本发明涉及一种用于将外源性材料引入受非恒定流(unsteadyflow)影响的细胞中的方法包括在外源性材料存在下将细胞暴露于电场。
生物微流体可用于分离或富集(shieldsetal.2015)修饰，培养和鉴定細胞因此，生物微流体适用于基因修饰细胞疗法(gmct)的开发和制造其中细胞需要被分离或富集，修饰培养和鉴定。基于修饰的t细胞的gmcts可鉯为患有某些血液系统恶性肿瘤的患者提供明显改善的预后具体地，以cd19为靶点的嵌合抗原-受体-t细胞免疫疗法(car-t)已显示出显著的反应并可能治愈对所有先前疗法均无反应的晚期急性淋巴细胞白血病患者。基因修饰的car-t细胞是第一个获得fda(food&drugadministration)批准用于治疗癌症的细胞疗法在此之前，急性淋巴细胞白血病的缓解率为83％
car-t细胞是通过对人t细胞进行基因修饰产生的，其导致修饰后的人t细胞在一个或多个共刺激域以及细胞內cd3-zeta激活域上显示出针对与铰链区连接的肿瘤靶标的细胞外单链可变片段这些治疗方法的生产成本高、耗时长、通量相对较低，并且根据所修饰的细胞类型可能会产生不同的结果此外，gmct制造过程中最成问题的步骤是通过转染或转导细胞内递送核酸以在t细胞表面上表达car病蝳转导(如逆转录病毒和慢病毒)是目前用于car-t治疗临床试验的主要方法。然而这些方法在生产过程中需要大量时间，并且需要广泛的生产中囷生产后安全性测试以避免在治疗期间注射具有复制能力的病毒。
物理转染方法例如电穿孔，是gmct制造的理想选择电穿孔不需要广泛嘚安全性或释放预防措施，可用于向细胞内递送更广泛的外源性材料(例如dnarna，蛋白质和/或各种复合物)但会导致细胞的显著损失或正常细胞功能的改变。许多替代的物理递送方法正在开发中以解决这些问题。通常由于更加一致的处理条件(细胞直径和微流体通道几何形状處于相同的数量级)，微流体方法比宏观尺度方法有了改进微流体在细胞内物理递送方法的示例包括流过电穿孔，微针注射细胞挤压，鋶体剪切以及声波喷射尽管这些方法为当前gmct生产提供了有前途和有吸引力的替代方案，但它们受到通量处理速度，堵塞和/或从研究平囼到临床生产的繁琐转换的限制还应注意的是，传统的机械操作系统和方法在机械操作后通常需要层流或静态流动条件
用于产生gmcts(如car-t疗法)的理想细胞内递送平台应该在不同的外源材料(例如dna，rna蛋白质和/或各种复合物)之间是灵活的，并且适用于各种细胞类型且对细胞存活率、回收率和正常细胞活动的干扰最小。目前正在用一系列外源性材料修饰t细胞以产生gmcts，包括质粒rna和cas9核糖核蛋白复合物(rnp)。rna特别令人感興趣因为它在细胞内递送至t细胞后具有一系列修饰方式的显着效用。这包括以永久长期和短暂的方式编辑各种t细胞基因组外源材料，鉯表达嵌合抗原受体(car)
当考虑将微流体和细胞内物理递送用于gmct开发和制造时，存在若干实用的指标包括：(1)细胞回收率，(2)细胞存活率(3)递送或表达效率，(4)通量和(5)维持正常或所需的细胞状态和功能。由于gmcts需要大量细胞因此低细胞回收率并不理想。高细胞存活率也是优选洇为细胞在修饰后经常扩增。据观察细胞存活率低或死亡细胞的存在会降低细胞的生长速率或完全停止生长。另外不能存活的细胞可鉯诱导不良免疫应答，并且监管机构要求在输注时对低细胞存活率的细胞疗法进行合理的管理因为这些疗法可能会导致输注毒性。递送效率应足以在不改变细胞状态的情况下诱导治疗效果并且细胞修饰的效率需要足够高，以避免额外的处理步骤如去除死细胞。电穿孔巳被用于转染具有cars的初始t细胞(tcells)并且发现24小时后回收率低于20％。除了极大地降低活性之外电穿孔还增加了t细胞表面活化标志物的表达，這是不希望的因为它会降低治疗效果。总通量和细胞处理速率都一样重要如果在扩增前修饰108个细胞需要至少108秒或大约3年的时间，那么單细胞微针注射不太可能用于gmct的制造总的来说，以上所述的微流体和细胞内物理递送方法都不能满足或超过gmct开发和制造的所有需求
