请教双酶切反应体系的建立_百度知道解决时间: 10:45
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大家好，问你们一个问题，我以前用takara的ECOR1和KPN1老是切不下来，每次切跑胶都是白板，现在我要换fermentas的这俩个酶，请问酶切体系和buffer怎么设计比较合适？我们这边用15ul体系酶切，可以同时加两种酶吗？能切下来吗？谢谢各位仁兄指点！
提问者： [] [] []
回答者： [] [] []
一级 一星助者
怎么切的，是两个同时在一种buffer里切的还是分开切的，两个酶的buffer不一样的话需要看说明书上推荐的buffer，不然的话就需要单独切了，回收之后再切另外一个，这样的话损失可能会大一些，但是结果比较保险。
体系不管多大，都有相应的buffer，只要将buffer变为1X工作浓度就行了，两个同时切的话，需要注意酶的量，看单位是多少，一般是1ul的酶切1ug的质粒或者其它DNA序列，尽量酶的体积不能超过体系的10%，因为里面含有甘油，可能会影响酶切效率。
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其他回答 (21)
takara的ECOR1和KPN1这两个酶的buffer不一样，ECOR1是H buffer，KPN1是L buffer，如果双酶切的话，参照这两个酶使用说明书，用M buffer比较好！
一般酶切体系都是按照酶使用说明书上的体系！
回答者： 一级 一星助者
takara的商品目录上基本涵盖了常用的单、双酶切体系，我做过好几个，无论是单酶切还是双酶切，效果都挺好的，我更喜欢用双酶切，损失少而且简单，不像单酶切还要回收一次。但有时双酶切由于所用BUFFER原因，存在效率问题，应该多参照说明说操作，takara的东西还是不错的，呵呵
回答者： 一级 一星助者
建议你去fermentas的官方网站看看，那里会给你提供不同内切酶在不同共用buffer里的活力，找个合适的就行了，体系嘛，上面的说的很多了，按照说明书就行了
回答者： 一级 一星助者
请问你们双酶切后是怎么回收的目的片段的？一定要胶回收吗？我的酶切除去的片段只有20多bp，可不可以不用胶回收直接用回收试剂盒呀？多谢了
回答者： 一级 一星助者
fermentas的酶切体系
temp 根据回收效率为70%计算 回收回来保证50ng/ul
KpnI(一般Acc65I更好用） 1ul
O bf&&& 2ul
水&&&&& -ul
回答者： 一级 一星助者
& 这是fermentas双酶切体系设计的网址，很管用的，选中自己所用的 两个酶在SBMIT 就用了&~~
回答者： 一级 一星助者
一般双酶切选用buffer的原则是两种酶在其中都能高效运作，fermentas公司会给你一张酶和buffer的表单，不同的酶都有好几种buffer但是只有一种是最适合，你就在这个表单上找出两种酶都能运作的BUFFER，并非一定要最佳，也可以双酶切。如果是在找不到共有的buffer可以先单切然后再换buffer继续另外一种。
回答者： 一级 一星助者
回答者： 一级 一星助者
fermentas&& 体系这两个酶用 1X Ybuffer
两个酶各1&
10* Y buffer& 2
回答者： 一级 一星助者
网站上不是推荐了分步法吗，我分步切了，可是怎么都出不来，郁闷
回答者： 一级 一星助者
你试试用100uL体系，15uL不太好做，因为浓了粘度大，酶的效果就差。只是多加点水和buffer。酶不要在buffer之前加。buffer最佳选择是M。
回答者： 一级 一星助者
按fermentas的官方网站上推荐的方法来做是最好的。
回答者： 一级 一星助者
fermentas家的酶现在用的是通用buffer吧 是Buffer Tango.
