人参皂苷Rg_1脂质体制备工艺的优化
人参具有大补元气,补脾益肺,生津,安神的功效,能调节中枢神经系统兴奋和抑制过程的平衡,并能提高学习能力。其主要成分人参皂苷基本上能代表人参的药效指标。药代动力学研究表明,人参皂苷难以通过血脑屏障(BBB)[1]。为提高脑血药浓度,增强人参的疗效,增加人参皂苷对血脑屏障的通透性,使人参皂苷更有效的通过BBB具有重要的临床意义。国内外研究表明[2,3],脂质体具有优良的靶向性,对提高血脑屏障的通透性有一定的作用,故作者采用膜膜分散-超声法制备人参皂苷Rg1脂质体,并用正交设计法优化处方和制备工艺条件。1仪器与试药RE-52旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);WH-90A微型混合器(上海亚荣生化仪器厂);BP-190S电子分析天平(德国赛多利斯天平有限公司);KQ-250B超声清洗仪(昆山市超声仪器有限公司);GL-20A全自动高速冷冻离心机(湖南仪器仪表总厂离心机厂);JEM-2000EX透射电子显微镜(日本电子公司);SCL-10A...&
(本文共3页)
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[目的]制备出符合肺部给药的人参皂苷Rg1脂质体,评价其稳定性,研究其肺部给药后在大鼠体内药代药动学过程,为深入开发人参皂苷Rg1新剂型和新的给药途径提供科学的理论和实验依据。[方法]①应用薄膜分散-超声法制备人参皂苷Rg1脂质体。②采用单因素分析,筛选出在人参皂苷Rg1脂质体制备过程中对包封率和载药量有影响的三个因素(质量浓度、有机溶剂和胆固醇磷脂比)。③根据正交试验的原理和原则,按L9(3~4)进行试验设计确定最优处方。④运用高效液相色谱法(HPLC)测定其包封率、专属性和回收率。⑤采用透射电子显微镜测定Rg1脂质体粒径、形态、结构和分布。⑥采用pH值测定仪和高效液相色谱法评价其稳定性。⑦采用肺部滴注给药研究人参皂苷Rg1脂质体在大鼠体内的药动学参数。选用SPF级健康成年SD大鼠,雌雄各半,体重300±20g,随机分为2组(n=12),人参皂苷Rg1脂质体组和人参皂苷Rg1溶液组。分别在0.5h、1h、1.5h、2h、2.5...&
(本文共60页)
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本论文主要包括以下几部分：第一部分文献研究对脂质体给药系统的研究进展、生物物理技术用于生物膜相态的研究进展、Caco-2细胞系体外模型及其药学应用的研究进展以及人参皂苷Rgl药理作用与药代动力学的研究进展进行了综述。第二部分实验研究一、人参皂苷Rgl含量测定方法的建立与理化参数研究实验选用Agilent eclipse XDB-C18色谱柱(4.6×250mm,5μm)；乙腈-水(20：80)为流动相；流速0.8mL·min-1;检测波长203nm,柱温25℃；进样体积10μL,结果表明,HPLC法测定人参皂苷Rgl脂质体的包封率,辅料对人参皂苷Rgl的检测没有干扰；以峰面积(Y)对进样量(X)做线性回归,得人参皂苷Rgl回归方程为：Y=75.7(R=1),结果表明人参皂苷Rgl在7.415ng-ng范围内的线性关系良好；人参皂苷Rgl日内RSD为0.35%(n=5)；日间RSD为2.99%(...&
(本文共129页)
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田七为广西传统道地药材之一,其所含的人参皂苷Rg1物质具有明显的抗凝血和抑制血小板聚集的作用,可作为脑血栓或中风的治疗药物。本论文采用乙醇回流提取法对广西田七进行提取,然后通过大孔吸附树脂法富集纯化人参皂苷Rgl,再通过离心薄层色谱仪制备出人参皂苷Rgl单体,并研究了人参皂苷Rg1脂质体制备方法,同时对其质量和稳定性进行了研究。实验内容及结果如下:1.通过比较回流法、超声法、浸渍法、微波萃取法四种提取方法对田七药材中三七总皂苷的提取得率的影响,得出最佳提取方法为回流法,提取得率为7.88%。提取方法为:提取溶剂为70%乙醇,用量为药材的8倍,80℃回流提取2次,每次2h。干膏得率为25.8%,干膏中人参皂苷Rg1的含量为13.37%。由此计算出回流提取法对于人参皂苷Rg1提取得率为3.45%,提取回收率为95.3%。2.采用D-101大孔树脂对田七乙醇提取物干膏进行初步分离,通过TLC定性检测收集人参皂苷Rg1纯度较高的解析液,...&
(本文共71页)
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制备液相收率问题
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最近在使用液相对一个样品进行纯化制备，因为时间紧，所以尽可能地增大上样量，为了确保前后杂质都去掉，故而只收集平头部分的馏分，但最后结果产品不太够了。我想问一下，从制备液相图上怎么计算收率？
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要求得回收率，那就必须从头开始收集一直到峰尾，不是仅仅收集平头部分。在收集时，一定要注明收集部分的时间，并作记录。然后再逐一进样一般的色谱分析，来判断是否有杂质。把没有杂质的部分混合在一起，计算回收率。当然，如果要准确的回收率，自然要多收集纯化的样品，也就是说收集的时间要缩短，尤其在锋头之前及之后的部分。
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现在制备已经结束了，但收率偏低，我正在找原因。不是说可以按照峰面积计算出来吗？
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您大概没有理解我所写的。是可以按照峰面积来计算的。可是不能只使用平头峰部分的面积。
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我觉得楼主这样收集的话，应该没多大问题，收率偏低是因为杂质含量太高的原因。
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sepuwang 我觉得楼主这样收集的话，应该没多大问题，收率偏低是因为杂质含量太高的原因。我现在的收率连一半都不到，正找原因呢
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玲珑叶 sepuwang 我觉得楼主这样收集的话，应该没多大问题，收率偏低是因为杂质含量太高的原因。我现在的收率连一半都不到，正找原因呢上样前粗品中目标成分含量多少？纯化后多少？这样计算收率我觉得应该不低于70%才合理。
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用液相图求那是最粗糙的作法，因为杂质和产品的响应一般是不一样的，再加上制备时是过载进样的，这样求回收率最不靠谱。以前我们是这么来做的，粗糙一点的话，我们可以把回收率简单定义成：制备后旋干浓缩后所得的纯品的重量/制备前旋干浓缩后的粗品的重量*100%，这个操作简单，只要把纯品和粗品分别称重后相除即可得出。精确一点的话，应该是这样定义的：制备后纯品中目标产品的重量/制备前粗品中目标产品的重量，这个操作麻烦，首先，你要有目标产品的标准品，然后用外标法分别求得制备前后目标产品的重量后再相除。
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cys_1984 编辑于
关于丁香园人参皂苷-α-鼠李糖苷酶的分离纯化及真菌RNA提取的研究_甜梦文库
人参皂苷-α-鼠李糖苷酶的分离纯化及真菌RNA提取的研究
摘要摘要本文主要 　　　　 研究微生物 ｓＧｇ菌产人参皂昔一 一 李糖昔酶的分离纯化和真菌中 ｐ３ ． 。鼠Ｒ Ａ的提取。 Ｎ实 　　　　 验结果表明：ｐ ３ 菌产人参皂昔一 一 李糖昔酶的最佳诱导物为人参， ｓ． ｇ Ｇ ａ鼠 最佳浓 度为４ ％；最佳发酵时间为 １０ ２ 小时；用硫酸钱沉淀人参皂昔一 一 ａ 鼠李糖昔酶的最佳硫酸钱饱和度为８％０ ５选 ． ５ Ｈ ． ｒｓ ｃ缓冲体 下的Ｄ Ａ －ｅｕ ｓＤ ５分离 　　　　 ｐ ７ Ｔｉ Ｈ１ 用０ ２Ｍ　 ２　 － ０ 系 Ｅ ＥＣｌｌｅ　 ２ 提纯人参 ｌｏ Ｅ 皂昔一 一 。 鼠李糖昔酶，Ｓ Ｓ Ｄ 一聚丙烯酸胺凝胶电泳测定结果为单一的单点，酶蛋白分子量约为５ｋ ａ 人参皂昔一 一 李糖普酶在提纯过程中的收率为２ ％； ６Ｄ 。 。鼠 ． 比活力由发酵粗酶 ９液的１．Ｕｍ 上升为６． ／ｇ 提高了４ 倍。 ４ ／ｇ １　 ５ Ｕｍ ， ６ ． ６ 对ｓＧ ｇ 　　　　 ｐ ３ 菌所产人参皂普一 一 李糖普酶做蛋白 ． “鼠 质电印 迹以 及蛋白 － 质Ｎ 端序列测 定， － ６ Ｎ端１个氨基酸残基依次 ｅ Ｔｒ ｒ Ａ － ｓ Ａｎ ａ Ｓ －ｌ Ｓ －ｅ ｙ 为Ｓ －ｈ Ｐ －ｌ Ａｐ ｓ Ｖｌ ｅ Ｇｎ ｅ ｌ－ ｒ ｒ － ｏ ａ － － － ｒ － ｒｌＴ －ＡｎＧｎＡ ｎＴ ｒ 测序结果提取的酶蛋白 ｓ－ ｌ ｓ－ｈ， － 纯度在 ９％以上。 ７ 以这 １ 个氨基酸残基为基 ６ 础， 在国际互联网蛋白质序列数据库中作蛋白 质同源性比较， 发现与蛋白质数据库中己 知的蛋白 质没有同源性。ｓＧｇ 　　　　 产人参皂昔一 一 李 ｐ ３菌所 ． 。 鼠 糖昔酶的最适反 件的研究表明： 应的 佳 应条 酶反 最 底物浓度为 １ｍ ／ｌ最佳酶反应时间为 １小时， ．ｇ ， Ｏ ｍ ８ 最适温度为４０， ０ 最适ｐ Ｃ Ｈ值为５ ． ． ０对人参皂普一 一 　　　　 。 鼠李糖若酶的底物水解能力进行的研究表明： 提纯酶只水解人参皂普 。 鼠 糖昔键， 一一李 酶活力为４． ／ｌ对ｐ Ｐ ６ Ｕｍ， Ｎ Ｒ和芦丁的 应活性都很 分别为 ５　 酶反 低，Ｌｕｍ 和 ０ Ｕｍ 。 ｏ ／ｌ ． ／ｌ 说明人参皂昔一 一 ８　 ａ 鼠李糖昔酶具有水解人参皂昔 Ｒ 的Ｃ６ ｅ － 位末端上的。 鼠李糖昔键的酶专一性，是专一性酶。 一 本文采用异硫氰酸肌和Ｃｔｉｏ－４ 联合变性， 氯仿、异戊醇多次 　　　　 ａｒｍｘ１ Ｍ Ｔ 酚、 抽提， 用 异丙醇沉淀ＲＡ 得到了高质量、 Ｎ， 完整的ＲＡ 提取的Ｒ Ａ　 ６ Ｏ２＝．　 