CM的切口，沿腹白线切开腹腔，将膀胱移出体外，暴露膀胱三角，仔细找出两侧输尿管，并将基与周围组织轻轻分离。用线将输尿管近膀胱端结扎，在结扎之上部剪一小口，把充满生理盐水的细塑料管向肾脏方向插入输尿管内，用线结扎固定，进行导尿，可看到尿液从细塑料管中慢慢的逐滴流出（注意：塑料管要插入输尿管管腔内，不要插入肌壁层麦收粘膜之间，插入方向应与输尿管的方向一致，勿使输尿管扭结，以免防碍尿液流出）。手术完毕后，用37℃左右的生理盐水纱布将腹部切口处覆盖，以保持腹腔的温度。将细塑料管连到记滴器，以记录尿液滴数。
3、观察项目：
（1）记录5分钟正常尿的滴数，并留取尿样。
（2）静脉快速注入生理盐水20ML，观察尿量变化，记录10分钟尿液滴数。
（3）静脉注射0.1%呋噻咪（速尿）2ml/kg，记录10分钟尿液滴数。
（4）静脉注射0.1%肾上腺素0.5ml，记录10分钟尿液滴数。
（5）静脉注射20%葡萄溶液10ml，记录10分钟尿液滴数。
（6）静脉注射0.6%酚红溶液0.5ml，用盛有10%NaOH溶液的培养皿接尿液，如尿中有酚红排出，遇NaOH即呈红色。记录从注入酚红起到排出酚红所需的时间。
4、尿糖定性试验：试管内加班氏试剂1ml再加尿液2滴，在酒精灯上加热煮沸。加热时应小心振荡试管，防止溶液煮沸时溢出管外。冷却后观察溶液的颜色，如颜色由绿转为黄色或砖红色，表示尿糖试验阳性。
1、实验前应给兔多食菜叶。
2、本实验需多次静脉注射，应注意保护兔耳静脉，静脉注射应从耳尖开始，逐渐移向耳根。
3、手术操作应轻柔，以避免造成操作性尿闭。实验过程中注意保持输尿管的畅通。
1、分析讨论上述各因素对尿量生成影响的机理。
2、静脉注射高渗葡萄糖后，尿量为什么会增多？为什么会出现糖尿？
3、呋噻咪的利尿原理是什么？临床应用如何？
3.10 药物的祛痰作用
[目的]& 学习用酚红（PSP）呼吸道排泌试验来筛试祛痰药的方法，观察药物的祛痰作用。
酚红给小白鼠腹腔注射后，可部分地由呼吸道粘膜排泌。有祛痰作用的药物在使气管分泌增加的同时，也使酚红的排泌量增加，因而可从供试品对气管内酚红排泌量的影响来观察药物的祛痰作用。酚红在碱性溶液中呈红色，可用比色法定量。
[材料]& 小鼠2只，体重25g左右；
离心机& 分光光度计（或光电比色计） 小鼠灌胃器&
手术剪& 镊子& 试管
桔梗（或远志）煎剂（取生药切片100g，加适量水煎25min，过滤，做成煎剂100ml）。
2.5%酚红溶液（准确称取酚红2.5g，用1mol/L氢氧化钠溶液2.5ml溶解，加生理盐水至100ml，摇匀即得）&
1mol/L氢氧化钠溶液&& 生理盐水
1、取25g左右的小鼠2只，雌雄均可，实验前停食（但不限饮水）12小时。给其中一只灌胃桔梗（或远志）煎剂0.25ml/10g，另一只灌胃等量生理盐水。
2、30min后每只小鼠腹腔注射酚红5mg/10g(2.5%溶液0.2ml/10g)。再隔40min将小鼠处死，剖开胸腔，分离气管。剪下自甲状软骨至下端分叉处的一段气管，放入盛有4ml生理盐水的试管中，振荡10min。取出试管内的气管，用离心法除去液体中的悬浮物。
3、取所得上清液3.5ml，加1mol/L氢氧化钠溶液0.1ml，显色后用分光光度计（或光电比色计）比色。在546nm处（或用绿色滤光板）读取吸收度，在标准曲线上查对相应的酚红浓度。标准曲线可以从测定0.5～10ug/ml酚红溶液得到的吸收度读数来绘制。
对照鼠气管洗出液的酚红浓度一般在1ug/ml以下。给药鼠的酚红浓度达到对照鼠数值的2倍时可以认为该药有效，超过3倍时为显效。
[注意事项]
解剖分离气管时应尽量避免损伤周围血管。如发生出血，应立即以滤纸吸净，以免将血液带入气管洗出液面而影响比色结果。
剪下气管后应立即将其投入盛有生理盐水的试管中，以防气管内分泌液的流失。
最好将全班的实验结果汇总，进行统计，以便更好地认识药物的作用。
试从本次实验结果讨论桔梗等恶心祛痰药的作用原理和应用。
3.11　药物对胃肠道蠕动的影响
[目的]& 测定卡红在胃肠道内的移动速度，观察药物对胃肠道蠕动功能的影响。
[材料]& 小鼠6只，性别不拘；注射器、小鼠灌胃器、粗剪、眼科镊子、短尺、
0.1%盐酸吗啡溶液、100ug/ml甲基硫酸新斯的明溶液、生理盐水、1%卡红（胭脂红）的生理盐水。
取停食12h的小鼠6只。其中2只用盐酸吗啡0.2mg/10g( 0.1%溶液0.2ml/10g)
灌胃，2只用甲基硫酸新斯的明20ug/100g(10ug/ml溶液0.2ml/10g)灌胃。15min后每只小鼠均用含1%卡红的生理盐水0.2ml灌胃。再过15min，将各鼠处死，剖开腹腔，取出胃肠道。剪开附着在肠管上的肠系膜，将肠管拉成直线。以幽门为起点，测量卡红色素在肠管内的移动距离和小肠（自幽门至回盲部）的全长，计算每只小鼠卡红的移动距离占小肠全长的百分率，比较3组动物结果之不同。
