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【求助】不同饱和度硫酸铵粗纯的摸索
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这个帖子发布于4年零182天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
用pET-28a 构建了一个表达HIV的gag蛋白的质粒，37度诱导表达量很高，但是HIS标签加到了N-端，结果HIS标签被包裹在内部，因为镍柱挂不上，所以尝试硫酸铵粗沉淀，并且设计了8个浓度，20%,25%，30%，35%，40%,45%,50%,60%, SDS-PAGE电泳结果很郁闷让我，所有的沉淀的条带都一样，没有区别，操作条件如下：诱导后，约200ml菌体，离心收集后，用7ml PBS重悬，超声一次(300W, 超5s，间歇5s，共15min)，12000rpm离心10min，沉淀明显减少，估计得到蛋白溶液7ml；明显感觉也较浓，下一步进行盐析，提前配制饱和度为100%的硫酸铵（3.8M，0度），设置上述的8个梯度，用1.5ml tube冰上操作，所有浓度下都添加超声后的上清蛋白溶液500μl/tube，并且按照参考资料上的添加标准，添加硫酸铵的体积，已达到目的饱和度，添加完毕，混匀后冰上放置了约2h，12000rpm离心10min，结果观察每个tube中的沉淀都很多，然后都用100μl纯水溶解沉淀，再加25μl的裂解buffer，沸水浴10min, 12000rpm短暂离心，上样10μl，结果如下：1道：超声后上清；2道：超声后沉淀；3~10道：不同饱和度硫酸铵沉淀后的蛋白样品(20%,25%，30%，35%，40%,45%,50%,60%)目的蛋白gag的分子量约为55kD,就是图片中最粗的那条带。但是用不同饱和度的硫酸铵沉淀后，根本没有区别，看不出来gag蛋白会在哪个浓度下会首先析出、沉淀下来。不知道是因为本表达系统内的杂蛋白与gag蛋白的性质差不多，还是因为硫酸铵的饱和度范围还应该更窄一些，比如21%，25%，27%,30%,33%....等等啦，还是因为盐析前的蛋白本来浓度就很高(换句话说，就是目的蛋白的浓度也很高，所以变得很容易在盐析作用时首先发生沉淀，所以不管哪个硫酸铵饱和度下，因为gag蛋白的浓度本来很高，马上发生了析出沉淀？)
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没有理解你的意思，不过第一次摸索硫酸胺沉淀没有必要分级很细，可以这样做取1ml蛋白样品加入饱和硫酸胺至20%(当然了如果没有沉淀继续加入直至有沉淀，离心，沉淀部分重悬备跑胶，上清部分留10微升备跑胶，其余上清继续加饱和硫酸胺至沉淀再离心，分别留沉淀和10微升上清跑胶，其余上清继续加饱和硫酸胺至下一梯度沉淀，一直大约到60-70%饱和度可以停止，毕竟这时候你的目标蛋白基本会沉完全的)该法有时候会出现你稍微加一点饱和硫酸胺就有沉淀，这样要离很多次心比较烦，个人建议首先试着加大约计算一下第一次沉淀时的饱和度，之后每隔10个饱和度离一次即可，祝你好运。
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首先感谢您的答复，我做的方法和您说的差不多呀，只不过是我同时让几个饱和度的反应一起进行罢了，我的意思是为什么饱和度分级这么细还是没能把蛋白分别沉淀开来，说白了就是没有让我的目的蛋白得到粗纯。是不是在蛋白初试浓度问题以及沉淀时间等问题上没有注意什么？
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估计我现在回复也晚了
可以考虑变性纯化 然后再透析复性
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有标签 的还是最好选择镍柱纯化，一种填料不好，可换个别家的试试，通常很少有挂不上的，别的纯化方法都很难得到理想的收率或纯度
