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单项选择题A1型题革兰氏染色所用染液的顺序是（）
A.结晶紫&乙醇&碘液&稀释复红
B.结晶紫&碘液&乙醇&稀释复红
C.碘液&乙醇&稀释复红&结晶紫
D.稀释复红&碘液&乙醇&结晶紫
E.稀释复红&结晶紫&碘液&乙醇
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D.异染颗粒第七章 食品微生物检验
第七章 食品微生物检验
学习本章的意义和内容：
掌握光学显微镜的使用方法，掌握细菌染色标本的制作技术。掌握样品的采集和处理方法。掌握菌落总数的测定方法与步骤。掌握大肠菌群的测定方法与步骤。学会乳糖胆盐发酵管培养基的制备。掌握革兰氏染色方法。
本章习题内容主要涉及：
食品微生物检验的范围；食品微生物检验的指标；细菌染色的基本方法和步骤；常用染色方法及染色液；食品微生物学一般检验技术
一、食品微生物检验的意义
食品微生物检验方法为食品监测必不可少的重要组成部分。
(1)它是衡量食品卫生质量的重要指标之一，也是判定被检食品能否食用的科学依据之一。
(2)通过食品微生物检验，可以判断食品加工环境及食品卫生环境，能够对食品被细菌污染的程度做出正确的评价，为各项卫生管理工作提供科学依据，提供传染病和人类、动物和食物中毒的防治措施。
(3)食品微生物检验是以贯彻“预防为主”的卫生方针，可以有效地防止或者减少食物中毒人畜共患病的发生，保障人民的身体健康；同时，它对提高产品质量，避免经济损失，保证出口等方面具有政治上和经济上的重要意义。
二、食品微生物检验的范围
食品微生物检验的范围包括以下几点：
(1)生产环境的检验：车间用水、空气、地面、墙壁等。
(2)原辅料检验：包括食用动物、谷物、添加剂等一切原辅材料。
(3)食品加工、储藏、销售诸环节的检验：包括食品从业人员的卫生状况检验、加工工具、运输车辆、包装材料的检验等。
(4)食品的检验：重要的是对出厂食品、可疑食品及食物中毒食品的检验。
三、食品微生物检验的指标
我国卫生部颁布的食品微生物指标有菌落总数、大肠菌群和致病菌三项。
(1)菌落总数
菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后所得1g或1mL检样中所含细菌菌落的总数。
(2)大肠菌群
大肠菌群是寄居于人及温血动物肠道内的肠居菌，它随着的大便排出体外。食品中如果大肠菌群数越多，说明食品受粪便污染的程度越大。
致病菌即能够引起人们发病的细菌。对不同的食品和不同的场合，应该选择一定的参考菌群进行检验。
(4)霉菌及其毒素
我国还没有制定出霉菌的具体指标，鉴于有很多霉菌能够产生毒素，引起疾病，故应该对产毒霉菌进行检验。
(5)其它指标
微生物指标还应包括病毒，肝炎病毒、猪瘟病毒、鸡新城疫病毒、马立克氏病毒、口蹄疫病毒，狂犬病病毒，猪水泡病毒等；另外，从食品检验的角度考虑，寄生虫也被很多学者列为微生物检验的指标。
四、染色细菌标本检查法
微生物中细菌、致病菌是很小的生物体，必须通过染色的方法，在显微镜下才能看得清楚，并且还可以通过染色的方法鉴别革兰氏染色特性，以及是否长有鞭毛、周毛、荚膜和芽孢等。
细菌染色用的染料多为有色泽的有机酸或者有机碱，因为其溶解度有限，一般使用其盐类。
可分为以下四类。
&&& (一)酸性染料
染色离子带阴电，因此，又叫做阴离子染料。它能与带阳电的
物质结合，使之着色。降低菌液的pH而使细菌带阳电时，就可用酸
性染料染色。如伊红、刚果红等。
&& (二)碱性染料
染料离子带正电，也叫做阳离子染料。它能与带负电的物质结
合。细菌一般带负电，所以细菌染色所用的染料，常用碱性染料，如
美蓝、碱性复红等。一部分碱性染料，如碱性复红、美蓝等具有与
氢结合的能力，结合后双键饱和，色基不再存在。此时，化合韧杖
还原，成为无色的化合物，再经氧化即可显色。
&& (三)复合染料
碱性染料与酸性染料的结合物，叫做复合染料，或叫中性染料。
例如wright染料中的伊红美蓝，Giemsa染料中的伊红天青等。
&&& (四)单纯染料被染杖柒物生成盐类。它的染色
能力，视其能否溶于被染物而言。它们大多数属于偶氮化合物，具
有脂溶性而不溶于水，如苏丹类(Sudans)染料。
2、影响染色的因素
不同细菌其细胞壁酌结构、细胞膜的通透性，膜孔的大小等有一定的羌别，用染料对其染色时．可能会有不同的结果。此外，培养基的组成、菌龄、染色液中电解质含虽和pH、温度、药物等，都可能影响细的染色情况。
3、细菌染色的基本方法和步骤
3.1基本方法
3.1.1单染色法
单染色法是用一种染料染色的方法。例如用美蓝或稀释击炭酸复红等，使各种细菌染成间―种颜色。故此法只显小细菌的形态和大小，对细菌鉴别价值较小。在染色过程中常加入媒染剂如碘、石炭酸、明矾或者加热的方法，以增加染料对细菌的亲和力。
3.1.2复染色法
复染色法是用两种以上染料染色的方法，此法除显示细菌形态大小外，不同类型的细菌可以染上不同的颜色，从而具合鉴别细菌种类的价值，因此也称鉴别染色法。
用复染色法染色时，所用的脱色剂如酒精、丙酮或酸类，用于检查染料和细菌结合的牢固程度，最后用与初染色剂颜色有鲜明对比的染料进行复染，以便进行观察，区别细菌种类。
常用的复染色法有革兰氏染色法和抗酸染色。
3.1.3细菌持殊结构的染色法
检查细菌的特殊结构，如鞭毛、英膜、异染颗粒等对鉴别细菌很有帮助。细菌特殊结构染色法不仅能使特殊的结构着色，还可使特殊结构染成与菌体不同的颜色，有利于观察。在细菌检查工作中，除异染颗粒染色法较常应用外，其他持殊结构染色法操作费时，且可用其他简易方法代替，故在日常检验工作中较少使用。
3.1.4荧光染色法
荧光染料，如金胶等也可对细菌进行染色。此类染料溶于水中，在紫外线照射下能激发出荧光，分为酸性染料及碱性染料两种。细菌用荧光染料染色后在荧光显微镜下检查，可在黑的背景中观察到细菌发出明亮的荧光。用荧光染色法检查细菌可加快检查速度和提高阳性率。
用荧光光源和普通光学显微镜配合起来，即可代替荧光显微镜进行荧光染色法检查。
3.2细菌染色的基本步骤
涂片－干燥一固定一染色－媒染一脱色－复染－镜检
单染法不需要媒染一脱色－复染步骤。
