细胞培养基：综述
细胞培养基：综述
Meenakshi Arora (arormx at UPMC dot EDU)
University of Pittsburgh Medical Center, United States
王秀英 (mary at labome dot com)
美国新泽西州普林斯顿合原研究有限责任公司 (Synatom Research)
http://dx.doi.org/10..3.175
更新 : ; 原始版 :
实验材料和方法
A comprehensive review of cell culture media and Labome survey results on cell culture media from 720 formal publications.
细胞培养现在已成为应用于生命科学的主要技术之一，它是从动物或植物移取的细胞、组织或器官并将它们在有利于生长的人工环境中培养的统称。细胞最适生长的基本环境要求是：控制的温度，良好的细胞附着基质和适当的培养液和培养箱，能够保持正确的pH值和渗透压。在动物细胞培养中最重要和最关键的一步是选择适当的培养液用于体外培养。生长培养基或培养基是液体或凝胶状态的，设计用于支持微生物、细胞或小的植株生长。培养基是控制最佳的细胞生长最重要和最复杂的因素。细胞培养基通常包括适当的细胞能量来源和调节细胞周期的化合物。一个典型的培养基还需要补充氨基酸，维生素，无机盐，葡萄糖，和血清，以提供生长因子，激素，和附着因子。除了营养外，培养基也有助于保持培养体系中的pH值和渗透压平衡。细胞培养基的类型
动物细胞的培养可以使用纯天然的培养基或人工/合成的培养基混合一些天然产物。天然培养基
天然培养基仅由天然生成的生物液体组成。天然培养基非常有用和方便，适用于多种不同的动物细胞培养。但是，由于缺乏对这些天然培养基确切成分的认识，使用天然培养基的主要缺点是可重复性差。人工培养基
通过人为地加入一些营养物质（有机的和无机的）、维生素、盐、O2和CO2气体、血清蛋白、碳水化合物、辅因子，制备成人工或合成的培养基 [] 。不同的人工培养基被分别设计用于下面的某个用途：及时生存（平衡的盐溶液，有特定的pH和渗透压）长时间生存（平衡盐溶液辅以各种配方的有机化合物和/或血清）不确定生长特定功能。培养基种类.
用于细胞培养的各种各样的人工培养基可以进一步分为以下四种类型：含血清的培养基：胎牛血清是动物细胞培养基最常见的补充成分。它用来作为一种成本相对较低的补充成分，提供动物细胞培养最佳的培养基。这些补充剂能够为不稳定或不溶于水的营养物质提供载体或螯合剂，提供激素和生长因子，蛋白酶抑制剂，并结合并中和有毒部分。
无血清培养基：培养基中含有血清存在有很多缺点，可能会成为免疫学研究中潜在的严重误解的原因 [,
] 。为了克服使用血清的这些缺点，一些无血清培养基中已经开发出来了 [,
] 。这些培养基通常是专门配制的，用以单一类型细胞的培养，包含确定量的纯化的生长因子、脂蛋白和其它蛋白质，而这些物质本来是由血清提供的 [] 。这些培养基也被称为“确定的培养基”，因为这些培养基中的物质是精确可知的。
确定化学成分的培养基：这些培养基包含无污染的超纯无机和有机成分，也可能含有纯蛋白质添加剂，如生长因子 [] 。这些成分通过基因工程细菌或酵母生产，添加维生素、胆固醇、特定氨基酸和脂肪酸 [] 。
无蛋白质培养基：无蛋白质培养基
含有任何蛋白质，仅包含用于细胞培养所必需的非蛋白成分。相比血清培养基，无蛋白培养基促进较好的细胞生长和蛋白表达，并有利于下游的表达产物纯化 [-] 。MEM，RPMI-1640等配方不含蛋白质，需要时可补充蛋白质。 不同类型的天然和人工培养基在表一中介绍。培养基类型例子用途 天然培养基生物液体样品血浆、血清、淋巴液、人胎盘脐带血清、羊水组织提取物肝，脾，肿瘤，白细胞和骨髓提取物，提取的牛胚胎和鸡胚Clots凝血剂或血浆凝块人工培养基平衡的盐溶液PBS, DPBS, HBSS, EBSS构成复合培养基的基质基础培养基MEM DMEM初级和二倍体培养复合培养基RPMI-1640, IMDM支持多种哺乳动物细胞表一：天然的和人工合成的培养基种类。培养基的基本组成
培养基中混合有氨基酸、葡萄糖、盐、维生素和其他营养物质，供应商可提供粉末或液体 [,
] 。不同的细胞系对这些组分的要求有所不同，这些差别部分是由于大量的培养基配方 [] 。每一成分拥有一个特定的功能，如下所述：缓冲系统