卡红移动距离占小肠全长的百分率=卡红的移动距离&100%/小肠全长
[注意事项]
1、& 卡红的灌胃量与将小鼠处死的时间必须准确，否则将造成结果误差。
2、& 取出肠道后，先用水浸湿，再平铺桌上，可免肠管与台面粘着。剪取肠道时应避
牵拉，否则将影响长度测量的准确性。
&& [报告要点]
药物及剂量
卡红移动距离（cm）
小肠全长（cm）
联系实验结果，讨论盐酸吗啡和甲基硫酸新斯的明对胃肠道的作用及其临床的意义。
3.12& 药物对实验性胃溃疡的防治作用
学习结扎大鼠的幽门以诱发胃溃疡的方法，观察几种药物对实验性胃溃疡的防治作用。
将大鼠胃的幽门结扎以后，胃液在胃内停滞，对胃壁产生消化作用，可以造成溃疡。此法于1945年由Shay氏等首先报道，以后被广泛用于抗溃疡药物的筛试。
[材料]& 大鼠6只，性别不拘，体重200～250g；铁丝鼠笼、 大鼠手术板、
手术刀、手术剪、 镊子、 外科缝针、 丝线、 粗棉线、 纱布、 大鼠灌胃器、 注射器； 2%碘酊、 75%酒精、 乙醚
、氢氧化铝凝胶（1%，按AL2OH3计算）、 2%雷尼替丁溶液、
1%甲醛溶液、& 生理盐水。
选用体重200～250g的大鼠6只，不拘性别，禁食（但可饮水）72h，然后进行手术。
手术时将动物固定于手术板上，剃去腹部的毛，用乙醚浅麻醉，用2%碘酊及75%酒精消毒皮肤。再自剑突下切开腹壁，用带扁平头的镊子将肝脏内侧的胃引出腹腔，寻找幽门和十二指肠的结合部，用在75%酒精中浸泡过的粗棉线在幽门和十二指肠的交接处作结扎，将胃放回原位，缝合腹壁，将大鼠放在笼内，不给任何食物与饮水，直至最后解剖。
将做完手术的大鼠分组，每组2只，分别给药。甲组大鼠灌胃氢氧化铝凝胶5ml/只。乙组大鼠皮下注射雷尼替丁5mg/100g(2%溶液0.25ml/100g)。丙组大鼠不给药。
于手术后18h，将全部大鼠处死。剪开腹壁缝线，取出胃，用抽有10～15ml生理盐水的注射器从幽门插入胃内，进行冲洗。向胃内注入1%甲醛溶液10ml，并将胃浸入1%甲醛溶液中固定。20min后沿大弯将胃剪开，用自来水冲洗后用放大镜检查胃壁粘膜，计数溃疡点的数目。注意三组大鼠结果的区别。
[注意事项]
手术前的绝对饥饿是造成溃疡的必要条件。应将大鼠关在架空的铁丝笼中，以防吃食粪粒与铺垫物。
结扎幽门时不得将胃十二指肠动脉扎死，以致妨碍胃部的血液循环。
用镊子翻动、夹取胃部时，动作要轻微，以免器官组织受损。
[报告要点]
鼠（编号）
胃粘膜所见
溃疡点数目
从本次实验所见，讨论胃溃疡的成因及氢氧化铝凝胶、雷尼替丁对溃
疡病的防治作用。
3.13 糖皮质激素的红细胞膜稳定作用
[目的]& 观察氢化可的松的稳定红细膜作用。
[材料]& 试管、 吸管 、 0.5%氢化可的松溶液 、 4%桔梗煎剂滤液、
2%红细胞的生理盐水悬液 、生理盐水
[方法]& 取试管3支，各加2%红细胞悬液3ml。第1管加生理盐水1
ml，第2管加生理盐水0.5ml，第3管加0.5%氢化可的松溶液0.5ml，摇匀。10min后，第2、3管各加4%桔梗液0.5ml，摇匀。此后每隔2～3min检查一次，注意三管中哪一管有溶血现象，并记录之。
[报告要点]
2%红细胞液
0.5%氢化可的松
试讨论糖皮质激素稳定红细胞膜作用的意义。
实验3.14　　应用管碟法测定抗菌药的抗菌浓度
［目的］观察常用抗菌药物的抗菌作用，以及初步了解其抗菌范围和细菌对药物敏感性测定的一般方法。
［材料］青霉素、链霉素、四环素、磺胺嘧啶钠；琼脂平皿、无菌吸管、小钢管（牛津杯）、镊子、滴管、游标卡尺等；金黄色葡萄球菌、大肠杆菌。
１、双碟的制备：
　　肉琼脂培养基底层，将灭菌肉琼脂培养基溶化后取15ml倒入灭菌平皿内。
　　肉琼脂培养基菌层，吸取大肠杆菌或金黄色葡萄球菌液１－15ml（经预试决定加入量）与100ml冷至45℃（最好用电热恒温水溶箱保温）的肉琼脂培养基混匀，然后分别每一平皿加入５ml，并均匀摊在具有底层培养基的平皿内。
　　２、待培养基凝固后，在每碟中均匀立放小钢管（即牛津杯４个），用纸板盖复盖。
　　３、将下列试验药液分别加入小钢管中（如下图），置３７℃培养１６－２４小时，测量抑菌圈大小，判定抗菌药物抑菌作用强弱。
１、青霉素溶液100u/ml&&
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&2、链霉素溶液200u/ml&
3、四环素溶液200u/ml&&&&
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
4、磺胺嘧啶钠200g/ml
菌　　　　种
抑菌圈直径（mm）
　　判　　定
金　黄　色
葡　萄　球　菌
磺胺嘧啶钠
大　肠　杆　菌
磺胺嘧啶钠
列出青霉素、链霉素、四环素、磺胺嘧啶钠的抗菌范围及其主适应症。
附：培养基及菌液的制备