染色过的细菌涂片标本在镜检时一般使用油浸镜。如果需保存标本，可在镜检后，用拭镜纸沾二甲苯擦掉镜油。长期保存在标本中央滴加一滴加拿大树胶，盖上一洁净的盖玻片，待其自然干燥后，保存于玻片标本盒中。
4、常用染色方法及染色液
4.1美蓝染色法
4.1.1吕氏碱性美蓝染色液
美蓝&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 0.3g
95％乙醇&&&&&&&
&&&&&&&&&&&&&30mL
0.01％氢氧化钾溶液&&&&&&&&&&
将美蓝溶解于乙醇中，然后于氢氧化钾溶液混合。
4.1.2染色法
将涂片在火焰上固定，待冷却后滴加染液，染1min～3min，水洗，待干，镜检。
菌体呈蓝色。
革兰氏染色法
4.2.1染色液
结晶紫染色液
结晶紫&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 1g
95％乙醇&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
1％草酸铵水溶液&&&&&&&&&&&&&&
将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。
(2)革兰氏碘液
碘&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
碘化钾&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 2g
蒸馏水&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 300mL
将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，在加蒸馏水至300mL。
(3)沙黄复染法
沙黄&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 0.25g
95％乙醇&&&&&&&&&&&&&&
&&&&&&&&&&10mL
蒸馏水&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 90mL
将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。
4.2.2染色法
(1)将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水洗。
(2)滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。
(3)滴加95％乙醇脱色，约30s；或将乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用乙醇滴满整个涂片，脱色10s。
(4)水洗，滴加复染液，复染1min，水洗，待干，镜检。
革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。
注：亦可用1：10稀释石炭酸复红染色液作复染液，复染时间仅需10s。
4.3耐酸性染色法（萎―倪二氏法）
4.3.1染色液
(1)石炭酸品红染色液
碱性品红&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 0.3g
95％乙醇&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
5％苯酚水溶液&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
将品红溶解于乙醇中，然后与苯酚溶液混合。
(2)3％盐酸-乙醇
浓烟酸&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 3mL
95％乙醇&&&&&&&&&&&&&&&&&
&&&&&&&&97mL
吕氏碱性美蓝染色液
4.3.2染色法
(1)将涂片在火焰上固定，滴加石炭酸品红染色液，徐徐加热至有蒸汽出现，但切不可使沸腾。染液因蒸发减少时，应随时添加。染5min，倾去染液，水洗。
(2)滴加盐酸-乙醇脱色，直至无红色脱落为止，（所需时间视涂片厚薄而定，一般为1min～3min），水洗。
(3)加吕氏碱性美蓝染色液，复染30min，水洗，待干，镜检。
耐酸性细菌呈红色，其他细菌、细胞等物质呈蓝色。
4.4柯氏染色法
4.4.1染色液
0.5％沙黄液
0.5％孔雀绿液
4.4.2染色法
(1)将涂片在火焰上固定，滴加0.5％沙黄液，并加热至出现气泡，约2min～3min，水洗。
(2)滴加0.5％孔雀绿液，复染40s～50s，水洗，待干，镜检
布氏杆菌呈红色，其他细菌及细胞呈绿色
4.5奥尔特氏荚膜染色法
4.5.1染色液
沙黄&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 3g
蒸馏水&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 100mL
用乳钵研磨溶解
4.5.2染色法
将涂片在火焰上固定，滴加染色液，并加热至产生蒸汽后，继续染3min，水洗，待干，镜检。
炭疽芽孢杆菌菌体呈赤褐色，荚膜呈黄色。
4.6瑞氏染色法
4.6.1染色液
瑞氏色素&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 0.1g
甲醇&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 60mL
用乳钵研磨溶解
4.6.2染色法
(1)待涂片自然干燥后，滴加染色液，固定1min。
(2)加入等量蒸馏水（pH6.5），染色3min～5min。
(3)用蒸馏水冲洗，待干，镜检。
4.7鞭毛染色法
4.7.1染色液的配制
称丹宁酸5g、氯化高铁（FeCl3）1.5g，溶于100mL蒸馏水中，待溶解后加入1％的氢氧化纳溶液1mL和15％的甲醛溶液2mL。
