基因类肿瘤相关物质（GTM综合指标）1
基因类肿瘤相关物质（GTM综合指标）1
基本信息：女&&68岁
病情描述及疑问：基因类肿瘤相关物质（GTM综合指标）104<95请问您这是什么，偏高9有危险吗？谢谢啦
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&&&非临床麻醉科
擅长：小儿、新生儿科，成人肿瘤麻醉。
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建议：这些检验指标需要结合临床症状，影像学检查，相关血液学检查等综合分析，如果其他检查没有任何问题，按时复查。
&&&内科_消化内科
擅长：擅长内科常见病及多发病的诊治，熟练在胃镜及肠镜下检查及进行微创手术治疗。
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建议：患者的肿瘤指标偏高是没有特异性的，不能诊断肿瘤，建议定期复查就可以了。
擅长：对妇产科常见病及多发病的诊断及治疗。
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分析：该情况可以考虑是性质待定
建议：这些检查指标需要结合临床症状，综合考虑，这一项高是不能确定是什么疾病的。
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有肿瘤基因的检测，只要检测一个基因合理么？
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龙鼎医药的秦义龙先生接受采访的时候曾表示，到目前为止我还没发现哪些肿瘤只需检测一个基因就能判断其风险，这在学术上是完全站不住脚的当然不合理
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但学过生物的都知道基因是有遗传效益的DNA片段。一个很难辨别吧！找一些大的公司去做相关检测不是很了解
肯定不合理啊，肿瘤是种非常复杂的疾病！去看看龙鼎秦义龙接受生物探索的专访报道《专访秦义龙：为每个中国人做一次基因检测》。
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要 杆状病毒是大型的双链DNA病毒，主要感染昆虫，该病毒作为重要的基因
工程载体，在昆虫细胞或虫体中表达外源蛋白，通过极晚期基因的启动子polh mori
或p10可使外源蛋白高水平表达。家蚕杆状病毒 Bombyx
白，可以包被于多角体的外膜表面。本研究利用da26基因融合表达外源基因，
使外源表达产物结合于病毒颗粒，通过超
正在加载中，请稍后...这是个机器人猖狂的时代，请输一下验证码，证明咱是正常人~新型PEI衍生物材料的合成及在肿瘤基因递送中的应用研究--《吉林大学》2014年博士论文
新型PEI衍生物材料的合成及在肿瘤基因递送中的应用研究
【摘要】：近年来，恶性肿瘤已经成为威胁人类生命健康的主要杀手，我国每年因恶性肿瘤而死亡的人数达到220万，占我国居民死亡原因的第一位。因此，恶性肿瘤的治疗已经成为亟待解决的世界性难题，具有极其重要的战略意义。现如今，临床常用的肿瘤治疗手段包括手术、化疗和放疗等，手术只能使一部分肿瘤患者受益，而化疗和放疗对正常组织器官毒副作用大，严重影响患者的生活质量。此外，长期使用化学药物治疗肿瘤，会产生多药耐药现象（Multidrug resistance，MDR），降低了化疗药物的治疗效果。而与传统治疗手段相比，基因治疗有望从根本上治疗疾病，已成为目前国际学术界研究的焦点，它被认为是医学和药学领域的一次革命，是当今生物医学发展中最重要的里程碑之一，同时也必将对传统制药业产生深远影响和冲击，有望成为未来在肿瘤临床治疗中的“新宠”。
基因治疗主要有三个方面：基因药物、基因诊断和基因传输。随着人类基因组计划（human genome project, HGP）的成功实施，基因诊断和基因药物的制备不再是基因治疗的障碍；但如何安全、有效的将药物基因运载到靶细胞并起到治疗效果，成为获得基因治疗良好效果的瓶颈之一。常见的基因递送方式可以分为物理方法、化学方法和生物方法。化学方法和生物方法都是利用载体承载基因药物，载体的地位极其重要，也成了基因治疗发展中的关键性问题。生物学上根据来源将基因载体分为质粒载体和病毒载体；而化学研究人员习惯将质粒看做DNA的一种，而将载体分为病毒类载体（ViralVector）和非病毒类载体（Non-viral Vector）。目前在临床使用中应用最多的仍然是病毒类载体，部分转染效率可高达90%以上，但病毒类载体存在严重的免疫源性等自身难以克服的缺陷。相对而言，非病毒类载体由于其特有的优势而越来越受到关注。聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine, PEI)分子已经成为了非病毒类基因载体领域里发展最快、最具有研究价值和应用潜质的一类基因传输载体。
