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Foxp3调节性T细胞
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|个人分类:|系统分类:|关键词:FlowJo, T 调节细胞，Treg 流式数据分析
FlowJo分析调节性T细胞
作者：胡金涛&
调节性T细胞（Treg）是抑制性T细胞内的一种功能亚群。Treg细胞是一群表达特征为CD4+CD25+Foxp3+的T淋巴细胞。Treg细胞来源于胸腺，占外周血CD4+T细胞的2%-10%。根据Treg的来源不同可以分为自然调节性T细胞（nTreg）和诱导产生的适应性调节T细胞（a Treg）两类。Treg细胞可以抑制T细胞增殖和分泌细胞因子，在防止发生自身免疫、控制肿瘤免疫和移植耐受方面发挥重要作用。Treg细胞缺陷或功能受损会引发很多自身免疫病，而Treg细胞增多则会抑制机体对病原体的免疫应答反应，因此，Treg细胞是一群重要的免疫调节细胞，在调节机体免疫应答中起着不可或缺的作用。
一、Treg细胞
Treg细胞(图一)
FSC,Y轴选择SSC。分析的细胞选择上图所示的淋巴细胞群进行分析。
FITC-CD4, Y轴选择SSC,圈出CD4+的细胞。如（图二）所示：
CD4+的细胞群，
PE-CD25, Y轴选择APC-Foxp3
设门。如（图三）所示。
二、Treg细胞
1.Treg细胞一般采用三标记染色法。本实验中荧光抗体搭配如下：(CD4-FITC/CD25-PE/
Foxp3-APC)。Treg细胞来源于CD4+的细胞，分析时首先要圈出CD4+的细胞，在CD4+的细胞中分析双阳性细胞（CD25+ Foxp3+），从而实现分析Treg细胞CD4+CD25+Foxp3+）。
2.Treg细胞(CD4+CD25+Foxp3+)，检测的结果：8.62%。可以根据检测结果判断Treg细胞在调节机体免疫应答中的作用。
三、Treg细胞
1.在细胞周期分析窗口工具栏中选择“文件”并单击，选择下拉菜单中的“另存为”，选择保存位置、重新命名文件名以及文件保存的文件类型（SVG、PNG、EMF、JPG）。
2.把上述样品的分析应用到组中，在Flow Jo软件界面中单击打开布局编辑器，在工作台的样品空间把“淋巴细胞结点和CD4+细胞结点”拖入布局编辑器中，单击布局编辑器右上角的Batch工具。输出整个实验组的数据。
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调节性T细胞
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调节性Ｔ细胞(ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌ ｓ,Ｔｒｅｇ)是具有调节功能的成熟Ｔ细胞亚群(Ａｋｉｒａ等.2002),最初在自身免疫性疾病及肿瘤治疗的免疫学研究中被发现(Ｓｈｅｖａｃｈ等.2000),因其具有抑制免疫反应的作用,一直被称作抑制性Ｔ细胞(Ｔｓ)。但随着细胞及分子生物学的飞速发展,Ｔｒｅｇ分子作用机制逐渐被阐明,其调节功能在机体免疫稳态维持、移植耐受、肿瘤免疫、过敏反应及微生物感染等方面均得到了证实。
调节性T细胞是近年发现的一种具有免疫抑制活性的CD4' T细胞亚群，它们可以在胸腺中被选择分化，也可以在外周淋巴组织内由转化生长因子书等细胞因子诱导分化。本文就调节性T细胞分化过程的关键信号通路及影响因素进行综述。调控调节性T细胞的分化过程能够影响其在体内的数口，可通过对其数量的干预，为自身免疫性疾病、免疫监视、排斥反应及变态反应等相关疾病提供可能的治疗靶点。
调节性T细胞(Tr)在体内外具有调节功能,根据其表面标记、产生的细胞因子和作用机制的不同,Tr可分为CD4+CD25+Tr细胞、Tr1和Th3等多种亚型。
CD4+CD25+Tr　
