维生素C发酵工艺的研究--《天津大学》2003年硕士论文
维生素C发酵工艺的研究
【摘要】：本文系统地研究了华北制药维生素C发酵工艺这一课题。在对维生素C发酵工艺的历史及现状进行了大量文献查阅的基础上。首次研究了从一步发酵工艺的醪液质量对二步发酵的收率及周期影响,并确定了一步发酵工艺对二步发酵工艺影响因素。通过正交实验研究发现,在山梨醇浓度、无菌空气比、山梨糖灭菌方式、存放时间(h)四个因素中,以无菌空气比、存放时间(h)对二步发酵2-酮基-L-古龙酸的积累影响较大。对照实验发现,对每一批一步发酵大罐进行严格无菌空气比(1:0.6)最佳控制和一步发酵醪液低灭后存放时间(6小时)最佳控制,可以较原工艺流程的二步发酵2-酮基-L-古龙酸的积累普遍高1-2 mg /ml。
在保证一步发酵醪液质量水平稳定的基础上,对发酵主要影响因素进行逐一累加优化组合研究。
1 首先研究了培养基的有机氮源玉米浆的影响并找出了优化组合工艺配方,在二步发酵大罐的不同生长期,玉米浆加入比例要求不同。同时也研究了不同厂家玉米浆的影响。确定了主要玉米浆供应商。
2 在玉米浆优化组合研究成果的基础上,研究温度对二步发酵的影响,优化了目前的工艺温度参数. 温度在不同生长时间及时进行协调控制,有利于2-酮基-L-古龙酸的积累。
3 在优化了温度参数后,通过研究动态控制pH对各生长期二步发酵的影响,又进一步优化了大生产的工艺流程。研究表明,pH在不同生长时间及时进行动态调节控制,有利于2-酮基-L-古龙酸的积累及生产周期的缩短。
4 在以上因素都优化组合的前提下,对不同生长期空气比的动态变化研究,确定了混合菌培养过程中,根据实际单罐批的生长情况,优化控制空气比可以协调巨大芽孢杆菌﹑氧化葡萄糖酸杆菌之间关系,为2-酮基-L-古龙酸的积累创造良好的条件。
总之,在保证一步发酵醪液质量及二步发酵的体积误差在1%以内时,针对目前的单罐及时进行优化组合控制的前提下,完全可以使目前我公司的单罐产
2-酮基-L-古龙酸的积累达到领先水平84—86%。同时发酵周期也可以控制在最经济的36---40 h范围内。
在20M3中试罐对照研究,原来工艺平均转化率81.21%,发酵周期46.8小时;优化组合I工艺流程平均转化率83.81%,发酵周期38.2小时,优化组合I工艺平均转化率较对照提高2.6%,发酵周期缩短8小时。进一步应用均匀设计软件分析,优化组合了以上的研究成果,在100M3发酵罐中连续十批发酵转化水平提高到84%以上,发酵周期稳定达到了36-38小时。
【关键词】：
【学位授予单位】：天津大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2003【分类号】：TQ466【目录】：
1.1 维生素C的理化性质及意义8-12
1.1.1 维生素C的理化性质及功能8-11
1.1.2 维生素C商品市场现状11-12
1.2 维生素C生产的发展简史12-15
1.2.1 浓缩提取(Concentration and Isolation)13
1.2.2 化学合成(Chemical Synthesis)13-14
1.2.3 生物发酵(Biological Fermentation)14-15
1.3 生物合成维生素C重要前体--2-酮基-L-古龙酸的理论研究15-29
1.3.1 生物合成2-酮基-L-古龙酸的代谢途径15-25
1.3.2 “二步发酵法”的基础研究论述25-29
1.4 维生素C二步发酵法大生产工艺控制现状及本论文的研究思路29-36
1.4.1 维生素C二步发酵目前工业生产现状30-34
1.4.2 本课题的意义及研究内容34-36
第二章 维生素C一步发酵对二步发酵的影响36-50
2.1 我国二步发酵法现状工艺流程36-44
2.1.1 材料36-38
2.1.2 方法38-44
2.2 一步发酵醪液质量影响因素44-47
2.2.1 一步发酵醪液菌体量45-46
2.2.2 一步发酵醪液醇糖转化率99%以上后低灭工艺46
