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【求助】TA克隆 板子上不长菌 急死了！！！
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这个帖子发布于4年零115天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
我最近一直在做TA克隆 准备去测序 我用的载体是pEASY-T1
加A的tag酶 进行的PCR 胶回收后做连接转化 可是做了快一个月了 怎么都不长菌
又一次长了培养了大概16个小时以后才长的菌 大小不一
我就挑了做菌落PCR竟然都是阳性 可是我斩了一下板子上的其他地方 没有菌的地方做为模版菌落PCR 也是阳性 我都无语了 是什么原因呀 恳请各位帮我一下吧……
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You should try to clone your PCR fragments (0.5-3 kb) in blunt-ending ligation.
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1.PCR产物放置时间久、冻融次数多，会使PCR产物末端的A脱落，就不能与T载体相连。请问你用来连接的PCR产物是不是最近做的PCR？怎么保存的？保存了多久？2.在PCR用来做检测或作菌落筛选的时候，应当用蒸馏水作为模板做一个空白对照，以防止体系中的引物、酶、buffer等被前一次的PCR产物污染，造成错误的阳性结果。3.感受态细胞是自己做的吗？有没有问题？是否找其他实验室帮个忙，问别人要一管最近几天做转化没有问题的感受态细胞？
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我是早上来了就PCR 完了就胶回收
回收产物放在4度冰箱 下午三点多就开始做连接转化
应该不存在放置时间太长的问题
我每次都是要做空白对照的 也能排除会有错误的阳性结果 感受态细胞是pEASY-T1里专门的感受态 昨天转进去一个质粒 今天早上还是什么都不长
我快崩溃了 到底是那个环节出问题了 是不是不能用T载体
要用T-blunt
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嗯，我也遇到了相同的问题，将LAtaq 扩的PCR产物胶回收后连至T-vector，转化至100ul感受态，涂板后要不不长，有一次好不容易长了约100个，结果挑了好几个做菌落PCR,都没有扩出来，对照也做了，没啥问题，这样就不知道问题出在哪了，有哪位前辈给点好的改进建议，不胜感激！！！
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1.PCR片段回收以后有没有作电泳看看是否有带，是不是回收出了问题？2.感受态细胞是自己做的还是购买的？T载体试剂盒里面有阳性对照的，楼主在做连接和转化的时候把阳性对照（T载体+control片段）、阴性对照（T载体自连）都做了吗？实验做不出来，就应当增加中间产物的检测，增加对照，这样才好分析。
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我做，基因片段3000bp左右，连接转化后总是不长菌，试了不同酶切位点，也试了同源重组，就是连接不上，求大神指导
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你的PCR产物量大么？是普通酶还是保真酶？普通酶用T-载体，如果保真酶你要用平末端的Blunt-载体&&PCR产物只需要一点，不要太多，太多的话你的菌长的很多 ，几个菌就足够了
基因编辑峰会支持人类胚胎研究(胚胎、基因细胞治疗：生物医药产业下一个风口(细胞治细胞STR鉴定 ——及时发现您的细胞是否被交生物秀论坛手机版全新改版,更快速度,更好体更新你的简历，加入生物秀人才库，高薪工作
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murongxiaoxiao大叔级摄影爱好者，喜欢分享绝对零度积极有责任心，热心公益事业yiii红米达人，爱拍照的北京女孩
逛了这许久，何不进去瞧瞧？查看: 3116|回复: 9
关于细菌总数平板不长菌的问题~~
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平板上面没有菌落。&&但是糖发酵管却有产气。&&为什么？
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补充下&&公司是做&&洗水用酶制剂的
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平板本身没过期吧/。。 样品处理均匀吗，我感觉原因在不均匀的问题上。
不过解释也是没问题的。。 就是平板不长菌 是 哪个稀释度？
&&-1的话， 结果是小于10 ， 但是不代表没有，食品检测微生物， 菌落总数一般都不会有0这样的绝对结果出现。&&
&&就是为了防止你这样情况发生，无法解释