１、肉汤培养基制法：
　　牛肉膏3.0、蛋白胨10.0、氯化钠5.0、蒸馏水1000。溶解后，调节pH在7.4－7.6，煮沸10分钟，冷却过滤，15磅压力灭菌15分钟备用。
２、肉琼脂培养基制法：
　　肉汤培养基100ml，琼脂1.8－2.2克，在肉汤培养基高压灭菌前，加入琼脂煮沸，再高压消毒，如果培养肺炎双球菌或链球菌，临用前须另加1％葡萄糖或10％灭活血清（即血清经56℃水溶30分钟）。
３、菌液制备：
常用的菌种有链球菌、肺炎双球菌、金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌等，前两种菌须用10％血清肉汤培养基接种，39℃培养16－18小时，然后1：10或1：100稀释后用，其余菌种给肉汤培养基接种，方法同前，培养后备用。
&实验3.15　应用试管法测定抗菌药的最小抑菌浓度
［目的］通过实验，掌握体外测定抗菌药物的ＭＩＣ的一般方法。
［材料］试管、吸管、试管架、洗耳球、容量瓶；　抗生素（如恩诺沙星）、肉汤培养液、菌液。
１、稀释药液（１０倍稀释法）：取原药１ml，用培养液稀释为１０ml；
　　对倍稀释法：取灭菌试管６支，在每支试管中各加入０.５ml的肉汤培养液，再往第１支试管中加稀释药液０.5ml，混匀，然后从第１管吸0.5ml到第２管，从第２管吸０.5ml到第３管，依次类推到第６管，再从第６管吸0.5ml抛弃，使每１管内的药液都为0.5ml。
２、加菌液：１至６号管各加０.5ml的菌液。
３、做对照管：
（１）绝对生长管：取１只试管加入0.5ml菌液、0.5ml培养液；
（２）绝对不生长管：取试管１只，加培养液0.5ml，药液0.5ml。
４、培养观察：将做好的各管包扎好，写好组名，放入３７℃的恒温培养箱内培养，２４小时后观察结果。
试验管以出现浑浊的前一管的浓度为最小抑菌浓度。如５号管开始出现浑浊，则４号管的浓度为该抗生素的最低抑菌浓度。
3.16& 药物的体内抗菌实验
了解细菌感染实验治疗方法的基本过程并观察青霉素的体内抗菌作用及ED50的测定。
[材料]& 小白鼠30只（18～22g）
注射器（1ml） 小试管& 试管架&
MH培养基& 金葡菌液&&
5%胃膜素悬液&
青霉素G钠&&
2.5%碘酊&& 70%乙醇&
5%石炭酸溶液
将保存的金葡菌接种于MH培养基中，于37℃培养16～18小时。用平皿表面计数法测定实验感染用的活菌数（如条件一致，则不必每次测定）。将上述菌液用生理盐水以10倍顺序稀释为10-1、10-2、10-3…等不同浓度菌液；再取此不同浓度的菌液1ml加5%胃膜素悬液9ml，即做成浓度为10-2、10-3、10-4…的菌悬液用。
将不同浓度的菌悬液分别腹腔注射于3～5只小鼠，每只0.5ml,观察其死亡情况。正式实验时选用最小致死量，即感染后引起小鼠80～100%死亡的菌液浓度进行感染。
肺炎球菌和链球菌的腹腔感染可不用胃膜素稀释，而是将在血清MH培养基中培养16～18小时的菌液腹腔注射0.2～0.5ml,观察24～48小时动物死亡情况。
取18～22g的小鼠30只，雌雄均可，雌者须无孕。按性别体重随机分为6组，每组5只。用预试中选定并适当稀释的菌悬液，每鼠腹腔注射0.1ml，以感染各组小鼠。第1～5组于感染的同时及感染后6小时肌内注射不同剂量青霉素，剂量分别为20万u，14万u，9.8万u，6.9万u，4.8万u/kg体重（亦可实验前根据细菌敏感情况调整用量）。连续观察2～3天，记录各组小鼠死亡情况。
[注意事项]
1、& 本实验须按微生物实验中处理感染动物之常规进行，严防菌液污染。
实验结束后，应将全部接种过菌液的动物不论死活进行焚化或丢入置有5%石炭酸溶液的缸内，用肥皂洗手后用碘酊及酒精擦手，以防传播疫病。
[报告要点]
&实验结果按下表填写并计算该药的半数有效量及95%可信限。并根据其半数致死量计算治疗指数。
治疗指数=LD50/ED50
剂量（mg/kg）
死亡动物数（只）%
ED50与95%可信限
1、& 抗菌药物的体内抗菌实验包括哪些基本步骤，应如何进行？
2、& 治疗指数有何意义？
3.17 硫酸链霉素的急性中毒及其解救
[目的]& 观察硫酸链霉素的急性中毒症状，了解其解救方法。
[材料]& 家兔2只
人工呼吸机& 橡皮导管&
剪刀& 注射器& 棉球
25%硫酸链霉素溶液& 10%葡萄糖酸钙溶液&
0.05%甲基硫酸新斯的明溶液
取家兔2只，编号，称体重，观察动物的呼吸情况，翻正反射及四肢肌肉张力。甲兔耳静脉注射硫酸链霉素0.4g/kg（25%溶液1.6ml/kg），观察其反应。当出现呼吸麻痹时，将与人工呼吸机的出气口相连的橡皮导管插入家兔的一侧鼻孔，连续给予人工呼吸，观察其能否恢复。