目前研究得较为清楚的亚型为CD4+CD25+Tr。研究表明,在正常人和小鼠的外周血及脾脏组织的CD4+T细胞中约有5%～10%的细胞持续表达CD25分子(IL-2受者α链),同时这一亚群是CD45RB分子低表达的。CD4+CD25+Tr具有免疫无能性和免疫抑制性两大功能特性。其免疫无能性表现在对高浓度IL-2的单独刺激,固相包被或可溶性抗CD3单抗,以及抗CD3单抗、抗CD28单抗的联合作用呈无应答状态,也不分泌IL-2。当经TCR介导信号刺激并有高浓度外源IL-2存在的情况下,CD4+CD25+Tr可活化并增殖,但其增殖程度较CD4+CD25-T细胞弱很多。CD4+CD25+Tr的免疫抑制性表现在经TCR介导的信号刺激活化以后能够抑制CD4+和CD8+T细胞的活化和增殖。
Tr1是另一类亚型的CD4+Tr。在IL-10存在的情况下,可通过异源抗原活化的人类T细胞经克隆产生,IFN-α可增强IL-10诱导产生Tr1的能力。另外,抗原与CD2共刺激可通过IL-10非依赖途径诱导产生抗原特异性Tr,产生大量IL-10,并具有调节功能。最近Kemper等研究发现,在IL-2存在的情况下,人CD4+T细胞与CD3和补体调节剂CD46结合诱导生成Tr1特异性细胞因子表型的T细胞。这种细胞增殖能力强,并具有旁观者抑制效应和免疫记忆力。Tr1与Th1和Th2之间的区别在于Tr1可产生高水平的IL-10,中等量的TGF-β、IFN-γ和IL-5,少量的IL-2,不产生IL-4。刺激TCR不能使Tr1有效增殖,有研究显示IL-15对于刺激Tr1在体外增殖至关重要。Tr1抑制免疫反应的主要机制依赖于产生具有免疫调节功能的细胞因子如IL-10和TGF-β。
Th3型CD4+Tr是在研究口服耐受机制的过程中发现的,Th3主要分泌TGF-β,对Th1和Th2都具有抑制作用。Th3可从IL-4缺陷小鼠产生,显示Th3是与Th2不同的一种独特类型。TGF-β、IL-4、IL-10可促进TCR转基因小鼠Th前体分化为Th3。低剂量抗原口服诱导产生Th3,同时口服IL-4可促进Th3的产生。由不成熟树突状细胞(DC)在体外诱导产生的CD4+Tr和体内诱导产生的CD8+Tr与Tr1具有相同的特性,即都产生高水平的IL-10,但不产生IL-4或IL-2。然而,与Tr1比较,不成熟DC诱导产生的CD4+Tr在体外的抑制活性不依赖于IL-10。并且,由不成熟DC在体外诱导产生的CD4+Tr通过抗原非依赖机制直接抑制成熟Th1的增殖反应,该过程需要细胞与细胞之间的接触,并可被外源性的IL-2所抑制。因此,从功能上讲,这些Tr更类似于上述的CD4+CD25+Tr。目前还不清楚CD4+CD25+Tr与Tr1之间的关系,有人认为它们可能是处于不同分化阶段的同一Tr亚型,CD4+CD25+Tr可能来源于胸腺部分分化的T细胞,并在外周遇到抗原时最终分化为产生IL-10和TGF-β的Tr1。但较多倾向认为CD4+CD25+Tr与Tr1是两种不同的细胞亚型,有研究观察到小鼠CD4+CD25+Tr属于CD45RBlow群体,而Tr1在体外由CD45RA+初始细胞分化而来。
Treg细胞有两种分化方式。一是胸腺分化，指的是在胸腺细胞成熟的过程中，一部分CD4单阳性的自身反应性细胞因表达foxp3而通过阴性选择，成为Treg细胞。这种Treg细胞被称为自然发生的Treg细胞(natural regulatory T cell,
nTreg) 。Treg细胞的另一种分化方式是外周分化，指的是一部分幼稚型T细胞在接受抗原肤刺激的过程中，由于受到大量TGF-(3的作用而诱导出foxp3的表达，成为Treg细胞。这种Treg细胞被称为诱导性。。的Treg细胞(induced regulatory T cell,
iTreg)。Treg细胞分化过程完成的标志就是foxp3在CD4+ T细胞的稳定表达。所以，影响Treg细胞分化的因素归根结底是影响了户Foxp 3的表达。许多影响Treg细胞分化的因素对前述这两种分化方式有相同或不同的作用效果，本文就可能参与Treg细胞分化过程的调控因素进行综述。
ＣＤ4+ＣＤ25+调节性Ｔ细胞具有以下特点:①自身免疫防御作用;②自然条件下是处于无能(Ａｎｅｒｇｙ)状态;③抑制其他ＣＤ4+Ｔ细胞和ＣＤ8+Ｔ细胞的生物活性;④抑制活性是抗原非特异性的;⑤抑制方法可能通过细胞与细胞间直接接触,或经分泌抑制性细胞因子发挥免疫抑制效应;⑥抑制作用与细胞表面ＣＴＬＡ-4和糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子家族相关基因(Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ-ｉｎｄｕｃｅｄｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒｆａｍｉｌｙ-ｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅＧＩＴＲ)的表达密切相关。