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硫酸铵沉淀一定要控制好总蛋白的量，不要超过20-30mg/ml，否则会产生共沉淀的作用。本来不该沉的回被该沉的给带出来。
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关于丁香园铜及其化合物是工业生产和日常生活中常用的物质，下面是对铜及其化合物的探究．问题一：硫酸铜溶液的配制小明同学在实验室配制硫酸铜溶液时意外地发现有时会出现少量白色浑浊，对此，他和化学兴趣小组同学作出如下探究．
配置用水
有浑浊
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自来水
无浑浊
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市售纯净水
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试验编号
1
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饱和溶液
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现 象
白色浑浊→澄清图 1（1）形成浑浊条件分析：小明分别作出如图1配制方式，并记录现象如下：另外，他将配好的饱和且澄清的硫酸铜溶液滴入纯净水中有如上现象，在配制过程中形成白色浑浊的因素可能有、、等，因此，在实验室配制硫酸铜溶液时要用的配制用水是（选填“自来水、市售纯净水、医用蒸馏水”）、在（选填“较低温度、较高温度”）下配制稍浓些的硫酸铜溶液．（2）白色浑浊成分分析．[查阅资料]同学们上网查阅资料获知：此白色沉淀是一种名为碱式硫酸铜的物质，它可溶于酸，其有多种可能的组成，如Cu2（OH）2SO4、Cu3（OH）4SO4或Cu4（OH）6SO4等．为确定此次得到的白色沉淀究竟是哪种组成，小明设计实验如下：[设计实验]称取5.16g白色沉淀，分成两等份：一份溶于足量的中，向溶液中滴加足量的氯化钡溶液，过滤、洗涤、干燥，得2.33g白色固体；将另一份固体在空气中充分灼烧得到黑色固体1.60g．[得出结论]通过计算确定该白色沉淀中Cu2+、OH-、SO42-的质量比为，其化学式为．（写出计算过程，共4分）问题二：氢氧化铜与葡萄糖反应产物的分析利用新制氢氧化铜可以验证葡萄糖的存在．下面是三个研究性学习小组分别从不同层面对此实验开展的研究性学习活动：Ⅰ．研究性学习小组甲对教材实验结论葡萄糖与新制氢氧化铜反应生成的红色沉淀是Cu2O，提出质疑，他们认为红色沉淀不一定是氧化亚铜．为了确定红色沉淀的成分，开展了如下研究：提出猜想：红色沉淀可能是、或二者混合物．查阅资料：①氧化亚铜能与酸反应，得到+2价的铜离子和单质铜；②在空气中灼烧氧化亚铜生成氧化铜；③铜能与稀硝酸反应生成硝酸铜、水和一氧化氮．设计方案：方案1：取该红色沉淀溶于足量的稀硝酸中，观察溶液颜色变化；方案2：取该红色沉淀溶于足量的稀硫酸中，观察是否有残渣；方案3：称取红色沉淀ag，在空气中充分灼烧至完全变黑，并在干燥器里冷却，再称重，反复多次直到固体恒重，称得质量为bg，比较a、b关系；你认为合理的方案是．Ⅱ．研究性学习小组乙针对小组甲的质疑，设计新的探究方案，装置如图2所示．①通入氢气体积　　②反应前，红色沉淀+硬质玻璃管的总质量③完全反应后，红色固体+硬质玻璃管的总质量　　④实验前，干燥管（含其中固体）质量⑤硬质玻璃管质量　　⑥锌粒质量　　⑦稀硫酸中含溶质的量　　⑧实验后，干燥管（含其中固体）质量　　（已知氢气在加热条件下能与金属氧化物发生置换反应，且假设反应能完全进行）A．②④⑤⑧B．②③⑤C．①⑥⑦D．①②⑤你认为需要测定上述（选择正确的字母填空）即可确定上述红色沉淀成分．Ⅲ．研究性学习小组丙上网查阅得知，“2005年诺贝尔化学奖授予了三位研究绿色化学的科学家”．绿色化学强调对环境友好，实现零排放．“变废为宝”符合绿色化学要求．他们收集上述红色沉淀制备化学试剂--胆矾（CuSO4o5H2O）．他们设计了一个简单且符合绿色化学要求的实验方案：将红色固体反复灼烧后，用足量稀硫酸溶解，再将所得溶液蒸发结晶，减压过滤，用少量95%的酒精淋洗晶体，晾干或用滤纸吸干．晶体用酒精淋洗而不用水洗的好处是：． - 跟谁学