但是我觉的你的酶切 切不出来不是酶的问题，就算切不出来带不对也不可能是白板 总得有dna在里面吧 有dna就总得有亮的地方吧
&fermentas的酶没有TAKALA的好用，除了T4连接酶。fermentas的酶真的没法用。
回答者： 一级 一星助者
&那要看你的两个内切酶是否是一样的 buffer， 如果不是就应该分别単酶切了。我做的双酶切体系一般是20ul，酶的量不超过体系的十分之一，也就是2ul，吸取时注意避免枪头外壁附着过多酶量，以防止STAR活性；buffer2ul；重组质粒10ul；用 dd水补足到20ul即可。
回答者： 一级 一星助者
回答者： 一级 一星助者
我觉得酶切用20ul体系更好一些，这样可以稀释甘油，因为酶是保存在50%甘油中的，体系小其浓度就高，会影响酶切活性。另外fermentas&新推出的酶大部分有通用Buffer，可免去分步酶切的烦恼，而且Buffer本身都加了Loading Buffer，切完可直接上样电泳。看看两种酶的Buffer只要开头的字母及后面的编号是一样的，就是通用Buffer，可以同时酶切。另外不明白的可咨询试剂公司的业务员。
回答者： 一级 一星助者
我觉得可能是你的质粒量不够，我做的低copy质粒用这两个酶酶切，很好用的
回答者： 一级 一星助者
建议用MCbuffer,我也是用这两个酶做
回答者： 一级 一星助者
曾经也用过,酶的使用说明里,Kpn I跟其他酶都不怎么合得来,最好用专用BUFFER分两次切
回答者： 一级 一星助者
20ul体系酶切量比较少，我常用50ul体系，这样回收的量会多一些。buffer可以根据说明书选择一下，最好是一次酶切，快捷省事儿。
回答者： 一级 一星助者
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载体构建中双酶切问题
最近在构建PET28a的载体，一个月了一直没有成功。有个问题是我的28a空载酶切后比原空质粒跑的快，不知道是什么原因？附上酶切体系 总体系30ul&&质粒+水:20+5ul&&EcoR 1ul.&&Xhol1ul.&&10×H buffer&&3ul& &37°酶切3h。水浴和培养箱都试过。转化的酶连体系4:1和3:2也都试过，不知道是没有切开还是没有连上的。师姐说没有切开的可能性大。不知道怎么判断是双酶切都切开了？
酶切之后胶回收的产物直接转化？你是说质粒酶切后的产物吧？直接转化能够长出菌，它的抗性和是否酶切完全有关系吗？我不太理解。另外会不会出现其中一个多克隆位点切开了，另一个多克隆位点没有切开的情况？这种情况怎么判断
分开做两个单酶切验证，如果单酶切都切开了就说明双酶切也应该没问题，宁外反应体系可以做大点到50ul，保温可以到PCR仪上做，方便:D
哪个公司的酶，只要切半小时就够了？还有酶切时间和载体大小有关系吗？
fermentas的，其他公司的也一样，与载体大小没太大关系
实验室用的 Takara的酶，而且师兄师姐们的protocol都是切2.5~3个小时。另外还想请教一下酶连体系是怎么确定的。实验室能够测的酶切后浓度，师姐说片段/质粒一般在3:1，可是这样下来，我算得的体积都是质粒加的比片段多。还想请教一下，你们怎么做的呢
takara的酶也是在五分钟左右就能切断九成以上的片段，切半小时足矣，不用测浓度，10微升连接体系，外源加7，载体加1，我这边几乎是百发百中。
我切的28a的空载一直有问题，后来没办法只能用构好的载体把28a载体切下来，把基因换上去（两个载体酶切位点相同），可是现在又是酶连一直连不上。两个酶一个是粘性末端，一个平末端。不知道这种情况怎么连？载体构的想吐
理论上 超螺旋比开环快
说实话，对于构建，我的了解不是很多，不过我也遇到这问题，之前我酶切了六次，新旧质粒全试了，电泳就出现明显的想要的条带，可是，奇迹出现了，尼玛就是连不上，好在最终脸上了，不解啊。。。你说的粘性和平末端我不太清楚，可能我做的比较简单
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求助，怎样保证双酶切彻底
我怎么保证用BamHI和SmaI同时双酶切这个质粒时，酶切完全。（中间仅18bp）用什么方法能够证明
再请问一下，你通常用什么方法失活此酶
第一种酶失活后，加入第二种酶时，是不是就将此视为质粒，还要继续加bffer，酶水等
水浴加热或干浴加热，只要达到酶失活温度就行，但不能超过，否则可能对DNA有影响
不需要再加其他了，直接加第二种酶就是ok
看起来效果还可以，大小是不是你要的。因为你两个酶切位点之间的片段较小，你那么大的marker，我估计你用的1~1.5%的胶，这是分不开那么下的DNA片段的。要浓度更大的才能分开。还有，忘了和你说了，加第二种酶可以直接在失活后的酶切管里加就是了（灭活前或灭活后可以取出一点做control），不用重新做体系。
是我要的条带，加大胶的浓度弄够分出来18bp？还有酶灭火后，之前第一次加的buffer对于后来的酶切还有作用吗
产物控制在200bp
pcr控制在25cycle
1小时内即可pcr完成！
利于早知道结果，间接缓解强迫、自虐！！
酶切后体系直接作为模板是不是有影响，要醇沉
直接用天根kit溶液回收后再作为模板
过柱子回收几十bp的小片段是收不到的
理论上是可以分开的，你查一下胶浓度对应的能分开的bp大小。失活后酶就没有活性了，不会影响。
各种酶的活性是不一样的，有的酶加热也没法使其失活，这时需要通过纯化的方法提取质粒
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