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引物设计错配位点过多超过9个可以吗
引物设计错配位点过多超过9个可以吗？错配位点是否影响过大？
你好，我是用primer5.0设计的引物，可是实在找不到没有错配位点的引物了，即使有二聚体也较严重
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随时随地聊科研引物设计中可能被忽略的几个细节(引物设计,引物,含量,碱基) - PCR实验 - 生物秀
标题: 引物设计中可能被忽略的几个细节(引物设计,引物,含量,碱基)
摘要: [引物设计中可能被忽略的几个细节(引物设计,引物,含量,碱基)] 最近PCR做的比较多，像启动子克隆，RT-PCR，BSP,MSP都做过，引物多数由自己设计，稍有一些心得。下面就引物设计中一些可能被大家忽视的细节发表一些愚见。1
引物的GT含量对形成引物二聚体有很大影响。 我们一般会认为，引物形成二聚体是因为引物自身形成发夹结构，或者引物间形成dimer或cross dimer。事实上并不仅仅如此。我曾经用数十种引物跑过电泳，发现条带间的亮度差别很大。分析了各 关键词:[引物 含量 碱基 引物设计 退火温度 条带 稳定性]……
最近PCR做的比较多，像启动子克隆，RT-PCR，BSP,MSP都做过，引物多数由自己设计，稍有一些心得。下面就引物设计中一些可能被大家忽视的细节发表一些愚见。1. 引物的GT含量对形成引物二聚体有很大影响。 我们一般会认为，引物形成二聚体是因为引物自身形成发夹结构，或者引物间形成dimer或cross dimer。事实上并不仅仅如此。我曾经用数十种引物跑过电泳，发现条带间的亮度差别很大。分析了各条引物的发夹结构及dimer的形成能力，发现并不与条带亮度正相关。后来通过各种碱基含量分析，得出一个结论，GT含量高的，特别是G含量高的，电泳时往往会得到较亮的条带。这给我们一个提示：引物设计时，要想避免PCR产物中出现引物二聚体，应选择AC含量高的引物。2. 引物的退火温度和GC含量并不是严格正相关。 我们设计引物时往往会选择让两条引物具有相同的GC含量。但实际上，相同GC百分比的相同长度引物，退火温度可能相差5度以上。退火温度是由引物与模板结合的稳定程度来决定的，但这种稳定程度除与GC含量相关外，还与碱基排列顺序有关。这是因为，双螺旋中，每个碱基对的两个碱基并不是一直处于同一平面，这与碱基对及碱基排列顺序有关，而这种双螺旋的构象影响了引物结合的稳定性。3. 设计引物时，应尽量使引物5‘端稳定，3’端不稳定 3‘端的稳定性对引物特异性至关重要，这是众所周知的。而不稳定的3’端会使错误配对的3‘端变得极不稳定。同时，5’端的稳定性可以保证引物与模板的紧密结合。能够分析比较是科研工作必备要素，鼓励加分，请朋友谨慎参考
回复这样说比较抽象，最好举个例子回复关于第一点，高GT含量容易导致二级结构的形成，算是我的个人经验，不知道朋友们有没有同样的体会。其实也是有理论根据的。在沃森的《基因的分子学》里提到过，在RNA中存在非常规碱基配对，GT配对就是其中一种。我想，做为单链的DNA引物，它在溶液里的行为应该是和RNA相似的。关于第二点，对premier5比较熟悉的朋友们应该知道，premier可以评估任何5个连续碱基的稳定性，比如AAAAA就比TTTTT要稳定的多，而TTTTT甚至比CTTTC稳定。第三点是premier 筛选引物的一条准则，可能是很多人没有注意的地方。回复受益！回复谢谢楼主回复设计引物时，应尽量使引物5‘端稳定，3’端不稳定你是专指在进行MSP和BSP是所用到的引物吧?回复不是，所有PCR都适用回复最近正在学习RT-PCR，谢谢分享哈回复感谢！回复你好，可是很多引物设计原则要求3‘端要与模板结合牢固，不过3’端稳定性差的话，就不容易结合到模板上，也就没法延伸了？我也是刚开始学，不知道对不对？回复你好，可是很多引物设计原则要求3‘端要与模板结合牢固，不过3’端稳定性差的话，就不容易结合到模板上，也就没法延伸了？我也是刚开始学，不知道对不对？The stability of the primer determines its false priming efficiency. An ideal primer has a stable 5" end and an unstable 3" end.If the primer has a stable 3" end, it will bond to a site that is complementary to it other than the target with its 5" end hanging off the edge. It may then lead to secondary bands.回复The stability of the primer determines its false priming efficiency. An ideal primer has a stable 5" end and an unstable 3" end.If the primer has a stable 3" end, it will bond to a site that is complementary to it other than the target with its 5" end hanging off the edge. It may then lead to secondary bands.