请教DEAE-sephadex G-50的装柱方法 - 实验交流 - 生物秀
标题: 请教DEAE-sephadex G-50的装柱方法
摘要: [请教DEAE-sephadex G-50的装柱方法] 我想问一下DEAE-sephadex G-50的装柱方法，还有可不可以不通过DEAE-sephadex柱而用其他简单的方法从水中分离蛋白啊？急！谢谢！ 关键词:[分离蛋白 分子筛 盐析 透析 纳米 沉淀物 盐浓度]……
我想问一下DEAE-sephadex G-50的装柱方法，还有可不可以不通过DEAE-sephadex柱而用其他简单的方法从水中分离蛋白啊？急！谢谢！回复透析可行否？回复能不能说得具体一些啊？谢了！回复我用的水中分离蛋白的方法：蛋白溶液加入一定量的，蛋白发生盐析沉淀出来，过滤后将蛋白沉淀物透析除去盐，即可。不同的蛋白需要的盐浓度不太一样，你可以查查文献。回复方法很多，比如
1、盐析，如楼上所说，但一般又叫做硫酸铵沉淀法
3、离子交换
4、亲和层析
5、反向层析
6、等电点沉淀
7、。。。。。。太多了，你去看看汪家政的蛋白质技术手册吧。回复我们现在在用一种仿生法合成纳米晶，但是想知道除了用DEAE-Sephadex-A-50层析法处理分理出蛋白得到我们需要的纳米晶以外还有没有其他的更可行简单的方法。如果有的话希望不吝赐教，非常感谢！回复你的是分子筛,用来进行溶液体系交换还可以,分离蛋白效果不好回复DEAE-sephadex G-50的装柱方法
1.溶胀，计算柱床体积，算出所需担体量，将担体充分溶胀
2.装柱。封闭柱下端，溶胀好的担体混旋装入柱内，接近上端停止。
3.打开柱下端，让溶剂缓慢流出，仔细观察，待担体接近沉降完全前，缓慢将剩余的混旋担体加入，这样做的目的是使柱体不会分层。
4.反复步骤3，直至装满柱体。关闭柱下端，装上柱上盖。
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电话：021-请问生物技术中什么叫Sephadex G100 与Sephadex G50 串联柱层析纯化?如何操作的?
叛逆尊0638
这是葡聚糖凝胶,G后面的数字代表凝胶颗粒的大小.具体操作详见,说明书啊 !
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标题: 关于Sephadex LH-20的几个问题，有经验者请进！(凝胶,柱子,硅胶,分子量,展开剂)
摘要: 样品最大分子量约800，里面含有菲环结构的甲酯类物质及其二聚体、三聚体，可以用乙醇、甲醇、乙酸乙酯、丙酮等有机溶剂溶解，之前用硅胶柱分离效果不好，现在想用凝胶柱试试。初步的方案是用1 6*30cm柱子，柱高26cm，上样量0 5~1毫升（溶解100mg样品），纯乙醇洗脱，5毫升 每管，准备洗脱3个柱体积。大家发表下意见，有没有什么问题？查了些资料，还是有不少困惑。请朋友们帮忙解答一下：1 有朋友说……
样品最大分子量约800，里面含有菲环结构的甲酯类物质及其二聚体、三聚体，可以用乙醇、甲醇、乙酸乙酯、丙酮等有机溶剂溶解，之前用硅胶柱分离效果不好，现在想用凝胶柱试试。初步的方案是用1.6*30cm柱子，柱高26cm，上样量0.5~1毫升（溶解100mg样品），纯乙醇洗脱，5毫升/每管，准备洗脱3个柱体积。大家发表下意见，有没有什么问题？
查了些资料，还是有不少困惑。请朋友们帮忙解答一下：
1.有朋友说，用此凝胶过柱用TLC探索展开剂，是这样的吗？这里的TLC应该是普通的硅胶板，感觉不是很有道理呢。如果是正相凝胶，那么基本用的是凝胶过滤作用，不是凝胶吸附作用，那怎么能用TLC确定展开剂呢？即使是反相凝胶，吸附剂是不一样的，有参考价值吗？
2.如果是有TLC确定洗脱剂，我是不是应该用石油醚和乙酸乙酯作洗脱剂呢？之前TLC制备板展开剂比例为PE:EA=9：2。还是选择纯乙醇过柱更好呢？
3.同样，洗脱之后用TLC检测。这里只是用TLC进行定性检测的吗？既然TLC可以检测说明谱图的硅胶柱是可以分离的吧，那么用制备板或者硅胶柱层析的方法不就好了吗？
4.1.6*30cm柱子，柱高26cm，是不是合理？看资料说柱高应该是柱径的8~10倍，那么30厘米的柱子才只能装16cm，是不是太浪费了？应该是柱子装的越长，分离效果越好吧？
5.关于上样量，准备100mg样品溶解于0.5毫升~1毫升的乙醇中上样，是不是合理？