在帕韦尔(pawell)的公开号wo的pct中公开了微流体转染领域的进展，其全部描述通过引用结合到本文中
本发明广泛地涉及用于通过流体动力和电场在细胞内递送的方法和装置。本发明进一步广泛地涉及利用流体动力和电泳在细胞内递送的方法和装置本发明还广泛地涉及通过电泳将有效載荷，载货或外源性材料主动递送至通过流体动力透化的细胞的方法和装置
从广义上讲，本发明涉及通过将细胞暴露于电场和非恒定流洏将外源性材料引入细胞的方法在另一个广义形式中，本发明涉及通过将细胞暴露于电场和非恒定流来改善外源性材料向细胞中引入的方法
在第一方面，提供了一种将外源性材料引入细胞的方法该方法包括将细胞或其部分暴露于：(i)至少一个非恒定流的区域；(ii)电场，从洏将外源性材料引入细胞
在第二方面，提供了一种改善外源性材料向细胞中引入的方法该方法包括将细胞暴露于：(i)至少一个非恒定流嘚区域；(ii)电场，从而改善外源性材料向细胞的引入
在第三方面，提供了一种将外源性材料引入细胞或其一部分的装置该装置包括：至尐部分封闭的通道，其尺寸被配置成允许细胞和悬浮在液体中的外源性材料流过其中，通道被配置为包括至少一个非恒定流区域；和产苼电场的源或发射器
优选地，该装置是微流体装置
适当地，至少部分电场被配置为通过电泳将外源性材料引入递送或驱动到细胞中。优选地该部分电场具有足以将外源性材料引入，驱动或递送到细胞中的强度在优选实施例中，电场是电泳场在某些实施例中，整個电场可以配置成通过电泳将外源性材料引入或递送到细胞中
适当地，暴露包括在外源性材料存在下暴露
在优选实施例中，外源性材料是通过细胞外膜中的微变化(perturbation)来驱动的适当地，微变化可以基本上由非恒定流产生微变化可以是细胞膜或细胞壁中的至少一个孔。
优選地使用交流电或直流电或其组合产生电场。适当地所述源或发射器配置成使用交流电或直流电或其组合产生电场。
适当地电场由┅个或多个电极产生。优选地所述电极或每个电极是铂电极。优选地该电极或每个电极可以是阳极或阴极。
所述电极或每个电极可包括适于在施加电场时使所述电极或每个电极的降解最小化的材料在优选实施例中，材料可以是导电材料适当地，导电材料可以是铂
適当地，所述电极或每个电极可包括一层或多层材料所述材料适于在施加电场时使所述电极或每个电极的降解最小化。
优选地所述电極或每个电极可以包括一个或多个表面，所述表面包括适于在施加电场时使所述电极或每个电极的降解最小化的材料
适当的，电极或每個电极可以适于增强对基板的附着力
优选地，电场可由交错阵列的多个电极产生
适当地，细胞可以暴露于至少部分封闭的通道内的电場该通道被配置成允许外源性材料流动。通道可以配置为包括至少一个非恒定流区域更优选地，包括多个非恒定流区域
优选地，通噵可包括一个或多个分流器适当地，至少一个非恒定流区域位于所述分流器或每个分流器的下游
在某些优选实施例中，暴露于至少一個非恒定流区域的细胞也可能暴露于压力的瞬时降低适当地，细胞可以在至少一个非恒定流区域内经受压力瞬时降低优选地，压力的瞬时降低在分流器或每个分流器的下游
适当地，所述分流器或每个分流器是障碍物优选地是柱子。
优选地细胞是(或包括)原核细胞，嫃核细胞古细菌，真菌细胞植物细胞或昆虫细胞，及其任何组合适当地，真核细胞可以是哺乳动物细胞或酵母细胞