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在线咨询下载客户端关注微信公众号&&&分类：铜及其化合物是工业生产和日常生活中常用的物质，下面是对铜及其化合物的探究．问题一：硫酸铜溶液的配制小明同学在实验室配制硫酸铜溶液时意外地发现有时会出现少量白色浑浊，对此，他和化学兴趣小组同学作出如下探究．
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饱和溶液
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现 象
白色浑浊→澄清图 1（1）形成浑浊条件分析：小明分别作出如图1配制方式，并记录现象如下：另外，他将配好的饱和且澄清的硫酸铜溶液滴入纯净水中有如上现象，在配制过程中形成白色浑浊的因素可能有、、等，因此，在实验室配制硫酸铜溶液时要用的配制用水是（选填“自来水、市售纯净水、医用蒸馏水”）、在（选填“较低温度、较高温度”）下配制稍浓些的硫酸铜溶液．（2）白色浑浊成分分析．[查阅资料]同学们上网查阅资料获知：此白色沉淀是一种名为碱式硫酸铜的物质，它可溶于酸，其有多种可能的组成，如Cu2（OH）2SO4、Cu3（OH）4SO4或Cu4（OH）6SO4等．为确定此次得到的白色沉淀究竟是哪种组成，小明设计实验如下：[设计实验]称取5.16g白色沉淀，分成两等份：一份溶于足量的中，向溶液中滴加足量的氯化钡溶液，过滤、洗涤、干燥，得2.33g白色固体；将另一份固体在空气中充分灼烧得到黑色固体1.60g．[得出结论]通过计算确定该白色沉淀中Cu2+、OH-、SO42-的质量比为，其化学式为．（写出计算过程，共4分）问题二：氢氧化铜与葡萄糖反应产物的分析利用新制氢氧化铜可以验证葡萄糖的存在．下面是三个研究性学习小组分别从不同层面对此实验开展的研究性学习活动：Ⅰ．研究性学习小组甲对教材实验结论葡萄糖与新制氢氧化铜反应生成的红色沉淀是Cu2O，提出质疑，他们认为红色沉淀不一定是氧化亚铜．为了确定红色沉淀的成分，开展了如下研究：提出猜想：红色沉淀可能是、或二者混合物．查阅资料：①氧化亚铜能与酸反应，得到+2价的铜离子和单质铜；②在空气中灼烧氧化亚铜生成氧化铜；③铜能与稀硝酸反应生成硝酸铜、水和一氧化氮．设计方案：方案1：取该红色沉淀溶于足量的稀硝酸中，观察溶液颜色变化；方案2：取该红色沉淀溶于足量的稀硫酸中，观察是否有残渣；方案3：称取红色沉淀ag，在空气中充分灼烧至完全变黑，并在干燥器里冷却，再称重，反复多次直到固体恒重，称得质量为bg，比较a、b关系；你认为合理的方案是．Ⅱ．研究性学习小组乙针对小组甲的质疑，设计新的探究方案，装置如图2所示．①通入氢气体积　　②反应前，红色沉淀+硬质玻璃管的总质量③完全反应后，红色固体+硬质玻璃管的总质量　　④实验前，干燥管（含其中固体）质量⑤硬质玻璃管质量　　⑥锌粒质量　　⑦稀硫酸中含溶质的量　　⑧实验后，干燥管（含其中固体）质量　　（已知氢气在加热条件下能与金属氧化物发生置换反应，且假设反应能完全进行）A．②④⑤⑧B．②③⑤C．①⑥⑦D．①②⑤你认为需要测定上述（选择正确的字母填空）即可确定上述红色沉淀成分．Ⅲ．研究性学习小组丙上网查阅得知，“2005年诺贝尔化学奖授予了三位研究绿色化学的科学家”．绿色化学强调对环境友好，实现零排放．“变废为宝”符合绿色化学要求．他们收集上述红色沉淀制备化学试剂--胆矾（CuSO4o5H2O）．他们设计了一个简单且符合绿色化学要求的实验方案：将红色固体反复灼烧后，用足量稀硫酸溶解，再将所得溶液蒸发结晶，减压过滤，用少量95%的酒精淋洗晶体，晾干或用滤纸吸干．晶体用酒精淋洗而不用水洗的好处是：．铜及其化合物是工业生产和日常生活中常用的物质，下面是对铜及其化合物的探究．问题一：硫酸铜溶液的配制小明同学在实验室配制硫酸铜溶液时意外地发现有时会出现少量白色浑浊，对此，他和化学兴趣小组同学作出如下探究．