活化的CD4+CD25+Tr主要通过接触抑制的方式抑制T细胞的活化和增殖。另外,CD4+CD25+Tr还可分泌细胞因子IL-10和TGF-β抑制免疫反应。CD4+CD25+Tr接触抑制的机制在于该细胞表达CTLA-4,CTLA-4跨膜分子胞内段携带免疫受者酪氨酸抑制基序(ITIM),与B7配接后传递抑制信号,抑制T细胞的增殖和活化,用抗CTLA-4单抗可阻断CD4+CD25+Tr的抑制作用。前已提及,Tr1发挥免疫调节作用主要是通过分泌IL-10和TGF-β来实现的,IL-10和TGF-β都是具有免疫抑制作用的细胞因子,二者抑制效应广泛。
IL-10可通过直接和间接机制明显降低抗原特异性T细胞增殖。IL-10对T细胞的直接作用包括抑制IL-2的产生以及延长细胞增殖周期。间接机制包括下调MHC II类分子的表达、下调单核细胞CD80和CD86的表达以及T细胞共同刺激分子CD28的配体。并且,通过抑制APC,IL-10有效抑制IL-12的产生,而IL-12是Th1细胞分化的关键因子。IL-10还可阻止T细胞受体介导的CD4+T细胞活化。以IL-10处理T细胞导致持久的抗原特异性T细胞无反应,以抗CD3和CD28抗体重新刺激细胞不能逆转IL-10诱导的T细胞无能,加入外源性的IL-2也不能逆转IL-10诱导的T细胞无能。除了主动抑制T细胞增殖,在特定条件下,IL-10可诱导Tr1的分化,人和小鼠CD4+T细胞在IL-10存在时经慢性活化可产生Tr1,增强Tr1的抑制作用。IL-10对其他炎症细胞也具有较强的抑制作用,可抑制单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞及嗜酸粒细胞产生前炎症因子和趋化因子,并可抑制单核细胞产生IL-10,提高IL-1α和IL-1β的自然拮抗剂IL-1RA的产生。IL-10还可抑制APC HLA-DR及多种共同刺激分子如CD54、CD80和CD86的表达。IL-10还可通过抑制嗜酸粒细胞表达CD40发挥抗过敏效应,导致嗜酸粒细胞加速凋亡在体内,IL-10表现出较强的免疫抑制和抗炎效应,在内毒素血症、自身免疫性甲状腺炎以及过敏原诱导的气道炎症小鼠模型中,IL-10都表现出保护作用。
TGF-β从三个方面对免疫功能起抑制作用:一是抑制免疫效应细胞的增殖;二是抑制免疫效应细胞的分化和活性;三是抑制细胞因子的产生及其免疫调节作用。将TGF-β加入到非纯化人T淋巴细胞培养基抑制IL-2依赖性ConA诱导的增殖,同时T细胞表达的IL-2Rα和CD71下降。TGF-β可使葡萄球菌毒素刺激的鼠CD8+T细胞毒性减低90%。混合淋巴细胞反应开始加入TGF-β可抑制细胞溶解效应细胞的产生,加入IFN-α可逆转该效应。TGF-β抑制新鲜分离的T细胞IL-4及IFN-γ的产生。
作为人体自身免疫的重要防线，Treg细胞在维持机体免疫耐受方而有着不可忽视的作
用。一方而，Treg细胞的缺失会导致X连锁多内分泌腺病肠病伴免疫失调综合征(the immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked syndrome IPEX)的发生。这是一种严重的多发性自身免疫疾病，导致幼年发病的肠道和多个内分泌腺的炎症。另一方而，在多种自身免疫性疾病和炎症性疾病的患者和动物模型中，均发现有Treg细胞数目的减少或功能的减弱，包括多发性硬化症、系统性红斑狼疮、I型糖尿病、类风湿关节炎、炎症性肠病、牛皮癣和动脉粥样硬化等。这些研究成果都提示我们，对Treg细胞的数目和功能的干预，可能是治疗多种自身免疫性疾病和炎症性疾病的针对性靶点。
调节性T细胞的应用前景
Tr所具有的免疫抑制特性使得其在自身免疫性疾病的调节中具有广泛的应用前景,目有许多研究显示调节性T细胞在Th1或Th2介导的疾病中具有良好效果。