2.2.3 一步发酵醪液低灭后无菌静止存放时间46-47
2.3 一步发酵醪液质量影响因素对二步发酵2-酮基-L-古龙酸的积累影响47-49
2.4 结论49-50
第三章 维生素C二步发酵工艺优化组合的研究50-68
3.1 材料51-52
3.1.1 菌株51
3.1.2 培养基51
3.1.3 方法51
3.1.4 溶氧值的测定51
3.1.5 二氧化碳的测定51-52
3.1.6 细胞密度( O.D.)的测定52
3.2 二步发酵产酸量的影响因素52-66
3.2.1 二步发酵液不同生长期大小菌体细胞密度( O.D.)及产酸的检测52
3.2.2 二步发酵醪液培养基玉米浆氮源的影响52-55
3.2.3 二步发酵培养温度55-58
3.2.4 二步发酵培养pH的调节58-62
3.2.5 二步发酵培养空气比62-66
3.3 结论66-68
第四章 维生素C发酵工艺优化组合的应用68-73
4.1 材料68-69
4.1.1 菌株68
4.1.2 培养基68
4.1.3 方法68-69
4.1.4 溶氧值的测定69
4.1.5 二氧化碳的测定69
4.1.6 细胞密度( O.D.)的测定69
4.2 结果与分析69-71
4.2.1 中试(20M~2)69-70
4.2.2 生产扩大试验70-71
4.3 结论71-73
第五章 结论与展望73-74
参考文献74-80
发表论文和参加科研情况说明80-81
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导读：《发酵工程工艺原理》复习思考题，第一章复习思考题，2．典型的发酵过程由哪几个部分组成？发酵产物包含哪几类？，发酵过程组成：（1）菌种活化与扩大培养，（2）发酵与酿造原料前处理及培养基制备，（3）发酵与酿造操作方式，发酵产物：（1）菌体或菌体部分成分，第二章复习思考题，1．发酵工业用菌种应具备哪些特点？，（2）可在易于控制的培养条件下迅速生长和发酵，发酵周期短，以保证发酵生产和产品质量的稳定性，
《发酵工程工艺原理》复习思考题
第一章复习思考题
1．什么是初级代谢产物？什么是次级代谢产物？次级代谢产物主要有哪些种类？
初级代谢：指微生物的生长、分化和繁殖所必需的代谢活动而言的。初级代谢过程所生成的产物就是初级代谢产物。
次级代谢：是指非微生物生命活动所必须的代谢活动而言，也就是说这种代谢对微生物的生长、分化和繁殖关系不大，生理功能也不十分清楚，但可能对微生物的生存有一定价值。次级代谢过程所生成的产物就是次级代谢产物。通常在细胞生成的后期形成。
次级代谢产物有抗生素、生物碱、色素和毒素等。
2．典型的发酵过程由哪几个部分组成？发酵产物包含哪几类？
发酵过程组成：（1）菌种活化与扩大培养；（2）发酵与酿造原料前处理及培养基制备；（3）发酵与酿造操作方式；（4）产物分离、提取与后加工。
发酵产物：（1）菌体或菌体部分成分；（2）初级代谢产物如醇、酸、糖、蛋白质等；（3）次级代谢产物如抗生素、色素等
第二章复习思考题
1．发酵工业用菌种应具备哪些特点？
（1）能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，并能高产和稳产所需的代谢产物。
（2）可在易于控制的培养条件下迅速生长和发酵，且所需的酶活性高。
（3）生长速度和反应速度快，发酵周期短。
（4）副产物尽量少，便于提纯，以保证产品纯度。
（5）菌种不易变异退化，以保证发酵生产和产品质量的稳定性。
（6）对于用作食品添加剂的发酵产品以及进行食品发酵，其生产所用菌种必须符合食品卫生要求。
2．什么叫自然突变和诱发突变？诱变育种的实质是什么？
（1）自然状况下发生的突变称为自然突变或自发突变；
人为地用物力或化学因素诱发的突变叫诱发突变。
（2）用各种物理、化学的因素人工诱变基因突变进行的筛选。
3．突变分为哪两种类型，举例说明。
（1）点突变：碱基对Z换和移码；
（2）染色体畸变：在染色体上发生大的变化，如断裂、重复、缺失、易位和染色体数目变化等结构变化 。
