pET-28a的酶切位点 - 实验交流 - 生物秀
标题: pET-28a的酶切位点
摘要: [pET-28a的酶切位点] 最近我想做个异源表达，用pET-28a系统。但是现在发现有些酶切位点加在ATG前以后引物形成比较难看的发夹，我担心效果不好。所以想扩大酶切位点的选择范围。想请教一下同志们，根据载体图谱，别人建议我从BamH I开始选择，多克隆位点是从Nco I开始的，只是它包括了His-tag还有T7-Tag,并且 关键词:[引物 酶切位点 核糖体结合位点 发夹 多克隆位点 结构 异源]……
最近我想做个异源表达，用pET-28a系统。但是现在发现有些酶切位点加在ATG前以后引物形成比较难看的发夹，我担心效果不好。所以想扩大酶切位点的选择范围。想请教一下同志们，根据载体图谱，别人建议我从BamH I开始选择，多克隆位点是从Nco I开始的，只是它包括了His-tag还有T7-Tag,并且好像在多克隆位点前后部分各有一个His-tag是不是可以把前面一个切掉啊，那个T7-tag是什么作用啊？多谢指教了。回复:(:(:(那只是一个标记而已,我个人认为只要不切到RBS 和Lac 一般不会影响你的目的片段的表达.顺便问你一句:你上面的那个引物应该没事.引物绝对没发卡结构是不现实的.回复我刚开始接触引物设计和PCR 。。。。帮顶:)回复
:(:(:(那只是一个标记而已,我个人认为只要不切到RBS 和Lac 一般不会影响你的目的片段的表达.顺便问你一句:你上面的那个引物应该没事.引物绝对没发卡结构是不现实的. 只是我的引物32bp除了中间的7bp两边都在发夹里了，我是用cDNA来扩，非常不好扩，所以想引物质量应该高一点，可是这对引物的确用DNA扩出来了。还有您说的RBS我在质粒里都见过，可是它具体是什么东西啊？非常感谢了。回复RBS 是核糖体结合位点回复
RBS 是核糖体结合位点 哦，非常感谢啦。
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【求助】求救。用pet28a表达不出蛋白
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这个帖子发布于8年零311天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
最近构了一批载体，分别用不同基因片段连到pet28a上。用来原核表达，却怎么也表达不出来。试过不同的iptg浓度以及温度，都没有效果。而且我想那么多载体，连的不同的基因，在同一个条件下怎么一个都表达不出来呢。别人一搞就出来，我死活弄不出来，郁闷啊。我的操作流程是挑单菌落，接到2ml相关抗性的lb，过夜培养。第二天取60ul接到3ml的lb中，长到od600为0.5-0.6时（因为是新手，取一ml去测浓度了），从中取出1ml（还剩1ml做对照），加iptg（manual上说是到1mM，我也试过不同的浓度，比如0.5mM），继续诱导（温度37，我也试过28，20）3个小时以上(久一点应该没有影响吧)，然后收集对照和诱导后的菌体，加loading buffer，沸水煮几分钟，离心，取上清上样。请大家帮我看看问题出在哪啊。
不知道邀请谁？试试他们
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如果确定载体真的构建成功了，恐怕就是生成包含体了。建议把破壁后沉淀也跑一下电泳，看看是否有目的条代。
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而且有的时候，诱导表达的蛋白可溶性部分不多，SDS-PAGE看不出来。
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哦，那样啊。其实如果我就一个载体表达不出来的话我也就认了，但是一堆载体都表达不了，就让我怀疑是不是我的操作还是什么试剂有问题了，所以我把我的操作过程都列出来，让大家帮我看看有没有问题。
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你构建表达载体后，是否测序确认了，读码框是否正确？
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你的操作条件都没有什么问题！你所说的温度，IPTG浓度以及诱导时间都是最常规的条件！最可能怀疑的地方在你的操作过程中，没有保持无菌，造成有杂菌污染！或者在培养基中没加入kana！建议你重新涂平板，挑取单克隆，进行诱导表达，条件不用变！同时送菌测序！确定你是否真的把目的基因转进去了！
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我也在做pET28a表达,若测序正确,我觉得你应该检查一下你的loading buffer,因pET28a在37度表达量是很大,易形成包涵体,而loading buffer在低温条件下SDS会析出,如未混匀就吸取上清的话,loading buffer中因无SDS而难以溶解包涵体,经离心后包涵体会沉淀至管底,上清电泳就无法检出表达的目的蛋白了.如样品沸水煮后离心之后管底的沉淀明显多于空白对照则十有八九是形成包涵体而loading buffer中无SDS所致.另外沸水煮的时间长一点,如15-20分钟试试!仅供参考!!