我理解的知识也是说必须使得3末端的稳定性高，否则形成的引物模板结合物不稳定，很难延伸。回复不错。O(∩_∩)O~。。。回复不错哦，O(∩_∩)O~。。。。回复我同意3‘端应该不稳定些，不然就等着错配吧。。。。回复看了大家说的，但是还是搞不清怎样才能使5’端稳定而3’端不稳定呢？谢谢啊回复楼主总结归纳分析的很好。这些要点在实际引物设计中是经常使用的，只是没有提炼总结出来。比如引物设计中，引物3’端一般出现A或T比较好，至于5"端要求不是很严格，我的经验是该段碱基设计用来平衡引物的GC含量，避免引物与引物之间出现大的Tm差或GC含量。回复同意3‘端应该稳定些回复我觉得lz这三条都有一定道理，具体设计引物时候是要综合考虑全面来权衡的，比如3‘端不稳定会使结合模板不牢，但是这个时候我们可以适当加大引物GC含量，而且不论总的退火温度或者GC含量如何，连续的多AT都是不推荐的回复大家好，我最近一直在做RT-PCR,简直要疯，我扩增人基质金属1和9（MMP-1,MMP-9）.用GAPDH做内参。引物是在文献上找的分别是：MMP-1:上游引物5"--AGAGCAGATGTGGACCATGC--3" 下游引物5"--ACCGGACTTCATCTCTGTCG--3".MMP-9:上游引物5"-TGGGCTTAGATCATTCCTCAGTGC-3" 下游引物5"-CCACCTGGTTCAACTCACTCCG-3".GAPDH:5"-ggtcggagtcaacggatttg-3",5"-atgagccccagccttctccat-3" .同一份c内参58度就P出来了，可是MMP-9和MMP-1搞死出不来，每次都是二聚体。温度从55，56，57，28，60，62，66，69，都跑了，我就怀疑是不是引物设计的问题。结果我从园里下载了 primer 5.0检测一下有点问题，但是我同样用这个检测已经扩出来的内参 还是有问题，我茫然了。我另外该用软件设计的是这样的不知道能不能用，请大家帮帮忙，指条路。试验从2月份就开始了，我现在都不敢去见老板了。。。。。 primer5.0设计：MMP-1:sense 5"-AGGGTCAAGCAGACATCA-3‘ antisense 5"-CAGAAGGGCAAGCATTAG-3" MMP-9:sense 5"-CCTTTGGACACGCACGAC-3" antisense 5"-TC GGCACTTGATGACTGTTG-3’非常感谢，盼回复！回复xiexiexie回复学习了:)回复想问一下楼主，有人说引物的3‘端不能落在密码子的第三位，原因是因为密码子第三位的简并性，那合成和密码子又有什么关系，难道有简并性就可以错配么，不理解，麻烦帮忙详细解释一下，非常感谢回复想问一下楼主，有人说引物的3‘端不能落在密码子的第三位，原因是因为密码子第三位的简并性，那DNA合成和密码子又有什么关系，难道有简并性就可以错配么，不理解，麻烦帮忙详细解释一下，非常感谢这里应该不涉及DNA的合成和密码子关系的问题吧。说到密码子的简并性，我想其中考虑到的是SNP的问题。一般来讲，引物的3‘端是要严格配对的，而密码子第三位的简并性，可能导致引物末端配对错误，从而导致扩增失败。不过在我看来，上述情况应属小概率事件，无需考虑的。
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【求助】设计的引物都有错配，可以用不
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这个帖子发布于9年零239天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
我做大鼠p38RT-pcr，查出来的是mRNA序列，用primer 5.0设计的引物都含有错配的情况，各位高手指点一下要怎么解决啊？帮忙设计一下吧！
1 ggagcccgag cgggcgctag agcgcgagcg gctgtcgcgc agcgtcggcg tgcgctcccc
61 agggagcggc tgcaagggga ccgcggcggg agctgcgtcg aaccgtgcag ccggctcccg
121 ctcgttgccg aggctcgtag gtgccgccgc ggctgacagg agccgtgggt cgcagcctcc
181 acacctgcgc gggcgcgggg tcgggtctgc cgcgggcgag cgagagggcg cagaggagag
241 cgtgcggctg caggcagggg ccctcgctcg gccacctcgt cgccgcgctg ccgccgctgg
301 aagatgtcgc aggagaggcc cacgttctac cggcaggagc tgaacaagac cgtctgggag
361 gtgcccgagc gataccagaa cctgtccccg gtgggctcgg gagcctacgg ctcggtgtgt
421 gctgcttttg atacaaagac gggacatcgt gtggcagtga agaagctgtc gagaccgttt
