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【求助】为什么我在分离淋巴细胞层时加分离液后没有出现白膜层？？
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这个帖子发布于3年零65天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
各位前辈，本人刚开始分离做分离外周血淋巴细胞分离，上次师姐带着很好的分离出了白膜层，但是这次独立操作却没有出现，请前辈们帮忙下：1、取外周血8ml封存于含EDTA管中，因为中午不好等台，就放在4度冰箱等待下午操作。2、用离心机1000R，20分钟离心后加入分离液（分离液未完全复温），在离心机下2000R，15分钟。请前辈们指点迷津。
不知道邀请谁？试试他们
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前面1000R，20分钟没必要的，颠倒混匀血液，加入等体积PBS混匀，再加入到等体积的分离液中，缓缓延壁加入，然后离心，设定室温25度，2000R，15~20分钟，这里要注意的是设置缓升缓降，以及加入到分离液时要缓缓加入，动作剧烈了，或者升降速度调快了，都会导致无法很好地进行密度离心，有可能会出现你所说的情况
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同上 前20分钟没有必要 我们一般一次取20ML血 事先放入肝素抗凝 上下来回颠倒几次 拿回来立即做实验 放入20ml等体积PBS混匀 另外建议最好取7个15ml离心管 每管放入3mlFICOLL（先预热）恢复至常温 每管再加入6ml稀释血 最好沿管壁倾斜缓慢加 最后放在4度离心机 那种大的离心机里离心 不带刹车的 缓升缓降 2000转离心30分钟 取出来 吸白膜时 最好用长枪头把上面血浆吸掉一些再吸白膜 另可多吸些FICOLL 也不要怕浪费 最后吸完后用5倍的PBS破环FIcoll的密度 离心去掉上清就可以了 根据需要再多洗几次就可以了
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分离过无数次的PBMC，很愿意将我的经验与你分享：将抗凝的外周血等量稀释，小心地叠加在等量的平衡至室温的淋巴细胞分离液上，2000 rpm 20 min。15 ml、50 ml 离心管均可，若分离血液的量较大的时候，比如100 ml、200 ml，用15 ml 离心管就太费事了，可用50 ml 离心管。分离液可比稀释血液少加一些，这样可减少离心管的数量，节省工作效率。注意离心前血细胞若有少量下沉并不影响结果。要点：离心时要关闭刹车挡；白膜层细胞要用5倍体积的1640或PBS洗涤;室温离心
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ml_wang edited on
ml_wang 分离过无数次的PBMC，很愿意将我的经验与你分享：将抗凝的外周血等量稀释，小心地叠加在等量的平衡至室温的淋巴细胞分离液上，2000 rpm 20 min。15 ml、50 ml 离心管均可，若分离血液的量较大的时候，比如100 ml、200 ml，用15 ml 离心管就太费事了，可用50 ml 离心管。分离液可比稀释血液少加一些，这样可减少离心管的数量，节省工作效率。注意离心前血细胞若有少量下沉并不影响结果。要点：离心时要关闭刹车挡；白膜层细胞要用5倍体积的1640或PBS洗涤;室温离心感谢您的回答，另外我想询问下：可不可以不用PBS稀释外周血，直接加入到淋巴细胞分离液？
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没试过。这一步关系到血液的粘稠度和密度，我一直都是用PBS或1640稀释后，再分离的，当然PBS可稍少加一些，这我做过，不影响分离效果。