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谢谢大家帮我分析。因为本室有测序仪，因此我对其中2-3个测过序，读码框是没有问题。我在前引物中加入的是nheI和ndeI，都是直接跟atg即可的吧。
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1.你的基因是来源于原核还是真核？可以考虑一下稀有密码子的问题。2.并不是所有转化表达载体后长出的转化子都可以表达，你可以多挑几个一起诱导看看。
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笑笑shmily 1.你的基因是来源于原核还是真核？可以考虑一下稀有密码子的问题。2.并不是所有转化表达载体后长出的转化子都可以表达，你可以多挑几个一起诱导看看。我没有考虑稀有密码子呢，影响会很大吗你的第二点也没有考虑到。但是我同时做多个载体的表达，都弄不出来。而且其中一个蛋白别人用其他载体表达过，表达出来了，对宿主有毒性；我自己诱导，也看得出诱导后菌颜色变暗，感觉也是有毒性的样子。
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再请教大家大家一个问题，我发现加iptg诱导后的菌很臭，恶臭，跟没有诱导前的大肠杆菌闻起来不一样，正常吗？大家也没有发现这样的现象？
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再请教大家大家一个问题，我发现加iptg诱导后的菌很臭，恶臭，跟没有诱导前的大肠杆菌闻起来不一样，正常吗？大家也没有发现这样的现象？
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weiqh191 我也在做pET28a表达,若测序正确,我觉得你应该检查一下你的loading buffer,因pET28a在37度表达量是很大,易形成包涵体,而loading buffer在低温条件下SDS会析出,如未混匀就吸取上清的话,loading buffer中因无SDS而难以溶解包涵体,经离心后包涵体会沉淀至管底,上清电泳就无法检出表达的目的蛋白了.如样品沸水煮后离心之后管底的沉淀明显多于空白对照则十有八九是形成包涵体而loading buffer中无SDS所致.另外沸水煮的时间长一点,如15-20分钟试试!仅供参考!!我觉得有点道理。loading buffer室温下放了1年多了，我今天重新配了一下，明天重新诱导了在看看。祝我好运，呵呵
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还有不知道你的基因上稀有密码子是不是很多，如果是，换个宿主菌试试
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哎，看来不是loading buffer的问题。我用重配的loading buffer煮了15分钟，还是没点东西。。
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你有没有把沉淀和上清都跑胶看看.形成包涵体的可能性很大.另外,你可以试以下超声破菌,释放出里面的蛋白,再进行煮样电泳.
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好像加入IPTG后没有恶臭味啊，至少我的重组蛋白就没有。
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如果阅读框对，细胞有没有用对啊？pet28a要用T7 promoter的，若转的DH5α永远也不会表达，里面没有质粒的promoter，换一个细胞试试，我也是用的这个质粒，没问题。
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换个宿主菌试试
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你挑的单克隆有没有问题啊？要鉴定一下哦
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很简单,找个阳性plasmid 对照,就知道问题在那,pET28a 只有NcoI和NdeI .