Ｏ２／Ｄ０ Ｎ。 Ｎ Ｏ２／Ｄ ０ １，　６ Ｏ２＝ Ｄ（ ３ ２ ６ Ｄ ０ ８ ） ｌ ２ 纯度较好， ．　 ８， 无杂质污染， 均一性比 较好。 ｇ 在１ 菌丝体中得到的总ＲＡ ．　 得 Ｎ为１ ｍ， ８ｇ 率为０１％。甲醛变性琼脂糖凝胶电泳２Ｓ　 条带的亮度接近１Ｓ　 条带亮度的２ ．８ ８ ＲＡ Ｎ ８ ＲＡ Ｎ 倍， 表明总ＲＡ Ｎ分子完整，降解较少。关键词： 人参皂昔一 一 李糖昔酶， ａ鼠 人参皂昔Ｒ ， ｅ 人参皂昔Ｒ ｉ ＲＡ ｇ Ｎ 提取 ，　Ａｂ ｔ ｃ ｓ ａｔ ｒＡ ｓ ａｔ ｂ ｔｒ ｃＩｔｓ　 ｒ ｉ ｅ ｓ ｅ ｒ ｎ ｓ ａ ｗ ｐ ｅ ｎ Ｒ ｆ ｆ ｉ　 ｉ ａ ｄ 　　　　ｅ ｇ ｓ ｏｉ －－ ａｍｏ ｄ ｅ　 　ｒ ａｄ　Ａ　ｍ　 ｇｗ 　 ｌｅ． ｎ　 ｐｐ ，　 ｎ ｄ ａ ｈ ｈ ａ ｉ ｎ ｉ ｓ ａ ｕ ｄ　 Ｎ ｒ ｕ ａ ｓ ｔ ｓ ｏ ｎ ｓ ｏ Ｔ ｅ　ｕ ｈｗ ｔ ｔ ｐｍ ｍ　ｄｃ ｎ ｉｇ ｓ ｎ ｗｔ ｔ ｏｃｎａｏ ｏ 　　　　 ｓｏ ｓ　ｔ　 ｏｔ ｕ ｉ ｕｅ ｅｔ　ｉ ｅ ａｄ　ｈ　 ｃｎｅｔｔｎ　 ｈｒ ｌ ｅ ｔ　 ｈ ｈ ｉ ｓ ａ ｅ　 ｎ ｍ ｓ　 ｎ　 ｉ ｈ ｎ ｅ　 ｒｉ ｆ４ Ｔ ｅ　ｉｕ ｃｌｒｔ ｅ　 ｐ ３ ｉ１０． ％．　 ｏｔ ｍ　 ｔ ｅ　 ｏ ｓ． ｇ　 ２ｈ ｈ ｐｍ ｕｕ ｉ ｆ　 ｍ Ｇ ｓ　 Ｔ ｅ，　 ｅ ｓ － ｒ ｍ ｏｉ ｓ ｗ ｐ ｅ ｕｉ Ｅ Ｅｃ ｌ ｏ ｃｌ ．　 ｐｒ 　　　　ｓ ｏｉｅ － ａ ｎｓ ａｅ　 　 ｒｄ　ｎ Ｄ Ａ － ｌｌ ｅ　ｕ ｎ Ｔ ｅ　ｅ ｈｎ ｇ ｎ ｄ ａ ｈ ｉ ｎ ｄ ｓ ａ ｕ ｓ ｇ　 ｅｕ ｓ ｏ ｍ ｈ ｕｅｚｍ 　ｐｒｙ　 ｄ　 ｏ ｃｌ　ｗ ｉ ｔ　　　　 ｉ ｅｏ ｄ－－ ａ ｎｓ ａ 　ｆｍ ｎｙ ｅ　 ｉ　ａ 　ｍ ｌ ｕ ｒ　 ｇ 　ｏ ｔ 　ｇ ｓ ｓ ｅ ｒ ｒ ｏｉ ｓ ｒ ｕｔ ｎ ｅ ａ ｅ ｈ ｆ　 ｈ ｎ ｎ ｉ ａ ｈ ｎ ｄ 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ｏ ８ ｔ　 ｉ ． ｏ Ｎ ｂ ８ ｔ ｆ ｍ　 ｍ ｃｌｍ　ｄ　 ｙ ｌｏ Ｒ Ａ　０ ８ Ｔ ｅ　 ｔ ｓ ｒ ｉｂｔｅｎ　 Ｒ Ａ　ｄ ｏ １ ｙｅｕ ａ ｔ ｉｄ　 Ｎ ｉ ． ％．　 ｌｈｎ ｓ　ｏ　ｗ ｅ ２Ｓ　 ａ ｒ ｇ　 ｉ ｎ ｈ ｅ ｆ　 ｓ　 ｅ　 １ ｈ ｉ ｅ ａ ｅ ｇ ｔ ８ Ｎ ｎ１ Ｓ　 ８ ＲＮＡ　 ｃｏ ｅ　 ２ ｉ ｌｓ ｔ ． ｓ　 ｏ　Ｋ ｙ　ｒｓ Ｇｎｅｏｉ －－ ａ ｎｓ ａ ，　ｉ ｅｏｉ Ｒ ，　ｉ ｅｏｉ Ｒ ｔ ｅ ｗ ｄ．　 ｉ ｎｓ ｅ ｒ ｍ ｏｉ ｓ Ｇｎ ｎｓ ｅ　 Ｇｎ ｎｓ ｅ　 ， ｏ 　 ｓ ｄａｈ ｄｅ ｓ ｄ ｅ ｓ ｄ ｇＲＮＡ　 ｏａ ｉｎ 　　　　　　　　　　　　　　　　 ｉ ｌｔ ｓ ｏ第一章 文献综述第一章文献综述１１ 人参的分类、形态、生长环境及化学成分 ．人参是中国最古老的名贵中药之一， 　　　　 具有多种生理活性， 对人体有良 好的滋补强壮 作用并对多种疾病有卓越的防治效果， 是中国最古老的中药之一。在我国关于人参的文 字记载最早可追溯到春秋战国时代范盆所著 《 计然》一书（ 约成于公元前 １０ 。 ８ 年） 后汉 时期的 《 神农本草经》一书则纤细介绍了 人参有 “ 补五脏、安精神、定魂魄、止 惊悸、 除邪气、明目 益智， 久服轻身延年” 之功效。１７ 年， ５８ 我国杰出的药学家李时珍在他的 历史 性著作 《 本草纲目 》一书中对人参作了 详尽的 介绍， 赋予了它十分重要的 地位‘ ” 。 人参在朝鲜、日本也有千年以上的历史， 朝鲜的 《 东医宝鉴》以及日本的江户时代吉益 东洞 （７２１７）的 《 １０－ ３ ７ 药徽》对人参的功能、主治、用法用量及方剂等， 也都有详尽的 载。 记闭１７ 年意大利旅行家马可波罗就将我国东北产人参介绍给欧洲， 　　　　 ２４ 但并未引 起重视。 １２ ６ 年塞姆德 ? ４ 阿尔沃龙 （ｅ ｄ　 ａ ） Ｓｍ Ａｖ ｏ　 ｌ ｒ 根据商人的讲述，再次介绍了 我国的人参， １７ ６ 年鲍德伦 （ｕ ｅｎ 在法国科学院宣读了 ９ Ｂｌ ｌ ） ｄｅ 介绍人参的报告， 至此，欧洲人才逐渐 了 解人参及其应用。 然而， 人参的植物学名却长期 没有产生。 ９５ 瑞典植物学家 １３ 年， 林奈 （ ．ｎｅ ＣＬ ｎ ）创立人参属 Ｐｎｘ ｉ ａａ，人参由植物五加科 （ ｒｉ ｅｅ Ａａａ ａ）中得一个属，Ｐｎｘ ｌｃ ａａ起 源于希腊字Ｐｎ（ ａ 全面） Ａｏ 药物） 即 “ 和 ｃｓ （ ， 全面的药物” “ ， 万灵药”之意。 他为美 洲产的人参定名为Ｐｎｘ　ｎｕｆｉ Ｌ而么 ａａ ｑｉ ｅ ｌｍ　 ｕ ｇ ｏｕ ． 有为我国 ， 人参定名。１ ２ 俄国 ８ 年， 植物 ４学 ．Ｍｙ 将生 在 洲的 丽 参 名 ａｘ　ｓ ｇ ． 家Ｃ ．ｅｒ 长 亚 高 人 定 为Ｐ ａｇｇｎ３ Ａ ｅ ｎ ｉ ｅ１ ｎ １１１１ 人参的分类 ．．目 前己 知人参的种类有：１ Ｐｎｘ　 ｅ ． ．ｅ ｒ　ｃｎ ｎ Ｎｅ， 丽人参： 、中国、 及日 ，　ａｇ ｇｎＣ Ｍｙ （ｓ ｉｅ ｅ） ａ ｉ ｇ Ａ ｅ Ｐ ｈｓ ｇ　ｓ 高 ｎ ． 韩国 俄国本栽培和自 在我国称之为普通人参， 　　 生。 别名： 圆参 （ 栽培品） 山参（ ， 野生品） ， 棒糙 东北土名） 　　 （ 。２ Ｐｎｘ　 ｇｅ ｌｍ　美国参 （ ，　 ａ ｑｉ ｕ ｏｕ Ｌ ａ ｕ ｆｉ ｎ 西洋参或花旗参） 加拿大、 ： 美国及中国 ’ 栽培［ ］ 。第一章 文献综述３ ａａ ｏ ｇ ｓ ｎ　 ｕ ． Ｆ ． ｅ ［ ｐｅｄ－ｎｓ ｎ　 ａ．　 Ｎ ｔ ｉｅ ，　 ｘ　 ｉｈ 　（ ｒ ）　 Ｃ ｎ　 ｓ ｏ ｉ ｈ 　Ｗ ｌ ｖｒ ｏ ｇ ｓ ｎ ｔ ｎ ｅ Ｂ ｋ ． ｈ Ｐ ｕ ｇｇ ｅ ｏ Ｈ ．　 ｌ ａ ｏｎ ｎ ．　 （ｕ ）　 ｔ　 ］ 　　 ． ｏｅＴｅｇ Ｂｒ Ｈ ｏ ｓ ，三七：中国南方栽培。 ｋ ｎ 别名： 参三七，田七， 旱三七 （ 通 称） 　　 ，盘龙七 （ 四川） ，金不换 （ 江西） 。４ Ｐｎｘ　ｎ ｕ　 ．ｅ ｒ 本 人参：日 ，　ａｊ ａｃ Ｃ Ｍ ｙ ，日 竹节 ｏ ａ ｃ ． ｅ ｐ Ａ 本及中国自 别名： 生。 竹根七、箩卜 　　　　 七、峨三七 （ 四川） 。５ Ｐｎｘ　ｏｉ ｍ　 ．．ｅｅ ｖｒＭ ｊ （ｕ ．ＣＹ Ｗｕ　Ｋ Ｍ． ｎ ［ ｎｘ ，　 ａｊ ｎ ｕ （ ＡＭ ｙｒ ａ ａ ｒ　ｒ）　 ．　 ｅ ．　 ｅｇ　 ａ ａ ａ ｃ Ｃ ｐ ．　 ．　ｏ Ｂ ｋ ． ｔ　 Ｆ Ｐ ａ ｍｊ Ｂ ｒ）　 ， 　　 （ｕ ． ｉ ］ 子参： ａ ｒ　 ｋ Ｔ ｇ ｏ ｎ 中国生。 别名： 疙瘩七、 土三七 （ 云南） 钮子七 （ ， 陕 西、甘肃、四川） 　　　　 ，扣子七 （ 西藏、四川、湖北） 。６ Ｐｎ ｔ ｔ Ｌ 美国 ，　ａ ｒ ｕ ． 假参 （ 耀之参） 加 ａ ｘ　 ｓ　 如Ｉ 闪 ： 拿大、 栽培。 美国 ７ Ｐｎ Ｐ ｕｏ ｇ ｓ ｇ　Ｍｊ Ｂｒ 夹叶 ，　ａ ｓ ｄｎ ｉｅ ｖ ａｒ　 ， 竹节参：中国 ａ ｘ　 ｇ ｎ ｎ ａ ｏ ｕ ｅ ｒ　 ｋ 南方自 生。１１２ 人参的形态及生长环境 ．． 人参为五加科人参属植物人参的根， 　　　　 为多年生宿根草本， ０６ｃ ， 高３－０ｍ 根茎细长（ 野 生） 或短粗光滑， 基部具有宿存鳞片。叶形及数目 随生长年龄有一定的变化：一年生一 枚三出 复叶， 俗称 “ 三花” ； 二年生一枚掌状复叶， 俗称 “ 巴掌” ； 三年生二枚复叶， 俗称 “ 二甲子” ：（ 以后随年龄增加复叶数） ，三复叶称 “ 灯台子” ；四复叶称 “ 四匹 叶” ：五复叶称 “ 五匹叶” ；六复叶称 “ 六匹叶” ； 这时即使年龄增加，叶数通常 （ 也不增加） 。掌状复叶轮生茎顶，总花梗长 ７２ｃ －０ｍ；中间三小叶较大， 椭圆形至圆状椭 圆形，长４５ｍ，宽 ２６ｍ；最外侧一对小叶较小，前端较尖，基部楔形，边缘锯齿。 －ｃ －ｃ叶表面呈深绿色，沿脉有稀疏刚毛；叶背面呈淡绿色。人参有雄蕊 ５ 个，子房下位花柱２ 花期 ６７ 列， － 月。果实为浆果状核果， ２ （ 含 室 每室有一粒种子） 种子黄白色或淡棕 ，色， 呈倒卵形或宽椭圆形， 果期８ １ 个月５ １ 人参生于以红松为主的针阔混交林或杂木林下， 　　　　 产区主要分布在亚洲大陆东部中高纬度的山林地带，象中国、朝鲜、俄罗斯等均有大量分布。我国野生人参分布在吉林、 辽宁、 黑龙江及河北北部的山地。 大约在北纬４－８ 东经 １ 度 ６ １ 度的区域 ０４ 度， １ ７ 分一３ ４内的 各种类型的山地； 分布区气候平均气温在零下 １℃一 １℃ ０ 零上 ０ 之间，一年有２－５ ４２侯； 降 量 ０ １ ０ 升， 壤 棕 森 土 地 化 色 林 （ 年 雨 为５ － ０毫 土 为 色 林 或山 灰 棕 森 土５ ００ １１１３ 人参的化学成分 ．．人参的化学成分比较复杂， 其主要有效成分是人参皂昔， 具有人参的主要生理活性，第一章文献综述含量约４７ 。 －％ 对于人参皂昔的研究， 若以１ ４ ａｉ ｅ 由 ８ 年Ｇｒｇ ｓ 西洋参中分离的 ５ ｒｕ 道德人参 奎酮（ ｎ ｕｏ，　３ ５ １算起， Ｐ ａ ｉｎ Ｃ５ ６ ４ ａ ｑ ｌ 　　　 ０ ） Ｈ 至今已 有百余年的历史。 在本世纪６ 年代以 人 ０ 前，参的研究进展缓慢， 人们只能根据直觉、 直观的判断进行研究， 称为古代朴素的研究阶段， 在此阶段中积累了大量的临床经验。 ０ ６ 年代以 后，由于科学技术发展， 对人参化学 成分的分离、提纯和结构鉴定的研究取得了突破性的进展，为现代科学研究阶段。１６ ９３年Ｓｉｔ等［１ 人参根中 ｈ ａ ６将由 ｂａ － ８ 提取出的 皂 称为 总 昔 人参皂昔Ｒ （ｉｅ ｓｅ ｘ　 依 ｘ　ｎ ｎ ｉ－ ）并 Ｇ ｓ ｏｄ Ｒ ， 薄 板层析的Ｒ 值， 低到高 ｆ 由 把人参皂昔 命名为 参皂 ｏ Ｒ，　 ，　，Ｒ，　 人 昔Ｒ ．　 Ｒｌ Ｒ２ ｃ Ｒ ， ａ ｂ ｂ，　 ｄ Ｒ，　 Ｒ， Ｒ２ Ｒ３ 和Ｒｏ １ ６ 本学者Ｙｈ ａ１ ｅ Ｒ，　 ，　 ，　 ． ｆ ｇ ｇ ｇ、 ｈ ９ 年日 ．　 ７ ａａ［ ｒ９ 等从人参叶中 离出 分 皂普Ｒ ｌ Ｒ２ Ｒ ，　，　 Ｒ ， ｂ ｂ ，　 Ｒ Ｒ ，　 及根中未发现的新皂昔Ｇ Ｆ，　Ｆ，　Ｆ，又从花蕾中 ，　 ， ｃ ｄ ｅ ｇ －， Ｇ ２ Ｇ ３ － － 分离 ｄ Ｒ， 三种皂昔．１ ８ 本的 庄司 １ 出Ｒ ，　 纯， ｅ ９ 年日 真田 １报道了 种 ７ ０ １ 另两 单体皂 Ｒ３ 营 ｂ 和２ （ ） 葡萄糖人参皂昔－ｆ ０　 一 Ｓ Ｒ。本世纪 ９ 年代初我国学者在国内外研究基础上， ０ 对人 参根及其地上部分的皂营成分又深入地进行了 分离鉴定， 对单体皂昔的化学代谢、 半合 成、 碱水解及分析方法进行了系统研究，自 人参茎叶中得到 １ ０种新的皂营成分，分别 为２－　） 人参皂着 Ｒ２ －ｈ，　 、 Ｆ，　 羚基一 ０（ 一 Ｒ ｈ、 Ｒ ３ －ａ －４ ２－ Ｌ ５ 人参皂昔－ ｇ ２－ Ｒ２ ５轻基一 ，　 人参皂 － ｌ－、ｌ ｋ ｏｎｎｄＲ和凡１１ 昔Ｒ ，　 －，　 ｇｓｓ － 一［３ ｈ ｌ ｂｏ ｉ ｉ ， 卜 ａ ｙ ｒ ｅ ｅ ‘人参中除含有各种人参皂昔成分外， 　　　　 还含有多种糖类 （ 单糖、 低聚糖、多糖和杂多 糖） 族维生素 （ ＢＢＢ２及烟酸、 Ｂ 如 Ｉ２１， 烟酸碱、 泛酸） 还含有 ０ 昌醇 （ －ｉｏｔｒ ） ， － ０　 ｔｓｅｏ， Ｓ胡萝 卜 幽醇 （ａｃｓｅｏ ） Ｄｕｏｔｒｌ　 ，麦芽酚 （ａｔｌ　 Ｍｌ ） ｏ 、人参炔醇 （ａ ｘｎｌ、人参炔 Ｐｎ ｙｏ） ａ （ ｉ ｎｇｅ 及有机酸、 　　ｅｇｎ） Ｇｎ ｓ 脂肪酸、 肤类、氨基酸和少量挥发油 （ 含人参烯 ｐ ｃ ａｅ ｎ ｎ， ０ 榄香烯ｅｍ ｎ， 等。 一 ｌ ｅｅ） ｅ． 皂普的结构及性质 ２糖贰 （ 　　　　 贰、 糖昔、 配糖体） 在自 然界中的分布极为广泛， 根据 Ｇ ｂｎｖ ｕａｏ 等人的研究 １ 约有一半以 ［， ４ １ 上的植物中 含有贰。 大部分中 草药的主要药效成分是大量结构各异的 糖 贰三七、高山 红景天、 Ｇ 远志、 黄Ｃ 、 刺五加等日川 迄今为止， ‘。 一 人们已 经从生物体中 分 离得到了不计其数的各种不同结构的糖贰， 并且对糖试的结构和生物活性有了较深刻的认识。糖试中非糖基部分为泌体类或枯类化合物称为皂昔。皂普 （ａｏｉ）又名皂昔、 　　　　 Ｓｐｎｎ皂素或皂草贰， 是如甘草、 人参、皂昔是ｗ体类或菇类化合物的低聚配糖体的总称。 它由 疏水的非 糖基部分皂昔元（ ｌｃｎ和亲水的糖链 （ｕａ Ｍｉｔｅ） Ａ ｙｏ） ｇ Ｓｇｒ　 ｅｉｓ 两部分组成， ｏ第一章 文献综述结构上类似于表面活性剂，大多数皂昔能在水溶液中形成持久性的泡沫，象肥皂一样，因 得名。 此而 皂普是１由 １ ［ 皂普元 （ｐｇ ｉ ） ９ ］ ｓ ｏｅｎ 和糖组成， ａ ｎｓ 依贰元的 可分为 类， 不同 两 其 一为幽 体皂普 （ｅ ｉｌ　 ｎ ｓ　 ｓｒｄ ｓ ｏｉ ） 其二为 ｔｏ ａ ａ ｎ ， ｐ 三枯皂普 （ｉｒ ｎｉｓ ｏ ｎ） 体皂 ｔ ｅ ｅ ｄ　 ｎ ｓ ｒ ｐ ｏ ａ ｉ ａ幽 ｔ ｐ普的皂昔元是幽体衍生物， 三菇皂昔的皂普元三菇类化合物。由一条糖链和皂昔元分子中 轻基 （ 或毅基） 组合成的 皂昔， 单糖链 称为 皂昔小 （ ｏｏｅ ｏｄ ｓ ｏｉ ） 也叫 ｍ ｎｄ ｍ ｓｉ ａ ｎ ｓ　 ｓ ｉｃ　 ｎ ， ｐ单皂着；由两条糖链和皂营元分子中两个不同 位置的经基 （ 或梭基） 组合成的皂昔， 称为双糖链皂昔 （ｉ ｅ ｏｄ ｓ ｏｉ ） ｂｄｓ ｓｉ ａ ｎ ｓ　 ｓ ｍ ｉｃ　 ｎ ，也叫双皂昔；近年来还发现有三糖链皂昔 ｐ （ｉ ｍ ｓ ｉ ａ ｎ ｓ 　　ｓ ｏ ｄ ｓ ｏｉ ）存在。 ｔ ｅ ｉｃ　 ｎ ｒ ｄ ｐ 与皂昔共存于植物中的酶， 　　　　 能够使皂普酶解生成次级贰， 也可以使皂昔的寡糖链缩 短， 还可以 使双皂昔水解成单皂昔。 这些次级贰称为次皂普 （ｒ ａｏｅ ｎ） ｐ ｓ ｇｎ ｓｏ ｏｐ ｉ１３ ．人参皂普的化学结构及理化性质人参皂晋的化学结构１ ３ １ ． ．　人参皂 　　　　 营属于三菇类皂昔１０ 按其 ３－ ，２ ２ｑ 皂昔元的结 构不同 可分为 三种类型； 类是 一齐墩果烷型五环三菇皂昔， 其皂昔元为齐墩酸 （ ｌｎｎ ａ ｄ，此类皂普普遍存在于 Ｏｅ ｏｉ ｃ ） ａ ｃ　 ｉ 含有三菇皂昔类的植物中，自 然界并不乏见。另两类是达玛烷型的四环三菇类皂昔， 它 们在人参皂营中占大多数，目 前认为是人参的主要活性成分之一。 在达玛烷型人参皂昔中， 　　　　 依皂昔元的不同， 可将此型人参皂营分成两类， 即皂营元 为２ （）原人参二醇的，均称为人参二醇型皂普，有一 ａ、－ ａ、－ ｂ、－ ｂ、－ ｃ ０Ｓ一 Ｒ ｉ Ｒ２ Ｒ ， Ｒ ２ Ｒ ，－ｄ －ｇ －ｈ 皂 元为２（ 一 人 三 的 均 为 参 醇 皂 有 Ｒ， Ｒ、Ｒ３ Ｒ， ，　 等； 昔 ０ ） 参 醇 ， 称 人 三 型 昔? 一ｅ Ｓ原－ｆ －ｇ －９、 Ｐ ｔ ２（ 一 Ｒ，　 ｔ Ｒ２ －ｈ和 ０Ｓ 葡萄糖人参皂普－ ｆ 所谓人参二醇、 Ｒ、 ） Ｒ 等。 人参三醇并非是人参皂着的真性皂昔元，因为真性人参皂昔元在酸性条件下，难以保持原形物质。依据上述分类原则，可将人参皂昔分为三类，具体如下； 　　　　 １ ２－ 　　　　 、 ０Ｓ原人参二醇 （ｒｏａａａｏ 类： Ｐｏ ｐ ｘｄ ｌ ｔ ｎ ｉ） 包括人参皂昔 Ｒｔ Ｒｅ Ｒ３ Ｒ ， ａ ａ ａ ｂ ，　 ，　 ，　 ， Ｒ２ Ｒ３ Ｒ ，　，　 ，　 等， ｂ ｂ，　 Ｒ Ｒ３ Ｒ ２ 其结构如图１１ ，　 ｅ ｄ ｇ ｈ －０第一章文献综述Ｒ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 ，　 Ｒ ａ人参皂昔Ｒｉ　－ ｌ （－１ 一 － ｌ ０ Ｇｃ　 －） ０　 ａ　 ｒ （－１ 一 － ｙ ａ ｂ Ｇｃ　 ） ０ Ｇｃ　 － ｌ （－１ 一 － ｒ （ｙ）　 ） ０　 ｌ 　 ２ 　　　 ６ Ａ Ｐ ４ Ｘ 人参皂昔Ｒｅ　 － ｌ （－１ 一 － ｌ ０ Ｇｃ　 ） ０ Ａａ　 ｒ （．１ 一 － ｙ ａ ０　ｃ　 － ） ０ Ｇｃ　 － ｌ （－１ 一 － ｒ （ｕ）　 ） ０　 ｌ 　 Ｇ ２ 　　　 ６ Ｆ ２ Ｘ 人参皂昔Ｒ３　 － ｌ （．１ 一 － ｌ ０ Ｇｃ　 ） ０ Ｇｃ　 ） ０　 ｌ ａ ０ Ｇｃ　 ） ０ Ｇｃ　 － ｌ （．１ 一 － ｉ （－１ 一 － ｙ 　 ２ 　　　 ６ ３　 Ｘ 人参皂昔Ｒ ｉ　－ ｌ （．１ 一 － ｌ ０ Ｇｃ　 ） ０　ｃ ｂ ０ Ｇｃ　 ） ０ Ｇｃ　 － ｌ（－１ 一 － ｌ 　 ２ 　　　 ６ Ｇ 人参皂曹Ｒ ２　 － ｌ （－１ 一 － ｌ ０ Ｇｃ　 －） ０　 ａ　 ｒ ｂ ０ Ｇｃ　 ） ０ Ｇｃ　 － ｌ （－１ 一 － ｒ （ｙ） 　 ２ 　　　 ６ Ａ Ｐ 人参皂替Ｒ ３　 － ｌ （－１ 一 － ｌ ０　ｃ　 － ） ０　 ｌ　 ｒ ｂ ０ Ｇｃ　 － ） ０　ｃ　 － ｌ （－１ 一 － ｙ （ｙ） 　 ２ Ｇ 　　 Ｇ ６ Ｘ Ｐ人参皂昔 Ｒ　　 － ｌ （－１ ０ Ｇｃ　 ０ Ｇｃ　－１ ０ Ａ ａ　ｕ） ｃ　０ Ｇｃ　 ）一 － ｌ ２ 　　　 ｌ （ － ）一 － ｒ （ ｒ － ６ Ｆ 人参皂普 Ｒ 　　 － ｌ （ ．１ ０　ｌ ０　ｌ ｄ　０ Ｇｃ　 ）一 － ｃ　 － ｃ ２ Ｇ 　　 Ｇ人参皂昔Ｒ３　－ ｌ （－１ 一 － ｌ － ｇ ０　ｃ　－ ） ０ Ｇｃ　 Ｈ 　 Ｇ ２ 　　　人参皂昔 Ｆ　　０　ｌ ２　 － ｃ　 Ｇ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 ０　ｌ － ｃ Ｇ 人参皂首 ＣＫ　 Ｈ　 －　－ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 ０Ｇ 一比人参皂普Ｒ２　 － ｌ ｈ ０　ｃ　 　 Ｇ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 － Ｈ 图１１　 － 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 －　２ Ｓ原人参二醉类皂昔的结构 ０Ｆ ．１　 ｒｃ ｒｏＰｏｏａａａｉ Ｓ ｐ ｎｎ ｉ１ Ｓ ｕｔ ｅ　 ｒｔｐ ｎｘｄｏ ａｏｉｓ ｇ － ｔ ｕ ｆ　 ｉ　２ ２－ ，　 Ｓ原人参三醇 （ｒｏａａａｉ） 包括人参皂昔Ｒ ，　 Ｒ０ｇ ｃ ｆ ０ Ｐ ｔ ｎ ｔ ｌ 类： ｏ ｐ ｘｒ ｏ ｅ Ｒ，　 －ｌ ｏ ． ｆ ２ ｕ－ Ｒ ｉ Ｒｚ Ｒ ｉ ｇ ｇ ｈ等，其结构如图 １２ ，　 ，　 －０第一章Ｒ 　　　　　　　　 ，Ｒ 　　 ２１－ ｃ ３　 Ｇｌ ０　 ｃ － Ｇｌ ０　 ｃ － Ｇｌ－ Ｈ－ Ｈ人参皂昔 Ｒ ｅ 人参皂昔 Ｒ ｆ０ Ｇｌ （ － １ 。－ ｈ － ｃ　 － ）一 Ｒ ａ ２１－ ｃ　 ．１ ５　 ｌ ３ Ｇｌ （ ２ ）一 － ｃ Ｇ０　 ｃ － Ｇｌ人参皂昔Ｒ ， ｇ人参皂昔 Ｒ ， ｈＧｌ （ － ）一 － ａ ２ Ｒ 人参皂昔 Ｒｚ ０－ ｃ　 － １ ａ　ｈ Ｓ０　 ｃ － Ｇｌ图１２　 － －　２ Ｓ原人参三醉类皂普的结构 ０Ｆｇ１ 　Ｓｒｃ ｒ ｏ Ｐ ｔｐｎｚｔｏＳｐ ｎｎ ｉ － ｔ ｔ ｅ　 ｒ ｏａａａｒ ｌ　 ｏ ｉ ． ２　 ｕ ｕ ｆ　 ｏ ｉ ａ ｓ３ 、齐墩果酸 （ｌ ｎｎ ａｉ 类：仅有人参皂普 Ｒ ，其结构如图 １３ Ｏｅ ｏｉ ｃ ） ａ ｃ　ｄ ｏ －ｅｃＯＯＲｎ１ ０Ｒ 　　 ２ Ｒ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 ，人参皂昔 Ｒ 　　　 ｌ （一１ 一 － ｌ ｏ　 ｆ Ｇｃ　 ） ５　 ｃ ３ － ２ ＧＩ－ ｃ ｉ　 Ｇｌ图１３　 － － ２ Ｓ齐墩果酸类皂昔的结构 　　　　　　 ０Ｆｇｌ 　　　ｃｕｅ　Ｏｅｎ ｎｃ　ｉ ｉ． ２　 ｔｕｔｒ ｏ ｌ ｏ ｉＡ ｄ － Ｓｒ ｆ　 ａ ｃ一般人参中含原人参二醇类皂昔为 ４－０， 　　　　 ５６％ 含原人参三醇类皂昔为 １ ２％ 含齐 ２ ０， － 墩果酸类皂昔为 ７１％ －００１３２ 人参皂普的理化性质 ．．人参皂昔为人参的主要有效成分，多数为白 　　　　 色无定形粉末，或为无色针状结晶。