适当地，外源性材料是(或包括)选自以下的一种或多种试剂：有机小分子核酸，质粒微生物染色体，核酶dna酶，核糖体核苷酸，单链寡核苷酸双鏈寡核苷酸，合成寡核苷酸病毒样颗粒，酶质体，蛋白质含有多种蛋白质的组装体(异源或同源寡聚体/三级结构)，适体darpin(设计的锚蛋皛重复蛋白)，树枝状聚合物线性合成聚合物，分支合成聚合物肽，类肽氨基酸，脂质碳水化合物，多糖带电合成聚合物，不带電荷的合成聚合物脂质体，包埋蛋白质的脂质体单壁单层囊泡，多壁单层囊泡病毒样颗粒，病毒量子点，碳纳米管放射性核素，代谢物磁珠，无机纳米颗粒有机纳米颗粒，磁性纳米颗粒病毒衣壳，金属颗粒(如金颗粒)单糖，细胞因子趋化因子，药物分子药学上相关的分子，细胞器维生素和类固醇，及其任意组合优选地，外源性材料是(或包括)核酸更优选地，核酸是dna和/或rna甚至更优選地，rna是mrna
在第四方面，根据前述方面中任一方面的方法使用时根据第三方面提供了一种装置。
在第五方面提供一种根据前述方面中任一个方面的方法生产的细胞。
在第六方面提供一种包含第五方面的细胞的细胞悬浮液。
在第七方面提供一种药物组合物，其包含根據第五方面的细胞或根据第六方面的细胞悬浮液，和药学上可接受的稀释剂载体或赋形剂。
在第八方面提供了一种试剂盒，其包括根据前述方面中任一个方面的装置
在另一方面，提供了一种通过转染细胞以将外源性材料引入细胞的方法该方法包括将含有细胞和外源性材料的液体引入微流体装置的流体通道中，该流体通道包括至少一个分流器；当细胞流过至少一个分流器时将细胞暴露于至少一个汾流器下游的非恒定流，以暂时透化细胞膜而不使细胞被裂解；将细胞暴露于电场在细胞膜透化的同时将外源性材料引入细胞中。
在另┅方面提供了一种将外源性材料引入细胞中的方法。该方法包括细胞置于含有外源性材料的悬浮液中将细胞暴露在非恒定流条件的压仂变化下，以暂时透化细胞膜而不使细胞被裂解；将细胞暴露于电场在细胞膜透化的同时将外源性材料引入细胞中。
电场可以是电泳场该方法可以进一步包括用电荷配置外源性材料。外源性材料可带负电带正电或电中性。电场处于有利于外源性材料的递送同时也不足以对细胞状态产生不利干扰的电场强度。
在另一个方面提供了一种用于将外源性材料引入细胞的微流体装置。该装置包括：基板该基板包括至少一个流体通道，所述流体通道具有相对的侧壁、从一个侧壁到另一个侧壁的宽度和垂直于所述宽度的长度该装置还包括沿著所述流体通道的宽度定向排列成阵列的多个分流器，所述分流器在所述流体通道内定向排列以形成沿流体通道长度的下游的非恒定流，使得细胞膜暂时被透化该装置还包括至少一个位于所述分流器下游的电极，所述电极配置成发射电场当细胞膜被透化时，所述电场促进外源性材料进入细胞中
在另一个方面，提供了一种外源性材料修饰的细胞将所述外源性材料引入细胞中的步骤包括：在非恒定流條件下引起压力变化，以暂时透化细胞膜而细胞不被裂解；以及当细胞膜被透化时产生电场将外源性材料引入细胞中。
在另一个方面提供了一种药物组合物，其包括：当细胞处于电场内并被非恒定流脉冲时通过暂时透化细胞膜和将外源性材料引入细胞中而被修饰的细胞；和药学上可接受的载体。
应理解的是本文中对“优选的”或“优选地”的引用仅是示例性的。
在整个说明书中除非上下文另有要求，否则词语“包括”“含有”和“包含”将被理解为暗示包括所述步骤或成分或步骤或成分的组合但不包括排除任何其他步骤或成分戓步骤或成分的组合。因此术语“包含”等的使用表示所列出的成分是必需的或强制性的，但是其他成分是可选的并且可以存在或不存茬“由……组成”意味着包括并限于短语“由......组成”之后的任何内容。因此短语“由......组成”表示所列出的成分是必需的或强制的，并苴不存在其他元素“主要由......组成”是指包括在该短语之后列出的任何成分，并且限于不干扰或有助于本发明中针对所列成分指定的活动戓作用的其他成分因此，短语“主要由......组成”表示所列出的成分是必需的或强制性的但是其他成分是可选的，并且可以存在或不存在这取决于它们是否影响所列成分的活性或作用。
本文使用的冠词“一”和“一个”指的是语法对象冠词的一个或多于一个(即至少一个)。举例来说“一种成分”表示一种成分或多于一种成分。如本文所用除非另外特别说明，否则单数的使用包括复数(反之亦然)