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表达蛋白和基因克隆可以是同一个宿主菌，也可以是不同的宿主菌。PET载体对应的表达菌柱是BL－21（DE－3）吧？如果用普通的DH5a可能是检测不到表达条代。另外IPTG诱导我们通常是做4、5、6小时的比较，我认为IPTG诱导至少要4个小时才能检测到蛋白表达，通常5个小时左右有高效表达。
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yuan远 很简单,找个阳性plasmid 对照,就知道问题在那,pET28a 只有NcoI和NdeI .请问一下你说的什么意思啊？
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honghy73 表达蛋白和基因克隆可以是同一个宿主菌，也可以是不同的宿主菌。PET载体对应的表达菌柱是BL－21（DE－3）吧？如果用普通的DH5a可能是检测不到表达条代。另外IPTG诱导我们通常是做4、5、6小时的比较，我认为IPTG诱导至少要4个小时才能检测到蛋白表达，通常5个小时左右有高效表达。宿主菌是师姐她们之前用的bl21没错，就不知道是否太久了会有影响。至于诱导时间，我起码都是3个小时，通常4个小时，甚至更长都做过的
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laraine 好像加入IPTG后没有恶臭味啊，至少我的重组蛋白就没有。你有注意闻过没有啊？我是凑近了才闻到的。就像医院废弃的药品那样，很臭。
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liaoli1115 你有没有把沉淀和上清都跑胶看看.形成包涵体的可能性很大.另外,你可以试以下超声破菌,释放出里面的蛋白,再进行煮样电泳.我有跟本室的师姐讨论这样的问题，她跟我说，超声破菌只是为了判断蛋白是否再包涵体里，而如果只是为了上样检测是否表达目标蛋白的话，加loading buffer用沸水煮是足以破包涵体释放目标蛋白的，不知道这种理解是否正确。
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你可以取1.0ml的菌液,然后离心去上清,加40ul蒸馏水,加入40ul的2×Buffer,煮沸十分钟足够了,时间不能煮太久,否则水分都蒸发了.然后跑SDS-PAGE看看.如果读码框,序列突变的可能性都排除了,我也觉的可能是稀有密码子的问题,这样你可以换个宿主菌试试,PET操作手册上介绍对于含稀有密码子的序列Rosette菌是首选,要比BL21好.你可以看一下相关的资料.
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我把这些片断同时也连到PGEX－4t上，也表达不出。后来换了个菌株，也只表达出来一个，真够衰的。我最近作western，打算看看到底有没有表达。
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cqfyeah 你有注意闻过没有啊？我是凑近了才闻到的。就像医院废弃的药品那样，很臭。蛋白正常表达的话，菌液不会是恶臭的，而是很正常的大肠杆菌的味道，不知道你闻过没有:)最近我表达了两个蛋白也出现类似的情况，诱导后菌液很臭，电泳检测什么都没有。而这两个蛋白是已经证实有表达的了（以前的实验），所以怀疑是杂菌污染。你可以拿诱导后的菌液pcr看看能不能p出你的目的条带
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yydong810713 蛋白正常表达的话，菌液不会是恶臭的，而是很正常的大肠杆菌的味道，不知道你闻过没有:)最近我表达了两个蛋白也出现类似的情况，诱导后菌液很臭，电泳检测什么都没有。而这两个蛋白是已经证实有表达的了（以前的实验），所以怀疑是杂菌污染。你可以拿诱导后的菌液pcr看看能不能p出你的目的条带恶臭的问题我也不是很确定，我加了iptg之后的菌都会臭臭的。那天一个同室的学生做了一次诱导，用的是烧瓶，好像没有我那么重的味道（我一直用的10ml离心管加2ml培养基诱导的，不知道是不是通气不够充足的原因）我做诱导转接后都把剩下的菌拿来抽质粒的，然后酶切，有目标带，没有问题。然后和其中一个诱导出来的载体比较，跑出来的蛋白的带型是一样的（表达菌自己的蛋白）。而且我们这是和别人合作研究，他们做了诱导，然后纯化最后跑胶，有微弱的带。最近打算用flag抗体做western看看。
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怎么知道表达的蛋白对细菌有毒性呢？很郁闷。建议楼上买新的感受态细胞来转化。
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如果菌诱导之后很臭的话，多半是染杂菌了。建议多加点有效的抗生素。可能你的抗生素失效了也不一定啊
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蛋白表达不出来,如果是转化的时候不长菌的话,有可能是感受态细胞活力太低,还有可能是引物设计时酶切位点不对,这个可能性很大,所以后面怎么做也做不出来.IPTG诱导一般四个小时37度就可以了.
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还有诱导之后菌是有臭味的.一般诱导的时候染菌的几率不大.加IPTG的时候都可以直接加不用无菌操作的.我一直都这么做的.