味 微甘苦，具有较强的吸湿性。一般对酸不稳定 （ 人参皂昔 Ｒ 除外） ｏ ，弱酸下即可水解， 但在水解后得不到真正的原形皂昔元。 人参皂昔易溶于水、 甲醇、 乙醇， 可溶于正丁醇、第一章 文献综述醋酸和醋酸乙脂，不溶于乙 醚、苯中。 此外， 人参早带具有光学活性， 在甲醇中多呈现 右旋性［， ｚ 水溶液震荡产生强烈泡沫。 ｓ ］ 人参皂昔一般对酸不稳定 （ 　　　　 人参皂昔Ｒ 除外） 弱酸下即可水解， 。 ， 但在水解后得不 到真正的原形皂昔元， 原人参二醇类皂着和原人参三醇类皂昔在酸水解后产物分别为人参二 醇和人参三醇。 人参皂昔水解特点还在于其结构中与糖链缩合的 Ｏ 一 Ｈ性质不同， 如 皂昔元 Ｃ０Ｏ ２－ Ｈ是叔醇基， 其形成的 贰键比 仲醇基形成的贰键容易水解（１ ２，形成单糖 ３皂营。 Ｃ － Ｈ和 Ｃ － Ｈ与糖形成的贰键必须在较强的酸性条件下才能水解， 而 ３Ｏ ６Ｏ 但糖链的 末端糖在较温和的条件下也可以 键水解掉，生 断 成次级贰 （ｒ ａ ｏｉ ） ｐ ｓ ｐｎ ｓ＜ ｏｎ ｎ１４ ．人参皂昔的糖链、生理活性及药理作用人参皂昔的糖链及生理活性１４ １ ．．人参味甘、 　　　　 微苦， 性微温， 具有补气、固脱、生津，安神、益智等功效，自 古以来 在民间 就被视为名贵中药。 现代药理学研究表明２， ［ 人参中的主要有效成分是人参皂普， ４ ］ 其生理活性作用极为广泛，涉及人体中枢神经、心血管、免疫和消化等系统，并对机体合成 代谢、 腺功能 性 等具有良 好作用。 文学２ 对国 袁 ［等 产人参根 ｓ ］ 水提取 物和醇 物进 提取行研究表明， 人参根总皂营具有抗炎、 抗利尿、 镇静、 升高胰岛素低血糖、 兴奋离体心 脏、 抑制离体肠管等作用。 各国学者通过制作人参的粗制剂或粗提取物， 注射进小鼠 体内， 研究其药理作用， 结果表明： 人参总 皂昔具 有滋补强壮、 延缓衰老、 抗肿瘤、 调节 内 分泌系 作用［２； 统的 ［ ７ 具有降 验性高 ２１ ６ － 低实 血糖， 枢神经起调节 ［２ 对中 作用２９ ８１增强记 －忆力 神 射功能３， 有对心 管和 液系 调节作用［， 增加免疫功能， 和 经反 〔 具 ０ １ 血 血 统的 ３ 能 １ １ 能调节消化系统等功能。 人参皂营具有多种生理活性和良好的药理作用， 　　　　 但是天然人参皂若的分子结构并不是活性最佳的状态。以 往的研究多数只集中在皂昔元上， 这是因为以前人们只注意到皂 昔元的重要性， 忽视了糖链的作用。 然而， 近年来的许多事实已 经证实糖链在人参皂昔 的生物活性方面起着重要的作用， 也就是说如果改变皂昔的糖链， 其生理活性可提高几十倍，甚至几百倍。关于人参皂昔单体成分的药理活性的 　　　　 研究， 一直是很活跃的领域， 这方面的研究报 道有很多。 人们己从人参的根、 茎、叶中分离得到了大量的人参皂昔， 并对这些皂昔的 结构和生理功能进行了较为详尽的研究。 正如前面谈到的， 这些皂昔根据皂昔元的不同第一章 文献综迷分为三类，为齐墩甲 烷型三菇皂昔、人参二醇型皂昔和人参三醇型皂营。 在每一类中， 它们的 皂昔元结构是完全相同的， 区别主要是在糖链的结构不同。 而含有不同糖链结构的 人参皂昔 不仅生 性效 物活 价不同， 而且作 用也不 一样。 如人参二醇型皂昔Ｒ３ ｈ ｈ和Ｒ２ ，他们的皂普元部分是一样的，差别Ｃ３ 糖链上。Ｒ ２比Ｒ３ － 位的 ｈ ｈ少一个 ０　葡萄糖， －－ Ｄ 而两者在生理作用上却相差很大， ｈ Ｒ２具有很强的 抑制癌细胞增殖功能， ｇ却不具 而Ｒ，有 种 能３７ 又 人 三醇 皂 这 功 ［３ 如 参 型 昔纯，Ｒ２ ｈ 它 皂 部 一 ， ２］ －。 、 ｇ和Ｒｌ 们的 昔元 分是 样的 ，差别在Ｃ６ － 位和 Ｃ２ 位的 －０ 糖链上。 Ｃ６ 处； － 位和Ｃ２ 位上分别接有一分子 ０　葡萄 －０ －－ Ｄ 糖： ｇ 在Ｃ６ Ｒ２ － 位上接有 ０　葡萄糖一（，　一 －－ 李糖， －０ －－ Ｄ （ １ 。 Ｌ鼠 ２ ） Ｃ２ 位上为轻基； ｈ Ｒｌ 又比Ｒ２ “ Ｌ鼠 糖。 ｇ少 －－ 李 然而， 链中 这 微小变 却使Ｒ ，Ｒ： ｈ三 糖 的 种 化， ｇ ｇ和Ｒｌ 种皂 ，　 昔在生物活性效价和生理作用上产生了 很大的差别， ｇ具有使中 Ｒ， 枢神经兴奋、 抗疲劳、 改 善学习 记忆技能、 促进 Ｄ Ａ Ｒ Ａ合成、 化蛋白 Ｎ ，　 Ｎ 活 质分解 酶等作用， ｇ具有 Ｒ２ 抑制 血小板凝集、 活化蛋白 质分解酶等作用， ｈ 则具有抑制癌细胞增殖的作用［ ５ 目 Ｒ， ３１ 前 ７ 。 ４的 究 明 Ｒ，Ｒ： 具 抑 癌 胞 殖 作 ， － 位 缺 一 子 ｐ。 研 表 ， ｇ ｇ都 有 制 细 增 的 用 但Ｃ ０ 上 少 分 一 ，　 ２ －葡萄糖的Ｒ ｌ ｈ，效果明 显优于Ｒ ｌ ｇ其抑制癌细胞增殖的能力约是Ｒ ｌ ５ ｇ的１ 倍。各人参皂昔单体的生理活性如下： 　　　　１ 　　　　 Ｒ ：具有抗炎作用、解毒作用、抗酵素作用、具有 Ｔ ｒ ｂ 、人参皂昔 ｏ ｈｏ ｉ ｍ ｎ细胞活性化作用。２ 人参皂昔 ｂ： 　　　　 Ｒ ｌ 具有抗过氧化作用： 、 抗心率失常作用， 对抗由 氯化钡诱导的大鼠 心率失常；降胆固醇作用；调脂作用；神经保护作用，明显延长神经细胞的存活时间： 中 枢性抗应激作用； 促进血浆分泌皮质酮活性； 抗病毒作用，抑制Ｈ Ｖ １ Ｓ － 等的复 制。 ３人参皂昔 ｂ： 　　　　 Ｒ ２对环磷酸腺昔磷酸二酷酶有抑制活性； 、 促进血浆分泌皮质酮活性； 抑制糖尿病大鼠的肾病症； 抗血小板聚集作用； 抑制黑色素瘤小鼠 的肺转移， 阻止新血管的形成；对 ＥＯ ｔＨ引起的大鼠脑损害有保护作用。 ４ 　　　　 Ｒ ：具有抗过氧化作用： 、人参皂普 ｅ 对环磷酸腺昔磷酸二酷酶有抑制活性；促进血浆分泌皮质酮活性；抗血栓和抗动脉硬化作用；钙通道阻滞作用；抗心率失常作用， 对抗由氯化钡诱导的大鼠 心率失常：保肝作用；对蛋白 酪氨酸激酶有兴奋作用。 ５ 　　　　 Ｒ ：具有抗过氧化活性；对环磷酸腺昔磷酸二酌酶有抑制活性； 、人参皂昔 ｄ 促进血浆分泌皮质酮活性；抗心率失常作用；调节肾功能，抑制肾小球细胞的增殖； 提高柔毛霉素和长春花碱的细胞毒活性；对ＥＯ 起的大鼠脑损害有保护作用。 ｔＨ引 ６ 　　　　 Ｒ ：具有抑制中枢神经作用，促进 Ｄ Ａ Ｒ Ａ合成作用，促进血清 、人参皂昔 ｅ Ｎ ，　 Ｎ第一章 文献综述蛋白质合成作用。使分解蛋白质酵素活性化作用，具有促进副肾皮质荷尔蒙分泌作用。 人参皂普 Ｒ ：具有与脑神经细胞有关联的镇痛作用。 ｆ７ 人参皂普 Ｒ：具有与脑神经细胞有关联的镇痛作用。 ｆ８ 人参皂昔Ｒ ， 　　　　 ｇ 具有使中 、 ： 枢神经兴奋作用， 抗疲劳作用， 恢复疲劳作用， 改善记｝、学习机能，促进 Ｄ Ａ Ｒ Ａ合成作用，蛋白 ｈ Ｌ Ｎ ，　 Ｎ 质分解酵素活性化作用。９ 人参皂昔Ｒ２ 　　　　 ９ 、 ：具有抑制血小板凝集作用， 蛋白 质分解酵素活性化作用。 １、人参皂昔 ９； 　　　　 Ｒ ３ 抑制肿瘤生长、 ０ 抗肿瘤转移和浸润、 促进肿瘤细胞的凋亡、 增 效解毒、 提高机体免疫力。 此外， 具有保肝活性： 抗血小板聚集活性： 提高血浆皮质酮水平活性；在抗补体活性试验中对羊红细胞有溶血作用。１、 　　　　 １ 人参皂昔Ｒ ｌ ｈ；具有抑制癌细胞增殖作用， 抗肿瘤作用。 １、 　　　　 ２ 人参皂营Ｒｚ　 是抗肿瘤、 ｈ， ［： ｅ ， 抗转移的天然植物成分， 能抑制黑色素瘤Ｂ６ １细 胞和人卵巢癌细胞的增生；口 服本品显著延长荷 Ｈ Ａ细胞裸鼠的存活期：在培养的小 Ｒ鼠成纤维细胞中，对 Ｄ Ａ合成有抗增生作用；在正常人细胞中，显著减少姐妹染色单 Ｎ 体交换；提高抗癌药对 Ｐ８ＪＤ 的细胞毒活性；逆转 Ｐ ８ｔＤ 细胞对柔红霉素和 ３８ Ｍ Ａ ３８ Ｍ Ａ 长春碱的耐药性。１、 　　　　 ３ 人参皂昔Ｒ４ 具有细胞毒活性。 ｈ：１４２ 人参皂昔 Ｒ ， ．． ｇ的药理作用值 　　　　 是， 得注意的 人参皂普Ｒ： 人参 作用的主 ｇ是 益智 要成分， 延缓神经 衰老并 可 细胞降低老年发生的记忆损伤，有明 显改善脑功能， 提高学习能力， 增强记忆力和集中力， 从而预防 年 老 痴呆的 ［４。 ， 据多 实 指 包括 板、 温、 热、 眠、 效果４８ 此外 根 项 验 标， 倾斜 降 解 催 １１ ７ －镇痛、 抗惊厥、 格斗、 条件性回避实验等， 人参皂昔Ｒ 工 ｇ对中枢神经系统有轻微的兴奋 作用， 有促进学习辨别的作用， 醇引起的 对乙 记忆再缺失也有明显的改善作用［５。 ４１ 人 ９１ － 参 皂昔Ｒ， 代培养的大鼠 ｇ对原 海马神经 细胞有延长 存活时间、 死亡率、 抗谷氨酸 降低 对 介导的 神经毒性作用， 其机制被认为是由 于选择性抑制了 大剂量谷氨酸而引 起的钙离子浓度异常升高。人参皂普Ｒ ， 　　　　 ｇ在钙离子影响的 心脏和血管平滑肌的收缩中， 依靠钙促进血管收缩， 有血管扩张的功能。 还使红血球变形来通过３大小的毛系血管， 一 改善末梢循环。 此显 由 示， 人参皂普Ｒ 】 ｇ能改善血流循环， 止动脉硬化，强化心细胞保护和心脏机能。 防 人参第 一章文献 综 述皂 ｇ可 慢大鼠 昔Ｒ ， 减 心率。 参皂普Ｒ。 有 人 ｇ具 较强的 抗氯化钡诱发的 大白 心 鼠 率失常 作用， 对所产生的心动过速有较强的纠正作用， 使心率恢复到正常水平。还有， 　　　　 人参皂昔Ｒ ｉ ｇ抗疲劳作用显著； 且能增加培养的人皮肤成纤维细胞中 氨基葡聚 生 糖的 成量， 抗皮 衰 也 定 用５ ， 参皂 ｇ还 有 吗 耐 性 这对 肤 老 有一 作 ［ 人 昔Ｒ： 具 抗 啡 药 ２ １和缓解吗啡成瘾性的作用。 ．． 人参皂昔 Ｒ 的药理作用 ４３ ｅ 目 有关人参皂普Ｒ 药效学报导主要有： 　　　　 前， ｅ 人参皂昔 Ｒ 可消除或降低肾上腺素的 ｅ 正性肌力作用，人参皂昔 Ｒ 可能为肾上腺素受体的竞争物；人参皂普Ｒ 能抑制Ｎ ＋ ｅ ｅ ａ， Ｋ－Ｔ 酶的活性， ＋ Ｐ Ａ 抑制作用强度与剂量成正比， 从而增强了心肌收缩力： 人参皂昔Ｒ ｅ有一定的抗溶血作用，而无溶血作用；人参皂营 Ｒ ｅ有升高血浆皮质酮的作用；人参皂晋 Ｒ 对血清蛋白质合成速率较强； ｅ 人参皂昔 Ｒ 具有抗辐射作用， ｅ 保护骨髓的造血功能； 人参皂着 Ｒ 抑制血小板聚集活性强。 ｅ 人参皂普 ｅ 　　　　Ｒ 广泛存在于五加科人参属植物中，例如人参的根、茎、叶、花蕾、果 实中，三七的根、根茎、芦头中，以及西洋参的根、叶、果实中。