6.装柱子的问题。用纯乙醇洗涤溶胀装柱，应该是没有问题的吧，看资料都说用甲醇装柱，后面再置换。难道是乙醇装柱很容易出现气泡，不易控制？
还有，溶胀后要超声脱气，凝胶在乙醇中直接超声，应该不会破坏凝胶结构吧？
还有人说，用真空泵脱气，这个怎么脱，没想明白。。。
7.另外，看到好多次“Sample Text”，不知道中间是哪两个字，也没看明白什么意思。
我的理解是：先上一部分样，待样下移一定长度，再上一部分样。那这样的话，和前者样品会不会有重叠？
原文如下：将样品一次全上柱,这样分离效果一定不会好,但我们的侧略是将样品Sample Text的部分再上一遍或几遍,这叫反复xxxx 柱层，好处是工作量小（对比下面就知道了），在前后较纯的馏分，如果目标组分量足够，可就乐去吧。
问题比较细、多，希望大家能耐心解答一下，不胜感激！！！！网友回复祝一帆风顺，心想事成。网友回复划线英文是“反复××××柱层”。我的样品是氢化菲环甲酯类物质及低聚物。网友回复分离利用的原理不一样,最好查一下相关资料再做。到时可站内联系,多告诉我一些信息,根据我的经验,看一下是否能有更好的方法分离。网友回复柱长30厘米太短了吧，越长效果越好，我们的凝胶柱将近两米了快，尽量找长一点的柱子网友回复 引用内容:
祝一帆风顺，心想事成。 谢谢网友回复 引用内容:
柱长30厘米太短了吧，越长效果越好，我们的凝胶柱将近两米了快，尽量找长一点的柱子 恩，我先用30cm的柱子先探索一下，后面再调整。你用两米的，是分离蛋白质的吧，还是天然产物中的什么物质？网友回复 引用内容:
分离利用的原理不一样,最好查一下相关资料再做。到时可站内联系,多告诉我一些信息,根据我的经验,看一下是否能有更好的方法分离。 恩，之前硅胶柱试过，效果不好，点太多，很混乱。凝胶柱周围没见用过，所以问题比较多。网友回复 引用内容:
恩，我先用30cm的柱子先探索一下，后面再调整。你用两米的，是分离蛋白质的吧，还是天然产物中的什么物质？... 我们也是分离天然化合物的，如果有一定量的凝胶宁愿装一根装长点也不要分几根装，楼主装那么短恐怕没什么效果的网友回复 引用内容:
我们也是分离天然化合物的，如果有一定量的凝胶宁愿装一根装长点也不要分几根装，楼主装那么短恐怕没什么效果的
... 刚开始用，凝胶太贵，不敢多买，想买25克凝胶试试，不知道行不行呢。你们装两米的柱子，用了多少凝胶啊？我的想法是这个东西分离分子量不同的低聚物，分子量这么低，有没有希望呢？网友回复 引用内容:
恩，之前硅胶柱试过，效果不好，点太多，很混乱。凝胶柱周围没见用过，所以问题比较多。... 硅胶柱利用的是根据极性不同进行分离，好像有一种填料是根据粒度不同进行分离的网友回复 引用内容:
恩，之前硅胶柱试过，效果不好，点太多，很混乱。凝胶柱周围没见用过，所以问题比较多。... 硅胶柱利用的是根据极性不同进行分离，好像有一种填料是根据粒度不同进行分离的网友回复 引用内容:
硅胶柱利用的是根据极性不同进行分离，好像有一种填料是根据粒度不同进行分离的... 恩，就是凝胶柱网友回复 引用内容:
刚开始用，凝胶太贵，不敢多买，想买25克凝胶试试，不知道行不行呢。你们装两米的柱子，用了多少凝胶啊？我的想法是这个东西分离分子量不同的低聚物，分子量这么低，有没有希望呢？
... 25g凝胶够了，用那种直径小的很长的那种，直径差不多1.5cm左右吧，能不能分开要看它们分子量差的大不大，如果是同一类型的效果不会很好，可以试一下网友回复 引用内容:
25g凝胶够了，用那种直径小的很长的那种，直径差不多1.5cm左右吧，能不能分开要看它们分子量差的大不大，如果是同一类型的效果不会很好，可以试一下... 分子量大概是，600,300，嗯那就换一个半米长的，听你这么说，是不是够呛呢？网友回复 引用内容:
25g凝胶够了，用那种直径小的很长的那种，直径差不多1.5cm左右吧，能不能分开要看它们分子量差的大不大，如果是同一类型的效果不会很好，可以试一下... 你是分离哪类物质的，我的是萜类衍网友回复1.有朋友说，用此凝胶过柱用TLC探索展开剂，是这样的吗？这里的TLC应该是普通的硅胶板，感觉不是很有道理呢。如果是正相凝胶，那么基本用的是凝胶过滤作用，不是凝胶吸附作用，那怎么能用TLC确定展开剂呢？即使是反相凝胶，吸附剂是不一样的，有参考价值吗？