称2g硝酸银溶于100mL蒸馏水中。在90mL乙液中滴加浓氢氧化铵溶液，到出现沉淀后，继续滴加使其变为澄清，然后用其余10mL乙液小心滴加至澄清液中，至出现轻微雾状为止（此为关键性操作，应特别小心）。滴加氢氧化铵和用剩余乙液回滴时，要边滴边充分摇荡，染液当天配，当天使用，2d～3d后基本无效。
4.7.2染色法
在风干的载玻片上滴加甲液，4min～6min后，用蒸馏水轻轻冲净，再加乙液，缓缓加热至冒汽，维持约半分钟（加热时注意勿出现干燥面），在菌体多的部位可呈深褐色到黑色，停止加热，用水冲净，干后镜检。菌体及鞭毛为深褐色到黑色。
五、食品微生物学一般检验技术
1、各类食品微生物检样样品的采集与制备实例
1.1肉与肉制品样品的采集与制备
1.1.1样品的采取
(1)生肉及脏器检样
如是屠宰场后的畜肉，可于开腔后，用无菌刀采取两腿内侧肌肉各50g（或劈半后采取两侧背最长肌肉各50g）；如是冷藏或销售的生肉，可用无菌刀取腿肉或其他部位的肌肉100g。检样采取后放入无菌容器内，立即送检；如条件不许可时，最好不超过3h。送检时应注意冷藏，不得加入任何防腐剂。检样送往化验室应立即检验或放置冰箱暂存。
(2)禽类（包括家禽和野禽）
鲜、冻家禽采取整只，放无菌容器内；带毛野禽可放清洁容器内，立即送检，以下处理要求同上述生肉。
(3)各类熟肉制品
包括酱卤肉、肴肉、方圆腿、熟灌肠、熏烤肉、肉松、肉脯、肉干等，一般采取200g，熟禽采取整只，均放无菌容器内，立即送检，以下处理要求同上述生肉。
(4)腊肠、香肚等生灌肠
采取整根、整只，小型的可采数根、数只，其总量不少于250g。
1.1.2检样的处理
(1)生肉及脏器检样的处理
先将检样进行表面消毒（在沸水内烫3s～5s，或灼烧消毒），再用无菌剪子剪取检样深层肌肉25g，放入无菌乳钵内用灭菌剪子剪碎后，加灭菌海砂或玻璃砂或玻璃砂研磨，磨碎后加入灭菌水225mL，混匀后即为1：10稀释液。
(2)鲜、冻家禽检样的处理
先将检样进行表面消毒，用灭菌剪子或刀去皮后，剪取肌肉25g（一般可从胸部或腿部剪取），以下处理同生肉。带毛野禽去毛后，同家禽检样处理。
(3)各类熟肉制品检样的处理
直接切取或称取25g，以下处理同生肉。
(4)腊肠、香肠等生灌肠检样处理
先对生灌肠表面进行消毒，用灭菌剪子取内容物25g，以下处理同生肉。
注：以上样品的采集和送检及检样的处理均以检验肉禽及其制品内的细菌含量从而判断其质量鲜度为目的。如须检验肉禽及其制品受外界环境污染的程度或检索其是否带有某种致病菌，应用棉拭采样法。
1.1.3棉拭采样法和检样处理
检验肉禽及其制品受污染的程度，一般可用板孔5cm2的金属制规板，压在受检物上，将无菌棉拭稍沾湿，在板孔5cm2的范围内揩抹多次，然后将板孔规板移压另一点，用另一棉拭揩抹，如此共移压揩抹10次，总面积50cm2，共用10只棉拭。每支棉拭在揩抹去完毕后应立即剪断或烧断后投入盛有50mL灭菌水的三角烧瓶或大试管中，立即送检。检验时先充分振摇吸取瓶、管中的液体，作为原液，再按要求作10倍递增稀释。
检验致病菌，不必用规板，在可疑部位用棉拭揩抹即可。
1.1.4检验方法
见菌落总数、大肠菌群测定及各有关致病菌和霉菌的检验。
1.2乳与乳制品样品的采集与制备
1.2.1样品的采取和送检
1.2.1.1散装或大型包装的乳品
用灭菌刀、勺取样，在移采另一件样品前，刀、勺先清洗灭菌。采样时应注意部位等代表性。每件样品数量不少于200g，放入灭菌容器内及时送检。鲜乳一般不应超过3h，在气温较高或路途较远的情况下应进行冷藏，不得使用任何防腐剂。
1.2.1.2小型包装的乳品
应采取整件包装，采样时应注意包装的完整。各种小型包装和乳与乳制品，每件样品量为：生奶1瓶或1包；消毒奶1瓶或1包；奶粉1瓶或1包（大包装者200g）；奶油1块（113g）；酸奶1瓶或1罐；炼乳1瓶或1罐；奶酪（干酪）1个。
1.2.1.3成批产品
对成批产品进行质量鉴定时，其采样数理每批以千分之一计算，不足千件者抽取1件。
1.2.2检样的处理
1.2.2.1鲜奶、酸奶
以无菌操作去掉瓶口的纸罩纸盖，瓶口经火焰消毒后以无菌操作吸取25mL检样，放入装有225mL灭菌生理盐水的三角烧瓶内，振摇均匀（酸乳如有水分析出于表层，应先去除）。
1.2.2.2炼乳
将瓶或罐先用温水洗净表面，再用点燃酒精棉球消毒瓶或罐的上表面，然后用灭菌的开罐器打开罐（瓶），以无菌操作称取25g（mL）检样，放入装有225mL灭菌生理盐水的三角烧瓶内，振摇均匀。
1.2.2.3奶油
以无菌操作打开包装，取适量检样置于灭菌三角烧瓶内，在45℃水浴或温箱中加温，溶解后立即将烧瓶取出，用灭菌吸管吸取25mL奶油放入另一含225mL灭菌生理盐水或灭菌奶油稀释液的烧瓶内（瓶装稀释液应预置于45℃水浴中保温，作10倍递增稀释时所用的稀释液亦同），振摇均匀，从检样融化到接种完毕的时间不应超过30min。
注：奶油稀释液：格林氏液（配法：氯化钠9g、氯化钾0.12g、氯化钙0.24g、碳酸氢钠0.2g、蒸馏水1000mL）250mL、蒸馏水750mL、琼脂1g、加热溶解，分装每瓶225mL，121℃灭菌15min。
1.2.2.4奶酪
先用灭菌刀削去部分表面封蜡，用点燃的酒精棉球消毒表面，然后用灭菌刀切开奶酪，以无菌操作切取表层和深层检样各少许，置于灭菌乳钵内切碎，加入少量生理盐水研成糊状。
见菌落总数、大肠菌群测定及各有关致病菌和霉菌的检验。
2、微生物染色
2.1实验目的
学习微生物的染色原理、染色的基本操作技术，从而掌握微生物的一般染色法和革兰氏染色法。
2.2染色原理
由于微生物细胞含有大量水分，对光线的吸收和反射与水溶液的差别不大,机体是无色透明的，与周围背景没有明显的反差,在普通光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。&
2.3染色方法
2.3.1简单染色法
简单染色法又叫普通染色法，只用一种染料使细菌染上颜色，如果仅为了在显微镜下看清细菌的形态，用简单染色即可。
2.3.2复染色法
用两种或多种染料染细菌，目的是为了鉴别不同性质的细菌，所以又叫鉴别染色法。主要的复染色法有革兰氏染色法和抗酸性染色法。
2.4实验材料
2.4.1器材：
显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、接种环、载玻片、酒精灯等。
2.4.2试剂：
石炭酸复红染液、草酸铵结晶紫染液、碘液、95％乙醇、蕃红染液