其中人参果实、花和花蕾中 含量较高， 分别为６ 和大约２ ４ ０ ％ ．％ ９从 参 昔的 和药 研 角 来 一 可 　　　　 化学 理学 究 度 说， 般 从不同 然来 直 备 参总 人 皂 天 源 接制 人皂苍， 然后再进一步从中分离和纯化人参皂告单体成分。然而，从医药工业的生产实践角度看， 与其以高成本低收率制备医药上有用的稀有人参皂普单体成分， 倒不如根据人 参皂昔基本结构相同只是糖基不同的特点， 通过改变人参皂昔糖基来制备所需有用的稀有皂昔。例如，人参皂普 Ｒ， ｇ在人参中的 含量较少， ． ， 约０ ％ 从人参中 ２ 直接提取显 然不合实际。若采用微生物酶水解，去掉人参皂昔 Ｒ 的Ｃ ６ ｅ － 位末端上的一个 ａ 鼠李糖基， 一就 大 可 量制备 人参皂普Ｒ ， 而 通过 ｇ 且， 对人参皂 。 昔单体成分的 药效学的 研究发 就 现，人参而言， 其活性成分即人参皂普的药理作用随单体结构上糖基的减少而增强。 也就是说，皂普元上所带糖基越少，它的药用价值越高。． 人参皂普结构改造方面的研究进展 ５如上所述， 　　　　 天然皂昔的分子结构不一定是活性最佳状态， 如果改变人参皂营分子中的糖基， 其活性可提高几十倍、 几百倍。 但由于皂昔结构复杂， 大多数研究主要是围绕第一章 文献综述皂昔结构的 研究， 进行糖昔键和贰键的 裂解反应。 而有目 的地改变人参皂昔糖基， 来提 高人参皂营生物活性方面的研究报道却很少。目 对人参皂普糖基年的改变方法归纳 前，起来主要有化学法和酶法。１５１人参皂昔的化学水解和转化研究进展 ．．　 人参皂昔的水解法在研究皂昔元的结构以 　　　　 及皂昔的糖链中各糖的联结顺序及位置方面有重要意义，常用的裂解方法有酸催化水解法、乙 酞解法、Ｓ ｉ ｍｔ ｈ降解水解法、光 解法、 碱裂解法和酶水解法等［ ，１ １５ ，３　 ２ 人参皂昔遇酸极不稳定， 　　　　 通常是用稀酸对皂普进行水解， 若用醋酸缓和水解， 即能得到相应的人参次皂昔， 若水解条件比较剧烈，则所有的贰键均可断裂， 生成人参皂若元。 人参皂昔的全水解通常用硫酸或盐酸， 一般用５ ＨＳ ４ 醇一 （：　 １ ３ ％ ２Ｏ 以乙 水 ｌ １ ：　 或 ） 为溶剂，回流６ 小时。或采用 ５ Ｈ Ｌ甲醇溶液水解 ４ ％Ｃ 小时。用乙醚萃取皂昔元。 Ｓｉｔ５等用弱酸水 　　　　 ｈ ａ［１ ｂａ ４　 解人参 － ，－ ２－ｅ 皂普 Ｒ 、Ｒ 、Ｒ 得次生皂 （ ｏ ｐｇ ｉ 和一 ｂ ｂ 营 Ｐ ｓｏ ｎ ） ｒ ａ ｅｎ个 糖， ａ ｋ［等研究了 寡 而Ｔｎ ａ　 ａ ５ ５ ］ 达玛烷型 三菇Ｃ０ ２ 绝对构型 催化反 证明了 将 和酸 应， 如果２ （ ） 原人参二醇用醋酸水溶液加热 （ ０　 一 Ｓ 或在相同条件下对人参皂昔－ｂ、 Ｒ ２ Ｒ Ｒ ， －ｂ、－ｅ 进行部分酸水解）可得 ２ （ ）一 ０　 原人参二醇与其 Ｃ。 Ｓ ２位异构体 ２ （ ） 人参二醇 （ Ｄ ０　 一 Ｒ Ｕ　 １） Ｉ 的混合物，且后者较多，这表明稀醋酸能促使 ２ 碳位沙锅内的构型有 Ｓ ０ 型转为 Ｒ型：容易控 我国 者陈英杰［等发 在适宜的 应条件 ，碱催化水解法具有反应温和、　　 学 （ ５ 现， ３ ］ 反 下 成功地 制的特点，特别适用于贰元遇酸不稳定贰的水解 。 用此法水解人参皂昔－ｇ等， Ｒ ２ 　　而若用 得到了原人参三醇及相应的皂昔元和人参皂着－ｈ， Ｒ， 但其中的游泳皂着收率很低：酸水解人参皂昔时，只能得到侧链环合的次生皂昔元。 自 　　　　 从人参招待被确认为人参根的主要有效成分后， 化学家们曾致力于某些单体皂昔的 成和 合 有效单体皂营的 化。 搓［等利 转 刘惟 ５ 用化学法 ６ ］ 进行了 人参皂昔－ ２ 半 Ｒ 的 合成， ｈ合成的一ｈ与一ｈ的结构极为相近。 Ｒ２ Ｒ ２ 合成路线是葡萄糖经乙酞化和澳代反应生成四乙酞 浪代葡萄糖，再于由人参茎叶中制得的人参二 醇缩合，得到人参二醇－０ ０　四乙 ３ －　一 酞 － － Ｄ 葡萄糖贰， 最后用三乙胺脱乙 酞基即得人参皂昔－ｈ。 Ｒ ２ 其与天然品人参皂昔－ｈ的区别 Ｒ： 仅在 Ｃ１ － ７侧链不同。合成的一ｈ具有抗癌作用，但这种化学方法得到的副产物多，且 Ｒ２ 反应难以 保证有活性的空间异构体。１５２酶法改变人参皂昔糖基的研究进展 ．．第一章文献综述酶水解法为一种选择性水解反应， 性质的酶能作用于不同构型和不同组成的糖 　　　　 不同 的 糖昔键或贰键，从而达到定向 水解的目 神田 ［等将人参皂昔Ｒ 用高峰沉淀 的。 博吏５ ］ ７ 〕 ｄ酶 （ａａａａ ） ＴＫｄ ｓｓ 水解， ｉｔｅ 得人参皂普 Ｆ， ２ 沟通了 这两个皂昔的结构；酶解法也能部分水解产生若干次级皂昔， 有利于结构式的确定， 同时贰键的断裂不致引起皂昔元的变化， 从而得到真试元，如人参皂昔 Ｒ ， ｈ用酸水解得到人参皂着三醇，若以橙皮贰酶解则可得真皂昔元 ― 原人参三醇。 酶解法也常用于定向 制备， 小桥恭一［等研究了 ［ ５ ８ ］ 人参皂营被 人体肠内细菌利用而生成其他次生皂昔的情况， 其中人参皂普 Ｒ ， ｂ被酶解后生成人参皂 昔Ｒ ， ｄ 人参皂昔 Ｒ 可生成人参皂普 ＧＦ和人参皂昔 Ｒ３ 人参皂普 ＧＦ和人参皂普 ｄ － ２ ９， － ２ Ｒ； ｇ 都可生成人参皂昔 Ｒ２ ｈ，然后生成皂昔元：人参皂昔 ＧＦ 的大部分是生成 － ： Ｃｍ ｏｎ－， ｏ ｐｕｄ 然后生成皂普元。说明 Ｋ 酶解法水解人参皂昔来定向 制得活性更高的次生皂普是很可行的。 在利用生 　　　　 物 酶 法 改 变 人 参 皂 昔 葡 萄 糖 基 方 面 ， 能 查 到 相 关 报 道 （ ｉ ｇｗ ：Ａ ｒ ．ｈｍ，　 １１９ ；　ｉ ｒ ｘＥｚｍ Ｍｉ ｂ ｅｈ ７ ３，　５ ０ 　　ａａ ａＪ ｇｉＣ ｅ ． ７２，　３ Ｐｎ ｔｒ ：ｎｙ ｅ ｃｏ． ｃ．１，　 １９ ） Ｋｄ ｃ ６，　 ９ ａｎａ ｕ ｒ Ｔ ，　 ２ ９ 但是国际酶学上还没有弄清皂营糖昔酶和纤维素酶的区别， 其研究使用的酶大部分是用商品纤维素和半纤维素酶代替皂昔糖昔酶， 试图要改变皂昔葡萄糖基制备高活性次生皂 昔， 因此没有多大进展。 这方面， 本课题组的负责人金凤燮教授和鱼红闪博士进行了多 年的研究工作，偶然发现一种现象：从微生物中分离得到了一种皂普 ｐ 葡萄糖营酶， 一分子量约为 ３ｋ 。 ４Ｄ 该酶能 够水解人参皂昔 Ｒ： ｇ分子中 一个葡萄糖基， 生成高 抗癌的皂 普Ｒ２ 然而该酶不能水解纤维素１ 葡萄糖普酶研究中常用的底物， ｈ； ３ 一 如纤维二糖或者对 硝基 一 糖昔 （ 州 Ｐ ） 对 现的 酚ｐ 葡萄 简称 Ｇ ； 新发 皂普０葡萄糖普酶的 － 蛋白Ｎ端序列的初 测定、 际互联网（ ｐ／ｗ ．ｂｎ ． ．ｖ　 质序列数 （Ｌ Ｓ Ｓａｈ 步 在国 ｈ ： ｗ ｅ． ｎ ｇ ） ｔ ／ ｎ ｉｌ ｉ ｏ 蛋白 ｗ ｍ ｈ 据库（ ＡＴ　ｒ Ｂ ｅｃＲｓｔ 中比 ｅ ｌ） 较结果， ｕｓ 该酶与ａ 淀粉酶和ｐ 淀粉酶具有一定的同 一 一 源性， 而与传统的０ 一 葡萄糖昔酶蛋白 序列截然不同。从而进一步证明了，皂营糖昔酶与纤维素、半纤维素 等的糖营类酶是有很大区别的。在以往对糖普类水解酶的研究中，大多采用糖链底物或带较小疏水基团的糖链底 　　　　物， 如可溶性纤维糊精、 纤维二糖、 Ｍ ，　 Ｇ ｐ Ｐ Ａ等， Ｃ Ｃ ｐ Ｐ ，　 Ｇ Ｎ Ｃ 当用这类酶去水解人 参 皂普的糖昔键时，往往达不到预期的效果，如栗山健一（ 等利用纤维素酶 　　 ５ ９ ］ （．　．　 ４，　 　　．　 １ ） ￥葡萄糖昔酶 （．　．　 ２）以 ＥＣ３２ ．　 一 ．　 ＥＣ３２Ｉ　 及两者的混合酶剂， ．　 ．　 ．　 １ 去水解芝麻中 ｇｎ 　　 ｉａ配糖体的 链，ｇ 的Ｌ ｎ 糖 １底物中 加了９０ｇ 酶制剂， 现当 ０ｍ 的 发 单独使 用单一酶时几乎无法水解，而且用混合酶制剂的水解率也仅为０ ％． 　　 ． 类似的情况还有很多，因此， ９ 认为不同来源的葡萄糖昔酶，对底物的专一性是不同的。 　　第一章 文献综述有关利用微生物产的鼠李糖昔酶， 水解人参皂昔 Ｒ 的一个 ａ 鼠 ｅ 一 李糖基， 制备人参 皂昔Ｒ ， ｇ方面，至今还没有相关的报道。１６ 糖普酶提取方法的研究进展 ．蛋白质和蛋白质相互分离主要利用它们之间的各种性质的微小差别。诸如分子形 　　　　状、 子 大小、 离 质、 解 生 能 一 等。 主 理 外 下 个 分 量 电 性 溶 度、 物功 专 性 其 要原 不 乎以 两方面： 一是利用混合物中几个组分分配率的差别， 把它们分配于可用机械方法分离的两 个或几个物相中，如盐析、 有机溶剂提取、层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相 中， 通过物理力场的作用使各组分分配于不同区域而达到分离的目的， 如电泳、 超离心、超滤等。 其方法主要有：１盐析法， ． ． ２有机溶剂分离纯化法， ． ３凝胶过滤层析， ． ４离子 交换层析，５亲和层析，６凝胶电泳 ． ． 有关糖普酶的提取方法， 　　　　 根据材料的选择而有所不同， 但都不外乎上面所述的各种分离 提纯方法。 例如： ｕ Ｗ ｎ ｉ ｋ ｉ ａ ａ Ｇ ｏ　 ｆ 等、 ｅｏ Ｗ 等及Ｙｓ ｕｉ　ａ ｅｅ ｊｇ ａ ｙｋｌ 等对茶鲜叶粗酶提 ｕ ｊ ｉ ｍ 取物进行层析纯化，分别从数北种鲜叶、水仙种鲜叶及阿萨姆种鲜叶中得到了ｐ 一樱草 糖昔酶。 茶叶中糖昔酶纯化， 一般经过鲜叶匀浆制成丙 酮粉、 有机溶剂沉淀、Ｎ ４２ ４ （Ｈ）　 Ｓ Ｏ 盐析、 柱层析及ＦＬ Ｐ Ｃ等步骤［．　 葡萄糖营酶与０ 樱草糖昔酶纯化方法基本一致， ６ Ｓ ０ 一 ） 一 只是条件略有不同。 胜、 董尚 童启庆利用柱层析法对桅子花中 糖昔酶进行了 分离收集［ ［ ６ １ ［ 王月敏， 一 刘丽英， 叶路， 高磊等人利用硫酸钱分级沉淀和Ｄ Ａ － ｐａ ｌ Ｅ ＥＳ ｈｃ 离子交换层析 ｅ ｅ从白色念珠菌 ＷＤ ７培养液中提纯得到一种蛋白酶， ２ 初步鉴定该酶为天冬氨酸蛋白酶（。 ６ 武金霞，贺迎采用渗透压 ２ １ 张 冲击法 提取大肠 杆菌Ｅｃａ　青霉 ．　１ ｏ ０ ｌ ８ 素酞化酶 得到了 高比活的粗酶液， 再经硫酸钱分级沉淀，　 Ｅ Ｃｌｌ ｅ５ 离子交换柱层析就得到了聚丙 Ｄ Ａ － ｅｕ ｓ ２ Ｅ ｌｏ －烯酞 凝胶电 胺 泳显示一条单带的 酶，即 青霉素酸 化酶［ ６ ３ １蛋白 　　　　 质提纯以后需要有指标来说明它的纯度， 用一种方法一个条件来分析蛋白 质的 纯度是不够的。