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& &&&平板本身是没有问题的，是3天前配的，做好之后还放在室内做了下空气沉降是有菌落的。
一般我用之前都是从冰箱里面拿出来。&&然后 放在超净台吹风照紫外30分钟后才做的，&&我们公司去年是用自己做的原酶复配 总是有很多菌。 今年外购了原酶复配的 就是 一般都是菌落在营养琼脂上看不到，&&但是做糖发酵管的话就是有产气，&&如果时间久了 打开存放产品的桶盖会有气喷出来。
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fengchao123456
& && &这个稀释度问题。 以我个人的经验来看 是没什么问题的，
我们我们公司的产品都是加了防腐剂的&&会不会这个影响。
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& &&&斑竹。&&这事 最近都发生了 好多次了& &
& & 如果是刚生产出来的话， 平板跟 糖发酵管的情况是相对应的， 若是过了一周之后&&就 没有菌落但是&&却有 产气。&&操作问题可以排除，& &实验用品也是经过多次测试没有问题的。& &可纠结了。。。
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哦。 明白了。。 你所选用的稀释度 ，&&防腐剂的抑制作用还比较明显。
同一个稀释度& &在做菌落时候， 1mL样液 加15毫升的琼脂， 然后很快的凝固了。&&防腐剂成分就固定在了 加进去的样品液周围， 对其有抑制作用
& && && && && &
& && && && && &做乳糖发酵时候， 由于是液体培养基。&&防腐剂成分与之充分溶解。&&最后 防腐剂的浓度 下降了10倍， 抑制作用 明显的 减弱，&&细菌开始生长繁殖。。
& &综上所述，&&应该是防腐剂的原因。& &
& &建议： 下次能否选择更多的稀释倍数， 在目前选择的稀释倍数基础上， 再进行2次稀释&&分别做菌落
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& &&&谢谢斑竹。 我追加一个问题，& &
&&如果成品出来放置一个月后重新检测 ，& &平板上还是没有菌落。 但是发酵管却有产气，
问题现在就是，&&它已经加了防腐剂， 可是 成品包装桶却已然鼓了， 但是检测只能检测出产气
&&但是就是没有菌落。
除非 已经很明显是不良品才能检测出菌落。
是不是这个防腐剂只针对一些细菌， 但是对于产气的却没有抑制作用？
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我建议你门做一下 防腐剂 效果测试。&&看看具体是浓度不够， 还是防腐剂品种不对。
另外&&成品涨桶是个别 还是大多数
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本帖最后由 fengchao123456 于
10:28 编辑
& & 谢谢斑竹
稀释的话 是3个倍数&&10&&100&&1000&&】
加样用的是100微升和1毫升的移液器枪头都是用一次性的。
一般来说 平常不会出现这种问题的
&&每一个批次如果涨桶大概在75%左右，。。&&就批次来说，只是个别。
每年的这个季节&&都比较麻烦& & 呵呵， 由于配方上的问题 ， 有些事情不好问， 所以只能从自己这里找找问题& &&&唉。 要， 求结果，&&又不给配方我分析，&&实在是。。
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&&查看话题
转化后涂平板不长菌
问题：目的片段连接PE2载体后转BL-21感受态细胞后涂板不长菌
本人操作过程：
连接体系:线性化克隆载体：0.5微升
& && && && && && && && & 目的片段（bp）: 1.5微升
& && && && & Enzyme&&Premix: 5微升
& && && && && && && && &&&纯水& && &：3微升
体系配成后，轻轻混匀各组分，至于50度（pcr仪定温）反应15分钟，至于冰上冷却5分钟，存于负20度冰箱
转化:负70度取100微升BL-21感受态细胞至于冰上解冻2分钟，加入连接反应冷却液，轻轻混匀，至于冰上30分钟，42度热激1分30秒，冰水浴2分钟，加入600微升LB培养基，37摄氏度孵育10分钟充分复苏，37度200转每分钟摇45分钟，6000转离心8分钟，（超净工作台）留100微升培养液吸吹混匀涂板，37度培养箱过夜。
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【求助】我平板技术法不长菌
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各位大侠,我平板菌落计数法的时候不长菌,是怎么回事?我倒平板时是培养基不烫手的时候才倒的,培养基也调过pH值,但是就是不长菌,后来倾注进去0.5ml自来水也不长菌,不知道为什么?我用的培养基是肉膏蛋白胨培养基.
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Lecanii edited on
有没有试过用涂布法接种培养试试看????
