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小羽贯众提取物抗菌活性的初步研究
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组织构建细胞学实验 cytology experiments in tissue construction
五谷虫抗金黄色葡萄球菌物质的纯化及抗菌机制
张& 振，洪& 亮，王寿宇，吕德成
大连医科大学附属第一医院骨科，辽宁省大连市& 116011
Anti-Staphylococcus aureus substance purification from Wu Gu Chong and its related antibacterial mechanisms
Zhang Zhen, Hong Liang, Wang Shou-yu, L& De-cheng
Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital of Dalian Medical University, Dalian& 116011, Liaoning Province, China
参考文献(0)
五谷虫，又称蛆虫，为丽蝇科丝光绿蝇(Lucilia Sericata)或其近缘昆虫的幼虫。中国传统医学《本草纲目》、《本草求原》均记载：该虫性寒无毒，可搽敷外用，治疗臁疮、唇疔和痈疽等感染性外科疾病[1]。本课题组已成功应用五谷虫治疗糖尿病足部溃疡和脊髓损伤后截瘫压疮创面，取得了满意的效果[2-3]，并且具有较高的成本-效益比。临床和实验研究发现五谷虫通过分泌抗菌活性物质，能有效控制创面的细菌感染[4-8]。目前国内外学者对五谷虫抗菌物质的研究主要集中于通过分离纯化获得确切的单一抗菌物质，但由于分离纯化的方法不&& 同[9-11]，存在较大争议，且缺乏对五谷虫抗菌机制的研究。实验通过超滤法对五谷虫抗金黄色葡萄球菌物质进行分离纯化，同时检测该物质对细菌结构的破坏作用，探讨五谷虫的抗菌机制，从而为临床应用五谷虫治疗感染创面提供理论基础。
设计：对比观察。
时间及地点：实验于月在大连医科大学生物技术学院实验室完成。
材料：五谷虫及其粗提物按照王寿宇等[12]的方法获得。金黄色葡萄球菌(S.aureus，ATCC25923)标准菌株，由大连医科大学微生物教研室提供。
五谷虫抗金黄色葡萄球菌物质的纯化及抗菌活性实验需要试剂及仪器：
Main reagents and instruments:
实验方法：
超滤法对五谷虫粗提物进行纯化：将五谷虫粗提物样品液先用截留相对分子质量(Mr)为& 30 000的超滤离心管截留Mr&30 000的杂质，收集滤出液，再加入截留相对分子质量(Mr)为10 000的超滤离心管中，4 ℃，12 000 r/min下离心&&& 30 min，收集滤出液(Mr&10 000)及截留液(Mr&10 000)，放入-70 ℃冰箱冻存，并进行冷冻干燥,得到的冷冻干燥粉末-70 ℃保存备用。使用前再将干燥粉末加入无菌ddH2O中，分别获得滤出液及截留液样品液。
K-B纸片琼脂扩散法检测五谷虫纯化液的抗菌作用：将已处于对数生长期的金黄色葡萄球菌利用麦氏比浊管将菌液调整至0.5个麦氏浊度(相当于1.5&108 cfu/mL)。用无菌棉签蘸将其涂抹在整个水解酪蛋白琼脂培养基表面，保证涂布均匀，共接种10个培养基平板。将接种平板在室温下干燥3-5 min后，用无菌镊子将3个直径为&& 6 mm不含药物的无菌药敏纸片均匀贴于同一琼脂平板表面。在纸片上分别滴加五谷虫粗提物，超滤后的截留液及滤出液各20 &L，将琼脂平板置于37 ℃温箱里孵育18-24 h。培养后取出平板，观察并用游标卡尺测量抑菌圈直径。