由于蛋白质数量多， 性质相似者在所难免，一个条件下两个蛋白质不能 分开的可能性是很大的， 一般均希望用两种以 上的方法来分析蛋白 质的纯度。 只有一种 检定方法时应该用两种以上条件来鉴定。 对蛋白 质纯度的要求因工作需要而异， 生物制 品考虑制品体内的副作用， 物理化学研究要求不千扰对象的物化性质， 化学结构分析要 示杂质含量低于分析方法的灵敏度等等均要作具体分析。确定蛋白质 或多肤） 　　　　 （ 样品的纯度标准大致如下。即分子大小是否均一，电荷是否第一章 文献综述均一， 是否具有恒定的氨基酸组成， 是否具有单一的Ｎ 末端和Ｃ 末端残基， 进一步纯化时生物活性是否再有提高及能否结晶 从Ｎ 等， 末端测顺序一般在４ 上。 步以 如果都是单一的氨基酸残基，则含杂质可能为十六万分之一。 上述几条是较严格的要求， 　　　　 很难全都达到。通常以电泳时呈现单一的单点，以及末 端残基鉴定是单一的即可进行顺序测定。１７酶蛋白Ｎ端序列测定 ． 一蛋白 　　　　 质的一级结构即氨基酸的排列顺序，决定了蛋白质的高级结构及功能。因此， 测定蛋白质的一级结构是进行蛋白质结构与功能研究中不可缺少的部分。 蛋白质一级结 构分析方法主要有两种： 化学分析法， 一、 即直接进行肚链的拆分、 ‘ 裂解及氨基酸分析； 二、 通过测定编码蛋白 质的核昔酸顺序推测相应蛋白 质的氨基酸顺序。在测定序列前， 　　　　 对被测肤链的 某些性质必须有所了 首先， 解。 样品的纯度一定要在９％ ０ 以上，通常是用色谱和电泳精制过的。从 ＳＳＰＧ 上分离的蛋白质必须经过特殊处 Ｄ－ＡＥ理， Ｏ 浓度低于。００９ 否则ＳＳ 使ＳＳ ０５， ６ Ｏ 会影响到胰蛋白 酶的酶解， 也会明显降低ＨＬ ＰＣ分离时的分辨力。因为 ＰＤ ＶＦ膜结合蛋白 质能力的专一性远远超过它与盐、氨基酸和去 垢剂的结合， 能将蛋白质与这些杂质分开， 所以在 ＳＳＰＧ 后， Ｏ－ＡＥ 采用电印迹转移到ＰＤ ＶＦ 膜上，是常用的方法。如果样品是用反相 ＨＬ ＰＣ纯化的，因为流动相是挥发性溶剂，在真空千燥或冻干样品时可被除去。 如果蛋白 质是用离子交换 ＨＬ 或疏水ＨＬ 或凝胶过 ＰＣ ＰＣ 滤 ＨＬ ＰＣ精制的，则样品要进行脱盐。其次，对蛋白 质的肤链和亚基的构成情况应有所 认识。 在蛋白质样品纯度达到要求，盐和小分子也已除净时，还要转变半胧氨酸残基为 其他稳定的衍生物。因为半肤氨酸的琉基在分肤过程中易自 动氧化成各种产物， 包括形 成无序的二硫键，因 此需要将半肤氨酸残基先转变成稳定的衍生物。 由 　　　　 于核昔酸序列测定技术的发展， 越来越多的肤链序列已 借助于核酸法测定。 但是 核酸测序中， 所用引物的设计还是以肤链中某些片段的序列为基础，因此核酸测序仍离 不开蛋白质化学测序。用化学手段进行蛋白质测序的核心还是 Ｅｍｎ 　　　　 ｄａ 降解反应。Ｅｍｎ ｄａ 降解的基本化学原 理与它最初提出时相同。虽然可以利用的自动化仪器已有了很大的改进，Ｅｍｎ ｄａ 降解及随后的氨基酸衍生物的鉴定现己自 动化至很高的程度， 但对于那些经费有限或无法去中 心仪器实验室测试的实验室来说， 手工方法进行测序也相当成功。 其基本操作由四步（ 常第一章文献综述称为四 ＋ ． ） Ｃ ． 组成：即， 偶联 （ｏｐｉｇ 、 ｃｕｌｎ） 裂解 （ｌａａｅ、转化 （ｏｖｒｉｎ ｃｅｖｇ ） ｃｎｅｓｏ ）和 谱 析 （ｒ ａ ｇ ｐ ） 色 分 ｃｏｔｒｈ ． ｈｍ ｏ ａ ｙ１８　Ａ的提取 ．　Ｎ Ｒ分子生物学研究是科学研究中很普遍的一种手段。对某一生物或病毒进行性状研 　　　　究， 首先要获得该性状基因。 从细胞中分离ＲＡ Ｎ 的纯度与完整性对于许多分子生物学实 验至关重要。 。Ｎ 文库的构建、 ＴＰＲ ＲＡ 如 ＤＡ Ｒ－Ｃ ，　 序列分析、寡聚 （Ｔ Ｎ ｄ）纤维素选择分离 ｍＮ、 ＲＡ 差异显示 （ＲＡ　 ｆｒｎｉｌ　ｐａ）、 ｍＮ ｄｆｅｅｔａ ｄｓｌｙ 代表性差异分析 （ｅｒｓｎａｉｎｌ ｉ ｉ ｒｐｅｅｔｔｏａ Ｄｆｅｅｃ ｎｌｓｓ Ｄ ） 、 抑 制 性 消 减 杂 交 （ ｐｒｓｉｎ　 ｂｒｃｉｎ ｉｆｒｎｅ　 ａｙｉ，　 Ａ　 　Ａ 　Ｒ Ｓ ｐｅｓｏ　　　　　　　　　　　 ｕ ｓ ｔａｔｏ ｕ Ｈｂｉｉａｉｎ ＳＨ，　 ｈｒ ｙｒｄｚｔｏ，　 ） Ｎｔｅｎ印迹分析、蛋白质的体外翻译等，在很大程度上取决 Ｓ ｏ 于ＲＡ Ｎ 的质量。ＲＡ Ｎ 极不稳定、易于降 解，且Ｒａｅ Ｎｓ 广泛存在、结构稳定、 ＲＡ 对 Ｎ 有高 效的降解性，因此创造一个无 Ｒａｅ Ｎｓ 的环境、 严格防止 Ｒａｅ Ｎｓ 污染是成功提取 ＲＡ Ｎ 的关键。日 　　　　 前，己建立起来的关于 ＲＡ的提取方法如 Ｌｃ 法、氯化艳密度梯度离心法，多 Ｎ ｉｌ数情况下，这些方法均用到 Ｒａ。 Ｎｓ 的抑制剂如肌盐、酚、氯仿、 Ｄ 及氯化艳密度梯度 ＳＳ 离心「 且多是从动植物组织和细胞中 ６ ４ １ 提取未降 解的 ＲＡ Ｎ，而从真菌中 提取 ＲＡ的方法 Ｎ 国内外报道的较少。 真菌中富含 ＲａｅＲＡ ， Ｎｓ（ 酶） 又含有大量的多糖， Ｎ 另外， Ｎ 容易降 ＲＡ 解， 不同实验材料的ＲＡ Ｎ 提取方法又各有所异［， ［ 这给ＲＡ ６ ５ １ Ｎ 的提取增加了一定的难度。 当从培养细胞中提取 ＲＡ时， Ｎ 如采用 Ｌｃ 法，因高浓度的 ＤＡ ｉｌ Ｎ 会使加入 Ｌｃ 后的溶液 ｉｌ 粘度过大，从而很难分离 ＲＡ Ｎ 。如采用氯化艳密度梯度离心法虽然提取效果较好，但实验操作需要高速离心机 （０００ｐ，　 以 ， ４，　 ｍ ２ｈ 上） 且后续操作过程复杂， ０ｒ ０ 一般常规性实 验室条件很难实现。１８ ９７年 Ｃｏｎｚｎｋ ｈｒｃｙｓｉ等建立了酸一 异硫氰酸肌一 苯酚一 氯仿一步法（ｃ ｇａｉｉ － ｅ － ｌ ｆ ， Ｐ）。 方法较以 传统方法 　　－ｕｎｄ ｅ ｈｎｌ ｈｏｏｏｍ ＧＣ 该 ａｉ ｄ ｎｐ ｏｃ ｒ ｒＡ 往的 操作简单，无需特殊的设备，抽提时间缩短至 ４， ｈ因而得到广泛的应用。本研究在参考多种ＲＡ 　　　　 Ｎ 提取方法的基础上， 对一步法做了 较大的改 建立了一种 进，简 有效的 真菌ＲＡ 提取方 采用 硫氰酸 ６６ ａｒｍｘ１ Ｍ 变 单、 适合 Ｎ的 法， 异 肌１ ７ ｔｉ － Ｔ联合 ６１ ．　 和Ｃ ｏ ４性， 氯仿、异戊醇多次抽提， ＲＡ 在水相而 ＤＡ 酚、 使 Ｎ留 Ｎ 和蛋白 质进入有机相， 然后用 异丙醇沉淀 ＲＡ Ｎ，得到了高质量的、完整的ＲＡ Ｎ．第一章文献综述１９ ． 本论文主要研究内容天然的皂昔并不一定是生理活性最佳的分子结构， 　　　　 如果用酶法有目的地改变天然皂 普糖基， 将会极大地提高其生理活性和应用价值，同时能节约我国中药资源， 提高中药 学的科学含量，为我国的中药、医药保健品、高级化装品和洗涤剂等行业提供优质的原料。因此本文以结构已 清楚的、容易得到的人参皂昔为原料， 采用微生物酶法， 根据人参皂昔Ｒ ， ｇ和人参皂昔 Ｒ 的 ｅ 皂昔元相同， 但糖基不同的 特点， 利用 ｓ．　 ｐ３ 菌产的。 鼠 ｇ 一李糖昔酶，专一性水解掉人参中含量最多的人参皂昔Ｒ 的Ｃ６ ｅ － 位末端上的一个。 鼠李 一糖基， 得到高活性人参皂昔Ｒ ， 其酶反 ｇ， 应过程简示如下：Ｇ ｃ ０　 ｌ－ ＝ ＿Ｇｌ － ｃ０人参皂试 一 一 李 昔ｑ “鼠 搪 ｆ０ Ｇｌ － ｃ土Ｉａ Ｒ ｈＯ ｌ　 Ｇ － ｃＲ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　 ｅ　 Ｒｌ ｇ图 １４ 人参皂普一 一 李塘普酶水解人参皂普Ｒ 　　　　　　　　　　 － 。鼠 ｅＦ ．４　 ｒｌ ｉ ｏＧｎｅｏｉｅ　ｂ Ｇｎｅｏｉｅ － ａ ｎ ｓ ａｅ ｉ１ Ｈ ｄｏ ｚ ｇ　 ｉｓｎｓ Ｒ ｙ　 ｓｎｓ － ｒ ｍ ｏｉ ｓ ｇ － ｙ ｙ ｎ ｆ　 ｄ ｅ　 ｉ ｄａ ｈ ｄ本选题以 　　　　 研究能够专一性水解人参皂昔Ｒ 产人参皂普Ｒ ， ｅ ｇ的人参皂昔“ 鼠 一 李糖营酶为目 标，主要研究内容如下： Ｉ 　　　　 ．微生物产人参皂昔一 一 李糖着酶的诱导条件的确定 ａ鼠２ 　　　　 ，人参皂普一 一 ａ 鼠李糖昔酶的分离提取 ３ 　　　　 ．人参皂昔一 一 ａ 鼠李糖昔酶的分离纯化、纯度鉴定及分子量确定 ４ 　　　　 ．纯化后的人参皂昔一 一 ａ 鼠李糖着酶的电印迹及Ｎ末端氨基酸序列 一 ５ 　　　　 ．人参皂昔一 一 ａ 鼠李糖营酶对底物的水解能力的研究 ６ 　　　　 ．人参皂昔一 一 ａ 鼠李糖昔酶的酶反应条件的确定７ 　　　　 ．真菌中总 ＲＡ的提取 Ｎ另外， 　　　　 国际上对此方面尚无相关报道， 因此对人参皂昔一 一 ａ 鼠李糖普酶方面的研究 方法和理论具有开创性， 可为寻求ａ 鼠 一 李糖巷酶新亚类提供科学依据，并为其它类中 草药高活性次生皂昔的提取和糖基水解酶的 研究提供有价值的参考。第＿章 材料与方法第二章 材料与方法２１ 实验材料 ．　２ １ １ 菌种 ．．Ａｓｉ ｓＧ 　　　　． ｇ由大连轻工业学院生物与食品工程学院菌种保藏所 〔ｕｕ ｂｄ ｐ ３ ｉａ　 Ｃｌｒ ｔｅＣｌｃｏ ｏ Ｂｏ ｅ ｉｒ　 ｄ　ｏ Ｅ ｇ ｅ ｎ Ｃｌｇ 　　ａａ Ｉ ｔ ｔ ｏ Ｌｇｔ ｏｅｉ ｆ　 ｃ ｍ ｓ ａ Ｆ ｄ　 ｉ ｅ ｇ　 ｌ ｅ　Ｄｌｎ　 ｉ ｅ　 ｉ ｌ ｔｎ　 ｉ ｈ ｔ ｎ ｏ ｎ ｎ ｒ ｙ ｉ ｏｅ ｉ ｎ ｔ ｆ　ｈ ｓｕＩ ｕｒ 提供。 ｎｓ） ｄｔ ｙ２１２ 培养基 ．． 人参：吉林抚松第一参场人参制品厂提供； 　　　　 人参浸出液：实验室自 　　　　 制；槐花浸出液：实验室 自 　　　　 制；麦芽汁：大连华润啤酒厂提供； 　　　　液体发酵培养基：１ｍ 人参浸出 　　　　 ２１ 液＋ ８ １ ４ｍ 麦芽汁十 ０ １ 来水 （ ４ｍ 自 麦芽汁的最终浓 度为５） ０ａ２１３ 试剂 ．．人参皂 　　　　 昔标准品Ｒ，　 ｅ Ｒ， ｇ甲醇 　　　　 三氯甲烷 　　　　 正丁醇 　　　　　　 硫酸钱 　　　　本实 验室从人 纯化 参中长春化学试剂厂 天津市天河化学试剂厂 丹东市江城化工厂 沈阳试剂一厂ｐＰ 　　　　 ＮＲ美国Ｓ ｍ 化学公司 ｉａ ｇ第二章 材料与方法过硫酸钱 丙烯酞胺甲叉双丙烯酞胺北京化工厂 中国医药公司北京采购供应站北京化工厂甘氨酸三Ｔ 甲基氨基甲烷 （ｒ） ｓ Ｔｉ ｓ上海化学工业学校实验三厂丹东化工二厂考马氏亮蓝 Ｇ ５ ２０瑞士 Ｆ ｋ 公司 ｌａ ｕ滨酚蓝四甲基乙二Ｒ　Ｅ Ｄ （ ＭＥ ） Ｔ美国Ｂ Ｈ Ｃｅ ｉｌ　 Ｄ ．　 