481 cagtccatca ttcacgccaa aaggacctac agggagctgc ggctgctgaa gcacatgaag
541 cacgagaatg tgattggtct gttggatgtg tttacacctg caaggtccct ggaggaattc
601 aacgatgtgt acctggtgac ccatctcatg ggggcagacc tgaacaacat cgtgaagtgt
661 cagaagctta ccgatgacca cgttcagttt cttatctacc agatcctgcg agggctgaag
721 tatatacact cggctgacat aatccacagg gacctaaagc ccagcaacct cgctgtgaat
781 gaagactgtg agctgaagat tctggatttt gggctggctc ggcacactga tgacgaaatg
841 accggctacg tggctacccg gtggtacaga gcccccgaga ttatgctgaa ttggatgcac
901 tacaaccaga cagtggatat ttggtccgtg ggctgcatca tggctgagct gttgaccgga
961 agaacgttgt ttcctggtac agaccatatt aaccagcttc agcagataat gcgtctgacg
1021 gggacacccc ctgcttatct cattaacagg atgccaagcc atgaggcaag aaactacatt
1081 cagtctctgg cccagatgcc gaagatgaac ttcgcaaatg tatttattgg tgccaatccc
1141 ctggctgtcg acctgctgga aaagatgctg gttttggact cggataagag gatcacagca
1201 gcccaagctc ttgcgcatgc ctactttgct cagtaccacg accctgatga tgagccagtg
1261 gctgaccctt atgaccagtc ctttgaaagc agggacctcc ttatagacga atggaagagc
1321 ctgacctacg atgaagtcat tagctttgtg ccaccgcccc ttgaccaaga agaaatggag
1381 tcctgagcac cttgcttctg ttctgtccat cccacttcac tgtgagggga aggcctgttc
1441 atgggaactc tccaaatacc attcaagtgc ctcttgttga aagattcctt catggtggaa
1501 gggggtgcat gtatgtgcgt agtgtttgtg tgtgtctgtc tgtctgtccg tttgtccatg
1561 tatctttgtg gaagtcattg tgatggcagt gacttcatga gtggtagatg ctccttggca
1621 gtctgcctgc tctctcagag tccgggcagg ccgatgggaa ctgccgtctc cttagggatg
1681 tgtgtgtgta tgttaagtgc aaagtaagaa tattaaaata tccctgttcc tagttacctt
1741 gccacttcgg cttctcctgt ggccctgcct ttaccatatc acagtgacag agagaggctg
1801 cttcaggtct gaggctatcc ctcagccatg cataaagccc aagagaacca actggctcct
1861 gggctctagc ctgtgatcgg cttgctcatg tcctcagaac ctgtcagtct gtttgtgcct
1921 taaaaggaga gaagggcgcg ttgtggtagt tacagaatct cagttgctgg cgttctgagc
1981 caggcaaggc acagggctgt tggatggcca gtggggagct ggacaaaaca aggcagcctt
2041 caaggaggcc atgggtgcat gtgtgcatga gtgtatgtgc agccgccctc cctcacctcc
2101 aggagcaagc tgttttctat gcttacctaa gttcacctca gtgcagaggt ctccagtgcc
2161 aggcacaggc tcctgccatc agtagcttcc tatgtcatct tcacgtcatg cgggtgtttg
2221 catgctgtgc tctggagctt gtcctgtctt ctggaagccc tgggccgggc gtgtgaagac
2281 ttcccagcag tcctatccac gcacctcagc tgaggccacg ggcacactgc tgcttcctca
2341 ctccagctac gttgtgttga acacaactga tcctccaggt gcttgtggtg caggaaacgg