2.4.3菌种：
金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌
2.5操作步骤
2.5.1细菌的简单染色步骤
涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→镜检
在载玻片的中央滴一滴无菌蒸馏水，将接种环在火焰上烧红，待冷却后从斜面挑取少量菌种与玻片上的水滴混匀后，在载玻片上涂布成一均匀的薄层。
涂片最好在室温下使其自然干燥。
固定常常利用高温，手持载玻片的一端，标本向上，在酒精灯火焰外层尽快的来回通过2～3次，共约2～3s，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫为宜,放置待冷后，进行染色。
在涂片薄膜上滴加染色液一滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min。
斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。
用吸水纸吸去涂片边缘的水珠，置于室温下自然干燥。用吸水纸时切勿将菌体擦掉。
用显微镜观察，并用铅笔绘出细菌形态图。
2.5.2细菌的革兰氏染色步骤
涂片→干燥→固定→初染→水洗→媒染→水洗→脱色→水洗→复染→水洗→干燥→观察
(1)取大肠杆菌和枯草杆菌分别做涂片、干燥、固定，方法均与简单染色的相同。
(2)用草酸铵结晶紫染色1min后水洗。
(3)加碘液媒染1min后水洗。
(4)斜置载玻片，滴加乙醇脱色，至流出的乙醇不现紫色为止，大约需时20～30s，随即水洗。
(5)用蕃红染液复染1min，水洗。
(6)用吸水纸吸掉水滴，待标本片干后置显微镜下，用低倍镜观察，发现目的物后用油镜观察，注意细菌细胞的颜色。
2.6注意事项
2.6.1革兰氏染色成败的关键是脱色时间。
2.6.2选用培养18～24小时菌龄的细菌为宜。
2.7实验结果
简单染色 ：金黄色葡萄球菌和枯草杆菌染成红色。
革兰氏染色（大肠杆菌与枯草杆菌）分别染成红色和紫色。
3、酵母菌大小的测定和细胞计数
3.1实验目的
学会测微尺和血球计数板的使用方法，建立对微生物大小的概念。
3.2实验材料
3.2.1器材：
显微镜、物镜测微尺、目镜测微尺、血球计数板、载玻片、吸管和吸水纸等。
3.2.2样品：麦芽汁培养基、酵母菌。
3.3实验原理
3.3.1酵母菌大小的测定原理
先用绝对长度的物镜测微尺来校正不表示绝对长度的目镜测微尺，计算后者每格所代表的实际长度，然后放上待测的标本，用目镜测微尺测定标本上微生物细胞占目镜测微尺的格数，就可计算该微生物的大小。
3.3.2酵母细胞计数原理
微生物常用的计数方法有两种，即直接计数法和间接计数法。前者利用血球计数板在显微镜下直接计数，能立即得到数值。后者是在乎板上长成菌落后再计数，反应较真实，但费时太长。
3.4操作方法
3.4.1酵母菌大小测定的操作方法
(1)测微尺的构造和使用方法
①目镜测微尺的构造& 目镜测微尺是一块圆形玻片，其中央刻有精确的刻度，用前必须用物镜测微尺来标定。
②物镜测微尺的构造&& 物镜测微尺为一块特制的载玻片，其中央有一小圆圈。圆圈内刻有分度。
(2)目镜测微尺的标定
①取下接目镜，旋下目镜上的目透镜，将目镜测微尺放人接目镜的中隔板上，使有刻度的一面朝下，再旋上目透镜，并装入镜筒内。
②将物镜测微尺置于显微镜的载物台上，使有刻度的一面朝上，同观察标本一样，使具有刻度的小圆圈位于视野中央。
③先用低倍镜观察，对准焦距，待看清物镜测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺的刻度与物镜测微尺的刻度相平行，并使两尺的左边第一条线相重合，再向右寻找两尺的另外一条重合线。
④记录二条重合线间的目镜测微尺的格数和物镜测微尺的格数。
(3)计算方式
①目镜测微尺每格长度=两个重叠刻度间物镜测微尺格数×10/两个重叠刻度间目镜测微尺格数
②以同样方法，分别在不同倍率的物镜下测定测微尺上每格的实际长度。
目镜测微尺(&&& )格=物镜测微尺(&&&
目镜测微尺每格=(&&& )
③如此测定后的目镜测微尺的尺度，仅适用于测定时所用的显微镜的目镜和物镜的放大倍数。若更换物镜、目镜的放大倍数时，必须再进行校正标定。
(4)酵母菌大小的测定
①取下物镜测微尺，换上酵母菌水浸制片。
②测量菌体的长度和宽度各占目镜测微尺几格，然后换算出菌体的实际长度。
③在同一标本上测定5～10个菌体，求其平均值。
3.4.2酵母细胞数的测定操作方法
(1)血球计数板的构造
血球计数板是由一块比普通载玻片厚的特制玻片制成的。玻片中有四条下凹的槽，构成三个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽隔为两半，每半边上面个刻有一个方格网。方格网上刻有9个大方格，其中只有中间的一个大方格为计数室，供微生物计数用。
计数室通常有两种规格。一种是大方格内分为16中格，每一中格又分为25小格；另一种是大方格内分为25中格，每一中格又分为16小格。
(2)血球计数板的使用
①用血球计数板计数酵母菌悬液的酵母菌个数。
②样品稀释的目的是便于酵母菌悬液的计数，以每小方格内含有4～5个酵母细胞为宜。
③将血球计数板用擦镜纸擦净，在中央的计数室上加盖专用的厚玻片。
④将稀释后的酵母菌悬液，用吸管吸取一滴置于盖玻片的边缘，使菌液缓缓渗入，多余的菌液用吸水纸吸取，捎待片刻，使酵母菌全部沉降到血球计数室内。
⑤计数时，如果使用16格×25格规格的计数室，要按对角线位，取左上、右上、左下、右下4个中格（即100个小格）的酵母菌数。如果规格为25格×16格的计数板，除了取其4个对角方位外，还需再数中央的一个中格(即80个小方格)的酵母菌数。
⑥当遇到位于大格线上的酵母菌，一般只计数大方格的上方和右方线上的酵母细胞(或只计数下方和左方线上的酵母细胞)。
⑦对每个样品计数三次，取其平均值，按下列公式计算每1ml菌液中所含的酵母菌个数。
(3)计算公式
①16格×25格的血球计数板计算公式：
酵母细胞数/ml=100小格内酵母细胞个数/100×400×104×稀释倍数
②25格x16格的血球计数板计算公式：