pH值调节对维持最佳培养条件是至关重要的，通常可用以下两个缓冲系统中的一个达到这一目的：天然缓冲系统
天然的缓冲系统中的气态CO2与培养基中的CO3/HCO3含量维持平衡。使用天然缓冲系统进行培养需要在5％至10％CO2环境下进行，通常由CO2培养箱维持。天然的缓冲系统一般成本低、无毒 [] 。HEPES
化学缓冲液利用两性离子做缓冲。HEPES在pH值范围7.2-7.4内具有优异的缓冲能力，并且不需要受控的气体环境 [] 。HEPES是相对昂贵的，并且在高浓度时对于某些类型的细胞是有毒的。 HEPES受到荧光照射的光敏效应诱导后大大提高了对培养基的敏感性 [] 。酚红
大多数市售的培养基含有酚红作为pH指示剂，它能够持续监测pH值 [] 。在细胞的生长过程中，由细胞释放代谢物造成的pH值改变会导致培养基的颜色变化。在低pH值时，酚红使培养基变成黄，而在较高的pH值水平时，使培养基变成紫色。介质在pH值7.4应该是亮红色，最适合细胞培养工作。但是，使用酚红也有一定的缺点，如下所述：酚红可以模仿一些类固醇激素，特别是雌激素的作用。因此，在用到雌激素敏感的细胞，如乳腺组织做研究的时候，最好是使用不含酚红的培养基。一些无血清的配方中存在酚红会干扰钠-钾平衡。这种效应可以通过在培养基中加入血清或牛垂体激素中和酚红会干扰流式细胞分析时候的检测。无机盐
培养基中的无机盐有助于保持细胞的渗透平衡，通过提供钠、钾和钙离子调节膜电位 [].氨基酸
由于氨基酸是蛋白质的组成部分，它们是所有已知细胞培养基的必需成分。培养基中必须包含必需氨基酸，因为细胞不能自身合成。这些是细胞增殖必需的，其浓度决定了可达到的最大细胞密度。L-谷氨酰胺，作为一种必需氨基酸，在细胞培养是及其重要的 [] 。 L-谷氨酰胺提供NAD，NADPH和核苷酸合成的氮元素，并作为新陈代谢的二次能量来源。 L-谷氨酰胺是一种不稳定的氨基酸，随着时间的推移，会转换成细胞不能利用的形态，因此应该在使用前添加到培养基中 [] 。添加比原有培养基配方更多的L-谷氨酰胺的时候要特别小心，因为它的降解会导致氨的生成，氨会对某些细胞系有害。 哺乳动物细胞培养基中的L-谷氨酰胺浓度可以从Medium 199中的0.68 mM到Dulbecco’s Modified Eagles的4 mM。无脊椎动物的细胞培养基可包含高达12.32 mM的L-谷氨酰胺。有些补充成分，如glutamax更稳定，可在长时间培养生长缓慢的细胞时替代谷氨酰胺。非必需氨基酸也可加入到培养基中，以替代那些在生长过程中已被耗尽的成分。培养基中补充非必需氨基酸能够刺激生长，延长细胞的生存。糖类
糖类形式的碳水化合物是能量的主要来源。大多数培养基包含葡萄糖和半乳糖，而有一些含有麦芽糖和果糖。蛋白质和多肽
最常用的蛋白质和肽是白蛋白、转铁蛋白和纤连蛋白，在无血清培养基中特别重要。血清是一种蛋白质丰富的来源，包括白蛋白、转铁蛋白、抑肽酶、胎球蛋白和纤维连接蛋白。白蛋白是血液中的主要蛋白，结合水，无机盐，游离脂肪酸，激素和维生素，并将这些成分在组织和细胞间传输。白蛋白的结合能力使它成为从细胞培养基中去除有毒物质有效途径。抑肽酶是细胞培养系统中的保护剂，在中性和酸性pH值环境下稳定，耐高温，耐蛋白水解酶降解。它对一些丝氨酸蛋白酶（如胰蛋白酶）有抑制能力。胎球蛋白是一种糖蛋白，胎儿和新生儿的血清中的浓度比成人血清中高。它也是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂。纤维连接蛋白是细胞附着的关键组分。转铁蛋白是一种铁转运蛋白，能够为细胞膜提供铁离子。脂肪酸和脂质
同样，它们在无血清培养基中是特别重要的，因为它们通常存在于血清中。维生素
许多维生素是细胞生长和增殖必不可少的。细胞不能合成足够数量的维生素，因此，是组织培养中重要的补充成分。血清同样是细胞培养中维生素的主要来源，但是，培养基中也包含不同的丰富维生素，适用于某一特定细胞系的培养。维生素B群是生长刺激最常见的添加维生素。微量元素
无血清培养基中通常会补充微量元素，来代替那些血清中的常见成分。微量元素，如铜、锌、硒和三羧酸循环的中间产物，都是适当的细胞生长所必需的化学成分 [] 。这些微量营养元素是许多生物过程必需的，例如酶功能的维持。培养基补充成分
某些细胞系推荐使用的完整生长培养基还需要额外的成分，它们在基础培养基和血清中不存在。这些成分和补充物质，有助于维持细胞增殖和细胞的正常代谢 [,