2401 gacgaacaga gcacctgaac ccttgccatc tgacatcacc gacacaggag aacagtcctc
2461 tcctctcctc tcctctcctc tcctaggaca gtccccagct ctggaatcat gttcttctca
2521 ctcatggtag ccagctaaga aagctgcaaa ccgaacaaag ggagaaccga gctcctgaag
2581 ccaggagctc cttttactgt ccttctcaaa atagggtcat tagacacagc caagtcgtca
2641 aaggcccctt tccttgtacg gggccccccc gcccccggca gcttgacact gatttcagtg
2701 tctatttggg gagaaagcaa ttttgtcttg gaattttgta tgttgtagga atccttagag
2761 agtgtggttc cttctgatgg ggagaaaggg caaattattt taatattttg tatttcacct
2821 ttataaacat gaatcctcag gggtgaagaa ctgtttgcat aattttctga atttcaggca
2881 ctttgtgcta tatgaggacc catatattta agctttttgt gcagtaagaa agtgtaaagc
2941 caattccagt gttggacgaa acaggtctcg tatttaggtc aaggtgtctc cattctctat
3001 cagtgcaggg acatgcagtt ctgtggggca gggtaggacc ctgcatcatc tggagcccag
3061 aaggaggccg actggccagg cctcaccgcc tcagtatgca gtccagctcc acgtcatccc
3121 ctcacaatgg ttagtagcaa cgtctgggtt tgaacgccag gcgtggttat tttattgagg
3181 atgcctttgc acatgtggcc atgctgtgtt aggactgtgc cccagggccc ggacttgaag
3241 ctagagctgg cagaagagct cctggcatcc atggtgcgat gctgccgcca cccagtttct
3301 ccattggaag acaagggaat gagaagactg ctgtgtatgt gtatttgtga acttggttgt
3361 gatctggtat gccataggat gtcagacaat accactggtt aaagtaaagc ctatttttca
3421 gattcaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa gg
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1. 我的建议是设计的引物TM值尽量高一些，提高退火温度能适当减少错配引起的非特异性扩增。2. 错配是难免的，但要看错配所结合的位置和扩增的方向，不是每个错配都会引起非特异性扩增，与扩增位点相反方向的引物一般不会影响扩增结果。3. 再一点就是，如果你的错配实在是难免，如果其非特异性扩增产物大小与你要的片段大小差异很大也不太影响结果。4. 错配3‘端如果不能结合我觉得对结果影响也不大。5. 设计的引物适当减少错配结合的碱基数，越少越好。具体的设计你可以自己尝试。
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借地问同样的问题：我记得看过一个文章说在PP5里，下面的一些什么错配呀，二聚体一类的东西，最好都是NONE，但我也遇到了，都有FOUND的情况，请问怎么解决？？还是具体的一个一个引物去看呀？？谢谢！！！
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设计引物时，二聚体，错配之类在多数时候是不能完全避免的。软件提示有二聚体，错配之类时，要看看二聚体、错配等的严重情况。我有一同学的引物有32bp左右吧，就有10连续的个碱基形成二聚体，但经过若干次摸索之后，还是P出来了。（可能是运气好一点吧，^_^） 当然引物设计非常重要，要是设计地好，可能就不用走这么多弯路 了。
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因为你就想要某段序列,这个时候错配的问题可能是不可避免的.Primer5.0只能告诉你哪里有错配,但错配的程度解决不了.这时候需要用另外一个软件Oligo6.0,把用Primer设计好的引物输入到里面,看一下错配的程度,首先看引物同模板结合的效率(Priming efficiency)错配的Priming efficiency比较一下,就可知道错配的程度.如果相对接近,那么只能PASS了.如果相差很大,说明错配影响不大.但这样也不能保证就没有其它地方的错配了,因为还不知道基因组中其它基因的序列和引物的同源性,所以最好到NCBI中再BLAST一下,如果没有明显错配就OVER了.