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关于丁香园关于淋巴细胞分离的专题
研细末，制成药线。用于治疗淋巴结破溃后，瘘管肉芽组织不新鲜，脓腐难脱者。将药线插入瘘管，外用金黄膏盖贴。
淋巴细胞分离热门问答
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淋巴细胞分离的关键点
淋巴细胞分离的关键点
来源：互联网
点击次数：8789
【求助】淋巴细胞分离参与者：zhangwenli请教：我现在在做实验，第一步就是取健康人的外周血5ml，分离出里面的淋巴细胞.可是做了好几次都没能把它给分离出来.最后一次，我吸取了白雾状的一层，离心后看不到红色沉淀，结果放在高倍显微镜下一看，绝大部分还是红细胞，里面的淋巴细胞少得可怜.我是按照步骤一步一步的做了，怎么还是把淋巴细胞分离不出来呢?从血中分离淋巴细胞究竟需要注意什么?关键在什么地方? 急~~~参与者：变变鱼1.淋巴细胞分离液的使用要求是什么?有的需要稀释全血.2.带出红细胞是难免的，对以后实验影响大吗参与者：pwqbq你是直接分离淋巴细胞还是分离PBMC后再贴壁获得淋巴细胞啊，我们是拿Ficoll分离出单个核细胞后在贴壁获得淋巴细胞，说说分离PBMC的心得吧，也许对你有用，分离液和整个分离过程一定要在室温下使用，18~25度吧，全血稀释一倍后再分，2000转20min，再1000转10min洗两遍就差不多了。分离外周血带出的红细胞应该不是很多，脐带血的话是比较多一些，不过影响不大，你计数的时候可用3%的冰醋酸稀释计数，这样可以破坏红细胞，数的时候就不用担心受到红细胞的影响了。参与者：zhangwenli我也是按照你所说的步骤做的，全血稀释一倍后再分离.可是得到的PBMC加入含百分之十的小牛血清的1640中，在显微镜下看，视野里几乎全是红细胞，淋巴细胞太少了.不知是哪里出了问题~`参与者：liu2050淋巴细胞分离液，用法：&；1．抽取正常人静脉血加到肝素抗凝管中，加等量含5～10IU/ml肝素的无血清缓冲液悬浮细胞。将细胞悬液小心加在与血液等量的淋巴细胞分离液上，室温中，水平离心500×g 20分钟。此时离心管中形成5层：最上面是血浆，血浆层和淋巴细胞分离液之间是PBMC，淋巴细胞分离液层和最下面的红细胞层之间是粒细胞层，又成为棕黃层。2．吸去最上层的血浆，收集血浆层和淋巴细胞分离液交界面的单个核细胞，尽量全部吸出PBMC。加1～2倍量含5IU/ml肝素、2%灭活小牛血清的Hanks液（洗涤液），混匀后离心200×g 10分钟，低速离心有利于去除细胞悬液中留存的血小板，去上清液。3．再用同样洗涤液洗涤细胞2次，每次离心500×g 10分钟，洗去残留的淋巴细胞分离液。用1%台盼蓝染色检测细胞活力（应&；95%）并计数细胞。再用含10%小牛血清的细胞培养液将细胞配成适当浓度。通常，每毫升外周血可得1×106～2×106PBMC参与者：zhangwenli感谢！我照你的方法再试试！参与者：solarwt有个好办法，就是用红细胞裂解液裂解掉红细胞，剩下的就全是白细胞了，可以在用淋分液之前用，也可以在用淋分液之后用。参与者：pwqbq如果红细胞实在太多，也可在分离前用明胶沉淀大部分红细胞，明胶与全血1：1混匀，室温静止半小时，红细胞会沉降下来，收集上层的细胞悬液，用hank's液洗一遍，再用ficoll常规分离就好了，基本上是没有红细胞了，不过就是多一步，比较麻烦，所以分离外周血时我们是不用的，分离脐带血才用。参与者：norika我也做过PBMC的分离，感觉你的问题主要还是出在吸取白色雾状层的时候操作不得要领，吸出来的主要还是杂质细胞。有两个经验之谈：1，如果你是用吸管插到液面里去吸，那你可以选择2ml的吸管或者毛细吸管，在雾状层界面上面一点的地方吸，不能插到细胞层里面去吸；2，还可以先用吸管把雾状层上面的液体吸走，注意不要碰到雾状层，然后在把要的部分慢慢吸出来。我用的第二种方法，比较简单一些，你可以试试看参与者：zhangwenli稀释全血可不可以用生理盐水代替Hank's液?