&乙兔耳静脉注射硫酸链霉素0.4g/kg（25%溶液1.6ml/kg），呼吸麻痹后同样通过鼻导管给予人工呼吸，并静脉注射葡萄糖酸钙250mg/kg(10%溶液2.5ml/kg)及甲基硫酸新斯的明0.15mg/kg(0.05%溶液0.3ml/kg)，观察其能否恢复。
[报告要点]
四肢肌张力
给链霉素后
给链霉素后
给葡萄糖酸钙及新斯的明后
链霉素的急性中毒主要表现在哪些方面？应如何解救？你能否从静注葡萄糖酸钙和新斯的明有解救作用来推论链霉素使骨骼肌麻痹的机制？
3.18& 磺胺药物的溶解性
［目的］　了解磺胺类药物的特性。
［材料］　１０ml刻度试管、试管架、滴管；
磺胺嘧啶、蒸馏水、１Ｎ氢氧化钠、１／４Ｎ盐酸、pH试纸、天平。
１、取ＳＤ粉0.2克，放入10ml试管中，加入蒸馏水5ml，剧烈振摇数分钟，观察能否溶解。
２、然后滴入１Ｎ氢氧化钠，随摇随滴，直到药物溶解为止，采用pH试纸测其pH值。
３、再慢慢滴加１／４Ｎ盐酸，随摇随滴，可见溶液变混浊，有羽状小片游悬于其中，此时再测其pH值。
４、最后再加入过量的１／４Ｎ盐酸，溶液能否变成澄清？此时pH值又为多少？
　氢氧化钠
　　盐　酸
　过量盐酸
解释本实验各阶段的结果，并讨论其临床意义。
3.19& 糖皮质激素对单核巨噬细胞吞噬功能的影响
（小鼠碳粒廓清法）
[目的]& 学习小鼠碳粒廓清法，观察可的松对单核巨噬细胞功能的影响。
一定大小的颗粒状异物（如印度墨汁等），静脉注射入血流后，迅速被单核吞噬细胞所清除，故恒定异物量时，其血流中消除速率可反映单核巨噬细胞的吞噬功能。血中碳粒浓度对数值与时间呈直线关系，该直线斜率K可表示吞噬速率（或称廓清指数）。因动物肝、脾重量可影响K值，故可换算为吞噬指数a。
[材料]& 小鼠2只（编号）
试管& 采血吸管&
注射器&& 小鼠固定器&
鼠笼& 天平& 剪刀
镊子& 分光光度计
1%醋酸可的松溶液& 生理盐水&
0.1%NaCO3溶液& 1：5稀释的印度墨汁
实验前4天，取体重18～22g
的小鼠2只，标记，称重。给甲鼠腹腔注射醋酸可的松100mg/kg(1%溶液0.1ml/10g)，乙鼠腹腔注射生理盐水0.1ml/10g，每日1次，连续3日。
实验当天（即末次给药后24小时），给每只鼠尾静脉注射1：5稀释的印度墨汁0.1ml/10g,并记时。注射印度墨汁后1min和5min用采血吸管（预先用肝素溶液湿润）分别从眶后静脉丛取血20ul，加入盛有0.1%
NaCO3溶液2ml的试管内，摇匀。在680nm波长下比色，记录吸收度（A）值。最后将小鼠颈椎脱臼处死，取肝、脾，用滤纸吸干后称重。
按下列公式计算廓清指数K值和吞噬指数a值：&&
式中A为血样吸收度值，t为采血时间，W为体重，Wls为肝脾合重。&&&&
[注意事项]
印度墨汁临用前用生理盐水稀释5倍，经超声处理后，3000rpm离心15min，弃去沉淀物后供用，以免凝聚的碳粒阻塞毛细血管，引起动物猝死。
经尾静脉注射的印度墨汁量必须准确。
采血时间也可于注射印度墨汁后2min和20min进行，但必须准确无误。
[报告要点]
鼠（编号）
剂量与途径
廓清指数（K）
吞噬指数（a）
综合各实验小组的结果，对两组小鼠的廓清指数和吞噬指数差异进行统计学处理。
糖皮质激素对免疫过程的哪些环节有作用？本实验结果说明什么问题？
3.20& 环磷酰胺对小鼠血清抗体形成的影响
[目的]& 学习血清中溶血素的分光光度测定法，观察环磷酰胺对血清溶血素形成的影响。
经绵羊红细胞（SRBC）免疫后的动物，其淋巴细胞可产生抗SRBC抗体溶血素，并释放至外周血。溶血素与SRBC一起体外温育，在补体的参与下，可以发生溶血反应。溶血产生的全部血红蛋白与Drabkin试剂反应，变成氰化血红蛋白，溶液呈稳定红色，可于540nm比色。由分光光度法测定溶血过程中释放的血红蛋白，可以检测出免疫动物血清溶血素的含量。
[材料]& 小鼠2只（编号）
试管& 试管架& 吸管&
长针& 注射器& 天平&
恒温水浴& 冰浴&
离心机&& 分光光度计&
0.1%环磷酰胺溶液&&
Alsever溶液[葡萄糖2.05g，氯化钠0.42g，柠檬酸钠0.80g，蒸馏水100ml，无菌过滤，（G5漏斗）或8磅10分钟灭菌后备用]
Drabkin试剂（碳酸氢钠1.0g，氰化钾0.05g，高铁氰化钾0.2g，蒸馏水1000ml）。&&&&&&&&&&
3:5(V/V)SRBC悬液（无菌条件下自健康成年绵羊外颈静脉取血，置于有玻璃珠的三角瓶中，摇动10分钟以除去纤维蛋白，加入2倍量的Alsever
溶液，混匀，置4℃冰箱备用，保荐期不超过2周，临用前用生理盐水洗涤3次，前两次1500rpm离心5min,弃去上清液，最后经2000rpm离心10min
得压积红细胞。按3:5（V/V）以生理盐水稀释即得所需SRBC悬液。）
补体（将新鲜豚鼠血清按10:1(V/V)加入压积SRBC中，于4℃放置30min，经常震荡，2000rpm离心10min，吸取上清液，用生理盐水1:10稀释即得。原血清可置—20℃以下备用。）