没有意义，LH-20不具备正相分离特性，使用纯有机溶剂时，只有分子筛作用。
2.如果是有TLC确定洗脱剂，我是不是应该用石油醚和乙酸乙酯作洗脱剂呢？之前TLC制备板展开剂比例为PE:EA=9：2。还是选择纯乙醇过柱更好呢？
前面说了，硅胶板TLC摸的条件没意义。
3.同样，洗脱之后用TLC检测。这里只是用TLC进行定性检测的吗？既然TLC可以检测说明谱图的硅胶柱是可以分离的吧，那么用制备板或者硅胶柱层析的方法不就好了吗？
定性检测当然可以，如果TLC能够分开，当然可以上硅胶柱层析。
4.1.6*30cm柱子，柱高26cm，是不是合理？看资料说柱高应该是柱径的8~10倍，那么30厘米的柱子才只能装16cm，是不是太浪费了？应该是柱子装的越长，分离效果越好吧？
柱子径高比越小越好，但跑柱子的时间很慢，凝胶又不能加压。柱高/直径8~10，柱效不算太高。
5.关于上样量，准备100mg样品溶解于0.5毫升~1毫升的乙醇中上样，是不是合理？
可以，上样体积越小越好，如果样品能溶的话，尽可能少用溶剂。
6.装柱子的问题。用纯乙醇洗涤溶胀装柱，应该是没有问题的吧，看资料都说用甲醇装柱，后面再置换。难道是乙醇装柱很容易出现气泡，不易控制？
还有，溶胀后要超声脱气，凝胶在乙醇中直接超声，应该不会破坏凝胶结构吧？
还有人说，用脱气，这个怎么脱，没想明白。。。
直接乙醇装可以，但是凝胶在乙醇中溶胀率不及甲醇，同样量的凝胶柱效偏低。脱气抽真空就可以，不能超声。
7.另外，看到好多次“Sample Text”，不知道中间是哪两个字，也没看明白什么意思。
我的理解是：先上一部分样，待样下移一定长度，再上一部分样。那这样的话，和前者样品会不会有重叠？
原文如下：将样品一次全上柱,这样分离效果一定不会好,但我们的侧略是将样品Sample Text的部分再上一遍或几遍,这叫反复xxxx 柱层，好处是工作量小（对比下面就知道了），在前后较纯的馏分，如果目标组分量足够，可就乐去吧。
你考虑的对，分次上样，一定要小心样品重叠。如果有的成分系统很慢，会干扰下次上样，还不如重装柱子来得快。网友回复 引用内容:
1.有朋友说，用此凝胶过柱用TLC探索展开剂，是这样的吗？这里的TLC应该是普通的硅胶板，感觉不是很有道理呢。如果是正相凝胶，那么基本用的是凝胶过滤作用，不是凝胶吸附作用，那怎么能用TLC确定展开剂呢？即使是反 ... 非常感谢！回答很详细。如果要用该柱子的吸附分配作用，那怎么选择洗脱剂及比例呢？还有脱气抽真空的话，是用乙醇浸泡后，用抽干，脱气吗？那后面上柱子的时候不还是用乙醇上柱子吗，不就又带入气体了？网友回复 引用内容:
非常感谢！回答很详细。如果要用该柱子的吸附分配作用，那怎么选择洗脱剂及比例呢？还有脱气抽真空的话，是用乙醇浸泡后，用真空泵抽干，脱气吗？那后面上柱子的时候不还是用乙醇上柱子吗，不就又带入气体了？... 如果用到凝胶的吸附作用，要用含水洗脱剂，一般甲醇-水，比例要通过小试来确定，因为LH-20兼有分子筛和反相作用，单纯用HPLC的出峰顺序判断哪个先洗脱也没什么意义，要看两个效应叠加的效果。
真空脱气的意思是，用溶剂溶胀凝胶后，用真空泵抽去体系中的气泡，不是要把溶剂抽干，这和做液相时用真空脱气一个道理，只是让气泡快速膨胀不至于附着在凝胶表面。
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【讨论】药典头孢类聚合物为什么要用SEPHADEX G10柱子啊？
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这个帖子发布于4年零284天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
SEPHADEX G10的柱子柱效并不高，还那么要求峰谷高比的，为什么不用TSK的高效凝胶柱呢？是考虑到厂家的经济承受能力，还是方法方面的原因啊？
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TSK凝胶柱的方法是09年才出来的。并不是考虑了经济原因的！现在可能TSK的方法要更好些吧！