相关实验方法
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B淋巴细胞的存在于胎肝（14天或通顺儿8-9周）的岛（islanksofhaemopoieticcells）中，此后B淋巴细胞的产生和分化场所逐渐被骨髓所代替。B淋巴细胞（blymphocytes）简称B细胞，成熟的B细胞主要定居于浅层的和的红髓和白髓的淋巴小结内。在刺激下可分化为，浆细胞可合成和分泌抗体（免疫球蛋白），主要执行机体的（humoralimmunity）。
B淋巴细胞简介
B淋巴细胞亦可简称。来源于骨髓的多能。在禽类是在内发育生成，故又称囊依赖淋巴细胞（bursa dependent lymphocyte）/骨髓依赖性淋巴细胞简称B细胞，是由骨髓中的造血干细胞分化发育而来。与相比，它的体积略大。这种淋巴细胞受刺激后，会增殖分化出大量。浆细胞可合成和分泌抗体并在血液中循环。B细胞是一种最常见的淋巴细胞，有关这种疾病的研究不断涌现。在哺乳类是在类囊结构的骨髓等组织中发育的。又称骨髓依赖淋巴细胞。从骨髓来的干细胞或前B细胞，在迁入法氏囊或类囊器官后，逐步分化为有免疫潜能的B细胞。成熟的B细胞经外周血迁出，进入、淋巴结，主要分布于脾小结、脾索及、淋巴索及消化道粘膜下的淋巴小结中，受刺激后，分化增殖为浆细胞，合成抗体，发挥的功能。目前使用的大多数疫苗就是通过刺激这类B淋巴细胞产生抗体的。B细胞在骨髓和集合淋巴结中的数量较T细胞多，在血液和淋巴结中的数量比T细胞少，在胸导管中则更少，仅少数参加再循环。B细胞的细胞膜上有许多不同的标志，主要是表面抗原及表面受体。这些表面标志都是结合在细胞膜上的巨蛋白分子。　为T细胞非依赖性细胞。B2为T细胞依赖性细胞。B细胞在体内存活的时间较短，仅数天至数周，但其在体内可长期存在[1]
B淋巴细胞分化
B淋巴细胞综述
B细胞的分化过程主要可分为前B细胞、不、 成熟B细胞、活化和五个阶段。其中前B细胞和不成熟B细胞的分化是非信赖的，其分化过程在骨髓中进行。抗原依赖阶段是指成熟B细胞在抗原刺激后活化，并继续分化为合成和分泌抗体的浆细胞，这个阶段的分化主要是在外周中进行的。
B淋巴细胞前B细胞（pre-Bcell）
前B细胞是从骨髓中淋厂分化而来，只存在于骨髓和胎肝等造血组织。前B细胞胞浆中可检测到IgM的重链μ链，但无轻链，也无膜表面Ig的表达，因此缺乏对的反应能力。末端脱氧核甘酸转移酶（terminal deoxy nucleotidyl transferase TdT）以及共同型急性抗原（common acute lymphoblastic leukaemia antigen CALLA）即CD10可表达在前B细胞，进入非成熟B细胞后这两种标志即消失，因此TdT和CD10对于区分前B细胞与B细胞其它发育阶段非常有用。CD19、CD20和MHCⅡ类在此阶段开始表达。前B细胞对抗原无能力。
B淋巴细胞不成熟B细胞（immature B cell）
开始表达mIgM，但如与结合，则产生负，使B细胞转变为受抑制状态，不能继续分化为成熟的B细胞，这是形成自身免疫的机制之一。不成熟B细胞CD19、CD20和MHCⅡ类抗原表达量增加，并可开始表达CD21抗原。
B淋巴细胞成熟B细胞（matrue B cell）
骨髓中发育成熟B细胞经血液迁移至外周，此时膜表面同时表达mIgM和mIgD，mIgD的表达防止了B细胞与结合后所引起的免疫。成熟B细胞表达补体受体1（CR1）、致有丝分裂原受体以及多种受体。
B淋巴细胞活化B细胞（activated B cell）
成熟B细胞被相应或多克隆刺激剂刺激后成为活化B细胞，断而发生增殖和分化，在此过程中，膜结合Ig水平逐渐降低，而分泌型Ig逐渐增加，并可发生基因重链类别的转换。活化B细胞中的一部分可分化为小淋巴细胞，停止增殖和分化，并可存活数月至数年，当再次与同一抗原接触时，很快发生活化和分化，产生抗体的潜伏期短，抗体水平高，维持时间长，这种B细胞称为记忆B细胞（memory B cell）。
B淋巴细胞浆细胞（plasma cell PC）