给药与免疫&
取体重20g左右的小鼠2只，标记，称重。甲鼠皮下注射环磷酰胺20mg/kg(0.1%溶液0.2ml/10g)，乙鼠皮下注射生理盐水0.2ml/10g。30min后，给每只鼠腹腔注射3:5(V/V)SRBC悬液0.2ml进行免疫。
制备血清样品&&
免疫4天后，摘除两鼠眼球，将血液分别滴集于两支小试管内，室温下放置１h，用长针将凝固的血块与管壁划开，使血清充分渗出。以2000rpm离心10min，取上层血清，用生理盐水稀释500倍。
取2支试管，分别加入已稀释好的两鼠血清样品各1ml，再逐支加入3:5SRBC悬液0.5ml，冰浴中冷却试管，向每管内加入补体1ml。将试管移至37℃恒温水浴中，保温10min，随即置入冰浴中以终止反应。以2000rpm离心10min，取上清液供比色测定用。
另取一支试管，加入生理盐水1ml代替血清样品，其它操作与上述相同。该试管作为空白对照管供比色测定用。
&（1）测定样品的吸收度值&&
分别取上述上清液1ml置入试管中，加入Drabkin试剂3ml，充分摇匀，放置10min后，于540nm波长下比色，记录吸收度值。
（2）测定SRBC半数溶血时的吸收度值&&
取3:5SRBC悬液0.25ml，加Drabkin试剂稀释至4ml，摇匀，放置10min，于540nm比色，即得本实验中所用SRBC半数溶血时的吸收度值。
按下式计算样品半数溶血值（HC50）：
汇集全实验室的结果，计算两组小鼠的平均HC50值，进行t检验以判断差异的显著性。
[注意事项]
1.溶血反应时，应严格控制试管在恒温水浴中的保温时间。
2.小鼠血清的稀释和吸取量必须准确。
3.制备补体时，豚鼠血清一定要经SRBC吸收，以消除非特异性溶血。
[报告要点]
剂量与途径
全实验室HC50
平均HC50差异的显著性
根据本次实验结果，初步分析环磷酰胺的作用原理。
3.21& 环磷酰胺对抗体分泌细胞的影响（溶血空斑试验）
[目的]& 利用玻片小室法学习液相单层溶血技术，并观察环磷酰胺对抗体分泌细胞的影响。
取出经绵羊红细胞（SRBC）免疫后的动物脾脏制成细胞悬液，与SRBC混合温育，在补体参与下，抗体分泌细胞释放的抗体（溶血素），溶解周围的SRBC，形成肉眼可见的溶血空斑。溶血空斑大体上能够反应抗体分泌细胞数，故溶血空斑试验可在体外检测单个抗体分泌细胞（即空斑形成细胞，PFC），从而定量观察药物对抗体分泌细胞的影响。
玻片小室法是将抗体分泌细胞，靶细胞和适量补体共同混悬于液体培养基中，加入平面小室，封闭形成一片单层细胞，37℃温育形成空斑。
[材料]& 小鼠2只（编号）
载玻片（76&26mm）
&盖玻片（24&4mm制作小室用）&
盖玻片（画有5&5格的22&22mm，空斑计数用）&&
平皿&& 吸管
尼龙网（100目）&&
镊子&& 血细胞计数板&
0.1%环磷酰胺溶液&&&
生理盐水&&
10%SRBC悬液（用生理盐水稀释压积红细胞而得，约2&109SRBC/ml）&
1%SRBC悬液（用Hank&s溶液配制而成）&&
补体（经SRBC吸收的豚鼠血清）&&
Tris-NH4CL溶液&&&
Hank&s溶液&& 台盼蓝（tryp an
blue）染液&& 石蜡
1．制作玻片小室&&
在载玻片的两端和中央各放一张盖玻片（24&4mm）,另将一张载玻片复盖其上，将两层载玻片用夹子夹住，然后用石蜡封固载玻片两端和一边，制作成一边开口的两个小室。
2．给药与免疫&& 取体重18～22
g小鼠2只，称记体重，以甲乙编号。甲鼠腹腔注射环磷酰胺10mg/kg（0.1%溶液0.1ml/10g）,乙鼠腹腔注射等容量生理盐水。每日1次，连续3日。首次给药后30min，给每只小鼠腹腔注射10%SRBC悬液0.2ml致敏。
3．制备脾细胞悬液&&
免疫4天后，依次将两鼠放血处死，剖腹，取脾，称重。在盛有冷的Hank&s溶液10ml的平皿内清洗脾脏，剔除脂肪和结缔组织。将脾脏移入另一盛有同样溶液的平皿内，剪碎脾脏，经100目尼龙网过滤至离心管中。以1000rpm离心5min，弃去上清液。向离心管内加入Tris-NH4CL溶液5ml以溶解红细胞，用滴管悬浮沉淀物，离心，弃去上清液。用Hank&s溶液洗涤3次。最后加入Hank&s溶液2ml悬浮脾细胞。
用台盼蓝拒染色法测定细胞活力，将脾细胞悬液和台盼蓝染液各取1滴，混合后滴加至血细胞计数板中，按白细胞计数法，显微镜下计数未染色的活细胞数和染色的死细胞数，细胞存活率应在90%以上。用Hank&s溶液将细胞浓度调整为1&107/ml。
4．填充小室&&
取2支小试管，分别取两鼠脾细胞悬液20ul，再依次加入1%SRBC悬液0.9ml和补体80&l，充分混匀。用滴管将2支试管内的混合液分别注入两个小室中，注满后用70℃熔化的石蜡将小室完全封闭。将玻片小室水平置于37℃恒温箱温育1h.