酵母细胞数/ml=80小格内酵母细胞个数/80×400×104×稀释倍数
(4)血球计数板的清洁
血球汁数板使用后，用自来水冲洗，切勿用硬物洗刷，洗后自行晾干或用吹风机吹干，或用95％的乙醇、无水乙醇、丙酮等有机溶剂脱水使其干燥。
4、食品中细菌总数的测定
4.1实验目的
学习活菌的计数方法；掌握食品细菌总数的测定报告方式。
4.2实验材料
4.2.1器材：
电热恒温培养箱、冰箱、恒温水浴锅、托盘天平、电炉、吸管、广口瓶、三角瓶、玻璃珠、平皿、试管、试管架、酒精灯、均质器或乳钵、灭菌刀或剪刀、灭菌镊子、75％酒精棉球、玻璃蜡笔、登记薄
4.2.2培养基和试剂：75％乙醇、生理盐水、15％氢氧化钠溶液、营养琼脂培养基、检验方法
4.3实验方法
4.3.1检验程序
菌落总数检验程序：检样→做成几个适当倍数的稀释液→选择2～3个适宜稀释度各以1ml之量分别入灭菌平皿内→每皿内加入46℃适量营养琼脂→菌落数→报告
4.3.2检样稀释及培养
(1)以无菌操作，将检样25g（或25ml）剪碎以后，放于含有225ml灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预先置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1：10的均匀稀释液。&&&&&&
(2)用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液，下同），振摇试管混合均匀，做成1：100的稀释液。
(3)另取1ml的灭菌吸管，按上项操作顺序作10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用1支1ml灭菌吸管。
(4)根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择2～3个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1ml稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作两个平皿。
(5)稀释液移入平皿后，应及时将凉至46℃营养琼脂培养基[可放置在（46±1）℃]水浴锅内保温]注入平皿15ml～20mL，并转动平皿使混合均匀，同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。待琼脂凝固后，翻转平板，置（36±1）℃恒温箱内培养（48±2）h取出，计算平板内菌落数目乘以倍数，即得1g（1mL）样品所含菌落总数。
4.3.3菌落计算方法
(1)菌落计数方法
做平板菌落计数时，可用肉眼观查，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落总数。
(2)菌落计数的报告
①平板菌落数的选择
选取菌落数在30～300之间的平板作为菌落总数测定标准。一个稀释度使用两个平板，应采用两个平板平均数，其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余的一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘2以代表全皿菌落数。平皿内如有链状菌落生长时（菌落之间无明显界线），若仅有一条链，可视为一个菌落数；如果有不同来源的几条链，则应将每条链作为一个菌落计。
②稀释度的选择
应选择平均菌落数在30～300之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之。若有两个以上稀释度，其生长的菌落数均在30～300之间，则视两者之比如何来决定。若其比值小于或等于2，应报告其平均数；若大于2则报告其中较小的数字。
③菌落数的报告
菌落数在100以内时，按其实有数报告，大于100时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算。为了缩短数字后面的零数，也可用10的指数来表示。
5、食品中大肠菌群的测定
5.1实验目的
学习食品中大肠菌群检测程序、方法；掌握食品中大肠菌群检测结果的报告方式。
5.2实验材料
5.2.1设备和材料
温箱、水浴锅、天平、显微镜、均质器或乳钵、温度计、平皿、试管、发酵管、吸管、载玻片、接种针
5.2.2培养基及试剂
乳糖―胆盐发酵管、乳糖发酵管、蛋白胨水、靛基质试剂、麦康凯、伊红美蓝琼脂（EMB）、远腾氏琼脂、革兰氏染色液
5.3实验方法与步骤
5.3.1采样及稀释
(1)以无菌操作将检样25g（或25ml）放于含有225ml灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1：10的均匀稀释液。固体检样最好用无菌均质器，以800r/min～1000r/min的速度处理1min，做成1：10的稀释液。
(2)用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇混匀，做成1：100的稀释液，换用1支1ml灭菌吸管，按上述操作依次作10倍递增稀释液
(3)根据食品卫生要求或对检验样品污染情况估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种3管。也可直接用样品接种。
5.3.2乳糖初发酵试验
即通常所说的假定试验。其目的在于检查样品中有无发酵乳糖产生气体的细菌将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1ml以上者，用双料乳糖胆盐发酵管；1ml及1ml以下者，用单料乳糖发酵管。每一个稀释度接种3管，置（36±1）℃温箱内，培养（24±2）h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产生者，则按下列程续进行。
5.3.3分离培养
将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂板或麦康凯琼脂平板上，置（36±1）℃温箱内，培养18h～24h，然后取出，观察菌落形态并作革兰氏染色镜检和复发酵试验。