又称抗体分泌细胞（antibody secreting cell）。成熟B细胞接受刺激后，在抗原提呈细胞和的辅助下成为活化B细胞，进而分化为，合成和分泌各类，同时获得了PC-1（plasma cell antigen-1）等浆细胞特异性标志，而mIg,MHCⅡ类抗原、CD19、CD20、CD21等标记消失。
B淋巴细胞发育
B淋巴细胞综述
鸟类的是B细胞分化的场所。在胚胎早期，B细胞分化的最早部位是卵黄囊，此后在和骨髓，出生后则在骨髓内分化成熟。 B细胞分化过程可分为二个阶段，即非依赖期和抗原依赖期。在抗原非依赖期，B细胞分化与抗原刺激无关，主要在内进行。而抗原依赖期是指成熟B细胞受抗原刺激后，可继续分化为合成和分泌抗体的阶段，主要在周围内进行。
B淋巴细胞骨髓微环境
早期B细胞的增殖与分化，其发生是与骨髓造血微环境（hemopoietic inductive microenviroment HIM）密切相关。HIM是由以外的基质细胞（stroma cell）及其分泌的和细胞外基质（extracellular matrix ECM）组成。可包括、血管内皮细胞、纤维母细胞、前脂肪细胞、等。由分泌的纤粘连蛋白、胶原蛋白及层粘连蛋白等形成细胞外基质，此外还可合成和分泌众多的细胞因子。HIM的作用主要是通过细胞因子可调节造血细胞的增殖与分化，通过可使造血细胞与间质细胞相互直接接触，有利于造血细胞的定位和成熟细胞的迁出。
B淋巴细胞B细胞在骨髓内的发育
B细胞与其它血细胞一样，也是由骨髓内多能分化而来。认为T和B细胞可能来自共同的淋巴样干细胞，但对基分化途径、分化部位以及其特异的表面标志尚未明确，有待进一步研究。
已证明，B细胞在骨髓内的发育，可经过（pro-B）、前B细胞（pre-B）、不成熟B细胞（immature B）及成熟B细胞（mature）几个阶段。成熟B细胞释放至周围
，构成B细胞库，在此阶段经刺激后，可继续分化为合成和分泌抗体的，即抗原依赖的分化阶段。B细胞在骨髓内分化各阶段的主要变化为的重排和膜表面标志的表达。B细胞在发育分化过程中，同样也经历选择作用，以除去非功能性重排B细胞和自身反应性B细胞，形成周围成熟的B细胞库。
1．祖B细胞　这种发育早期的B细胞，发生在人约第9周开始，约第14天开始。尚未表达B细胞系的特异表面标志，也未发生lg基因重排，仍处于（germline）阶段。但的晚期可出现B系特异标志，Thy-1 、Tdt 、B200 、mb-1 等分子。
2．前B细胞 是由祖B细胞分化而来，约占成人骨髓有核细胞的5%。前B细胞能检出的最早标志是lg重链基因重排，随后在胞浆中可检测出IgM的重链分子，即μ链。但无轻链基因重排，因此也无膜Ig表达。
但在小鼠前B细胞株中，克隆出二个前B细胞特有的基因，并与Cγ与Vγ同源，分别命名为λ5和Vpre-B基因，在人也证明前B细胞中存在此种基因。它们编码的蛋白Vpre-B和λ5可非共价结合，形成伪轻链（pseudo L chainФl）或（surrogate L chain）。此伪L链可与μ链结合形成μ重链与伪L链复合体，并表达于前B细胞膜上构成其受体，与信号传导有关，对前B细胞的进一步分化具有重要作用。
此阶段还表达MHCⅡ、Tdt、CD19、CD10、CD20和CD24等分化。其中CD19、CD20、和CD22在中的出现均早于μ链。前B细胞对抗原无能力，不表现免疫功能。
3．不成熟B细胞 此阶段发生L链基因重排，故可组成完整的IgM分子，并表达于膜表面（IgM），可称为Bμ细胞。此种细胞如与抗原结合，易使膜受体交联，产生负信号，使B细胞处于受抑状态，不能继续分化为成熟B细胞。这种作用可能是使自身反应B细胞克隆发生流产，是形成B细胞自身的机制之一。不成熟B细胞开始丧失Tdt和CD10，但可表达CD22、CD21及FcR。同时CD19、CD20以及MHCⅡ类分子表达量增加。
4．成熟B细胞 随着B细胞的进一步分化，可发育为成熟B细胞，并离开骨髓进入周围。此时膜表面可同时表达sIgM和sIgD，但其V区相同，而C区不同，故其识别是相同的。成熟B细胞可发生于一系列膜分子变化，可表达其它多种膜标志分子，如受体、、Fc受体、，病毒受体以及一些其它分化等。
5．（PC） 成熟B细胞可在周围淋巴器巴接受抗原刺激，在TH细胞及的协助下，及其产生的作用下可使B细胞活化，增殖并分化为合成和分泌抗体的浆细胞。此阶段B细胞可逐渐丢失一些膜分子如CD19和CD22等。并可发生Ig的，从产生IgM转换为产生IgG 、IgA或IgE的B细胞。