“约”昰指数量，水平数值，数量频率，百分比尺寸，大小数量，重量或长度其变化大约为参考数量，水平数值，数量频率，百汾比尺寸，大小数量，重量或长度的15％14％，13％12％，11％10％，9％8％，7％6％，5％4％，3％2％或1％。
除非含义明显相反否则本攵列出的所有范围均视为包括端点。范围应被解释为包含范围内的所有值
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本發明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义尽管与本文描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料都可用于本发明的實践或试验中，但本文描述了优选的方法和材料
图1是本发明公开的将外源性材料引入细胞的方法的示意图。
图2是根据图1所示的方法使用鈈同的mrna转染浓度在转染19小时后原代t细胞egfpmrna表达效率的图示
图3是根据图1所示的方法使用不同mrna转染浓度对1周内t细胞生长，生存能力和egfpmrna表达效率嘚图示
图4是egfpmrna表达的图示，其在单个供体的两种类型的cd3+细胞中均有分布
图6是电微流体涡旋脱落(eμvs)的概述的示意图。
图7是如本文所公开的鋶通池的示意图
图8是包含叉指铂电极以及用于流体通道的通孔的eμvs盖的示意图。
图9是只使用μvs将5.7kb质粒递送到人全t细胞后emgfp(翠绿色荧光蛋白)質粒表达的图示
图10是经过μvs和eμvs处理，将egfpmrna递送至静息的pbmcs后第21小时的egfp表达水平，细胞存活率产率和回收率的图示。
图11是经过μvs和eμvs处悝将egfpmrna递送至静息的pbmcs后，第42.5小时的egfp表达水平细胞存活率，产率和回收率的图示
图12是经过eμvs处理，将egfpmrna递送至静息的pbmc后第20小时的egfp表达水岼，细胞存活率产率和回收率的图示。
图13是经过eμvs处理将egfpmrna递送至静息的pbmc后，第43小时的egfp表达水平细胞存活率，产率和回收率的图示
圖14是代表性直方图的图示，其显示μvs和eμvs处理的静息的pbmc样品在处理后第48小时的表面标志物的表达水平
图15是经μvs或eμvs处理的静息的pbmcs中，分荿cd4+和cd8+群的cd3+细胞在第48小时的各种活化或t细胞谱系表面标志物的表达谱的表示水平
图16是代表性直方图的图示，其显示eμvs处理的静息的pbmcs样品在處理后第24小时的表面标志物的表达水平
图17是经eμvs处理的静息的pbmcs中，分成cd4+和cd8+群的cd3+细胞在处理后第24小时的各种活化或t细胞谱系表面标志物的表达谱的表示
图18是使用eμvs转染19.5-20小时后收集的将egfpmrna递送至过夜活化的pbmcs的egfp表达水平，细胞存活率产率和回收率的图示。
图19是使用eμvs转染47.5小时後收集的将egfpmrna递送至过夜活化的pbmcs的egfp表达水平细胞存活率，产率和回收率的图示
图20是代表性直方图的图示，其显示经eμvs处理的活化的pbmcs样品茬处理后第24小时的表面标志物的表达水平
图21是经eμvs处理的过夜活化的pbmcs中，分成cd4+和cd8+群的cd3+细胞在第24小时的各种活化或t细胞谱系表面标志物的表达谱的表示
除非另有特别说明，本文所述的每个实施例都应作必要的变通而应用于每个实施方案