5.3.4乳糖复发酵试验
即通常所说的证实试验，其目的在于证明从乳糖初酵管试验呈阳性反应的试管内分离到的革兰氏阴性无芽胞杆菌，确能发酵乳糖产生气体。在上述的选择性培养基上，挑取可疑大肠菌群1～2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置（36±1）℃的温箱内培养（24±2）h，观察产气情况。凡乳糖发酵管产气，革兰氏染色为阴性无芽胞杆菌，即报告为大肠杆菌阳性；凡乳糖发酵管不产气或革兰氏染色为阳性，则报告为大肠杆菌为阴性。
根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100ml（g）食品中大肠菌群的最可能数。
6食品中病原菌的检验
6.1实验目的
了解沙门氏菌属的生化反应及原理；学习沙门氏菌属因子血清的使用方法；掌握沙门氏菌属的系统检验方法。
6.2实验材料
托盘天平、均质器或乳钵、温箱、显微镜、灭菌广口瓶、灭菌三角烧瓶、灭菌吸管、灭菌平皿、灭菌小试管、灭菌毛细吸管、载玻片、酒精灯、灭菌金属匙或玻璃棒、接种棒、镍铬丝、试管架
6.2.2培养基和试剂
缓冲蛋白胨水、氯化镁孔雀绿（MM）增菌液、硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液、亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液、亚硫酸铋琼脂（BS）、DHL琼脂、HE琼脂、SS琼脂、三糖铁琼脂、蛋白胨水，靛基质试剂、尿素琼脂、氰化钾（KCN）培养基、氨基酸脱羧酶试验培养基、糖发酵管、缓冲葡萄糖蛋白胨，甲基红试剂，V-P试剂、丙二酸钠培养基、氧化酶试剂、革兰氏染色液、沙门氏菌因子血清
6.3实验内容
6.3.1样品的采集及处理
应采集可疑食品或可疑带菌者的新鲜粪便进行检验。检查带菌者时也可用肛拭取样（经干热无菌的棉拭先用保存液或增菌液湿润，深入肛内7cm～10cm处采样）样品若不能及时检验，应将样品放入保存液中，置4℃的冰箱内保存。
6.3.2增菌培养
经过加工的食品中的沙门氏菌，由于加工过程中受到损伤而处于濒死状态，故为了分离出食品中的沙门氏菌必须对加工过的食品进行前增菌，使沙门氏菌恢复其活力。
增菌的目的是使沙门氏菌以外的细菌（主要是艾希氏菌属）受到抑制，而使沙门氏菌得到一定的增殖，提高沙门氏菌的检出率。
鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品和原料，不必经过前增菌。各取上述检样25g（或25ml）加入盛有灭菌生理盐水25ml的三角瓶中，做成均匀样液，取半量接种于100ml氯化镁孔雀绿（MM）增菌液或四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液内，于42℃培养24h；另取半量接种于100ml亚硒酸盐胱氨酸增菌液内于（36±1）℃培养18h～24h。增菌培养基的效果应先加以测定，而且还应考虑到如果增菌的目的菌是伤寒沙门氏菌就应以37℃为好，而其他沙门氏菌则以42℃为好。
6.3.3分离培养
取增菌液一环，划线接种于沙门氏菌选择性培养基上，如亚硫酸铋琼脂（BS）、DHL琼脂、HE琼脂、SS琼脂。两种增菌液可同时划线接种在同一个平板上，于（36±1）℃分别培养18h～24h（DHL、HE、SS）或40h～48h（BS），观察各种平板上生长菌落的特征。
6.3.4生化试验
挑取上述选择性琼脂平板上的可疑菌落，接种三糖铁琼脂斜面（先涂布斜面，后穿制底层），一般应多挑几个菌落，以防遗漏。
在三糖铁琼脂斜面内，只有斜面产酸并同时硫化氢（H2S）阴性的菌株可以排除，其他反应结果均有沙门氏菌存在的可能，同时也均有不是沙门氏菌的可能，因此都需要做几项最低限度的生化试验。必要时作涂片染色镜检应为革兰氏阴性短杆菌，作氧化酶试验应为阴性。&&&&&&&&
在接种三糖铁琼脂的同时，再接种蛋白胨水（供做靛基质试验），尿素琼脂（pH7.2）、氰化钾（KCN）培养基和赖氨酸脱羧酶试验培养基及对照培养基各一管，于（36±1）℃培养18h～24h，必要时可延长到48h。&
6.3.5血清学分型鉴定
(1)抗原的准备
一般采用1.5％琼脂斜面培养物作为玻片凝集试验用的抗原。O血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的（如2.5％～3％）培养基上再检查；如果是由于Vi抗原的存在而阻止了O凝集反应时，可挑取菌苔于1ml生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再检查。
H抗原发育不良时，将菌株接种在0.7％～0.8％半固体琼脂平板的中央，待菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查；或将菌株通过装有0.3％～0.4％半固体琼脂的小玻管1～2次，自远端取菌培养后再检查。
(2)O抗原的鉴定
用A-F多价O血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水对照。在生理盐水中自凝者为粗糙型菌株，不能分型。被A～F多价O血清凝集者，依次用O4、O3、O10、O7、O8、O9、O2、和O11因子血清做凝集试验。根据试验结果，判定O群。被O3、O10因子血清凝集的菌株，再用O10、O15、O34、O19单因子血清做凝集试验，判定E1、E2、E3、E4、各亚群，每一个O抗原成分的最后确定均应根据O单因子血清的检查结果，没有单因子血清的要用两个O复合因子血清进行核对。不被A～F多价O血清凝集者，先用57种或144种沙门氏菌因子血清中的7种多价O血清检查，如有其中一种血清凝集，则用这种血清所包括的O群血清逐一检查，以确定O群。
6.3.6菌型的判定和结果报告方式
综合以上生化试验和血清学分型鉴定的结果，按照沙门氏菌属抗原结构表判定菌型并报告结果。
食品微生物检验方法是食品监测必不可少的重要组成部分，可衡量食品卫生质量，为卫生管理工作提供依据，保障人民的身体健康。
食品微生物检验包括生产环境的检验，原辅料检验，食品加工、储藏、销售诸环节的检验，食品的检验等内容。