配置用水
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自来水
无浑浊
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饱和溶液
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白色浑浊→澄清图 1（1）形成浑浊条件分析：小明分别作出如图1配制方式，并记录现象如下：另外，他将配好的饱和且澄清的硫酸铜溶液滴入纯净水中有如上现象，在配制过程中形成白色浑浊的因素可能有、、等，因此，在实验室配制硫酸铜溶液时要用的配制用水是&（选填“自来水、市售纯净水、医用蒸馏水”）、在（选填“较低温度、较高温度”）下配制稍浓些的硫酸铜溶液．（2）白色浑浊成分分析．[查阅资料]同学们上网查阅资料获知：此白色沉淀是一种名为碱式硫酸铜的物质，它可溶于酸，其有多种可能的组成，如Cu2（OH）2SO4、Cu3（OH）4SO4或Cu4（OH）6SO4等．为确定此次得到的白色沉淀究竟是哪种组成，小明设计实验如下：[设计实验]称取5.16g白色沉淀，分成两等份：一份溶于足量的&中，向溶液中滴加足量的氯化钡溶液，过滤、洗涤、干燥，得2.33g白色固体；将另一份固体在空气中充分灼烧得到黑色固体1.60g．[得出结论]通过计算确定该白色沉淀中Cu2+、OH-、SO42-的质量比为，其化学式为．&（写出计算过程，共4分）问题二：氢氧化铜与葡萄糖反应产物的分析利用新制氢氧化铜可以验证葡萄糖的存在．下面是三个研究性学习小组分别从不同层面对此实验开展的研究性学习活动：Ⅰ．研究性学习小组甲对教材实验结论葡萄糖与新制氢氧化铜反应生成的红色沉淀是Cu2O，提出质疑，他们认为红色沉淀不一定是氧化亚铜．为了确定红色沉淀的成分，开展了如下研究：提出猜想：红色沉淀可能是、或二者混合物．查阅资料：①氧化亚铜能与酸反应，得到+2价的铜离子和单质铜；②在空气中灼烧氧化亚铜生成氧化铜；③铜能与稀硝酸反应生成硝酸铜、水和一氧化氮．设计方案：方案1：取该红色沉淀溶于足量的稀硝酸中，观察溶液颜色变化；方案2：取该红色沉淀溶于足量的稀硫酸中，观察是否有残渣；方案3：称取红色沉淀a&g，在空气中充分灼烧至完全变黑，并在干燥器里冷却，再称重，反复多次直到固体恒重，称得质量为b&g，比较a、b关系；你认为合理的方案是．Ⅱ．研究性学习小组乙针对小组甲的质疑，设计新的探究方案，装置如图2所示．①通入氢气体积　　②反应前，红色沉淀+硬质玻璃管的总质量③完全反应后，红色固体+硬质玻璃管的总质量　　④实验前，干燥管（含其中固体）质量⑤硬质玻璃管质量　　⑥锌粒质量　　⑦稀硫酸中含溶质的量　　⑧实验后，干燥管（含其中固体）质量　　（已知氢气在加热条件下能与金属氧化物发生置换反应，且假设反应能完全进行）A．②④⑤⑧B．②③⑤C．①⑥⑦D．①②⑤你认为需要测定上述&（选择正确的字母填空）即可确定上述红色沉淀成分．Ⅲ．研究性学习小组丙上网查阅得知，“2005年诺贝尔化学奖授予了三位研究绿色化学的科学家”．绿色化学强调对环境友好，实现零排放．“变废为宝”符合绿色化学要求．他们收集上述红色沉淀制备化学试剂--胆矾（CuSO4o5H2O）．他们设计了一个简单且符合绿色化学要求的实验方案：将红色固体反复灼烧后，用足量稀硫酸溶解，再将所得溶液蒸发结晶，减压过滤，用少量95%的酒精淋洗晶体，晾干或用滤纸吸干．晶体用酒精淋洗而不用水洗的好处是：．