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一般PET-28表达出来的都是包涵体占主要部分的，你可以当OD达到0.6时，加IPTG至1.0mM，诱导５个小时，之后煮样跑ＳＤＳ，这样表达的结果大部分都是包涵体的．如果有表达了，你可以再摸索条件让可溶的蛋白增加．
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关于丁香园pET-28a与pGEX-4T-1表达蛋白的区别 - 实验交流 - 生物秀
标题: pET-28a与pGEX-4T-1表达蛋白的区别
摘要: [pET-28a与pGEX-4T-1表达蛋白的区别] 大神们，最近在做原核表达载体构建，以及表达条件的筛选，用到了两种载体，pET-28a与pGEX-4T-1，蛋白是胞内蛋白，这两种载体有什么区别吗，哪一个作为表达载体更好一些？ 关键词:[多克隆位点 载体 引物 蛋白表达 基因 阅读框 表达蛋白]……
大神们，最近在做原核表达载体构建，以及表达条件的筛选，用到了两种载体，pET-28a与pGEX-4T-1，蛋白是胞内蛋白，这两种载体有什么区别吗，哪一个作为表达载体更好一些？回复类型和抗性不一样。pET-28a为组成型，抗kana，pGEX-4T-1为诱导型，抗Ampicillin。前者可以不经诱导组成型表达某个基因，后者在经过诱导物的诱导后才能表达某个基因；前者的优点就是不要诱导可以一直稳定的表达，这也决定了它的缺点，就是不能控制在何时表达某个基因，后者的优点就是可以控制表达的时间，但是需要诱导物。哪个更好的话，得看用途了。回复不是吧，ORF不是开放式阅读框吗，这不是蛋白表达时才才用的东西吗，设计引物要在多克隆位点设计，目的片段要插入到多克隆位点啊，我在选择载体上没有绝对的标准啊，我现在用的就是PET-28，我是没有一个选择的依据吧，其实这个问题也困扰着我，同样也想请大神指点一下，共同进步回复
不是吧，ORF不是开放式阅读框吗，这不是蛋白表达时才才用的东西吗，设计引物要在多克隆位点设计，目的片段要插入到多克隆位点啊，我在选择载体上没有绝对的标准啊，我现在用的就是PET-28，我是没有一个选择的依据吧 ... 恩恩，1.因为我后期是要做蛋白纯化的，是不是就应该根据ORF设计引物尼？还是把CDS序列告诉公司，直接让他们设计并合成就可以？
2.还有一个问题就是双酶切位点应该怎么选择尼？除了尽量共用，目的基因不能含有相同的酶切位点，还有别的跟目的蛋白有关的要求吗？回复
不是吧，ORF不是开放式阅读框吗，这不是蛋白表达时才才用的东西吗，设计引物要在多克隆位点设计，目的片段要插入到多克隆位点啊，我在选择载体上没有绝对的标准啊，我现在用的就是PET-28，我是没有一个选择的依据吧 ... 关于第一个问题，现在有c的第一链，想直接设计并合成两端带有酶切位点的引物，直接合成两端带有酶切位点的目的基因~
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电话：021-pET28a选择哪两个酶切位点可以只留下N端的His-tag？ - 实验交流 - 生物秀
标题: pET28a选择哪两个酶切位点可以只留下N端的His-tag？
摘要: [pET28a选择哪两个酶切位点可以只留下N端的His-tag？] 本人新虫，在校学生，做课题，老师让我构建表达载体，用pET28a，要求只留下N端的His-tag，请问该选择哪两个酶切位点呢？现在很着急，找导师问导师让我自己去查资料自己找，找分子生物学老师问，她告诉我去找我导师问去，现在很着急，请高手指点，谢谢，谢谢，谢谢…… 关键词:[酶切位点 目的基因 选择基因 酶切 酶切图谱 基因 终止密码子]……
本人新虫，在校学生，做课题，老师让我构建表达载体，用pET28a，要求只留下N端的His-tag，请问该选择哪两个酶切位点呢？现在很着急，找导师问导师让我自己去查资料自己找，找分子学老师问，她告诉我去找我导师问去，现在很着急，请高手指点，谢谢，谢谢，谢谢……
回复无论你选择哪两个酶切位点都达不到你的要求（只留下N端的His-tag），保留N端His-tag可以用NdeI或者更后面的位点，但都会留下His-tag外的残基。回复嗯，那随便在Nde1到Xho1之间选两个酶切位点，在目的基因后面加入终止密码子就行了哈，不用考虑那个切掉的片段多大吗？是根据目的基因大小选酶切位点，还是根据酶切位点间的大小设计目的基因呀？（因为两周前导师告诉我基因已经优化好了，但是也没告诉我优化好的基因啥样子）回复