对于转染效率而言，理想的PEI分子量范围约为11.9×103~70.0×103，其中重均分子量为25K的超支化PEI（PEI25K）转染效率最高，因而成为衡量非病毒基因载体各项性能的“黄金标准”。PEI独特的“质子海绵效应”有利于实现细胞内的内涵体逃逸。然而，PEI25K作为非病毒基因载体材料仍然有很多缺陷，如相对较低的基因转染效率、细胞毒性大、聚合物结构的不可降解性等。因此，对其进行结构改造就显得尤为必要。
本论文立足于肿瘤基因治疗这一当前研究热点，设计了两类新型PEI衍生物材料，我们首先将不同数量的带有疏水基团的N-乙酰-亮氨酸，以EDC/NHS催化，使其与PEI25K的伯氨基进行偶联，来研究N-乙酰-亮氨酸引入的数量对PEI25K作为基因传递材料能力的影响。然后在前期工作基础上，进行了N-异丙基丙烯酰胺改性PEI25K基因载体的制备及性能研究，通过一系列的化学及细胞实验对衍生物的材料结构、细胞毒性、核酸结合能力、基因转染效率进行研究，并采用改性后的PEI衍生物（PEN）将外源的p53基因递送到p53基因缺失的前列腺癌PC-3细胞系与p53野生型细胞系Hela中进行对比研究。
第一部分：N-乙酰-亮氨酸(N-Ac-Leu)改性PEI25k基因载体的构建与评价
1.本章采用EDC/NHS催化反应合成了三种N-Ac-Leu修饰的PEI衍生物，分别为N-Ac-Leu-PEI (60:1)、 N-Ac-Leu-PEI (80:1)、N-Ac-Leu-PEI (100:1)并利用核磁共振氢谱（1H NMR）对聚合物的结构进行表征。
2.通过凝胶电泳可以表明，三种N-Ac-Leu-PEI聚合物均能很好的与pEGFP质粒结合，但结合能力低于未修饰的PEI25K。通过表面电位测定可以得知三种N-Ac-Leu-PEI的表面电位在+30mV，恰好可以说明N-Ac-Leu-PEI与质粒结合能力的降低。粒径测定结果表明N-Ac-Leu-PEI聚合物的粒径在180~220nm范围内。
3. N-Ac-Leu-PEI基因载体材料的溶血实验证明载体材料溶血效应相对于PEI25K明显降低，具有很好的血液相容性；蛋白吸附实验中，N-Ac-Leu-PEI蛋白吸附值相对于PEI25K明显降低，且随时间的增加蛋白吸附值缓慢降低。由此证明N-Ac-Leu基团的引入可改善PEI的生物相容性，可望用于活体实验中。
4. MTT实验结果表明，N-Ac-Leu-PEI在HeLa细胞中的细胞毒性较PEI25K有明显降低。
5.三种N-Ac-Leu-PEI聚合物均能有效的介导基因转染，且转染能力高于PEI25K。N-Ac-Leu-PEI (100:1)在质量比为3.0的条件下转染效率最高。
第二部分：PEI衍生物基因载体的设计制备以及性能研究
1.首先在PEI骨架上偶联上N-异丙基丙烯酰胺，然后通过细化投料比，得到五种PEI衍生物（PEN）。使用凝胶阻滞实验和细胞毒性试验初步筛选出一种载体。之后通过核磁共振氢谱对所选材料的结构进行了表征。
2.使用纳米粒度电位仪检测了载体、质粒以及载体质粒复合物的粒径大小以及表面电位。
3.通过MTT实验检测了载体的细胞毒性，结果显示，修饰后的载体毒性低于PEI。
4. DNase I酶降解实验发现，在载体质粒质量比不小于0.8时，载体就能够实现对DNA的完全保护。相比较而言， PEN对DNA的保护能力较PEI略有下降。
5.通过绿色荧光蛋白质粒转染实验和PGL-3质粒转染实验，分别定性定量考察了材料
作为基因载体的传递性能。实验数据表明，在PEI上引入N-异丙基丙烯酰胺，降低了聚合物的表面电荷，并引入了一定量的疏水基团。但是疏水基团的过多引入反而会降低载体的基因转染效率。在定性转染试验中，改变载体的加入量发现，在载体质粒质量比为2时，转染效果最好。在定量转染实验中，PEI展现了不错的转染效率，PEN虽然不及PEI，但和商业转染试剂相比，转染效率相差无几。