科目:难易度:最佳答案解：问题一：（1）在配制过程中形成白色浑浊的因素可能有：温度、水中杂质含量（或水的纯度）、硫酸铜溶液的浓度；在实验室配制硫酸铜溶液时要在低温下用医用蒸馏水配制；（2）氯化钡与硫酸铜反应的化学方程式为：CuSO4+BaCl2═BaSO4↓+CuCl2 ．2.33g硫酸钡中硫酸根（SO42-）的质量为：2.33××100%=2.33××100%=0.96g；碱式硫酸铜在空气灼烧产物为CuO、H2O、SO3．1.6gCuO中铜元素的质量（即Cu2+的质量）：1.6××100%=1.28g；&一份白色沉淀中OH-的质量为：5.16g÷2-1.28g-0.96g=0.34g．所以 白色沉淀中Cu2+、OH-、SO42-的个数比为：=2：2：1；所以白色沉淀的化学式为Cu2（OH）2SO4 ；问题二：Ⅰ、紧紧围绕“红色”来猜想，因为铜也是红色的，所以红色沉淀可能是Cu、Cu2O或者二者混合物；【设计方案】：方案1：由于Cu、Cu2O都能与稀硝酸反应，得到蓝色溶液，所以不行；方案2：Cu2O与稀硫酸反应有Cu生成，有残渣，Cu不与稀硫酸反应有残渣，所以方案2不行；方案3：铜在空气中灼烧生成CuO，Cu2O在空气中灼烧也生成氧化铜，但两者增加的质量不同．agCu在空气中灼烧，完全反应后质量变为&g；agCu2O在空气中灼烧，完全反应后质量变为 g；所以ag红色沉淀在空气中灼烧完全反应后，当b为&g时红色沉淀Cu；当b为为 g 时红色沉淀 Cu2O；当 g＜b＜&g 时红色沉淀为两者混合物；Ⅱ、解答此题时，应知道测定的原理；用此装置测定物质组成通常在如下两种途径：氢气与Cu2O反应的化学方程式为：Cu2O+H2 2Cu+H2O．结合装置图和化学方程式，硬质玻璃管+其中固体在反应前后质量差是Cu2O中O的质量，通过氧的质量可求出Cu2O的质量，再进一步判断是否含有Cu；此法需要测定的数据：B& ②③⑤；一般不用测氢气的体积、锌粒、稀硫酸中溶质的方法，因为在用氢气还原金属氧化物时，通常需要先通一段时间氢气，反应后还要再通一段时间氢气，再加上氢气并不都能与金属氧化物反应，部分氢气会白白浪费掉，所以实际参加反应氢气的量很难测定．Ⅲ、硫酸铜能溶于水但不能溶于酒精，晶体用酒精淋洗而不用水洗的好处是可以获得最多的晶体；故答案为：（1）温度；水中杂质含量（或水的纯度）；硫酸铜溶液的浓度；医用蒸馏水；较低温度；（2）稀盐酸（或稀硝酸）； 64：17：48； Cu2（OH）2SO4 ；Ⅰ． 铜；氧化亚铜；方案三；Ⅱ、B；&Ⅲ、减少晶体溶解．解析问题一：（1）观察表一，在10℃时，分别用自来水、市售纯净水、医用蒸馏水配制硫酸铜溶液，自来水有浑浊，另外两个无浑浊；说明有无浑浊现象与所选用的“水”有关，再细想这三种水的区别在于它们的纯度不同．自来水纯度最低，医用蒸馏水纯度最高．所以得出第一影响因素是水的纯度．用市售纯净水配制硫酸铜溶液时，在10℃无浑浊，30℃时有浑浊，说明浑浊的形成与温度有关．观察表二，当把饱和且澄清的硫酸铜溶液滴入一定量的纯净水时，浓度越来越大．说明浑浊与溶液的浓度有关．（2）白色浑浊分析题目中告诉我们，碱式硫酸铜溶于酸，所以我们应该联想到“一份溶于足量的__________中”填酸，常见的酸有稀盐酸、稀硫酸，但这里不能用稀硫酸，因为加入的稀硫酸也能与后面加入的氯化钡反应生成沉淀，使沉淀偏大．盐酸与碱式硫酸铜反应生成氯化铜、水和硫酸铜．根据书写方程式的步骤：写出反应方程式；氯化钡与硫酸铜反应的化学方程式为：CuSO4+BaCl2═BaSO4↓+CuCl2 ；分别减少2.33g硫酸钡中硫酸根（SO42-）的质量；1.6gCuO中铜元素的质量（即Cu2+的质量）；一份白色沉淀中的质量；即可求白色沉淀中Cu2+、OH-、SO42-的个数比；从而确定白色沉淀的化学式；问题二：氢氧化铜与葡萄糖反应产物的分析Ⅰ、紧紧围绕“红色”来猜想，因为铜也是红色的，所以红色沉淀可能是Cu、Cu2O或者二者混合物．