5．空斑计数&
温育结束后，在玻片小室上放置一张画有5&5格的22&22mm的盖玻片，用解剖镜（&44）逐格依次计数空斑。实验结果以每百万（1&106）脾细胞中含PFC数表示。
小室容积=盖玻片面积&小室高度=22&22&0.18(mm3)=0.087ml
& PFC/106脾细胞=小室中空斑数&
[注意事项]
制作小室的玻片应洁净无油。使用前将其在去污剂中煮沸1小时，或在铬酸清洁液中浸泡一夜，常水冲洗数次后再用蒸馏水冲洗。最后用无水乙醇浸泡，晾干。玻片小室也可用载玻片和双面胶条制作。
为保持细胞活力，制备脾细胞悬液时需将细胞置于冰浴中，用滴管悬浮细胞沉淀物时不能让气泡进入悬液。
3. 用台盼蓝染色后，必须在3分钟内计数细胞。
4. 避免小室内出现气泡，因气泡可导致液体流动而使小的空斑消失。
5. 空斑计数时间应严格限定在温育结束后1小时之内。否则因布朗运动和轻微的对流而使已形成的空斑模糊和消失。
6. 填充小室也可注入定量的反应混合物，用SRBC填补剩余空隙。
[报告要点]
剂量与途径
平均PFC数差异的显著性
综合全班实验结果，对两组小鼠的平均PFC数进行统计学处理。
本实验中为什么SRBC即是免疫原又是靶细胞和指示细胞？
结合本次实验结果，讨论环磷酰胺的作用与临床应用？
实验3.22&&&
高锰酸钾的解毒作用
［目的］　观察高锰酸钾对士的宁的解毒作用。
［材料］　小白鼠２只；注射器２支、钟罩２个、试管２支；0.1%高锰酸钾溶液、0.5%士的宁液、蒸馏水。
取0.1%高锰酸钾溶液0.4ml与0.5%士的宁液0.1ml于试管内混匀，放置３—５min，观察其颜色变化，然后将此液的0.2ml给一只小白鼠腹腔注射。另取蒸馏水0.4ml与0.5%士的宁溶液0.1ml混匀，以0.2ml的量给另一只小白鼠腹腔注射，观察二鼠试验结果有何不同？为什么？
注射药物名称及剂量
　　　　　　反　　应
实验3.23　　吸附药的吸附作用
［目的］　了解吸附药的吸附作用及其在毒物中毒时的解毒作用。
［材料］　小白鼠２只；试管４支、试管架、小漏斗、滤纸、大烧杯、粗天平、量杯、1ml注射器１支；0.05%美兰溶液、0.05%硝酸士的宁注射液、活性炭。
１、取0.05%美兰溶液５ml放入试管内，加入活性炭末0.5g，用姆指闭住管口，剧烈振摇５—６分钟后，用滤纸过滤，取其滤液尝其味，并与0.05%硝酸士的宁的味作比较。
２、取0.05%硝酸士的宁液５ml与活性炭１g置于试管内，用姆指闭住管口，剧烈振摇５—６分钟后，用滤纸过滤，取其滤液尝其味，并与0.05%硝酸士的宁的味比较。
３、取小白鼠２只，其中１只于腹腔注射滤过的0.05%硝酸士的宁液0.2ml/10g，另一只小白鼠腹腔注射未处理过的0.05%硝酸士的宁0.2ml/10g。将两只小白鼠分别置于钟罩内，观察其结果如何？
美兰活性炭滤液
　士的宁液
士的宁液＋活性炭滤液
　颜　　色
　小白鼠反应
用实验结果说明活性炭在临床治疗中的意义。
实验3.24　　敌百虫的急性中毒与解救
［目的］观察有机磷酸酯类中毒的主要症状，了解阿托品、碘磷定在有机磷中毒解救中的意义和解毒原理。
［材料］兔２只、５％敌百虫、0.5％硫酸阿托品注射液、４％碘磷定注射液
兔胃导管、注射器、烧杯、
　　１、取兔２只，称其重，先观察正常兔的唾液分泌，瞳孔大小，全身活动、四肢肌肉及排粪情况。
　　２、给两只兔灌服５％敌百虫溶液每公斤１０ml，记录服药的时间。
　　３、观察兔中毒的表现：唾液分泌增加、瞳孔缩小、全身肌肉颤动、四肢无力、排粪等。
　　４、待兔表现明显症状后，立即一只兔子按2ml/kg的剂量静注0.5%硫酸阿托品，观察哪些中毒症状消失，尚有何种症状存在，然后再静注４％碘磷定1ml/kg，观察兔子的临床表现有何变化？而另一只兔子反过来先注射碘磷定后再注射阿托品，观察临床表现有何不同？
注射阿托品后
注射碘磷定后
［讨论］用实验结果来说明阿托品和碘磷定解救有机磷酸酯中毒的作用和解毒原理，以临床表现上如何鉴别？
实验3.25　　亚硝酸盐的中毒与解救
［目的］观察亚硝酸中毒的临床表现及亚甲兰的解毒效果。了解中毒与解毒原理。
［材料］兔１只；１０％亚硝酸钠、１％亚甲兰注射液、兔胃导管、注射器、小烧杯。
　　１、取兔１只，称其体重，记录呼吸、体温，观察皮肤结膜及耳血管颜色。
　　２、按5ml/kg给兔灌服１０％亚硝酸钠溶液，记录并注意观察动物的呼吸、眼结膜及耳血管的颜色变化，并于出现发绀时检查体温。
３、出现典型的亚硝酸盐中毒症状后，立即用诊断试纸检查唾液、尿液变化，而后速用１％亚甲兰注射液按2ml/kg静脉注射，观察并记录解毒效果。
亚硝酸盐中毒的临床表现特点是什么？小剂量的亚甲兰为什么能解毒？
实验3.26& 注射液的溶血性实验
[目的]& 通过本实验认识溶血现象并掌握溶血性试验的基本操作。
[材料]& 供采血之动物（兔、羊、狗等均可）；
烧杯& 竹签（去纤维蛋白用）&
试管&& 试管架&
滴管& 吸管&&
离心机& 恒温水浴&&
生理盐水&&
供试品（适当的中草药注射剂，另取4%桔梗切片煎剂作为阳性对照）