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关于丁香园关注今日：2 | 主题：274974
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【原创】引物特异性 已经设计好引物 在线引物blast 比对
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这个帖子发布于2年零19天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
本帖介绍了在PubMed主页进入引物blast的操作，有需要的战友可以浏览图片。稍等片刻，系统运行中~
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丁香园发帖子时上传多张图片时图片，完成后发现图片的顺序怎么老是不对，我已经对图片按照名字排序好了的，然后就是不对，害得我编辑了好几次才把顺序整理好，应该改进一下才好。
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非常感谢前辈！！！！！！原来引物是这么blast的。。。天哪我之前引物不是在这里验证特异性的。。。赶紧去看看我的引物有没有问题。。。
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客气了，我也是入门，相互学习！
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喔噻！刚刚用检索词“primer blast”百度了一下，没有想到3年前就有高手捷足先登发了和我的帖子相似的说明！早知道就不必花费1个小时捣鼓这个帖子了，%&_&%不过这位高手没有说明from***to***里面应该填什么；定义了accession号后，其实里面填写的是每个碱基在整个基因组中的位置，这样分析的比较好，可以直接给出primer pair。
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很感谢楼主的分享，虽然看到很多，真心的觉得楼主的这个不错。非常容易理解！
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这个还是有点不明白哦，求教
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这里面填写的是序列的位置呀，比如你的某一引物要位于从某一个位置到另一个位置，比如从到（就是上游引物所在的范围），这个帖子后面的两张图可以说明这个问题：这样应该很清楚了吧，您再不明白我也没有办法了，^_^
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嘿嘿，后来明白了，之前我弄了是这样子，可是怎么都不出来，谢谢！
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楼主，想问一下，尽管引物可能与其他基因结合，但是可能两个引物在其他基因上的扩增产物需要1000多个bp，而目的基因在设计的引物下扩增出300bp，这样的话在你的PCR条件下是不是就不能扩增出其他基因上的片段啊？
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您好，我们共同探讨。我认为1000bp扩增和300bp扩增没有什么太大的区别；如果引物和300bp、1000bp都能配对，那这样的引物尽量不要用。不过设计引物首先看模板是什么，如果是基因组DNA或者是由mRNA反转录的cDNA，特异性肯定要高；如果模板是质粒，则对特异性没有太大要求，随便手写都可以的。设计引物我感觉没有那么难吧，不过在扩增基因组DNA中的目的基因时，如果错配率很高，应该考虑是否重新设计引物。
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明天试试我的引物有没有问题。
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标记撒，嘻嘻
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如果不是自己设计的引物，不知道位置，可以比对吗
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引物是当然可以的。知道序列可以比对。
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新东方之剑 引物是当然可以的。知道序列可以比对。楼主您好，我对自己的引物进行了测试，但是对结果分析有点不太明白，能麻烦您帮我看一下分析结果吗？谢谢
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想问一下楼主 ，blast引物特异性的监测，product 的长度是有什么设计原则吗？要不要说跟自己的目的基因的长度差不多，还是说特异性检验就是要检测所有可能结合产生的产物呢？在参数设置方面还是有点疑惑。期待版主解答。
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