求解释几种基因克隆步骤原理

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2016-08-02 10:36 标签： 基因克隆的基本步骤
图位克隆基因原理与方法
从遗传学观点来看，基因克隆有两条途径:正向遗传学途径和反向遗传学途径。正向遗传学途径指 的是以欲克隆基因所表现的功能为基础，通过鉴定其产物或表型突变来进行，如传统的功能克隆及近年 来迅速发展的表型克隆;反向遗传学途径则着眼于基因本身，根据被克隆的目的基因在染色体上都有稳 定的位置来实现。由于在多数情况下，我们并不清楚基因产物的结构和功能，很难通过正向遗传学途径 克隆基因，而反向遗传学途径则显示了较好的前景.其中可以利用的主要有三种方法，分别是转座子标 签法、随机突变体筛选法和图位克隆法。转座子标签法中受转座子的种类、转座频率及有些植物存在内 源转座子等的影响，随机突变体筛选法则随机性较大且不能控制失活基因的种类和数量等，限制了它们 的应用。图位克隆(maP一based doning)又称为定位克隆咖sitionalclonin目，1986年首先由剑桥大学的 Coulson等提出，用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行...&
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1引言水稻是最重要的粮食作物,也是单子叶模式植物.水稻重要基因的精细定位和克隆已成为当前植物功能基因组学研究的热点之一.八十年代以来分子生物学研究技术不断进步,水稻基因组研究进展非常迅速,为水稻基因的克隆开辟了新的途径,主要有转座子标签技术、图位克隆技术,以及建立在RNA水平上的各项差异显示技术,包括DDRT-PCR,cDNA-RDA,SSH等[1-3].其中最常用的基因克隆技术是图位克隆(map-based gene cloning或positionalcloning)技术[4],图位克隆技术是近几年随着各种植物的分子标记图谱的相继建立而发展起来的一种新的基因克隆技术,本文拟对图位克隆的研究进展做一介绍,以期对水稻遗传育种研究有所助益.2图位克隆法图位克隆(map-based clonig)又称定位克隆(posi-toinal cloning),1986年首先由剑桥大学的Alan Coul-son提出[4].是根据目标基因在染...&
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１图位克隆技术的原理及基本技术环节现在 ,分离和克隆发育相关基因的方法有很多 ,如传统的功能克隆 (ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｃｌｏｎｉｎｇ)，即根据纯化的已知基因的产物推算其相应的核苷酸序列 ,再据此序列合成寡聚核苷酸探针从ｃＤＮＡ文库或基因组文库中钓取目的基因。另外 ,还有近年来发展十分迅速的表型克隆 (ｐｈｏｎｅｔｙｐｉｃａｌｃｌｏｎｉｎｇ)〔１〕，例如差别筛选法 (ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｓｃｒｅｅｎｉｎｇ) 〔２〕、扣除杂交技术 (ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ)〔３〕、ｍＲＮＡ差异显示技术 (ｍＲＮＡｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｄｉｓｐｌａｙｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＰＣＲ，ＤＤＲＴ ＰＣＲ) 〔４〕 、代表性差示分析(ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓ，ＲＡＤ)〔５〕、抑制性扣除杂交(ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｓ...&
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随着作物遗传水平的不断提高和对生物新技术的渴求 ,研究者对诸如育种材料的遗传多样性、亲本选择指标、后裔评价方法等提出了更高的要求。因此从表现型选择到基因型鉴别 ,特别是对有益基因定位、克隆、转移和累加 ,是人们为获取高产、优质、多抗新品种 (系 )而应该关注的研究工作。然而无论对于控制质量性状的单 (寡 )基因还是与大多数农艺性状有关的微效多基因来说 ,对其进行克隆都需要建立和发展相关的技术和方法。现代遗传学的发展为建立基因克隆新技术提供了理论指导。从遗传学的观点来看 ,克隆基因的途径可概括为正向遗传学和反向遗传学两种。正向遗传学途径指的是通过被克隆基因的产物或表现型突变去进行 ;反向遗传学途径则指的是依据被克隆基因在染色体上的位置来实现。由于绝大多数控制重要农艺性状的基因产物及调控机制尚不清楚 ,走正向遗传学之路困难较多 ,而反向遗传学途径则显示出较好的前景。循反向遗传学途径克隆基因有三种主要方法可资利用 ,分别是转座子示踪法...&
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近些年来,图位克隆技术在模式植物拟南芥以及重要农作物水稻中得到了广泛的应用,分离出了一大批在农艺生产上有重要应用价值的基因(Bryanet al.,2000;Li et al.,2003;She et al.,2010;Tanabe eal.,2005),然而在玉米方面的应用却相对较少。随着玉米基因组测序的完成(Schnable et al.,2009),大量分子标记的公布以及DNA多态性检测技术的不断改进,大大简化了玉米图位克隆的技术流程,降低了工作成本,这使得玉米基因的图位克隆变得更加简便、快捷,为图位克隆技术在玉米中的应用开辟了广阔的前景。1图位克隆技术的遗传定位原理图位克隆技术最早由剑桥大学的AlanCoulson提出(Coulson et al.,1986),该技术以突变表型为切入点,根据功能基因在基因组中有相对稳定的基因座位,利用遗传标记对目标基因进行初定位的基础上,再通过染色体步移(Tanksley et al.,...&
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目前,克隆基因的途径有2种:正向遗传学(for-w ard genctics)和反向遗传学(reverse genctics)途径。前者是依据目的基因所表现的功能为基础,通过鉴定其产物或某种表型突变而进行的;后者则着眼于基因本身,通过特定的序列或在基因组中的位置进行。传统的功能克隆(functionalcloning)属于前者范畴,它是根据已知基因的产物反推其核苷酸序列,再据此序列设计探针或引物从cD N A文库或基因组文库中筛选克隆(如玉米组蛋白脱乙酰酶H D2基因的分离)(Lusseretal.,1997),也可以制备产物抗体,从表达载体构建的cD N A文库中筛选相应克隆,进而分离目的基因。另外,还有近年来发展十分迅速的表型克隆(phonetypicalcloning)(Jonsson andW eissm an,1995),例如差别筛选法、扣除杂交技术、m RN A差异显示技术、代表性差示分析、抑制性扣除杂交等(Sche...&
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