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偶尔也会遇到这种情况，有以下几方面值得考虑：1.培养基：有时有忙中出乱的时候，多加少添类的；pH调节过头；灭菌时间过长等2.稀释倍数：过高3.推棒涂抹时推棒灼热，将菌体扼杀4.菌种本身的问题：生命活力减退可以再试试，同时做组斜面对照。
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开始我是用涂布的,但是菌落分的不是很开,后来就用倾注法了.用倾注法的第一天效果很好,但是第二天开始到现在菌长的很少了,或者干脆不长.我是测泡菜腌制过程中菌总数变化的,怎么说乳酸菌也会长出一点啊,为什么连加了新鲜自来水的板都不生长呢?配培养基用自来水没关系的吧,是不是一定要蒸馏水?
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我觉得可能是你取的液体的问题，泡菜腌制的液体可能含菌的数量很少，再稀释菌的数量会更少。（配培养基用自来水可以但是要测好Ph值）
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根据你的说法我的那些怀疑都是要被一一否定的。我对泡菜的制作工艺并不是很了解，我想问泡菜腌制过程对于厌氧条件严不严格？如果严格的话，可能在你取样的时候破坏了它良好的厌氧生长环境，这就可以解释你在第一天测定时菌体生长良好而在其后生长越来越少的现象。同时可以通过闻泡菜的气味可以得知泡菜腌制好坏的吧？一点浅见！！！
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哦忘记说了,我是取泡菜到生理盐水,然后计数的.难道是稀释度太大了?我另外吸取了0.5ml自来水倾注法倒平板,结果也没长菌,这样的情况应该会长菌的吧?腌制过程是厌氧的,所以我取样时充氮气保护.泡菜味道倒是很香的,所以我想里面肯定有很多乳酸菌.但是在MRS培养基里面培养了70h后仍然没长菌,晕啊!
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有没有使用标准菌株作对照？另外，配制好的平板最好做质控，如果没有质控，你怎么知道所使用的平版是否符合要求。假如质控合格，按照操作要求做出来的结果应该是对的并且有可比性。
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谢谢!请问质控是怎么做的?我是怀疑培养基配制有问题,但是我仔细看了,使用的药品都没弄错,灭菌20min, pH也调到7.0左右的.是不是琼脂有问题?我用的是福建泉州市泉港化工厂生产的琼脂条.我没有用标准菌株作对照,我用倾注法在平板上加了0.5ml自来水,再倒入50℃(水浴锅控制温度)培养基,摇匀,37℃培养.但是到现在已经培养了30h了,还没长出一个菌.
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一个建议：重新配制培养基，不要怕麻烦！不要灭菌太长时间！
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我一直没弄懂楼主你说“倾注进去0.5ml自来水”、“加了新鲜自来水的板”、“用倾注法在平板上加了0.5ml自来水”这样做的意义，呵呵。检测每批次培养基是否合格，可以同时做阳性对照，菌种用自己保存的斜面，这样应该能排除是否是由于培养基不合格所引起的阴性结果。（应该来说没有每批都这样做的必要，不过为了排除这种可能，此次实验还是务必这么做的！）另外，倾注法倾注时培养基的温度可控在48℃。
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抗生素浓度高了
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plwei 谢谢!请问质控是怎么做的?我是怀疑培养基配制有问题,但是我仔细看了,使用的药品都没弄错,灭菌20min, pH也调到7.0左右的.是不是琼脂有问题?我用的是福建泉州市泉港化工厂生产的琼脂条.我没有用标准菌株作对照,我用倾注法在平板上加了0.5ml自来水,再倒入50℃(水浴锅控制温度)培养基,摇匀,37℃培养.但是到现在已经培养了30h了,还没长出一个菌.你使用的是MRS培养基，对吧？找两种质控菌株：Lactobacillus gasseri ATCC 19992 和 Staphylococcus aureus ATCC 25923，把上述两种菌分别接种到做好的MRS培养基，乳酸杆菌应该生长而金葡菌不长，那么表示这个培养基符合要求。
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谢谢各位的慷慨建议 !今天MRS培养基上长出来了!但是牛肉膏上长的菌很少,可能杂菌真的是很少.
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谢谢各位的慷慨建议 !今天MRS培养基上长出来了!但是肉膏蛋白胨培养基上长的菌仍然很少,可能杂菌真的是很少.
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