酶标浊度法检测不同时间点五谷虫纯化液的抗菌活性：取五谷虫粗提物、截留液及滤出液样品液各200 &L，与&& 22 &L的10%无菌胰蛋白胨混匀，取150 &L加入到灭菌的96孔板中,用1%无菌胰蛋白胨作为阴性对照；再分别加入已稀释的金黄色葡萄球菌液30 &L。振荡均匀后，用酶标测试仪测定各样品液在零时刻589 nm处的吸光度(A589)值。然后将96孔板置入37 ℃温箱中孵育，分别用全自动酶标测试仪测量其3，6，9，12，15，18，21，24 h后的吸光度(A589)值。
MTT法检测不同浓度五谷虫纯化液对金黄色葡萄球菌增殖的影响：96孔板的每孔中加入106cfu/mL的金黄色葡萄球菌菌液90 &L，之前步骤筛选出具有明确抗菌活性的五谷虫纯化液10 &L，使其终浓度分别为0.125，0.25，0.50，1.00，2.00，4.00，8.00，16.00 g/L。阴性对照孔加入无菌ddH2O 10 &L，阳性对照孔加入10 g/L的氨苄青霉素(AMP)10 &L。每组设4个重复孔。将96孔板置于37 ℃，体积分数5%CO2培养箱中缓慢振荡(12 r/min)暗培养24 h后每孔加入5 g/L MTT 溶液10 &L，继续培养4 h后，离心(1 500&g)，上清液转到另一96孔板中，再加入10%的 DMSO 100 &L，37 ℃下继续振荡&&&& 30 min。酶标测试仪上以570 nm波长测A值(A570)，记录结果。按下式计算抑制率(%)：
抑制率&70%则对该药为高度敏感(S)，抑制率50%-70%则对该药为中度敏感(MS)，抑制率& 50%则对该药为不敏感(R)，抑制率&70%的最低浓度即为最低抑菌浓度(MIC)。
五谷虫纯化液抗菌物质对金黄色葡萄球菌细胞膜通透性的影响：参照marri等[13]的方法，并稍作改良。收集对数生长期菌体，用无菌磷酸盐缓冲液洗涤，重悬于磷酸盐缓冲液中至细菌浓度约为108 cfu/mL，在96孔板中每孔中加入100 &L菌液，然后加入10 &L&&&&& 30 mmol/L的邻硝基苯&-D-半乳吡喃糖苷(ONPG)，按以下分为3组：A组每孔加入10 &L磷酸盐缓冲液(阴性对照)；B组每孔加入10 &L的TritonX-100 (1%)(阳性对照)；C组每孔加入10 &L的相应MIC浓度的五谷虫纯化液样品。振荡均匀后，置于37 ℃恒温培养，每隔30 min用全自动酶标测试仪测405nm的吸光度值(A405)。
五谷虫纯化液抗菌物质对金黄色葡萄球菌超微结构的影响：收集对数生长期菌体，加入含MIC浓度五谷虫纯化液的TSB培养基，在37 ℃，130 r/min震荡下分别培养6，12 h后，离心，弃上清，洗涤。重悬在1 mL的25 g/L戊二醛中，4 ℃放置过夜。离心，弃上清，用磷酸盐缓冲液洗涤。再用10 g/L锇酸固定4 h，磷酸盐缓冲液漂洗。依次用梯度浓度的乙醇脱水，离心。一部分用乙酸异戊酯置换2次，20 min/次，CO2临界点干燥，离子溅射仪中喷金，通过扫描电子显微镜观察。另一部分环氧树脂包埋，超薄切片机切片，将切片置于载网聚乙烯醇缩甲醛支持膜上，用3%醋酸铀染色，通过透射电子显微镜观察。
主要观察指标：五谷虫纯化液不同时间段的抗菌活性；五谷虫纯化液不同浓度的抗菌活性及MIC；金黄色葡萄球菌细胞膜通透性；金黄色葡萄球菌超微结构。
统计学分析：采用SPSS 16.0统计软件分析，多组资料间比较采用单因素方差分析。LSD法多重比较组间差异。以P & 0.05差异为有显著性意义。