4．何为转化、转导、DNA体外重组技术？举例说明在发酵工业中的应用。
转化育种：从供体细胞中取出遗传物质，通过对受体细胞的培养处理，使供体的DNA片段进入受体细胞内，与受体细胞的DNA重新组合而获得变种的一种育种方法。
转导育种：由噬菌体作为媒介，将一个细胞的遗传物质传递给另一个细胞，从而获得高产变种的一种育种方法。
DNA体外重组技术：根据需要用人工方法取得供体DNA上的基因，在体外重组于载体DNA上，再转移入受体细胞，使其复制、转录和翻译表达出供体原有的遗传性状。
5．什么是选择性培养基？它在菌种筛选中有何应用价值？举例说明。
选择性培养基是用来将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来的培养基。根据不同种类微生物的特殊营养需求或对某种化学物质的敏感性不同，在培养基中加入相应的特殊营养物质或化学物质，抑制不需要的微生物的生长，有利于所需微生物的生长，提高所需微生物的分离效率。
一种类型选择培养基是依据某些微生物的特殊营养需求设计的，也可以称为富集培养基。例如，利用以纤维素或石蜡油作为唯一碳源的选择培养基；利用以蛋白质作为唯一氮源的选择培养基；缺乏氮源的选择培养基等。
另一种类型选择培养基是在培养基中加入某种化学物质，这种化学物质没有营养作用，对所需分离的微生物无害，但可以抑制或杀死其他微生物。例如，在培养基中加入数滴10％酚可以抑制细菌和霉菌的生长，从而从混杂的微生物群体中分离出放线菌；在培养基中加入亚硫酸铋，可以抑制革兰氏阳性细菌和绝大多数革兰氏阴性细菌的生长，而革兰氏阴性的伤寒沙门氏菌可以在这种培养基上生长；在培养基中加入染料亮绿或结晶紫，可以抑制革兰氏阳性细菌的生长，从而达到分离革兰氏阴性细菌的目的。
现代基因克隆技术中也常用选择培养基，在筛选含有重组质粒的基因工程菌株过程中，利用质粒上具有的对某种（些）抗生素的抗性选择标记，在培养基中加入相应抗生素，就能比较方便地淘汰非重组菌株，以减少筛选目标菌株的工作量。
6．何为营养缺陷型？举例说明营养缺陷型的筛选方法。
（1）营养缺陷型：指某一菌株丧失了合成某种营养物质的能力，在培养基中若不外加这种营养成分就不能正常生长的变异菌株。表示为“X-”。
（2）营养缺陷型的检出（影印法）：是将经处理的细菌涂在完全培养基的表面，待出现菌落后，用灭菌丝绒将菌落影印接种到基本培养基上，经过培养出现菌落后比较两个培养皿，凡在完全培养基上出现菌落而在基本培养基上的同一位Z上不出现菌落者，这一菌落便可初步断定是一个缺陷型，然后将在完全培养基上的菌落接种至完全培养基斜面培养保存作进一步的鉴定。
7．如何筛选抗性突变株？
抗生素抗性突变：将菌种诱变处理，用含有某种药物的培养基挑选抗性突变体，野生的敏感菌不能在这种培养基上生长。用梯度平板法。
抗噬菌体菌株选育：诱变后用高浓度噬菌体平板筛选抗性菌株。
条件抗性突变：温度敏感突变。
8．设计一个从自然界中筛选高温淀粉酶产生菌的实验方案，并说明主要步骤。
欲从自然界中筛选高温淀粉酶产生菌，最好在温度较高的南方，或温泉，火山爆发及北方堆肥中采集样品。将采集来的样品经过预处理（如高温加热），减少杂菌量，然后进行富集培养，富集培养以淀粉为唯一碳源，这样形成的优势菌种即为以为能产生淀粉酶的一类菌株，然后采用平板筛选，通过初筛与复筛，最终获得性能优越的高温淀粉酶产生菌。
9．菌种保藏的目的与核心是什么？产孢子的微生物适宜用何种保藏方法？
（1）目的：保证菌种不发生遗传变异、无污染和保持活力。
核心：人工创造条件（如低温、干燥、缺氧、和缺乏营养物质），使菌种的代谢活动处于不活动状态。
（2）适宜用砂土保藏法。
附：菌种保藏方法：斜面低温保藏法、石蜡油封保藏法、砂土保藏法、冷冻干燥法、液氮超低温冻结法
1．酵母菌：一般采用定期移植斜面低温保藏法，将酵母接种于麦芽汁琼脂斜面上，放Z低温处，每隔几个月移植一次。也可采用石蜡油封藏法。
2．霉菌：采用砂土管保藏法。此法特别适宜于产孢子或芽孢的微生物。