取新鲜兔血（或羊血、狗血）10～20ml，用竹签搅拌以除去纤维蛋白，再用生理盐水冲洗竹签3～5次。每次加生理盐水5～10ml，混匀后用离心机离心，弃去上清液，再加入生理盐水，离心，直至上清液不呈红色为止。然后按所得红细胞的容积，用生理盐水配成2%的悬液。
取试管7支，编以号码，按下表加入各种溶液。第6管不加供试品，作为空白对照。第7管不加供试品并用蒸馏水代替生理盐水，作为完全溶血对照。轻轻摇匀后置37℃的水浴中保温1h后观察结果，作出判断。
供试品溶液（ml）
生理盐水（ml）
2%红细胞悬液（ml）
全溶血：溶液澄明，红色，管底无红细胞残留。
部分溶血：溶液澄明，红色或棕色，底部尚有少量红细胞残留。镜检红细胞稀少或变形。
不溶血：红细胞全部下沉，上层液体无色澄明。镜检红细胞不粘集。
凝集：虽不溶血，但出现红细胞凝集，经振摇后不能分散，或出现药物沉淀。
一般认为凡1小时后第3号管以及第3号以前的各管出现溶血、部分溶血或凝集反应抑制即不宜供静脉注射之用。
[报告要点]
供试品的名称、含量、理化性状、生产单位及批号、保温后各试管的结果以及试验结论。
1．& 什么叫溶血现象？与药物有关的哪些因素可以引起溶血现象？
2．& 如何进行溶血性试验？其结果如何判断？
药理学研究实验设计基本知识
药理学研究的目的是揭示药物有什么样的作用，为什么有这样的作用及有些什么毒副反应等。大至新药的创制，小至某项药效的验证，均应根据需要和可能，作出科学的选题。开题前的调研是必不可少的，包括文献资料的查阅、现状的考察、前人或外域资料借鉴等。经过开题报告和论证，对实验有明确的认识：实验的目的是什么？主要内容是什么？应该收集哪些数据？准备说明什么问题？以最经济的人力、物力和最短的时间完成任务为原则，周密地进行实验设计。为了达到预期目的，实验者必须本着实事求是的科学精神，在严肃的态度、严密的方法和严格的要求下进行实验研究。根据实验观察和记录，运用正确的统计分析，得出可靠的结论。
要想有效地完成一项药理实验研究，首先必须科学地设计该项实验。依靠合理的实验设计，可以收到事半功倍的效果。由于情况各有不同。一个良好的实验设计应根据实验要求灵活掌握，只有良好的实验设计、正确的实验操作、再配合合理的分析，才能达到理想的结果。因此，从整个研究过程来看，实验设计是中心环节，实验设计虽不能改变事物发展的本质，但一个正确无误的实验设计有助于反映事物发展的内在联系。
一、&&&&&&
药理实验设计的原则
药理实验的对象是生物体，因此它必须遵循自然科学研究中实验设计的三大原则——重复、随机、对照。
(一)重复（Replication）
由于生物个体差异或实验误差，仅根据一次实验或一个样本动物所得的结果，往往很难下结论。在适当的范围内重复次数愈多则愈可靠，所以药理实验的结果应当能够稳定地重复。同时在提高或具备足够的实验重复性时，需注意与实验有关的或发生干扰的因素，否则实验的重复性就成了空话。
样本数大小的选择&&&
样本数加大固然可以提高精密度，但人力、物力、时间的消耗也随之增加，不符合经济原则，样本数过小又难以得出正确结论。如何能在少量样本的情况下，获得可靠的结论，应在实验设计中加以考虑。
对所需样本大小的估计可根据下列因素考虑（1）药效方面：药效作用强则样本数可小，药效作用弱则要相应增加样本数。（2）生物差异：变异系数（CV）大则样本数应大；可信限要求小，则样本数需增加；P值要求小，样本必须加大。
一般情况下，小动物（小鼠、大鼠、鱼、蛙）每组10∽30例，计量资料两组对比时，每组应不少于10例，计数资料则每组不少于30例；中等动物（兔、豚鼠）每组8～12例，计量资料每组就不少于6例，计数资料每组不少于20例；大动物（犬、猫、猴）每组5～15例。
按统计学原理，我们可以得出如下结论：（1）两组样本数相同时，实验效率最高；（2）量反应比质反应指标效率高；（3）同体实验比分组实验效率高。
2. 干扰因素的控制
（1）动物方面& 品系、体重、年龄、性别、饲料及生活环境等。
（2）测定仪器方面& 精密度、灵敏度、操作水平等。
（3）药物方面&
批号、纯度、剂量、溶剂等。药物结构或药物主要有效成分含量明确与否，对实验能否重复至关重要，尤其是中药研究。对所研究对象的条件不能控制，就失去了进行研究的必要条件，这在中药研究中是常被忽略的一个重要问题。
（二）随机（Randomization）
药理实验的对象是生物样本，本身常有差异，因此，把各实验对象在机会完全均等的条件下，接受处理和分配，可消除人为因素或其它偏性误差的影响。
主要随机方法：
（1）完全随机化法：把实验动物完全随机地分配到各实验组中去。此法最简单也是最常用，但效率较差，一般用于单因素大样本实验。
（2）配对随机法：先将动物按性别、体重、窝别或其它因素加以配对，以基本相同的两个动物为一对配成若干对，然后将每对动物随机分配于两组中，使两组的动物数、体重、性别取得均衡，以减少组间的生物差异。
（3）区间随机法；这是配对随机法的扩大。将全部动物按性别、体重及其它条件等分成若干组。每组的动物数与拟划分的组数相等，各个动物的体质条件相似。再给每个区组中的每一只动物编号，利用随机数字表将它们分配到各组。