实验采用超滤膜技术，两步超滤法对五谷虫粗提物进行分离纯化，首先用截留分子质量为30 000的超滤膜，除去大分子杂质，滤过液再用截留分子质量(Mr)为&& 10 000的超滤膜超速离心，从而分离出两个组分，即滤出液(Mr&10 000)和截留液(Mr&10 000)，分别用酶标浊度法及K-B纸片琼脂扩散法检测各组分的抗菌活性，筛选出滤出液(Mr&10 000)组分具有明显抗菌活性，从而在整体上提高五谷虫的抗菌活性。同时应用MTT法测得该五谷虫滤出液对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度(MIC)为1 g/L。Bexfield等[14]通过采用Mr 10 000及500的超滤膜对五谷虫分泌物进行分离纯化，纯化后经抗菌活性分析显示Mr&500和500& Mr&10 000的组分对金黄色葡萄球菌具有抗菌活性。Huberman等[15-16]及Kerridge等[17]都通过研究发现，五谷虫分泌物中Mr&1000组分具有明显的抗菌活性。这些研究都提示五谷虫体内可能含有多种不同的小分子量的抗菌物质，并可能相互之间具有协同作用，如果通过纯化分离出单一的抗菌物质，则可能影响其抗菌活性。因此，超滤膜技术可以在五谷虫抗菌药物研发中具有重要的作用。
实验通过检测反应体系内&-半乳糖苷酶的活性，反应细胞膜通透性的变化，&-半乳糖苷酶是细菌胞质膜上的水解酶，可以将ONPG水解成黄色的ONP，如果细胞膜受到损伤，则通透性增加，&-半乳糖苷酶进入胞外或者ONPG进入胞内增加，而使反应体系内的吸光度增加。经五谷虫提取物抗菌物质作用30 min后，反应体系内的吸光度值快速增加，表明五谷虫抗菌物质通过与金黄色葡萄球菌细胞膜相互作用，增加细胞膜的通透性。扫描电子显微镜观察五谷虫提取物抗菌物质作用6 h后，细菌表面出现凹陷或孔洞，甚至坍陷；而作用12 h后部分细胞膜破裂，细胞内容物外泄。透射电子显微镜观察显示经五谷虫提取物抗菌物质作用12 h后，细菌表面破损形成孔洞，细胞内水溶性物质外泄而形成空腔。这些结果初步揭示了五谷虫抗菌物质通过作用于金黄色葡萄球菌的细胞膜而形成孔洞，增加细胞膜的通透性，导致细胞内容物外泄，最终细胞死亡。但五谷虫抗菌物质是否存在着细胞内的作用靶点，通过影响细菌的生理代谢，从而发挥抗菌活性，则需要进一步的研究。
目前，研究结果显示五谷虫含蛋白质质量分数为62.70%、脂肪质量分数为11.20%、几丁聚糖质量分数为16%,另外蟾饲五谷虫还含有华蟾蜍毒基和羟基华蟾蜍毒基。具有抗菌抗病毒、抗肿瘤、治疗小儿厌食、治牙疳和口疮、愈合感染创面等作用,但是在制备工艺、质量标准研究方面没有报道。蟾饲五谷虫及五谷虫药理活性多样,但在化学成分研究方面、制备工艺方面和质量标准研究方面有待进一步深化。
本实验通过超滤法对五谷虫抗金黄色葡萄球菌物质进行分离纯化，同时检测该物质对细菌结构的破坏作用，探讨五谷虫的抗菌机制，从而为临床应用五谷虫治疗感染创面提供理论基础。
实验结果表明，运用超滤膜分离技术对五谷虫抗金黄色葡萄球菌物质进行分离纯化，确定其分子量小于10000，通过与金黄色葡萄球菌细胞膜相互作用，增加细胞膜的通透性。导致细胞内容物外泄，最终细胞死亡。
研究亮点: 运用超滤膜分离技术对五谷虫抗金黄色葡萄球菌物质进行分离纯化，确定其相对分子质量小于10 000，通过与金黄色葡萄球菌细胞膜相互作用，增加细胞膜的通透性。导致细胞内容物外泄，最终细胞死亡。提示五谷虫体内可能含有多种不同的小分子质量的抗菌物质，并可能相互之间具有协同作用，如果通过纯化分离出单一的抗菌物质，则可能影响其抗菌活性。因此，超滤膜技术可以在五谷虫抗菌药物研发中具有重要的作用。
2.1& 五谷虫纯化液的抗菌作用& 五谷虫粗提物，滤出液及截留液均能形成抑菌环，但滤出液(Mr&10 000)形成的抑菌环有效直径明显大于粗提物及截留液组[(14.5&2.4)，(8.7&1.6)，(7.6&0.9) mm，P & 0.01]，且统计学分析差异有非常显著性意义(P & 0.05)。见图1。
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2.2& 酶标浊度法检测不同时间点五谷虫纯化液的抗菌活性& 见表1。
