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【求助】载体与片段连接问题
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这个帖子发布于2年零141天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
对于载体构建方面有一些疑惑，希望各位给予解答。 一般而言，是否载体和片段5’端都磷酸化后，才能连接？但是做TA克隆，用Takara T载体的时候，插入片段5‘端应该是羟基吧，怎么会和T载体连接呢？
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并不需要将载体和片段都磷酸化以后才能连接。酶切以后的载体末端是带有磷酸集团的，而插入片段（PCR产物或退火产物）一般情况下是不带磷酸集团的，除非合成引物时特别要求后，合成公司才会进行磷酸化修饰。因此，连接是依靠酶切后载体5‘端所带的磷酸集团。所以其实连接后，两条链中只有一条链是连接的，另外一条链是没有连接的。Takara 的T载体也是通过酶切产生的，因此其5’端是携带有磷酸集团的，故而可以直接连接。
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瓶中飞羽 对于载体构建方面有一些疑惑，希望各位给予解答。 一般而言，是否载体和片段5’端都磷酸化后，才能连接？但是做TA克隆，用Takara T载体的时候，插入片段5‘端应该是羟基吧，怎么会和T载体连接呢？ 不需要磷酸化，TA克隆是因为T载体有个突出末端“T”，片段两端有突出末端“A”，利用碱基互补配对连接起来的
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breezemail 并不需要将载体和片段都磷酸化以后才能连接。酶切以后的载体末端是带有磷酸集团的，而插入片段（PCR产物或退火产物）一般情况下是不带磷酸集团的，除非合成引物时特别要求后，合成公司才会进行磷酸化修饰。因此，连接是依靠酶切后载体5‘端所带的磷酸集团。所以其实连接后，两条链中只有一条链是连接的，另外一条链是没有连接的。Takara 的T载体也是通过酶切产生的，因此其5’端是携带有磷酸集团的，故而可以直接连接。 但是小片段和载体做连接的时候，载体5'端是磷酸化的，小片段5‘端是羟基，按道理来说是可以连接上的，但是做了3次转化，都没有筛选出阳性克隆（平板上没有菌落），推测是载体和小片段没有连接上。有人建议说小片段5‘端也需要磷酸化，才能连接上。这就矛盾了。现在不清楚为什么载体和小片段没有连接上。
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但是小片段和载体做连接的时候，载体5'端是磷酸化的，小片段5‘端是羟基，按道理来说是可以连接上的，但是做了3次转化，都没有筛选出阳性克隆（平板上没有菌落），推测是载体和小片段没有连接上。有人建议说小片段5‘端也需要磷酸化，才能连接上。这就矛盾了。现在不清楚为什么载体和小片段没有连接上。 没有连接上，肯定是其它环节出了问题，绝对不是磷酸化的问题。找找其它的原因吧。
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但是小片段和载体做连接的时候，载体5'端是磷酸化的，小片段5‘端是羟基，按道理来说是可以连接上的，但是做了3次转化，都没有筛选出阳性克隆（平板上没有菌落），推测是载体和小片段没有连接上。有人建议说小片段5‘端也需要磷酸化，才能连接上。这就矛盾了。现在不清楚为什么载体和小片段没有连接上。 检查一下自己的片段和载体有么有问题吧，与磷酸化没有关系
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T4连接酶催化相邻DNA链的5’ -P末端和3’ -OH末端以磷酸二酯键结合的反应。而我的小片段是合成的两个核苷酸链退火形成的，该片段分别带有两个酶切位点的突出末端，也就是小片段的3'和5'都为羟基(形式上来说，就 PCR产物一样，3'和5'都是羟基)。酶切片段的5'端是磷酸基团，但是3'端不是。这样，理论上能够连接上吗？
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克隆专家qq：
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TA克隆是因为T载体有个突出的末端“T”末端，片段用Taq A酶扩增后，片段两端有突出的“A”末端，利用碱基互补配对连接起来的。
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&而我的小片段是合成的两个核苷酸链退火形成的，该片段分别带有两个酶切位点的突出末端 两个酶切位点的突出末端 &- What enzymes? If they are not the sticky ends with only one &A& nucleotide, TA cloning will not work. Phosphorylation does not a critical point in this case.