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TSK的柱子虽然也比较适合分析抗生素聚合物，可是相对于G-10的填料来说还是有一定的不足的。TSK的柱子虽然柱效比较高，分析出来的谱图比较好看。像大家在分析聚合物本身国内的技术就不过关，无法保证中间体及原料药的批次保证，所以才会做聚合物分析的啊~~
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我觉得10年药典应该改为TSK的方法啊？毕竟柱效要高很多的啊？再说在药典只是说用自己装的G10柱子，并没有真正的考虑到大家的实际情况，还有国外是否也做聚合物分析？是不是只针对国内的青霉素类产品有这个分析？厂家的工艺不过关？（也不一定，聚合物有的时候会在存放中产生）
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神马柱子都是浮云，方法OK就行。TSK09年出来，是要做方法验证的，G-10柱是老方法了。也不是所有头孢都用G-10的
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可是也不是TSK的柱子都能分析头孢啊，一般TSK的在分析脂溶性的样品的时候还可以，可是在水溶性的样品时相对于G-10的话柱效是比较高的，可是我认为G-10的成本更低，而且还是药典规定的。所以就一直用着。
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关于丁香园关注今日：57 | 主题：379137
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【求助】Sephadex G-75柱子分离纯化细节及求说明书
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这个帖子发布于2年零266天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
大家好，小妹我刚做分离纯化，分离蛋白大小15-16KDa左右，选用Sephadex G-75填料，没有说明书pharmacia公司的，网上找了个步骤，在附件，不知道可以不？麻烦经常做分离纯化的前辈指教！我的柱子为30cm*1.2cm!急！
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你的样品量大概多少毫升？你这种规格的柱子上样量会很有限。sephadex系列凝胶柱上样量不能太大，而且对样品稀释较大。所以样品尽量浓度高点，以免洗脱峰过低而难以观察。一直都不觉得凝胶过滤的纯化方法好，灌柱麻烦，峰形不好，样本稀释厉害，分离效果远远达不到说明书标称的那么好。不知道你为何选择G75柱，能用离子交换或者疏水柱的就尽量别用凝胶柱吧
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您好，谢谢您的回复，我对分离纯化不是很了解，我本来做分子方面的，第一次做分离纯化。只是查的参考文献用的是G-75和离子交换柱进行分离的，其他的还没有试过！另外想请教下，Hi Trap DEAE FF 1ml与SPXL 1ml、ANXFF(high sub)1ml/Q FF 1ml、Q XL 1ml、CM FF 1,ml、SP FF 1ml,这几种离子交换柱有什么区别，买回来一盒，里面有这些但是数目书没有了，真的不知道用那个？非常感谢！
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DEAE、Q是阴离子交换填料SP、CM是强阳离子交换填料至于用哪个填料，还要看你蛋白性质，在不同缓冲液条件下，蛋白所带电荷不同，来选择的。G-75是分子筛，使用最简单，缓冲液平衡柱子——上样——再缓冲液运行即可。
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我想请教一下你这个Hi Trap DEAE FF 1ml与SPXL 1ml、ANXFF(high sub)1ml/Q FF 1ml、Q XL 1ml、CM FF 1,ml、SP FF 1ml是什么试剂盒？我也是一只做分子，现在要做纯化，想买个有各种树脂的试剂盒试一下条件。
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