（4）拉丁方阵随机法：凡是纵行横行均无重复字母的方阵均称拉丁方。此法适用于多因素实验研究的设计。如观察某药不同剂量的效应，要求用四种剂量，不仅1、2、3、4号动物都各注射一次，而且每次注射时都必须有这四种剂量，以消除动物个体差异和用药顺序带来的影响。一般先将四个剂量编A、B、C、D四个号码，然后按4&4拉丁方阵排列（见表），每只动物纵列不受重复处置（如用量或其他条件），同一次横行也不受重复处置。如样本是5或6个，则可相应采用5&5，6&6方阵。各行各列之间还可以互换成多种变形。
表&& 4&4拉丁方阵
→&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
（5）正交设计：是用正交表用为因素分析的一种高效设计方法，在中药复方各组份对疗效影响的分析中较为方便而实用，例如某中药复方由甲、乙、丙、丁四种药组成。每药选用大、中、小3个剂量。欲分析各药对复方疗效的影响，可使用“L9（34）正交表”。L是正交表的符号，9表示作9次实验，34表示4种因素（甲、乙、丙、丁四味中药）各三个水平（大、中、小3个剂量）。按理有34=81种组合，即应进行81次实验，但用正交设计，作9次实验即解决问题。
（三）对照（Control）
在生物科学实验中，影响实验的因素很多。这些因素有的能控制，有的不能控制。为了解决这个问题，在实验中必须设定对照组，用对照组和实验组的比较来消除各种无关因素的影响。如用生理盐水代替药液同量给药者称“阴性对照组”，用已知疗效确切的典型药物代替者称“阳性对照组”。对照实验中就注意“同时同地同条件”，也就是要平行对照，否则失去对照意义。在同一个体身上观察给药前后某种指标的变化即为自身对照。此种对照可以减小个体差异的影响。在实验中设若干平行组，进行各组间的比较，也称组间对照，便于与已知药比较，并能检验实验条件是否能有效地反映供试品的药效。
二、&&&&&&&&
实验设计的要点
1、明确实验目的&&
也就是根据实验中要解决的中心问题，进行实验的项目设计，做到有的放矢。不要把与实验无关的内容或项目参入到实验中。
& 2、 决定实验方法及观察指标&
实验的观察指标往往和实验方法有联系。利用实体瘤筛试抗癌药，常以瘤重变化为指标。指标的选择首先要能反映被研究问题的本质，具唯一可靠性。其次指标必须能用客观方法，不仅定性而且能定量地加以测定，取得准确数据。
& 3、选择动物实验模型&
药理实验对象包括正常动物、麻醉动物及病理模型，即有整体动物，也有离体器官、组织和细胞等，主要根据实验目的、方法和指标的要求而定。例如小白鼠价廉而且来源广，可用于药效的初筛，LD50的测定等；大鼠用途与小鼠相仿，由于它消化系统中没有胆囊，便于作胆汁引流实验。对一种药物的研究就有一种啮齿类和一种非啮齿类哺乳动物，尽量使样本针对要求符合代表性的原则。
4、抽样与分组&
根据实验需要确定要分的组数，然后按随机原则进行分组，做到各组体重分布情况相似，性别各半。
5、预试验&
预试验是正式试验前的一个重要步骤，是对整个实验设计的预演，可以考察设计是否完善、合理、可行。通过预试验可以熟悉实验方法，探索剂量大小，修正试验样本的例数，检验实验的观察指标是否灵敏、可靠、客观等。
6、确定给药剂量
（1）给药剂量的换算：研究新药时往往缺乏参考资料可供查索。不同种动物间用药剂量应按一定方法加以换算。这部分内容将在本书附录五中加以讨论。
（2）用药剂量的选择：结合临床实际，在安全界限下药理作用才有意义。同时应观察药物的量效关系。分组测试至少2∽3个剂量。动物试验中的给药剂量一般为LD50的1/5&#，或治疗指数在3以上的药效才有实际意义。一般进行药效对比时选用中效剂量；进行协同试验时，试验剂量应偏低一点；进行解毒或拮抗实验，剂量应偏高一些。在探索药效的最适剂量时，应从小动物开始，在整体动物上按2倍或3.16倍递增，在离体器官上可按3倍或10倍递增。
（3）安全剂量的探索：当由大动物过渡到临床试验时，应特别注意安全问题。药物的安全剂量一般根据该药动物的最大耐受量或由该药与已知药的效价比值来估算，可以狗的最大耐受量的1/10作为人的初试剂量。
7、药药途径、药物剂型和观察时间的安排&&
给药途径对药物作用有很大影响，既要尽可能采用方便的途径、又要考虑药物的性质。一般要求两种以上的给药途径，既一种为口服，另一种为腹腔注射或静脉注射。药效或毒性实验都应如此。对某些因其溶解性和稳定性而影响剂型的药物：溶于水者制成水溶液供注射或口服；能溶于油者可制成乳状液，供肌内注射或腹腔注射或口服，水油都难溶者可制成混悬液供口服剂型等。有的药物一次给药作用不明显，需要多次给药（大多数抗菌药和抗癌药）。不同药物观察时间长短也不同，如急性毒性实验，一般观察7—10天，但抗癌药物中的抗代谢物，非观察2周不可。
8、拟订实验记录格式
实验记录一般应包括：
实验的名称。
实验样本的条件：动物的种类、品系、体重和性别等。
实验药物的情况：药物的来源