【设计方案】：方案1：由于Cu、Cu2O都能与稀硝酸反应，进行分析；方案2：Cu2O与稀硫酸反应有Cu生成，有残渣，Cu不与稀硫酸反应有残渣，进行解答；方案3：铜在空气中灼烧生成CuO，Cu2O在空气中灼烧也生成氧化铜，但两者增加的质量不同；用极值法进行分析解答；确定红色沉淀物；Ⅱ、解答此题时，应知道测定的原理；用此装置测定物质组成通常在如下两种途径：氢气与Cu2O反应的化学方程式为：Cu2O+H2 2Cu+H2O．结合装置图和化学方程式，硬质玻璃管+其中固体在反应前后质量差是Cu2O中O的质量，通过氧的质量可求出Cu2O的质量，再进一步判断是否含有Cu；一般不用测氢气的体积、锌粒、稀硫酸中溶质的方法，因为在用氢气还原金属氧化物时，通常需要先通一段时间氢气，反应后还要再通一段时间氢气，再加上氢气并不都能与金属氧化物反应，部分氢气会白白浪费掉，所以实际参加反应氢气的量很难测定．Ⅲ、根据硫酸铜能溶于水但不能溶于酒精，进行分析解答．知识点:&&&&&&&&基础试题拔高试题热门知识点最新试题
关注我们官方微信关于跟谁学服务支持帮助中心新品名称：CAS NO：319
新品类型：全新产品
新品型号：热稳定性
新品产地：山东潍坊
新品品牌：
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发布日期：
公司名称：
经营模式：生产型
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分子式：C12H18Br6
用途：六溴环十二烷是一种添加型阻燃剂，主要用于各种热塑性和热固性聚合物材料中，特别是适用于EPS（发泡聚苯乙烯）和其他苯乙烯树脂中，此外它还适用于织物、丁苯胶、粘合剂、涂料以及不饱和聚酯进行阻燃处理。
包装：每袋净重25公斤，内衬聚乙烯塑料薄膜袋，外用纸塑复合袋包装；也可根据用于要求加工。- 六溴环十二烷 (潍坊万博化工有限公司） 的 详 细 说 明
CAS&NO： 分子式：C12H18Br6 用途：六溴环十二烷是一种添加型阻燃剂，主要用于各种热塑性和热固性聚合物材料中，特别是适用于EPS（发泡聚苯乙烯）和其他苯乙烯树脂中，此外它还适用于织物、丁苯胶、粘合剂、涂料以及不饱和聚酯进行阻燃处理。 指标 项目&&&&&&&&特级&&&&&&&&&&&&&优级&&&&&&&&&&&一级 外观&&&&&&&白色粉末&&&&&&&&&白色粉末&&&&&&白色粉末 熔点&&&&&&&185-195&&&&&&&&&&176-185&&&&&&&&168-176 溴含量&&&&&&74-75&&&&&&&&&&&&73-75&&&&&&&&&&72-75 色相&&&&&&&&&&&30&&&&&&&&&&&&&&30&&&&&&&&&&&&&60 挥发份&&&&&&&&0.3&&&&&&&&&&&&&&0.5&&&&&&&&&&&&&1 包装：每袋净重25公斤，内衬聚乙烯塑料薄膜袋，外用纸塑复合袋包装;也可根据用于要求加工。
本公司还供应上述产品的同类产品：
潍坊万博化工有限公司是一家专业从事溴系阻燃剂及农药除草剂开发生产的企业，创建于2006年,法定代表人袁训东。公司位于山东省寿光市侯镇大地化工园，交通便利。
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t℃时，CuSO4在水中溶解度为25g，将32gCuSO4白色粉末加入到mg水中，形成饱和CuSO4溶液，并有CuSO4?5H2O晶体析出，
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t℃时，CuSO4在水中溶解度为25g，将32gCuSO4白色粉末加入到mg水中，形成饱和CuSO4溶液，并有CuSO4?5H2O晶体析出，则m的取值范围是（　　）A．18g≤m≤128gB．36gm180gC．18gm128gD．36g≤m≤180g
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