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与阴性对照组相比较，各个时间点五谷虫粗提物及超滤分离后的滤出液(Mr&10 000)和截留液&&&&&&&&& (30 000&Mr&10 000)均对金黄色葡萄球菌产生了抑制作用(P & 0.05)，且滤出液抗菌活性最强，其次为截留液，最弱为粗提物(P & 0.05)。
2.3& 不同浓度五谷虫滤出液对金黄色葡萄球菌增殖的影响& 由于滤出液的抗菌作用最强，后续实验均以滤出液为研究对象。滤出液对金黄色葡萄球菌细胞的增殖具有明显的抑制作用，且抑制率随浓度的增加而增加。根据抑制率大于70%的最低浓度为最低抑菌浓度，则五谷虫提取物的最低抑菌浓度为1 g/L。见表2。
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2.4& 五谷虫滤出液抗菌物质对金黄色葡萄球菌细胞膜通透性的影响& 见图2。
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随着时间的增加，五谷虫提取物组及TritonX-100组的A值增加，显示更多的&-半乳糖苷酶释放到胞外或ONPG进入到细胞内，表明金黄色葡萄球菌细胞膜受到损伤，导致细胞膜通透性增加。TritonX-100是一种非离子型表面活性剂，当其浓度为1%时，可以溶解细胞质膜，增加细胞膜的通透性，五谷虫对金黄色葡萄球菌细胞膜的作用类似于TritonX-100。
2.5& 五谷虫滤出液抗菌物质对金黄色葡萄球菌超微结构的影响& 见图3。
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扫描电子显微镜观察，正常的金黄色葡萄球菌细胞表面光滑、圆润，呈球状，细胞与细胞间界限分明，细胞排列呈明显的葡萄串状，见图3A；当与MIC浓度的五谷虫提取物抗菌物质共培养6 h后，金黄色葡萄球菌细胞表面出现凹陷或孔洞，见图3B1，甚至塌陷，见图3B2；共培养12 h后，可见部分金黄色葡萄球菌细胞膜破裂，细胞内容物渗出，见图3C。
透射电子显微镜观察，正常的金黄色葡萄球菌具有完整的细胞膜和细胞壁，结构完整，表面光滑，没有损伤，见图4A；与MIC浓度的五谷虫提取物抗菌物质孵育6 h后，细胞未见明显变化，见图4B；而与MIC浓度的五谷虫提取物抗菌物质孵育12 h后，可见部分细菌细胞形态发生明显变化，细胞表面破损形成小孔，内容物外渗，细胞质解体，形成空腔，使染色的细胞颜色变浅，见图4C。
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即送15丁当
做MTT细胞实验中，石油醚层的提取物应该用什么溶剂溶解呢？？？
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在做药用植物提取物对细胞的作用过程中，石油醚萃取层应该用什么溶剂溶解呢，不会对MTT实验产生影响，我尝试用0.1% DMSO 溶解，可是溶解不了，有没有做过此类实验的大神，给点经验吧，万分感谢！！！！
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现有DMSO溶解，再取适量体积用培养液稀释，有条件的话要用超声超一下，使其成均匀混悬状即可。DMSO的终浓度不要超过千分之五！石油醚的样品是不可能在培养体系中成透明的！
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maligao 现有DMSO溶解，再取适量体积用培养液稀释，有条件的话要用超声超一下，使其成均匀混悬状即可。DMSO的终浓度不要超过千分之五！石油醚的样品是不可能在培养体系中成透明的！你好，用培养基稀释，过滤的时候感觉石油醚物质很多都被过滤掉了，如果不过滤的话，细胞又会染菌，该怎么办呢
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