ｃ Ｌｄ公司 ｈｍ ａ ａ中国医药公司北京采购供应站十二烷基硫酸钠 〔Ｄ ） ＳＳＤ Ａ －ｅｕ ｓＤ ５ Ｅ Ｅ Ｃ ｌｌ ｅ　 ２ ｌｏ Ｅ美国Ｓ ｍ 化学公司 ｉａ ｇ美国 Ｗｈｔａ 公司进口分装 ａ ｎ ｍＣｔｉｏ－４　Ａ　ｏａｉｎ　ｔ　ｒ２１ 宝生物工程 （ ａｒｍｘ１ Ｒ Ｉ ｌｔｏ Ｋ Ｖ ．．１ Ｎ ｓ ｉ ｅ 大连）有限公司Ｇａｉｉｉｍ ｕｎｄｎｕ溶液２１４ 仪器 ．．宝生物工程 （ 大连）有限公ＰＨ Ｑ Ｑ型全温振荡器 Ｚ－Ｈｍｃ　１Ｒ ｉａ Ｃ ５ 型高速冷冻离心机 Ｆ中国哈尔滨东联电子技术开发有限公司日本制造Ｂ －６Ａ自 Ｓ１０ 动部分收集器ＷＬ －８Ｃ型电子微量泵 Ｂ ７－ Ｕ －２－２ Ｖ １００ 型分光光度计蛋白质电泳仪 蛋白质转膜装置上海市沪西仪器厂浙江新昌国康仪器厂日 本京都 Ｓｉａｚ ｈｍｄｕ公司 ＢｏＲｄ ｉ ａ 公司 －ＢｏＲ ｄ ｉ ａ 公司 －４１ ９ 型蛋白质测序仪 Ｄ一 Ｇ双稳数显电泳仪Ｍ ｃｏ ａ Ｒ ｉ ｒ ｍ ｘ　Ｆ美国Ａ Ｉ Ｂ 公司北京鼎国生物技术发展中心Ｔ ｅ ｏ　 ．　 　　 ｍ Ｉ Ｃ Ｕ Ａ ｈｒ Ｅ Ｓ第二章 材料与方法２２ 实验方法 ．２２１ 菌种的液体培养 ．．　２２１１ 人参漫出液的制备： ．．． １ 取适量人参粉碎。 ） ２ 称取人参粉 １０ ） ０ 克倒入烧杯， 并在烧杯中加入６０ １ 文火加热， ０ｍ 水， 熬煮 ７ 个小时，熬 　　 程中 煮过 注意补水。３ 用纱布过滤，滤液于７０ｇ ） ００ 下离心 １分钟。 ０４ ）得上清人参浸出液，补水至 ３０ ｌ ０ｍ 备用。２２１２ 槐花浸出液的制备 ．．．（ 取适量槐花粉碎。 １ ） （ 称取槐花粉 １０ ２ ） ０ 克倒入烧杯，并在烧杯中加入６０１ 文火加热，熬煮 ７ ０ｍ 水， 个小时， 熬煮过程中注意补水。 　　　　（ 用纱布过滤，滤液于７０ｇ ３ ） ００ 下离心 １ 分钟。 ０（） ４得上清槐花浸出液，补水至 ３０１ ０ｍ 备用。２２１３ 培养基的配制： ．．．根据上述所得麦芽汁４０ ｌ人参浸出 ０ｍ， 　　　　 ０ｍ ， 液３０ ｌ本实验采用的液体培养基配方为： １ ｌ ２ 人参浸出液＋４ｍ 麦芽汁＋ ０ ｌ 来水 （ ｍ ８１ ４ｍ 自 麦芽汁的最终浓度为５） ０ａ ２２１４ 接菌与培养 ．．．液体 　　　　 湿热灭菌后， ｓＧｇ 培养基 将 ｐ ３ 接种于培 ． 养基中， 接种量为 ２ 接好 环。 菌后，将培养基置于全温振荡器中，在３０，　 ｒ ２　 １ ｐ Ｃ　６ ｍ的条件下培养 ５ ０ 天。 ２２２ 人参皂普一 一 ．． ａ 鼠李箱普酶液的提取 ２２２１ 硫酸钱沉淀人参皂昔一 一 ．．．　 ａ 鼠李精昔酶的研究将发酵培养好的发酵液， 用高速冷冻离心机在 ７０ 下离心 巧 分钟， ０飞 去除菌体，第二章 材料与 方法收集上清液即为粗酶液。分别吸取 ２ｍ 粗酶液倒入 ｌ　ｌ ５１ Ｏｍ 小烧杯中， ｏ 在磁力搅拌条件 下，分别缓慢加入己 研磨好的 硫酸钱粉末， 使之成为不同饱和度的硫酸按溶液， 静置、过 再 速冷冻离 夜。 用高 心机在５０ｇ ８ 下离心２ 分 弃上清， 沉淀。 ０ ０ 钟， 收集 沉淀用２ｍ ．１ ５ ０２ ｐ ５ ．Ｍ　 ． ０ Ｈ ０醋酸缓冲液溶 分别测定上 和沉淀的 。 鼠 解， 清液 一 一 李糖昔酶 活力和蛋白 质 含量， 计算人参皂昔一 一 李糖昔酶的比 ａ鼠 活、总活和活力得率，从而确定硫酸铰沉淀人参皂普一 一 ａ 鼠李糖昔酶的最佳饱和度。２２２２ 人参皂昔一 一 ．　． ． ａ 鼠李箱昔酶的粗酶液的提职将 　　　　 发酵培 养好的ｌ ｍ 发酵液， 速冷冻离 ｏ ］ ｏ 用高 心机在 ７ ０ 下离 １分 去 ０ ｇ 心 ５ 钟， 除 ０ 菌体， 收集上清液； 在磁力 搅拌条件下， 缓慢加入己 研磨好的 硫酸钱粉末至８％ ５ 饱和度： 在４ 下 ℃ 静置、 过夜。 再用高 速冷冻离心 在５ ０ 下离心２ 分钟， 上 收 机 ８ｇ ０ ０ 弃 清， 集蛋白 质沉淀。 沉淀用 ｌ　０ ２ ｐ ５ 醋酸缓冲液溶解， Ｏ １．Ｍ　 ． ｍ ０ Ｈ０ 然后装入透析袋， 用相同缓冲液透 析４ 小时， ８ 用高速冷冻离心机在５０ｇ ８０ 下离心 １分钟， ０ 除去不溶性杂蛋白。 所得上 清液即为粗酶液。２２３ 人参皂昔一 一 ．． ａ 鼠李精普酶活力的测定２２３１ 以人参皂昔Ｒ 为底物的 ．．． ｅ 酶活力 测定： 用 ０２ Ｈ ． 　　　　ｐ ５ 醋酸缓冲液溶解人参皂普 Ｒ，制成 ２ ｇ ｌ ．Ｍ　 ０ ０ ｅ ｍ ／ 标准品 ｍ 溶液为 酶作用 的底物。取 Ｏ ｍ 人参皂营 Ｒ 标准品溶液， ．ｌ ｌ ｅ 加入 Ｏ ｍ 酶液，于４℃下反应 １ 小时， Ａ　 ｌ ０ ８然后加入 ０ ｍ 水饱和正丁醇终止酶反应，振荡，分层， ．１ ２ 取上层液作薄层层析检测，点样量为１ １ 展开， ０， １ 显色后立即 扫描并 复印。 Ｌ 谱用Ｓｉａ ｕ　 ９０ 分 ＴＣ图 ｈ ｄ Ｃ －３ 进行 析， ｍ ｚ Ｓ 以 人参皂营Ｒ 的 ｅ 转化率计算人参皂昔Ｒ ， ｇ的生成量。酶活力定义为： 　　　　 在上述条件下， 每小时生成 １　ｌ ｎ ｏ人参皂昔Ｒ ｉ ｍ ｇ的酶量为一个酶活力单位。２ ２ ３ ２ ．　 ．　 ．以芦丁为底物的酶活力测定：、２ 用 ００ Ｍ 　　　　ｐ５０ Ｈ．　 醋酸钠缓冲液溶解芦丁， 醋酸一 制成 ２ｇｍ 标准品溶液作为 ｍ／ｌ 酶反．　 ｍ ．　 酶液，于 ４℃下反应 １ 小时， ｍ ０ ８ 应作用的底物。取 ０ｌｌ芦丁标准品溶液，加入 ０ｌｌ然后加入 ０２１ ．　 水饱和正丁醇终止酶反应， ｍ 振荡， 分层， 取上层液作薄层层析检测，点 样量为１ 展开， 后立即 ０ 闪， 显色 扫描并 。 Ｌ 图 用Ｓｉ ｄ Ｃ－３ 进行 复印 ＴＣ 谱 ｈ ａｚ Ｓ 。 分析， ｍ ｕ　 ９第二章 材料与 方法以芦丁的转化率计算异棚皮素的生成量。 酶活力定义为： 　　　　 在上述条件下， 每小时生成 ｌｍｌ ｎｏ 的异棚皮素的酶量为一个酶活力单位。２２３３ 以州Ｐ 对硝墓酚一 一 李精昔） 物的醉活测定： ．．． Ｒ（ ａ鼠 为底 采用对硝基酚一 一 李糖昔 （ Ｒ 比 　　　　 ａ鼠 州Ｐ） 色法测定酶活，以２Ｍ ｍ 对硝基酚一 一 李糖 。鼠 若 （ Ｒ 为酶反应底物。 州Ｐ） ００Ｍ　 ５０ 醋酸一 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 ．　 ｐ ．　 ２ Ｈ 的 醋酸钠缓冲液４ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 配制２ｉ 的ＴＰ 溶液 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 ｎ Ｍ ＮＲ‘ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 分别取 ０４ ｌ ．　 ｍ４℃水浴预热 ５ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 ０ 分钟１０ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 ４℃水浴反应 ３ 分钟 ０４ ２５ｌ　 ＮＣ， 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 加 ．ｍ １ ａＯ溶液 Ｍ　 以蒸馏水为空白，蒸馏水代替酶液为参比， 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 测定可见光 ４５ｍ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 ０ｎ 波长处吸收值 （Ｄ Ｏ 值）酶活力定义为：在上述４Ｖ，　５０ 　　　　 ０ ｐ ．　 Ｈ　 的条件下，每小时水解底物释放 ｌ ｌ ｍ 对硝基 ｏ 苯酚的酶量为一个酶活力单位。酶活力计算公式为： 　　　　１酶活力（／ ｌ＝ Ｏ ，? （ ｍ　Ｋ? Ｄ Ｕ ）　－ ‘口　． 　 　 　 　 　．１　Ｖ 　　 　 　 　抒１ 　　　　． ― ．ｎＶ 　　 ａ式中 ：Ｋ ：标准对硝基苯酚绘制的标准曲线常数Ｏ ＃ 测定样液的吸光度； Ｄ　 ，ｔ：反应时间 小时；ｖ样 测定样液的总体积 ｍ； ： ｌｖ ：酶液体积 ｍ ； ． ｌ第止章 材料与方法ｎ ：稀释倍数２２４ 薄层层析 ．．薄层层析法 Ｔ Ｃ 也叫薄层色谱法，是一种物理化学的分离技术，即将吸附剂均 　　　　 （Ｌ ） 匀地涂到玻璃板或塑料板上使之形成薄层 （ 固定相），样品溶液滴于薄层的起始线上， 待溶剂挥散后，置入盛有一定溶剂 （ 即流动相， 一般称为展开剂）的密闭容器内。由于吸附剂对不同物质的吸附力的大小不同， 它对极性大的物质吸附力强， 但对极性小的物质吸附力相应地减弱。 因此当溶剂流过时， 不同物质在吸附剂和溶剂之间会发生不断地吸附、 解吸附、 再吸附、 再解吸附。 在这个过程中， 易被吸附的物质 （ 吸附力强的物质） ， 相对地移动得慢一些， 而较难被吸附的物质 （ 也就是吸附力较弱的） 则相应地移动得快 一些。经过一段时间毛细管作用的移动 （ 展开），不同的物质就彼此分开，从而获得分离。本实验室所用薄层层析板是由德国Ｍｅ ｋ 　　　　 ｒ 公司生产的。首先，将薄层层析板在 １ ｃ １ ０℃ 烘箱活化３ｍｎ６ｍｎ 然后， ０ ｉ ０ｉ － ｏ 用刻度毛细管吸取试样 １ ，点于薄层层析板上， ０ 闪 风 干，置于盛有展开剂的层析缸内， 展开， 取出， 待溶剂挥发完全后，喷 １ ＨＳ ４ ０ ２ 溶 ％　 Ｏ液，于 １５ ０℃下加热显色。 展开剂组成为氯仿；甲醇：水＝ 　　　　 ７：３：０ ；显色剂为 １％　Ｓ ４ ． ５ ０ Ｈ ０ 溶液。 ２ ２２５ 人参皂普一 一 ．． ａ 鼠李精昔酶的分离纯化 ２２５１ 离子交换层析 ．．．离子交换层析是在以离子交换剂为固定相， 　　　　 液体为流动相的系统中进行的。 此法广泛应用于很多生化物质 （ 如氨基酸、多肤、蛋白 糖类、核昔和有机酸等）的分析、 质、 制备、纯化，以及同业的中和、脱色方面。