在此期分化过程中，有部分B细胞可恢复为小淋巴细胞，并停止增殖和分化，SIgD可消失，且寿命长，可生存数月至数年。当再次与同相接触时易于活化和分化，故称此种B细胞，与机体的再次免疫相关。
当成熟B细胞分化为时，B细胞表面的部分标志消失，并出现一些新的浆细胞特有标志，如浆细胞抗原-1（PCA-1）等分子。一种浆细胞只能产生一种类别的Ig分子，并且丧失产生其它类别的能力。浆细胞寿命长较短，其生存期仅数日，随后即死亡。
B淋巴细胞膜表面
B淋巴细胞综述
B细胞表面有多种膜表面分子，籍以识别、 与免疫细胞和免疫分子相互作用，也是分离和鉴别B细胞的重要依据。B细胞表面分子主要有分化抗原、MHC以及多种膜表面受体。
B淋巴细胞CD抗原
在B细胞表面重要的CD，与B细胞识别、粘附、活化有关的CD分子结构和功能
。应用某些B细胞CD抗原相应的可鉴定和检测B细胞的数量、比例、不同的分化阶段和功能状态。
B淋巴细胞主要组织兼容性复合体抗原（MHC）
B细胞不仅表达MHCI类，而且表达较高比便和密度的MHCⅡ类抗原。除了外，从前B细胞至活化B细胞均表达MHCⅡ类抗原。B细胞表面的MHCⅡ类抗原在B细胞与相互协作时起重要作用，此外，还参与B细胞作为的作用。
B淋巴细胞膜表面受体
B细胞膜表面具有多种类型的受体。
1.（surface membrane immunoglobulin mIg）这是B细胞特异性识别的受体，也是B细胞重要的特征性标志。不成熟B细胞表达mIgM，成熟B细胞又表达了mIgD，即同时表达mIgM和mIgD，有的成熟B细胞表面还mIgG、mIgA或mIgE。在B细胞分化过程中，前B细胞的胞浆中可有IgM的重链μ链，但无mIgM；当发育为不成熟B细胞时，胞浆中μ链消失，胞膜上开始表达mIgM。在单个B细胞表面所有Ig的可变区都由相同的VH和VL基因所编码，因此它们的和结合是相同的。抗原刺激后的B细胞mIgD很快消失，记忆B细胞表面不存在mIgD。作为（B cell receptor BCR）的mIgM外，还有Igα和Igβ两种多肽链，分别命名为CD79a和CD79b，共同与mIg形成。
2.补体受体（complement receptor CR）　B细胞膜表面具有CR1和CD2。CR1（CD35）可与补体C3b和C4b结合，从而促进B细胞的活化。CD2（CD21）的配体是C3d，C3d与B细胞表面CR2结合亦可调节B细胞的生长和分化。
3.EB病毒受体　CR2（CD21）也是EB病毒受体，这与EB病毒选择性感染B细胞有关。在体外可用B细胞，可使B细胞永生化（immortlaized）而建成B细胞母细胞样，在人单克隆抗体技术和免疫学中有重要应用价值。在体内，EB病毒感染与、Burkitt氏以及等的发病有关。
4.致受体　丝分裂原（poke weed mitogen PWM）对T细胞和B细胞均有致有丝分裂作用。在小鼠，脂多糖（lipopolysaccharide LPS）是常用的致有丝分裂原。此外金黄色葡萄球菌CowanI株（Staphylococcus aureusstrain CowanI SAC）因含有A蛋白（staphylococcal protein ASPA），可通过与mIg结合刺激人B细胞的增殖。此外，（soybean agglutinin SBA）可凝集B细胞。
5.受体　多种细胞因子调节B细胞的活化、增殖和分化是通过与B细胞表面相应的细胞因子受体结合而发挥调节作用的。B细胞的细胞因子受体主要有IL-1R、IL-2R、IL-4R、IL-5R、IL-6R、IL-7R、IL-11R、IL-12R、IL-13R、IL-14R、IL-γR、IL-αR和TGF-βR等。
B淋巴细胞争议
50年前，Good、Cooper和他们的同事Raymond Peterson在《自然》杂志上发表论文，提出淋巴细胞有两种类型的观点。这左右了现代免疫学的进程，并且影响了对免疫缺陷疾病和免疫系统肿瘤的研究和治疗以及强大的研究工具和治疗方法——单克隆抗体的发展[2]
．163[引用日期]
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