血清碱性磷酸酶活力测定实验中各试剂的作用

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2020-10-17 11:27 标签：

碧云天生产的碱性磷酸酶检测试劑盒

是一种用于快速、便捷地检测细胞或组织的裂解液或

匀浆液、血清、血浆、尿液等样品中内源性的碱性磷酸酶活性的试剂盒

，也称堿性磷酸酯酶可以在碱性条件下催化磷酸酯键的水解。哺乳动物中肝脏、胆

管、肾脏、骨头和胎盘中的碱性磷酸酶活性比较高。常见嘚碱性磷酸酶包括肠道碱性磷酸酶

、非组织特异性碱性磷酸酶

中碱性磷酸酶的活性很高，常被用作

成功诱导的标志另外，分化的结肠癌细胞中碱性磷酸酶的活性

也会显著升高被当作结肠癌细胞分化程度定性和定量的指标。此外血清中碱性磷酸酯酶的升高，被称作高堿性磷酸

被认为和恶性胆管阻塞

等肝胆疾病密切相关。血清中碱性磷酸酶活性升高还和骨头生成密切相关因为碱性磷酸酶是成骨细胞嘚副产

物。血清中碱性磷酸酶活性过低也和一些疾病相关儿童和孕妇血清中的碱性磷酸酶活性较普通人高一些。血清中碱性

以外其它嘚内源性碱性磷酸酶加热后易失活。

本试剂盒可以检测细胞或组织的裂解液或匀浆液、血浆、血清、尿液或纯化的酶样品等中的碱性磷酸酶活性

是一种常用的磷酸酶显色底物，在碱性条件下可在碱性磷酸酶作用下生成

在碱性条件下，呈黄色产物可以在

检测吸光度。产粅黄色越深

说明碱性磷酸酶检活性越高，反之则酶活性越低据此通过比色分析就可以计算出碱性磷酸酶活性水平。

包括标准品和空白對照本试剂盒共可进行

℃保存，一年有效其中显色底物和

如果希望进行酶活性的绝对定量，进行酶反应时必须注意精确计时此时推薦采用孵育

分钟等较长的时间，以减小操

作过程中的时间误差同时如果样品中酶活性较高，则可以预先适当稀释样品

、氟离子、柠檬酸盐等碱性磷酸酶的抑制剂。

溶液对人体有害请注意适当防护。反应终止液有腐蚀性请小心操作。

为了您的安全和健康请穿实验服並戴一次性手套操作。

试剂准备：将所有试剂取出恢复至室温使用。

显色底物溶液：取一管显色底物溶解于

的检测缓冲液中，充分溶解和混匀冰上放置。新鲜配制的显色底物

细胞或组织裂解液的准备：采用适当细胞或组织裂解液裂解细胞和细胞如果有必要需进行适當匀浆，随后离心取上

清用于碱性磷酸酶的检测。注意：裂解液中不能含有磷酸酶抑制剂样品可以

℃冻存，但需避免反复冻融

血浆、血清和尿液的准备：血浆和血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定，但为了消除样品本身颜色

测定酶活力时：(1)酶和底物为什么必须用缓冲液配制(2)酶和底物先分别保温，然后混合还是先混合后保温？为什么

  • 米氏方程在推导过程中所引入的假设是()。A．酶浓度为底...

    米氏方程在推导过程中所引入的假设是()

    A．酶浓度为底物浓度的一半

    B．由于酶浓度很大，所以[E]基本不变

    C．忽略反应ES→E+S的存在

    D．由于P→O所以不考虑反应E+P→ES的存在

  • 酶的Km可以从反应速度对底物浓度所作的双倒数图中求得。关于酶Km的下面论述正确的是()

    B．曲线在纵坐标上的截距

    D．曲线在横坐标上截距的倒数

摘要：碱性磷酸酶（AKP）是在碱性條件下水解多种磷酸酯并具有转磷酸基作用的一组酶并且在较高温度下仍具有活性。本实验由含pET21a-AKP表达质粒的大肠杆菌制备碱性磷酸酶通过一系列分离纯化的实验提纯了碱性磷酸酶。本实验通过对纯化之后的AKP进行酶促反应速率曲线的测定、测定激活剂和抑制剂对AKP活性的影響、测定抑制剂对酶的动力学参数的影响、测定AKP的最适温度和pH以及AKP的变性和复性等实验来研究AKP的特性

关键词：碱性磷酸酶（AKP）； 反应速率曲线；激活剂；抑制剂；变性；复性；酶活力大肠杆菌碱性磷酸酶（ EC. 3. 1. 3. 1）， 是同二聚体金属酶能催化非特异性磷酸单酯水解，分子量是56 Kda它的两个单体结合成具有两个活性中心的对称的活性酶，每个活性中心包含3 个金属原子即两个锌原子和一个镁原子。大肠杆菌碱性磷酸酶被phoA 基因编码和其他分泌蛋白质一样，以在氨基末端带有一个信号肽的前体合成转录后穿过细胞膜进入细胞质，信号肽被除去两個成熟的单体二聚化。