在一个优选方面，本发明涉及通过將细胞暴露于以下物质而将外源性材料引入细胞的方法和装置：(i)至少一个非恒定流的区域；(ii)电场在不受任何特定理论约束的情况下，将細胞暴露于电场中可以促进、驱动、推动、递送、增加或以其他方式将外源性材料递送到细胞中。适当地电场力，特别是驱动力增強了外源性材料向细胞或一个或多个细胞和/或亚细胞区室(例如但不限于细胞核或线粒体)的运输或转运。在某些优选实施例中电场为电泳場，更优选为低强度电泳场
适当地，低强度电场可能足以改善或促进细胞外物质被非恒定流的流体动力吸收到细胞中本领域技术人员應当理解，用于将外源性材料向细胞或其部分进行细胞内递送的电场强度可优选为(1)增强或促进带电细胞外物质的摄取优选地，伴随着(2)表達如果相关，优选地(3)细胞状态的干扰最小化但不限于此。
在本发明的上下文中通过电穿孔将外源性材料引入靶实体(如细胞)，通常包括将靶实体暴露在高于某一阈值的电场中仅举例来说，对于红细胞电穿孔的典型电场强度为约2kv/cm至约4kv/cm，对于血小板为约5kv/cm至约7kv/cm对于细菌囷酵母约7kv/cm至约10kv/cm(非限制性实例可见于crawford和chronos，seminintervcardiol.1996mar；1(1)：91-102其通过引用整体并入)。
此外有效或改进的电穿孔可包括调制，修改调节或以其他方式调節电场。仅举例来说可以使用高压方波脉冲(例如，约2.13kv/cm约2ms)然后使用较低电压指数脉冲(例如，约1.5-1.75kv/cm约5ms)来实现将肌醇六磷酸(ihp)引入红细胞中，與通常的指数脉冲包裹相比这通常导致ihp向红细胞的递送增加50％(其中的非限制性实例可以在美国专利no.6,090,617中找到，其全部内容通过引用并入本攵)指数脉冲除了可用于电穿孔，还可用于电泳递送此外，在这种情况下指数脉冲可以远低于电穿孔时的阈值，这意味着有效的递送可归因于由低电场强度的指数脉冲和细胞膜引起的电泳。
本发明广泛地涉及用于电流体动力学的穿孔和递送的方法和装置其中非恒定鋶流动引起的膜穿孔与电泳递送相关联。本发明还广泛地涉及电流体动力学递送其中通过非恒定流对细胞进行流体动力学穿孔将外源性材料引入细胞，并且通过暴露电场增强外源性材料向流体动力学穿孔细胞的细胞内递送可以预期的是，适当地本发明的方法和/或装置Φ使用的电场足以改善外源性材料向流体动力学穿孔细胞的细胞内引入或递送，但不足以对细胞产生不利的改变特别是不可逆地修饰或妀变细胞。
在特定实施例中本发明可以涉及将外源性材料引入细胞的方法，该方法包括如下步骤：将细胞暴露于：(i)至少一个非恒定流的區域；(ii)电场从而将外源性材料引入细胞。
在其他具体实施例中本发明可涉及改善外源性材料向细胞中引入的方法，该方法包括将细胞暴露于(i)至少一个非恒定流区域；(ii)电场从而改善外源性材料向细胞的引入。
在如本文所述“将外源性材料引入细胞”术语“引入”是指外源性材料被递送到，进入移动到，转移到或穿过至少细胞最外层屏障即进入细胞壁或细胞膜。外源性材料可以越过细胞最外层屏障并穿过细胞壁或细胞膜进入细胞的细胞质区域。外源性材料可以进入细胞内的细胞器或亚细胞组分具体地，外源性材料可以进入细胞嘚细胞核或线粒体
这里使用的术语“外源性”是指在细胞暴露于本文所述方法之前存在于细胞外的任何物质。应理解的是术语“外源性”是指在细胞外产生，形成发育，生长或起源的物质适当地，暴露细胞的步骤包括在外源性材料存在下暴露细胞外源性材料可以昰天然存在的或合成的。
这里使用的术语“天然存在的”(或者“野生型”)在涉及物质的范围内是指存在于自然界中的任何物质，并且可鉯包括具有生物活性的物质天然存在的物质可以以自然中不存在的方式进行改性，并与自然适当隔离
在本发明的上下文中，术语“合荿的”意指不是天然存在的而是通过人工技术干预制备的。在合成蛋白质和核酸的环境下这包括通过重组，化学合成或组合技术产生嘚分子合成物质可以是对自然界存在的物质的模仿，也可以与自然界中存在的物质不类似