3．细菌和放线菌：一般细菌采用冻干法为佳，放线菌可采用冻干法和砂土管法保藏。
10．造成菌种退化的原因是什么？生产中如何防止菌种的退化？
（1）菌种退化的原因：保藏方法不妥、保藏操作不当、传代不当、培养基不适、回复突变
（2）防止菌种退化的措施：
从菌种选育方法上考虑：（1）进行充分的后培养及分离纯化；（2）增加突变位点，减少基因回复突变的几率。
从菌种保藏方式上考虑：（1）尽量减少传代次数；（2）选择适宜的保藏培养基。
从菌种培养适宜条件上考虑 ：（1）结构类似物抗性菌株在保藏培养基中应添加相应药物及时淘汰回复突变细胞。（2）基因工程菌添加抗生素于培养基中防止质粒的丢失。
从菌种管理的措施上考虑 :复壮
（1）定期对保藏菌种分离纯化，淘汰已退化细胞；（2）定期对发酵液进行分离筛选。
11．何为菌种的复壮？
狭义的复壮是指在菌种已经发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定典型性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的相应措施。
广义上的复壮是指在菌种的典型性状或生产性状尚未衰退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性状测定工作，以期从中选择到自发的正突变个体。
12．培养基有哪些类型？各有何种用途？发酵工业上使用最广的是哪种类型？
（1）培养基的类型
状态：固体、半固体和液体培养基。
纯度：天然培养基、合成培养基和半合成培养基
生产工艺要求：孢子培养基、种子培养基和发酵培养基。
（2）各种培养基的用途：
固体培养基：常用于微生物分离、鉴定、计数和菌种保存等方面。
液体培养基：适于作生理等研究，由于发酵率高，操作方便，发酵工业也常大规模使用。 半固体培养基：用于鉴定菌种、观察菌种运动特征及噬菌体的效价测定等。
天然培养基：营养丰富，适合于微生物的生长繁殖和目的产物的合成。
合成培养基：适用于研究菌种基本代谢和过程的物种变化。
半合成培养基：这类培养基能更有效地满足微生物对营养物质的需要，在生产上应用较多。 斜面培养基：供菌种繁殖的一种常用的固体培养基。
种子培养基：菌体的扩增。
发酵培养基：供菌种生长、繁殖和合成产物用。
（3）使用最广的是：液体培养基。
13．如何确定培养基的组成？生产中液体培养基的制备有哪些步骤？
（1）通过单因子试验法、正交试验设计和均匀设计等试验方法来确定培养基的组成和配比。
（2）液体培养基的制备：原料预处理（淀粉糖的制备、 糖蜜的预处理）、原料混溶（缓冲物质、主要元素原料、微量元素、生长素）、调节pH和灭菌。
14． 淀粉糖的制备方法？哪种方法制备的淀粉糖质量好？
（1）制备方法：
优点：生产简易，设备简单，水解时间短，设备生产能力大。
缺点：设备需耐腐蚀，高温高压；副反应复杂。对原料要求高，颗粒不能大，浓度不能高，否则转化率低。
优点：反应条件较温和，不需耐高温、耐压、耐酸设备；酶作用专一性强，淀粉水解副反应少，糖液纯度高，淀粉转化率高；可在较高淀粉乳浓度下水解，可采用粗原料；糖液颜色浅，纯净，无苦味，质量高，有利于糖液的精制。
缺点：反应时间较长，要求的设备较多，需专门培养酶的条件，由于酶本身是蛋白质，易造成糖液过滤困难。
3、酸酶结合法
酸酶法：先用酸水解成糊精或低聚糖，再用糖化酶水解为葡萄糖。
酸液化速度快，且糖化是由酶来进行，对液化要求不高，可采用较高的淀粉乳浓度，提高生产效率。
酶酸法：先用淀粉酶液化到一定程度，然后用酸水解成葡萄糖。
能采用粗原料淀粉，淀粉浓度较酸法高，生产易控制，时间短，减少副反应，糖液颜色较浅。
（2）酸酶结合法制备的淀粉糖质量好。
15．糖蜜可直接用作发酵原料吗？为什么？
包含总结汇报、资格考试、旅游景点、党团工作、办公文档、考试资料、教程攻略、word文档以及(141228)发酵工程复习参考题及答案等内容。本文共5页
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