6.在前列腺癌细胞系PC-3中，通过RT-PCR和Western blot分别从mRNA水平和蛋白水平证明p53基因的表达。之后通过检测相关蛋白表达的变化证明表达出的p53蛋白的确具有正常的功能。之后通过检测caspase家族蛋白活性和线粒体膜电位变化辅助说明上述问题。
7.使用流式细胞仪检测周期阻滞和细胞凋亡情况，在检测周期阻滞时发现Hela细胞系不存在周期阻滞现象，通过DAPI染色，证明细胞存在凋亡现象。
8.综合各方面的实验结果，证明经过修饰，虽然在一定程度上降低了PEI的基因转染效率，但所得到的衍生物的毒性低，而且其基因转染效率可以和商业转染试剂相媲美。而且在递送p53基因致使癌症细胞凋亡的试验中，展现了较好的转染性能，后续的凋亡相关实验也证明外源的p53基因的确可以代替或者补偿内源性缺失或者无效的p53基因。
【关键词】：
【学位授予单位】：吉林大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2014【分类号】：R318.08;R73-36【目录】：
中文摘要4-7Abstract7-15中英文缩略词对照表15-16第1章 绪论16-46 1.1 引言16 1.2 文献综述16-46
1.2.1 基因治疗16-21
1.2.2 基因递送21-23
1.2.3 基因载体23-33
1.2.4 PEI 的修饰及其在基因递送中的应用33-38
1.2.5 前列腺癌简介38-41
1.2.6 p53 基础知识41-46第2章 N-乙酰-亮氨酸改性 PEI25k 基因载体的构建与评价46-60 2.1 实验材料46-47
2.1.1 细胞株46-47
2.1.2 主要试剂47
2.1.3 主要设备47 2.2 实验方法47-50
2.2.1 细胞培养47
2.2.2 N-乙酰-亮氨酸-PEI（N-Ac-Leu-PEI）的制备47-48
2.2.3 N-Ac-Leu-PEI 的表征48
2.2.4 N-Ac-Leu-PEI 质子缓冲能力的测定48-49
2.2.5 N-Ac-Leu-PEI/pDNA 的凝胶阻滞电泳49
2.2.6 BSA 蛋白吸附测定49
2.2.7 溶血实验49
2.2.8 N-Ac-Leu-PEI 的细胞毒性测定49-50
2.2.9 体外细胞转染评价50 2.3 结果与讨论50-58
2.3.1 N-Ac-Leu-PEI 的合成与表征50-51
2.3.2 N-Ac-Leu-PEI 的粒径与表面电位51-53
2.3.3 N-Ac-Leu-PEI 聚合物的缓冲能力53-54
2.3.4 N-Ac-Leu-PEI/pDNA 复合物的凝胶阻滞电泳54
2.3.5 N-Ac-Leu-PEI 蛋白吸附实验54-55
2.3.6 N-Ac-Leu-PEI 的溶血实验55-57
2.3.7 细胞毒性评价57-58
2.3.8 体外细胞转染评价58 2.4 本章小结58-60第3章 PEI 衍生物基因载体的设计制备以及性能研究60-82 3.1 实验材料60-61
3.1.1 细胞株60-61
3.1.2 主要试剂61 3.2 实验方法61-66
3.2.1 PEI 衍生物 PEN 的制备以及简单筛选61-62
3.2.2 载体基因复合物粒径电位表征62
3.2.3 载体保护基因免于 DNA 酶降解实验62
3.2.4 细胞培养62
3.2.5 细胞毒性实验62-63
3.2.6 细胞转染实验63
3.2.7 RT-PCR63-64
3.2.8 Western blot64
3.2.9 Caspase 家族蛋白活性检测64-65
3.2.10 线粒体膜电位变化检测65
3.2.11 流式细胞术检测周期阻滞65
3.2.12 DAPI 染色看凋亡小体65
3.2.13 流式细胞术检测细胞凋亡65-66 3.3 实验结果与讨论66-81
3.3.1 PEN 的合成与结构表征66-67
3.3.2 载体/DNA 复合物的粒径与表面电位67-69
3.3.3 载体对 DNA 酶降解的保护69
3.3.4 细胞毒性实验69-70
3.3.5 细胞转染实验70-73
3.3.6 p53 细胞内表达检测73-75
3.3.7 p53 表达后相关效果检测75-81 3.4 本章小结81-82第4章 结论与展望82-84参考文献84-96作者简介及在学期间所取得的科研成果96-98致谢98
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