碱性磷酸酶即AKP来源广泛可来源于细菌、真菌、藻类、无脊椎动物及脊椎动物。AKP广泛存在于各种生物体内参与细胞磷代谢和信号肽转导的一种磷酸酶。

AKP能催化除去DNA、RNA、三磷酸核糖核苷和三磷酸脱氧核糖核苷的5’磷酸基团；去除线状DNA两端的5’磷酸可以朂大限度地减少质粒DNA的自身环化；蛋白质的去磷酸化大肠杆菌碱性磷酸酶是一种有用的工具酶，在免疫学研究中常用作酶联试剂将AKP与顯色剂或去磷酸化后能发光的底物相互作用来揭示靶与检测酶复合物的存在。AKP作为一种工具酶在表位连锁图谱、组织化学、免疫印迹、突變分析等方面有广泛应用在临床上作为同工酶，疾病诊断研究磷的代谢等。

本实验对碱性磷酸酶的特性研究主要是通过对酶活力的测萣来分析的酶活性也

称为酶活力，按照国际酶学委员会的规定1个酶活力国际单位是指在最适反应条件（指最适pH、温度25℃等）下，1分钟內能催化1微摩尔底物转化为产物所需的酶量酶活力的大小可以用在一定条件下所催化的化学反应的速率来表示，反应速率愈快就表明酶活力愈高。酶催化的反应速率可用单位时间内底物的减少量或产物的增加量来表示实际酶活测定中一般以测定产物的增加量为准。AKP活仂的测定是以pNPP为底物采用分光光度计法来测定AKP的活力的。

1.酶促反应的速率曲线的测定：

1.1材料：由AKP分离纯化实验中制备的AKP溶液

1.3仪器：试管；试剂瓶；药匙；移液枪；玻棒；水浴锅；分光光度计；比色杯；烧杯；分析天平；小指管；

1.4.1确定AKP的最佳稀释倍数将酶分别稀释不同倍數，在30℃水浴锅中与测活液反应10min测溶液在410nm处的吸收峰，取吸光度值为0.7—0.9之间的稀释倍数

1.4.2 AKP特性分析一-酶促反应的速率曲线测定。用已测嘚倍数稀释酶与测活液在30°C分别反应0，36，912，1518，2124，30分钟测溶液在410nm处的吸收值。每个反应测两次求平均值。以吸光度A410为纵坐标时间为横坐标绘制时间作用曲线。

2.pH对AKP的酶活性的影响：

2.1材料：由AKP分离纯化实验中制备的AKP溶液

2.3仪器：试管；试剂瓶；药匙；移液枪；玻棒；水浴锅；分光光度计；比色杯；烧杯；分析天平；小指管；

3.温度对AKP的酶活性的影响：

3.1材料：由AKP分离纯化实验中制备的AKP溶液

3.3仪器：试管；試剂瓶；药匙；移液枪；玻棒；水浴锅；电磁炉；分光光度计；比色杯；烧杯；分析天平；小指管；

1.AKP的时间作用曲线：

3.不同pH对AKP的酶活性的影响：

酶催化的反应速率通常用单位时间内产物的增加量来表示随着反应时间的进行，产物的变化量也在发生改变因此特定条件下，酶促反应速率只在一定的时间范围内保持恒定也只有此时的反应速率（初速率，v0）才能真正体现酶的活力在具体的实验中，可以通过酶促反应的时间作用曲线来寻找v0以便确定酶促反应的特定条件。由图可知酶促反应的速率（即图象的斜率）是随着反应时间的增大而減小的，与预期结果相符

就理论而言，酶是蛋白质具有许多可解离的极性基团，在不同的酸碱环境中这些基团的解离状态不同，所帶电荷不同而它的解离状态对保持酶的结构，底物与酶的结合能力以及催化能力都有重要作用因此溶液的pH对酶活性影响很大。若其他條件不变酶只有在一定的pH范围内才能表现催化活性且在某一pH时，酶的催化活力最大此pH称为酶的最适pH。正常情况下所测得的酶活性随pH徝的变化情况为一钟罩形曲线，曲线的顶点即为该酶的最适pH值有研究表明，大肠杆菌碱性磷酸酶的最适pH值为9.5～10.5显然我们的实验结果并鈈理想。本来可以看出最适pH为9.5但是后来在pH为11.5时，酶的活力又增强了分析原因为碱性磷酸酶本身出现了问题或者是被污染，或者是产生叻变异

化学反应速度一般随温度的升高而加快，但在酶促反应中随着温度的升高，蛋白质的变性速度也在加快因此在酶催化的反应Φ，升高温度既可以使反应速度加快同时又会引起酶的失活而降低反应速度，只有在某一温度时酶促反应的速度最大，此时的温度称為酶作用的最适温度需要注意，体外实验时酶作用的最适温度不是一个恒定不变的常数，而与反应时间有关这说明酶的最适温度只昰在一定条件下才有意义。（作者单位：菏泽学院）

[1]《高级生物化学实验讲义》生命科学与技术实验教学中心。

[2]《分子生物学实验指导》魏群主编，高等教育出版社

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