离子交换层析之所以能成功地把各种无机离子、有机离子或生物大分子物质分开， 　　　　其主要根据是离子交换剂对各种离子或离子化合物有不同的结合力。两性离子如蛋白 质、 酶类、多肤和核昔酸等物质与离子交换剂的结合力， 主要取决于它们的物理化学性 质和在特定Ｐ 条件下呈现的离子状态。当Ｐ 低于等电点 （工 Ｈ Ｈ Ｐ）时， 它们带正电 荷能与 阳离子结合；反之， Ｈ高于 Ｐ 时时，它们带负电 Ｐ 工 荷能与阴离子交换剂结合。Ｐ Ｐ Ｈ与 Ｉ 的差值越大，带电量越大，与交换剂的结合力越强。第二章 材料与方法本论文采用 Ｅ ＦＣｌｃｓ Ｄ ２弱阴离子交换柱对人参皂普一 一 　　　　 Ｄ Ａ － ｅｏｕｅ　５ ｌ Ｅ ａ 鼠李糖昔酶分 离提纯。 其柱长为１．ｍ 柱内 １ｃ ， 径为２ ， ５ ｃ 柱的有效体积为３ｃ ３　 ｍ ６ｍ ０ 将 Ｄ Ａ － ｅｏｕ Ｅ２用水浸泡过夜，然后进行装柱，等待柱稳定后，开始进 　　　　 Ｃｌｃｓ Ｄ ５ Ｅ Ｅ ｌ ｅ　行预处理：先用 １ 倍体积的 １ Ｎ Ｏ ２ Ｍ　ａ Ｈ洗柱，然后用蒸馏水洗至中性；再用 １ 倍体积 ２的１ Ｈｌ Ｍ　 洗柱， Ｃ 然后用蒸馏水洗至中 如此反复３ 性； 次后， １ 倍体积的１ Ｎ Ｏ 再用 ２ Ｍ　 Ｈ ａ 洗 然后 馏水洗至中 最后用。２ ｐ ５ 酸缓冲液连续平衡４ 小时 柱， 用蒸 性。 ．Ｍ　 ． ０ Ｈ ０醋 ８ 后，待用。流 动相： ． Ｍ　 ５ 用０２ ｐ ． ０ Ｈ 。醋酸一 钠缓 液配制的Ｋ ｌ 醋酸 冲 Ｃ溶液流速：０ ｍ／ｉ ．１ ｎ ３ ｍ ；上样量：５ １ ｍ 将粗酶液上柱后， 先用缓冲液洗脱， 再分别用由缓冲液配制的 ６ｍ ０ Ｍ，　 ｍ １０ Ｍ， ２ １０ Ｍ，　 ｍ ３０ Ｍ，　 ｍ ５０ Ｍ　 ｌ ８ｍ ２０ Ｍ，　 ｍ ４０ Ｍ，　 ｍ Ｋ 溶液进行梯度洗脱，以达到分离提纯 ４ ０ ０ ０ Ｃ 蛋白 质的目的。所得各管提纯酶（ 每管收集３ １ ｍ） 在紫外光 ２０ ｎ下测吸光值。 ８ｍ ２２５２ 凝胶层析 ．．．　 凝胶层析， 　　　　 又称为凝胶过滤、 分子排阻层析或分子筛层析。 是以各种凝胶为固定相， 利用流动相中所含有个物质的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术。 其设 备简单， 操作方便， 填料不需要再生处理即可反复使用， 使用于不同相对分子质量的 各 种物质的分离，己广泛地用于生物化学、生物工程和工业、医药等领域。 本实验选用的是 Ｓｐａｅ Ｇ０ 超细葡聚糖凝胶层析。其柱长为 ６ｃ ，柱内 　　　　 ｅｈｄｘ　 ０ １ ０ ｍ 径为 ２ ，柱的有效体积为 １０ｍ ． ｃ ｍ ８ｃ ３称取ＳｐａｅＧ０ 超细葡聚糖凝胶干粉 １ ， 　　　　 ｄｘ　０ ｅｈ １ ３ 倾入过量的洗脱液（．Ｍ　 ５ ｇ ０２ ｐ ． ０ Ｈ ０醋 酸缓冲液） ，中溶胀 ７ｈ装柱， ２， 然后用 ２３ － 倍体积洗脱液洗脱， 使柱床稳定， 平衡４ｈ ８．流速：０ １ ｎ 　　　　ｍ／ｉ；上样量：５ １ ． ｍ ３ ｍ将粗酶液上柱后， ０ ２ ｐ ５ 　　　　 用 ． Ｍ　 ． ０ Ｈ ０醋酸缓冲液缓冲液洗脱， 动部分收集器收集 用自 流出液，所得各管提纯酶〔 每管收集 ３ １ ｍ） 在紫外光２０ｍ下测吸光值。 ８ｎ ２２５３ 高效液相蛋白 ．．． 质制备色谱对酶的 进一步纯化 高效液相蛋白 　　　　 质制备色谱仪 （ｉｏｉＭ ｄ ｍ 的工作原理与阳离子交换柱相同， Ｂ ｌ ｃ　 ｉ ） ｏ ｇ ｅｕ各技术参数如下：第二章 材料与方法缓冲体系； ． Ｍ　 ． ａｃ ｃ缓冲体系。 　　　　 ０ ２ ｐ ５ ＮＡ－Ａ ０ Ｈ　 ０　 Ｈ柱规 Ｕ ＴＱ６强 离 交 柱 ｐ　 ５ ｍ 柱 积为６ｌ 　　　　 ＯＭ － 阳 子 换 ；（ ２　ｍ ； 体 格： Ｎ １Ｘ　 ３ ｍ流动相：Ａ液： ．Ｍ　 Ｈ ． ａｃ Ａ 缓冲液 　　　　 ０ ２ 　ｐ ５　Ｎ Ａ－ ｃ ０ ０　 Ｈ Ｂ液： 　　　　　　　　　　 ．Ｍ　 Ｈ ． Ｎ Ａ－Ａ 缓冲液 含有 Ｉ Ｋ Ｌ ０ ｐ ５ Ｍ　 Ｃ 的０２ ０　ａｃ ｃ Ｈ进样量：ｌ ｌ 　　　　 ｍ流速：Ｉ　Ｕ ｉ 　　　　 ｍ ｍ ｎ ． Ｏ将Ｄ Ａ － ｌｃｓ Ｅ２ 　　　　 ｅｏｕ Ｄ ５ 弱阴离子交换柱提纯后的酶液进行混合， Ｅ ＥＣ ｌ ｅ　 然后超滤离心， 除去高盐离子， 再用缓冲液，即流动相Ａ液将其溶解， 准备上样， 上样量为 Ｉ　 洗脱 Ｍ。 Ｉ过程为：首先，用 Ａ液平衡柱子；接下来，加 Ｂ液对酶液进行连续梯度洗脱。洗脱过 程中，使Ｂ液的浓度在４ 分钟内由０ 逐渐上升至 ８％，控制洗脱速度为 Ｉ　ｔｉ ０ ％ ０ ．ｌ ｎ Ｏ ｍ ， ｍ然 洗 液 萦 检 器中 波 ８ ｎ 动 测， 出 用自 部 收 器 集 后， 脱 在 外 测 于 长２ ｍ 处自 检 流 液 动 分 集 收 ０于试管中，每管收集 ３ １ ｍ 洗脱液；最后，再用 Ａ液洗柱，使盐浓度降到 ０ ，再持续平衡１ 分钟。 ０２２６ 人参皂昔一 一 ．． ａ 鼠李箱昔阵纯度及分子最的测定 Ｓ Ｓ聚丙烯酞胺凝胶是由 　　　　 Ｄ Ｉ一 单体丙 烯酸胺和交联剂又称为共聚体的 ＮＮ 甲 ，一 叉双丙烯 酞胺在加速剂和催化剂的作用下聚合交联成三维状结构的凝胶， 凝胶形成的孔径不同引起分子筛效应； Ｄ （ｏｉ Ｄ ｄｃ Ｓｌｔ十二 Ｓ Ｓ　 ｄ ｍ　 ｅ ｌ　ａ Ｓ ｕ ｏ ｙ ｕ ｅ 烷基硫酸钠） ｆ 是阴离子去污剂，由 于 ＳＳ Ｉ 带有大量负电荷， Ｄ 因而清除或掩盖了不同种类蛋白 质间的电荷差异， 使其均带有相同密度的负电荷，因而可利用分子量差异将各种蛋白质分开。本实验使用的是 ＢｏＲｄ 　　　　 ｉ ａ 公司提供的蛋白 － 质电泳仪，采用 Ｓ Ｓ聚丙烯酞胺凝胶电 Ｄ－ 泳测定人参皂昔一 一 李糖若酶的 ａ鼠 纯度与分子量。 浓缩胶浓度为５ 工作电 ％， 压为３Ｖ ０； 分离胶浓度为 １％，工作电压为６Ｖ ０ ０．标准蛋白 　　　　 质为ａ 合标准蛋白 包括Ｐｏ ｏ ｌｅ　９ｋａ，　ｕ ｉ （ ｋａ， ， ｈｐ ｒａ ｂ　 Ｄ ） Ａｂｍｎ　 Ｄ ） ｈｙ ｓ （７ ｌ ６ ６　Ｇｕｍｃ　ｙｒ ｅａ （３　 ） Ｇｙｅ ｌ ｙｅ 一 。 ｈ ｅ ６Ｄ） Ｔ ｐｎｇ （４ ｌａ ｉｄ ｄ ｇ ｓ ５ ｋ ａ，　 ｃ ａｈｄ ３ ｓ ａ （ ｋ ａ ｒ ｓｏｅ ２ ｔ ｅ ｏ ｎ ｅ　 Ｄ ｈ ｌ ｒｄ － ｐ ｔ３ ，　 ｉ ｎ　 ｙ ｋ ａ。实验方法如下： Ｄ）１ 、溶液的配制：０３％的丙烯酞胺溶液： ２．克丙烯酞胺，．克甲叉双丙烯酞胺， ０ 取 ９ ２ ０ ８ 加水定容至 １ ｍ， ０ １ ０第二章 材料与 仿法过滤，于棕色瓶中避光４ 　　 ℃保存。２ １Ｍ　ｉＨ １ ）　 Ｔｓ Ｃ分离胶缓冲液， Ｈ ． 取１２ ｒ，　 ｌ　 Ｈ ｌ 加水定 ． ｒ－ ５ ｐ ８ ： ８ 克Ｔｓ ２ｍ １　 Ｃ， ８ ． ｉ ４ Ｍ　 容至１０ ，　 　　１ ４ ０ｍ ℃保存。３ ０ Ｍ　ｉＨ Ｉ ）　 Ｔｓ Ｃ 浓缩胶缓 ． ｒ－ ５ 冲液， Ｈ ． 取 ６ 克 Ｔｓ ４ｍ １ Ｈ ｌ 加水定 ｐ６ ： ． ｒ，　 ｌ　 Ｃ， ８ ０ ｉ ８ Ｍ　 容至１０ ｌ ４ 　　　　 ０ｍ ，　 ℃保存。４电 ） 极缓冲液，Ｈ ． 取２．克甘氨酸，．克Ｔｓ１ １　 Ｓ Ｓ加水定容至 １ ０ １ ｐ８ ： ８ ３ ８ ６ ０ ｒ，　 １ Ｄ ， ｉ ０ ０ ｍ ％ ０ ｍ， ０室温保存。 　　　　５ １％Ｓ Ｓ ）　 Ｄ 溶液：称取 １ 克 Ｓ Ｓ ０ ０ Ｄ ，加水定容至 ｌ　ｌ Ｏｍ ，室温保存。 Ｏ ６ １％过硫酸钱溶液 （ Ｐ ） ０ 克过硫酸按，加水定容至 Ｉ　 ）　 ０ Ａ Ｓ ：取 ． １ ｍ ，每次使用前新鲜配 ｌ置。 　　　　７ ０％ ）　 澳酚兰指示染液： ．克溟酚兰， ． １ 取０ １ 加水定容至 １０ ｌ ０ｍ ，室温保存。８ ）染色液： １ ５ 取 ． 克考马氏 ２ 亮兰， ５ｍ １ ％甲 ２０ １　 ０ 醇，３． ｌ　 ％ ０ ５ ｍ ９． 冰醋酸， ２ ９ ５ 加水定容至５ ｌ室 存。 　　 ｍ， 温保 一０ ０９ ）脱色液：取 ７． １　 ％冰醋酸，０ｍ １０ ０ ｍ ９． ４ ９ ５ ３０ ）　％甲醇，加水定容至 １０ｍ，室温保存。 ０ ００ ］２ 　　　　 、胶的制备：１ 分离胶的配制（０ ： ） １％）蒸馏水 　　　　　　　　 ４ｍ ． ｌ Ｏ３％的丙烯酞胺 　　　　　　　　 ０３ ｍｌ ． ３１Ｍ　 ８ ＴｉＨ Ｉ 　　　　　　　　 ． ｐ ． ｒ－Ｃ 分离胶缓冲液 ５ Ｈ ８　 ｓ２ｍ ．ｌ ５１ ％Ｓ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　 ０ ＤＳ　 Ｏｌ　 ．　 Ｏ ｍｌ四甲基乙二胺（Ｅ Ｅ ）　 　　　　　　　　Ｄ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 ＴＭ ０ ０ｍ ．４ ｌ ０１％过硫酸钱溶液 （ Ｐ ）　 　　　　　　　　 Ａ Ｓ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 ０ Ｏ１ｍ ． ｌ Ｏ ２ ）浓缩胶的配制（ ） ５ ： ％蒸馏水 　　　　　　　　 ３％的丙烯酞胺 　　　　　　　　 ０ ３ｍ ． １ ４ ０３ ． ｍ１ ８０ Ｍ　 ６ Ｔｓ Ｃ 　　　　　　　　浓缩胶缓冲液 ． ｐ ． ｒ－ Ｉ ５ Ｈ ８　 Ｈ ｉ１５ １ ．ｍ ２第二章 材料与方法１ ％Ｓ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　 ０ ＤＳ　 ００ ｍ１ ．５四甲 　　　　　　Ｅ Ｅ ）　 基乙二胺（ Ｍ Ｄ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 Ｔ ０ ０ｍ ．５ ｌ ０１％ 　　　　　　 （ Ｐ ）　 ０ 过硫酸钱溶液 Ａ Ｓ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 ０５ ｌ ．ｍ ０３ 　　　　 、样品处理：１ 样品 ） 缓冲液的配制；蒸馏水 　　　　　　 ２ｍ ． １ ４０Ｍ　６ Ｔｓ Ｃ浓缩胶缓冲液 　　　　　　Ｈ Ｉ ． ｐ ． ｒ－ ５ Ｈ ８　 ｉ甘油 　　　　　　Ｉ　 ．１ ０ ｍ０ｍ ．ｌ ８Ｉ　 ＤＳ　 　　　　　　　　 ０ ％Ｓ