食品微生物检验指标主要有菌落总数、大肠菌群、致病菌、霉菌及其毒素等。
食品微生物检验的一般程序包括：检验前准备、样品的采集与处理、样品的送检与检验、检验、结果报告等。
染色是强化细胞或细胞组份与周围环境之间的反差，便于利用普通光学显微镜来观察微生物细胞的简捷方法。染色的制片过程一般包括涂片、干燥、固定、染色、水洗、干燥等基本步骤。
一、填空题
1、我国卫生部颁布的食品微生物指标有&&&&&&&
、&&&&&&& 和&&&&&&&
2、薄层色谱法检测有机氯农药残留时采用的显色液是&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
阳性斑点显&& 色。
3、细菌染色的基本方法有&&&&&&&
、&&&&&&&&&&&&&
、细菌持殊结构的染色法和荧光染色法。
4、细菌染色的步骤包括：涂片&&&&
、&&&& 、&&&&
、&&&& 、&&&&
、&&&& 和镜检。
5、革兰氏阳性菌呈&&&&&
色，革兰氏阴性菌呈红色。
6、微生物常用的计数方法有两种，即&&&&&&&
和&&&&&&& 。
7、凡乳糖发酵管产气，革兰氏染色为阴性无芽胞杆菌，即报告为大肠杆菌&&&&&&
性；凡乳糖发酵管不产气或革兰氏染色为阳性，则报告为大肠杆菌为&&&&&&
8、沙门氏菌检测中前增菌的目的是&&&&&&&
9、沙门氏菌检测中增菌的目的是&&&&&&&
10、检测经过加工的食品中的沙门氏菌需要前增菌主要因为&&&&&&&
二、选择题　
1、耐酸性染色法是（　）
A.单染色法
　B.复染色法　C.荧光染色法　　D.特殊结构的染色法
2、革兰氏染色的关键步骤是（　）
A.脱色　　　B.媒染　　　　C.复染　　　　D.固定
3、稀释度的选择
3、活菌计数法检测细菌总数应选择平均菌落数在（　）的稀释度，乘以稀释倍数报告之。
A 10～20之间　　　B.
200～500之间　 　C. 30～300之间　
　D. 5～10之间
4、血球计数板25格×16格（&&
A大方格内分为16中格，每一中格又分为25小格　　　B.
方格内分为25中格，每一中格又分为16小格　　　C.大方格的长和宽　D.小方格的长和宽
5、乳糖初发酵试验通常在（&&
）检测中用到。
乳酸菌　　　B.
酵母菌　 　C. 细菌总数　　D. 大肠杆菌
三、问答题
1、叙述食品微生物检验的意义。
2、食品微生物指标菌落总数、大肠菌群和致病菌的具体含义是什么？
3、比较单染色法和复染色法。
4、叙述棉拭采样法和检样处理的方法。
5、叙述细菌的简单染色的操作方法。
6、叙述菌样经涂片、干燥和固定后的革兰氏染色步骤。
7、目镜测微尺的标定如何操作？
8、如何使用血球计数板计数酵母菌悬液的酵母菌个数？
9、简述菌落总数检验程序。
10、菌落总数检验中若有两个以上稀释度，其生长的菌落数均在30～300之间，如何报告？
四、综合题
1、采用活菌计数法测定食品中细菌总数的测定，以无菌操作，将检样25g（或25ml）剪碎以后，放于含有225ml灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预先置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1：10的均匀稀释液。（1）以后的操作步骤是什么？（2）结果如何报告？
2、进行大肠杆菌检测时经乳糖初发酵实验结果有乳糖胆盐发酵管都产气，（1）说明什么问题？接下来应该如何进行分析？（2）革兰氏染色在何时进行？有什么意义？
一、填空题
1、菌落总数、大肠菌群和致病菌
2、硝酸银显色液，\
3、单染色法，复染色法
4、干燥，固定，染色，媒染，脱色，复染
5、紫，红。
6、直接计数法，间接计数法
8、使沙门氏菌恢复其活力。
9、沙门氏菌以外的细菌（主要是艾希氏菌属）受到抑制，而使沙门氏菌得到一定的增殖，提高沙门氏菌的检出率。
10、由于加工过程中沙门氏菌受到损伤而处于濒死状态。　
二、选择题
1B 2 A& 3 C 4 B
三、问答题
&答：食品微生物检验方法为食品监测必不可少的重要组成部分。
(1)它是衡量食品卫生质量的重要指标之一，也是判定被检食品能否食用的科学依据之一。
(2)通过食品微生物检验，可以判断食品加工环境及食品卫生环境，能够对食品被细菌污染的程度做出正确的评价，为各项卫生管理工作提供科学依据，提供传染病和人类、动物和食物中毒的防治措施。
(3)食品微生物检验是以贯彻“预防为主”的卫生方针，可以有效地防止或者减少食物中毒人畜共患病的发生，保障人民的身体健康；同时，它对提高产品质量，避免经济损失，保证出口等方面具有政治上和经济上的重要意义。
答：(1)菌落总数：菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后所得1g或1mL检样中所含细菌菌落的总数。
(2)大肠菌群：大肠菌群是寄居于人及温血动物肠道内的肠居菌，它随着的大便排出体外。食品中如果大肠菌群数越多，说明食品受粪便污染的程度越大。
(3)致病菌：致病菌即能够引起人们发病的细菌。对不同的食品和不同的场合，应该选择一定的参考菌群进行检验。
答：单染色法：单染色法是用一种染料染色的方法。例如用美蓝或稀释击炭酸复红等，使各种细菌染成间―种颜色。故此法只显小细菌的形态和大小，对细菌鉴别价值较小。在染色过程中常加入媒染剂如碘、石炭酸、明矾或者加热的方法，以增加染料对细菌的亲和力。
复染色法：复染色法是用两种以上染料染色的方法，此法除显示细菌形态大小外，不同类型的细菌可以染上不同的颜色，从而具合鉴别细菌种类的价值，因此也称鉴别染色法。
用复染色法染色时，所用的脱色剂如酒精、丙酮或酸类，用于检查染料和细菌结合的牢固程度，最后用与初染色剂颜色有鲜明对比的染料进行复染，以便进行观察，区别细菌种类。
所以两者的染色步骤和目的都不一样。
答：检验肉禽及其制品受污染的程度，一般可用板孔5cm2的金属制规板，压在受检物上，将无菌棉拭稍沾湿，在板孔5cm2的范围内揩抹多次，然后将板孔规板移压另一点，用另一棉拭揩抹，如此共移压揩抹10次，总面积50cm2，共用10只棉拭。每支棉拭在揩抹去完毕后应立即剪断或烧断后投入盛有50mL灭菌水的三角烧瓶或大试管中，立即送检。检验时先充分振摇吸取瓶、管中的液体，作为原液，再按要求作10倍递增稀释。