] 。虽然一些补充成分如激素，生长因子和信号物质是某些细胞系正常生长所需的，但最好还是要采取以下一些预防措施：由于添加补充成分会改变完整生长培养基的渗透压，这会对细胞生长产生不利影响，因此最好在添加补充成分后重新检测一下渗透压。对于大多数细胞系，最佳的渗透压应该介于260 mOSM/kg到320 mOSM/kg之间。添加补充成分后培养基的保质期会发生变化。含蛋白质补充物的完整培养基降解速度往往比基本培养基快。抗生素
虽然不是细胞生长必需的，抗生素通常还是会用来控制细菌和真菌污染物生长 [] 。常规细胞培养不建议使用抗生素，因为抗生素可以掩盖由支原体和耐药细菌造成的污染 [,
] 。此外，抗生素还会干扰敏感细胞的代谢。培养基中的血清
血清是白蛋白、生长因子和生长抑制剂的复杂混合体 [] 。血清是细胞培养基中最重要的组分之一，作为氨基酸、蛋白质、维生素（特别是脂溶性维生素，如A，D，E，和K）、碳水化合物、脂质、激素、生长因子、矿物质和微量元素的来源。通常会在培养基中使用胎儿和小牛来源的血清来支持细胞生长 [] 。胎儿血清含有丰富的生长因子，适当细胞克隆和难以培养的细胞的生长 [] 。胎儿血清被用于接触抑制研究，因为它较低的生长促进特性。正常的生长培养基往往包含2-10％的胎儿血清。培养基中补充血清具有以下作用 [] ：血清未细胞提供了基本的营养成分（在溶液中和结合到蛋白质上的）。血清为生长促进和特定细胞功能提供多种生长因子和激素。它提供了多种结合蛋白质，如白蛋白、转铁蛋白，可以携带其他成分进入细胞。例如：白蛋白可携带脂类、维生素、激素等进入细胞。它还可提供蛋白质，如纤连蛋白，促进细胞附着到基质上。它提供扩散因子帮助细胞在分裂前扩散。它还提供蛋白酶抑制剂，保护细胞免受降解。它还提供矿物质，如Na+，K+，Zn2 +，Fe2 +等。它增加培养基的粘性，因此保护细胞在悬浮培养搅拌过程中免受机械损伤。它还可以作为一种缓冲液。由于存在生长因子和酶抑制剂，血清在细胞培养中的作用是非常复杂的。不幸的是，除了提供各种功能，在组织培养中使用血清也有一些缺点 [, ,
]. 表培养基中使用血清的优点培养基中使用血清的缺点血清包含多种生长因子和激素，可以刺激细胞生长和发挥功能。血清成分缺乏均一性帮助细胞附着在使用每一批前都需要检测以确保质量作为扩散因子可能包含一些生长抑制因子作为缓冲剂帮助维持生长培养基的pH值增加污染的可能作为结合蛋白培养基中存在血清可能干扰细胞培养产物的纯度和分离减小机械损伤或由搅拌造成的损伤表二：培养基中使用血清的优点和缺点。培养基的准备
供应商那里有三种形式的培养基：粉末状态：需要研究人员准备和灭菌。浓缩状态：由研究人员稀释。工作液：可直接使用不许其他操作。粉状介质是最便宜的，但需要进行灭菌 [] 。可取的做法是，在加入血清前先过滤除菌，因为血清存在下的发泡作用会使蛋白质变性。胎牛血清或马血清可以在过滤后加入。培养基在使用前始终要进行无菌检测，方法是将其放置在37℃的CO2培养箱中培养72小时，以确保该批次是未被污染的。培养基应在4℃下保存。由于培养基的部分成分是光敏感的，应贮存在黑暗环境下。培养基的选择标准
细胞培养基的选择非常重要，会显著影响细胞培养实验的成败 []. 培养基的选择依赖于要培养的细胞的类型和培养目的和实验室可用的资源 [,
]. 不同的细胞类型有高度特异的生长要求，因此，每种类型细胞的最适培养基必须通过实验决定 [,
].总体来说，MEM适用于粘附生长的细胞，而RPMI-1640适合悬浮生长细胞。表三描述了普通研究的细胞系以及推荐的生长培养基。细胞系细胞形态物种 培养基 Applicati应用HeLa B上皮细胞人MEM+ 2mM 谷氨酰胺+ 10% FBS + 1% 非必需氨基酸 (NEAA)致肿瘤性和病毒研究HL60成淋巴细胞人RPMI 1640 + 2mM谷氨酰胺+ 10-20% FBS分化研究3T3 克隆 A31成纤维细胞小鼠DMEM + 2mM谷氨酰胺+5% 胎牛血清 (NBCS) + 5% FBS致肿瘤性和病毒研究COS-7成纤维细胞猴DMEM+ 2mM谷氨酰胺+ 10% FBS基因表达和病毒复制研究CHO上皮细胞仓鼠Ham′s F12 + 2mM 谷氨酰胺 + 10% FBS 营养和基因表达研究HEK 293上皮细胞人EMEM (EBSS) + 2mM谷氨酰胺+ 1%非必需氨基酸(NEAA) + 10% FBS转换研究HUVEC内皮细胞人F-12 K + 10% FBS + 100