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关于丁香园无标题文档
第二节&&cDNA 文库的构建
&&&&cDNA 文库中的外源 DNA 片段是互补 DNA （complementary DNA , cDNA）。 cDNA 是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的 mRNA 经体外反转录后形成的双链 cDNA 。 cDNA 文库代表生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内转录水平上的基因的群体，并不能包括该生物的全部基因，且这些基因在表达丰度上存在很大差异。
cDNA 文库的构建
cDNA 文库的构建共分四步（图 8-2）：
&&第一，细胞总 RNA 的提取和 mRNA 分离；
&&第二，第一链 cDNA 合成；
&&第三，第二链 cDNA 合成；
&&第四，双链 cDNA 克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖。
&&&&&&图 8-2 ： cDNA 文库构建流程图
一、 RNA cDNA
mRNA RNA RNA mRNA cDNA rRNAtRNA mRNA [ oligo（dT）]mRNA Poly（A）mRNA mRNA1．mRNA mRNA mRNA cDNA &&&&&&
2．mRNA mRNA 50-90% mRNA 0.5% mRNA 3．mRNA 3.1 mRNA 3.2 cDNA mRNA mRNA ,& agarose 3.3/ A-Sepharose A -spharose EDTA oligo（dT） mRNA mRNA mRNA0.01-0.05% \\
mRNA cDNA reverse transcriptase）AMV MMLV
MoloeyRNA DNA
5'--3' DNA
Oligo（dT）Oligo（dT） 10～206～10 Oligo（dT） cDNA cDNA
Oligo（dT）Oligo（dT）mRNA
poly（A） mRNA
cDNA cDNA cDNA cDNA poly（A）cDNA cDNA 610
mRNA mRNA mRNA 5'-cDNA cDNA mRNA 5' RT-PCR
5'-RACE cDNAmRNA-cDNA cDNA cDNA 1．8-3mRNA cDNA 3'-cDNA DNA S12．8-4 RNA
DNA Ⅰ DNA
DNA Ⅰ DNA cDNA
5'- mRNA DNA
5'--3' RNA H cDNA
Ⅰ 3'--5' cDNA
3'-cDNA 5'-3．（8-5）
Berg 1982 Poly（dG）Ⅱ Poly（dT）
Oligo（dT）cDNA cDNA TdT cDNA
3'-Poly（dC）RNA
cDNA cDNA Poly（dC）/（dA）图 8-5 ：引导合成法合成 cDNA 第二链4． Gubler Hoffman1983TdT cDNA 3'-Poly（dC） Poly（dG） cDNA PCR PCR cDNA cDNA cDNA 1．8-6）（100dA/dT , 20dG/dC） cDNA E.coli 2．8-7 cDNAcDNA 5'-NotⅠcDNA SalⅠ
cDNA 3．3.1 mRNA-cDNA
RNA , DNA , 3.2 RACE
3' 5' 8-8 8-9
cDNA 图 8-9 ： 3' RACE&&&3.3 新 RACE
五、 cDNA 克隆用的载体（见第三章）。复习题_百度文库
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&&查看话题
测序正确的片段双酶切连接表达载体，提质粒PCR验证后，还需要再次测序吗？
我做的是表达，照理应该测序确定一下，不过之前对双酶切太信任了，我切胶回收又从来不用紫外，都是肉眼看着徒手切。感觉没有什么能让片段变化的因素。
&&但是最近单酶切的一个样品送去测序，连的片段已经测序正确了，pcr鉴定用的是上游特异性引物，下游通用引物，pcr条带大小正确，但是测序居然连反了……而且末端有三个单点突变……突变可能是测序错误，我一看反了也没有再细看。但是连反了是什么鬼！
&&我还有六个样品，是双酶切连接的，在克隆载体上测序正确，然后连了表达载体，提质粒pcr鉴定，上下游引物分别是特异性引物和通用引物，条带大小正常，而且每个样挑的三个单克隆条带大小相同。这是不是意味着这三个样我可以随便用呢？网上没有关于这个的讨论，我心里挺没底的，做过的同学都来说一说吧。
我的片段3000，所以都是双向测序再拼接的
单酶切连反确实正常，但我当时是通用引物正向，特异引物反向出目的条带了才送的测序。如果连反应该是p不出条带的。
&&最后你说的组合验证我确实没想到，是个好办法。
&&测序倒没有不方便，就是构建的载体比较多，前面测序已经花了3000多……怕老师说我浪费钱……今天一咬牙已经送去测序了……
怎么样的结果是有必要测序或者没必要测序呢？是表达出来送测序还是表达不出来才送测序？
&&我做的是真核表达，毕赤酵母。不过都差不多吧。
表达出来的蛋白跟预期大小差不多，我就不测序。表达不出来就去测序。
o～～嗯，多谢～细菌确实这么干省事很多。我做酵母首先转化成功率比较低，然后又得筛选，筛选完了表达还得5天……似乎送个测序花个5天心里有底气点。
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