检验致病菌，不必用规板，在可疑部位用棉拭揩抹即可。
答：涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→镜检
(1)涂片：在载玻片的中央滴一滴无菌蒸馏水，将接种环在火焰上烧红，待冷却后从斜面挑取少量菌种与玻片上的水滴混匀后，在载玻片上涂布成一均匀的薄层。
(2)干燥：涂片最好在室温下使其自然干燥。
(3)固定：固定常常利用高温，手持载玻片的一端，标本向上，在酒精灯火焰外层尽快的来回通过2～3次，共约2～3s，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫为宜,放置待冷后，进行染色。
(4)染色：在涂片薄膜上滴加染色液一滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min。
(5)水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。
(6)干燥：用吸水纸吸去涂片边缘的水珠，置于室温下自然干燥。用吸水纸时切勿将菌体擦掉。
(7)镜检：用显微镜观察。
答：初染→水洗→媒染→水洗→脱色→水洗→复染→水洗→干燥→观察
(1)取大肠杆菌和枯草杆菌分别做涂片、干燥、固定，方法均与简单染色的相同。
(2)用草酸铵结晶紫染色1min后水洗。
(3)加碘液媒染1min后水洗。
(4)斜置载玻片，滴加乙醇脱色，至流出的乙醇不现紫色为止，大约需时20～30s，随即水洗。
(5)用蕃红染液复染1min，水洗。
(6)用吸水纸吸掉水滴，待标本片干后置显微镜下，用低倍镜观察，发现目的物后用油镜观察，注意细菌细胞的颜色。
答：①取下接目镜，旋下目镜上的目透镜，将目镜测微尺放人接目镜的中隔板上，使有刻度的一面朝下，再旋上目透镜，并装入镜筒内。
②将物镜测微尺置于显微镜的载物台上，使有刻度的一面朝上，同观察标本一样，使具有刻度的小圆圈位于视野中央。
③先用低倍镜观察，对准焦距，待看清物镜测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺的刻度与物镜测微尺的刻度相平行，并使两尺的左边第一条线相重合，再向右寻找两尺的另外一条重合线。
④记录二条重合线间的目镜测微尺的格数和物镜测微尺的格数。
答：（1）样品稀释，以每小方格内含有4～5个酵母细胞为宜。（2）将血球计数板用擦镜纸擦净，在中央的计数室上加盖专用的厚玻片。（3）将稀释后的酵母菌悬液，用吸管吸取一滴置于盖玻片的边缘，使菌液缓缓渗入，多余的菌液用吸水纸吸取，捎待片刻，使酵母菌全部沉降到血球计数室内。（4）计数时，如果使用16格×25格规格的计数室，要按对角线位，取左上、右上、左下、右下4个中格（即100个小格）的酵母菌数。如果规格为25格×16格的计数板，除了取其4个对角方位外，还需再数中央的一个中格(即80个小方格)的酵母菌数。（5）当遇到位于大格线上的酵母菌，一般只计数大方格的上方和右方线上的酵母细胞(或只计数下方和左方线上的酵母细胞)。（6）对每个样品计数三次，取其平均值，按下列公式计算每1ml菌液中所含的酵母菌个数。
答：菌落总数检验程序：检样→做成几个适当倍数的稀释液→选择2～3个适宜稀释度各以1ml之量分别入灭菌平皿内→每皿内加入46℃适量营养琼脂→菌落数→报告。
& &答：若有两个以上稀释度，其生长的菌落数均在30～300之间，则视两者之比如何来决定。若其比值小于或等于2，应报告其平均数；若大于2则报告其中较小的数字。
四、综合题
解：（1）步骤如下：A
用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液，下同），振摇试管混合均匀，做成1：100的稀释液。B另取1ml的灭菌吸管，按上项操作顺序作10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用1支1ml灭菌吸管。C根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择2～3个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1ml稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作两个平皿。D稀释液移入平皿后，应及时将凉至46℃营养琼脂培养基[可放置在（46±1）℃]水浴锅内保温]注入平皿15ml～20mL，并转动平皿使混合均匀，同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。待琼脂凝固后，翻转平板，置（36±1）℃恒温箱内培养（48±2）h取出，计算平板内菌落数目乘以倍数，即得1g（1mL）样品所含菌落总数。
菌落数在100以内时，按其实有数报告，大于100时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算。为了缩短数字后面的零数，也可用10的指数来表示。
解：（1）可能有大肠杆菌存在，应该进行分离培养和乳酸复发酵实验。将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂板或麦康凯琼脂平板上，置（36±1）℃温箱内，培养18h～24h，然后取出，观察菌落形态并作革兰氏染色镜检和复发酵试验。乳糖复发酵试验，
即通常所说的证实试验，其目的在于证明从乳糖初酵管试验呈阳性反应的试管内分离到的革兰氏阴性无芽胞杆菌，确能发酵乳糖产生气体。在上述的选择性培养基上，挑取可疑大肠菌群1～2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置（36±1）℃的温箱内培养（24±2）h，观察产气情况。凡乳糖发酵管产气，革兰氏染色为阴性无芽胞杆菌，即报告为大肠杆菌阳性；凡乳糖发酵管不产气或革兰氏染色为阳性，则报告为大肠杆菌为阴性。（2）在进行乳糖复发酵实验的同时就可以进行。和复发酵的结果一起最后确定样品大肠杆菌是否为阳性。
说明：习题及答案已分别放在各章内容之后。
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