炎症性肠病　
在炎症性肠病(IBD)小鼠模型,同时输入Tr1细胞和致病性CD4+CD45RBhiT细胞可抑制严重免疫缺陷小鼠IBD的形成。该研究同时证实Tr1必须在体内被活化才能发挥调节作用,因为只有在接受的抗原可被Tr1识别的小鼠中才能阻止IBD的形成。Tr1克隆抑制免疫反应的特性与CD45RBlowCD4+T细胞相似,后者也可通过IL-10和TGF-β依赖机制抑制IBD。
移植免疫　
诱导免疫耐受是移植成功的关键,Tr在移植耐受中起重要调节作用。Taylor等研究显示,CD4+CD25+Tr在移植物抗宿主病(GVHD)的发生过程中起重要作用,在数个动物品系的组合中,不论全身放射剂量如何,去除供者T细胞接种物中CD4+CD25+Tr或移植前去除受者CD25-T细胞将导致GVHD的升高。输注新鲜纯化的供者CD4+CD25+Tr和等量的CD4+T细胞可适度抑制GVHD的发生。而体外培养的活化CD4+CD25+Tr与等量的CD4+T细胞或去除CD25-T细胞输注明显抑制快速致死性GVHD。
支气管哮喘　
支气管哮喘是由Th2细胞介导的气道慢性炎症性疾病,结合在肥大细胞、嗜碱粒细胞表面的抗原特异性IgE通过桥联抗原促使上述细胞释放炎症介质,在速发相及迟发相哮喘反应中起重要作用。Cottrez等研究发现,将Tr1克隆转移入OVA诱导的速发型超敏反应小鼠模型中,使抗原特异性IgE减少90%,抗IL-10抗体可逆转Tr1抑制抗原特异性IgE的作用,说明IL-10在Tr1的调节功能中起重要作用。给予Tr1的小鼠淋巴结T细胞经OVA刺激后分泌的IL-10较对照组细胞明显升高,仅分泌少量的IL-5,无IL-4。将抗原特异性Tr转移入致敏小鼠也可阻止气道高反应的形成。Zuany-Amorim等研究发现,经灭活分枝杆菌悬液SRP299处理的小鼠产生CD4+CD45RBlowTr,可通过产生IL-10和TGF-β抑制气道炎症的形成。
口服耐受及实验性自身免疫性脑脊髓炎　
口服耐受是指通过预先口服抗原特异性抑制细胞和(或)体液免疫,阻止机体对食物蛋白和细菌抗原的高反应性。口服低剂量抗原可诱导产生分泌免疫抑制性细胞因子TGF-β的调节性细胞,抑制实验性自身免疫性疾病的发生。低剂量抗原经Peyer's patch肠相关APC递呈后,优先诱导产生抗原特异性调节性细胞,这种调节性细胞在体内外遇到抗原后可分泌TGF-β。而高剂量抗原口服不仅诱导克隆无能和消除,也可诱导产生TGF-β的调节性细胞,OVA TCR转基因小鼠口服抗原也可诱导产生CD4+CD25+Tr,其抑制效应部分由TGF-β介导。Chen等研究发现,小鼠口服给予髓磷脂碱蛋白可诱导周围耐受,其肠系膜淋巴结可分离出产生TGF-β、IL-10以及IL-4的T细胞克隆,抑制实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)的形成,此病是由Th1介导的多发性硬化动物模型。另外,Kohm等研究发现,在体外,CD4+CD25+Tr可有效抑制MOG(35～55)特异性Th1的增殖和细胞因子的产生。在体内,过继转移CD4+CD25+Tr明显抑制自身反应性Th1介导的EAE的形成,同时MOG(35～55)特异性Th2出现的频率增加,中枢神经系统浸润降低。
Treg细胞和治疗肿瘤
由于Ｔｒｅｇ在机体免疫调控过程中的重要作用, 针对Ｔｒｅｇ进行肿瘤免疫治疗是肿瘤治疗的新策略。 Ｔｒｅｇ在体内具有很强的免疫抑制作用,清除(ｄｅｌｅ- ｔｉｎｇ)患者体内的Ｔｒｅｇ有望改善患者的免疫功能,因 而最早针对Ｔｒｅｇ的肿瘤治疗方案是清除肿瘤患者 体内的Ｔｒｅｇ,最早开展临床应用的也是此类方案,但 临床疗效与预期有很大距离。后续研究发现,清除 肿瘤患者体内的Ｔｒｅｇ虽能在一定程度上提高患者 的抗肿瘤免疫功能,但患者体内的Ｔｒｅｇ水平会很快 恢复,这是影响临床疗效的重要原因。据此,2006 年后有学者提出靶向Ｔｒｅｇ治疗肿瘤的策略应从“清 除”转变为“控制(ｍａｎａｇｉｎｇ)”,即控制体内Ｔｒｅｇ的 数量和功能。而近年来,靶向Ｔｒｅｇ的疗法趋于多元 化,特别是将靶向Ｔｒｅｇ的疗法与其他肿瘤生物疗法 相结合,以期产生更好的疗效。
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