嗯，那随便在Nde1到Xho1之间选两个酶切位点，在目的基因后面加入终止密码子就行了哈，不用考虑那个切掉的片段多大吗？是根据目的基因大小选酶切位点，还是根据酶切位点间的大小设计目的基因呀？（因为两周前导师 ... 要考虑的，最好两个酶切位点分开点，有利于酶切。
酶切位点的选择首先要分析目的基因的酶切图谱，不能选择基因内部有的酶切位点。回复
要考虑的，最好两个酶切位点分开点，有利于酶切。
酶切位点的选择首先要分析目的基因的酶切图谱，不能选择基因内部有的酶切位点。 好的，太感谢了~我明白了很多~回复
要考虑的，最好两个酶切位点分开点，有利于酶切。
酶切位点的选择首先要分析目的基因的酶切图谱，不能选择基因内部有的酶切位点。 呃，这个评分制第一次用，我以为每个回复都有个 帮助程度那几个红星评呢，原来只能评一次，抱歉评错了，应是星星最多那个~回复
要考虑的，最好两个酶切位点分开点，有利于酶切。
酶切位点的选择首先要分析目的基因的酶切图谱，不能选择基因内部有的酶切位点。 为什么不能选择目的基因内部有的酶切位点啊？回复
为什么不能选择目的基因内部有的酶切位点啊？ 因为选择基因内部有的的酶切位点的话在酶切时会把目的基因也给切断回复
因为选择基因内部有的的酶切位点的话在酶切时会把目的基因也给切断 谢谢，我明白了……
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【求助】用NcoI和XhoI双酶切PET28a，测序显示连接正确，但不表达
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问题已解决悬赏丁当:2
用NcoI和XhoI双酶切PET28a，测序显示连接正确，但不表达。我想请问各位战友有人用过NcoI酶切吗，是不是NcoI紧挨着ATG起始密码子所以不利于表达。还有就是在酶切位点酶切后产生CATGG, 起始密码子后面多了个G,我把另外两个密码子补齐后，又加了我的目的基因片段。这样表达有什么问题吗，转了三种宿主菌都不表达，是不是设计上出现了错误，请大家帮助我解答一下，谢谢~~~
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就是说你在起始密码子ATG后面的G加了两个碱基，这样你的目的基因表达出来会多一个氨基酸残基。你可以改一下序列，你可以把目的基因的第二个氨基酸残基对应的密码子看看有没有第一个是G的？没有的话直接把第二个氨基酸残基换成别的性质相似的，使第二个氨基酸残基的第一个密码子是G就可以了。我看你的描述，不知道是不是你在哪个位置弄了两个起始密码子，其实你把目的片段的起始密码子ATG直接用载体上的就行了。表达不出来原因很多，你同时可以做一个其他28a的载体，作为对照，看能不能表达出来，以确定是不是你诱导表达的方法上有问题
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还有，在核算一下你的蛋白表达产物的分子量，看是不是条带看错了；也可以用His 标签抗体做个Western，有可能表达量很低
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谢谢，我把NcoI的酶切位点ATG作为起始密码子了，这个应该就是PET28的起始密码子吧，如果我在目的基因上再加ATG应该只是加了一个氨基酸而不是作为起始密码子吧。我就是想确认一下，可不可以用NCOI切呢，是不是这个位点离核糖体结合位点太近而影响结合了呢
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应该是不影响的，你就用28a上的NcoI的ATG作为自己的目的基因起始密码子，应该没问题，多的那个G，你看看能不能改一下你的目的基因第二个氨基酸。像你说的也行，就是在你的目的基因前面多了两个氨基酸的密码子&ATGG##&,应该没什么影响
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谢谢我会继续试一下。
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你好，我想问下你现在的表达问题解决了吗？我现在也遇到了同样的问题，测序争取，但是没表达。
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你好，请问你酶切的条件以及酶切后的条带分别是多少啊？我用这两个酶切后条带好像不对，一个2000bp一个3000bp多，不应该是一个5000bp多和一个150bp左右的吗？
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