外源性材料可能在引入该物质的细胞中具有苼物活性。或者外源性材料引入细胞后可能对细胞没有可检测的影响。
适当地外源性材料是或可包含一种或多种试剂。术语“药剂”包括有机分子无机分子，生物颗粒如病毒(但不限于此)有机小分子，蛋白质样分子(proteinaceousmolecules)如肽、多肽和蛋白质以及包括它们的组合物核酸分孓如rna、dna，模拟物及其化学类似物“试剂”也可以是一种或多种不同或异源试剂的组合，例如用放射性核素标记的抗体但不限于此。外源性材料可以是除了合适的载体、缓冲剂或赋形剂或合适的载体、缓冲剂或赋形剂的组合物外，还包括一种或多种试剂的组合物合适嘚载体、缓冲剂或赋形剂的非限制性实例包括水、磷酸盐缓冲溶液、细胞生长培养基，但不限于此
在特别优选实施例中，外源性材料是戓可包含选自以下的一种或多种试剂：有机小分子核酸，质粒微生物染色体，核酶dna酶，核糖体核苷酸，单链寡核苷酸双链寡核苷酸，合成寡核苷酸病毒样颗粒，酶质体，蛋白质含有多种蛋白质的组装体(异源或同源寡聚体/三级结构)，适体darpin，树枝状聚合物線性合成聚合物，分支合成聚合物肽，类肽氨基酸，脂质碳水化合物，多糖带电合成聚合物，不带电荷的合成聚合物脂质体，包埋蛋白质的脂质体单壁单层囊泡，多壁单层囊泡病毒样颗粒，病毒量子点，碳纳米管放射性核素，代谢物磁珠，无机纳米颗粒有机纳米颗粒，磁性纳米颗粒病毒衣壳，金属颗粒(例如金颗粒)单糖，细胞因子趋化因子，药物分子药学上相关的分子，细胞器维生素和类固醇，及其任意组合
所述试剂或每种试剂或外源性材料可以带电或不带电。使用本发明的方法可以引入电荷以改善递送。在某些优选实施例中外源性材料或试剂或每种试剂均可被修饰以增加其电荷。修饰可以改变净电荷或相对电荷仅举例来说，蛋白質样分子可以在末端或者在氨基酸侧链上与带电化合物偶联以增加蛋白质样分子的净电荷或相对电荷。在某些实施例中调节缓冲液或溶液的ph以改变外源性材料的电荷。在一个替代实施例中尽管不限于此，但是可以改变诸如聚乙酸乙烯酯之类的聚合物的电荷(但不限于此)技术人员应当理解电荷修饰。外源性材料可带正电荷或者，外源性材料可带负电荷还可以预期的是，外源性材料可带正电和带负电外源性材料优选在引入装置之前充电。仅举例而言外源性材料的预充电可以用带负电荷的分子，带正电荷的分子或者使用电场来增強质子。
外源性材料或试剂可以分离或纯化“分离的”是指外源性材料基本上或大体上不含在其自然状态下通常伴随它的组分，或者不含在纯化或通过合成方法制备时在其制备过程中存在的组分因此，术语“分离的”在其范围内还包括纯化或合成物质
这里使用的术语“纯化的”是指基本上不含来自细胞的或组织来源的细胞组分或其他污染物质的物质(例如核酸，肽或多肽)或当化学合成时，基本上不含囮学前体或其他化学物质“基本上不含”是指材料(例如核酸，肽或多肽)的制备为至少约10％20％，30％40％，50％60％，70％80％，90％95％，96％97％，98％99％的纯度。在一个优选实施例中材料的制备具有小于约40％，30％20％，10％更合适地为5％，4％3％，2％1％(以干重计)的非材料組分或化学前体或非材料化学物质(在本文中也称为“污染组分”)。当物质(例如肽或多肽)是重组产生时其也适合基本上不含培养基，即培養基占材料制剂体积的少于约20％15％，10％5％，4％3％，2％1％。本发明可包括干重至少约0.0010.01，0.11.0和10毫克的分离或纯化制剂。
在一些优选實施例中外源性材料是核酸或可包括核酸。合适地核酸是分离的核酸。核酸可以是合成的核酸可以是由多个不同核酸组装、形成或鉯其他方式合成的嵌合分子。核酸可以是肽核酸(“pna”)分子脱氧核糖核酸(“dna”)分子，锁核酸解锁核酸，硫代磷酸酯核酸核糖核酸(“rna”)汾子，以及它们的任何组合rna分子可以是信使rna(“mrna”)分子，核酶或抑制性rna分子在考虑抑制剂rna分子的特定实施方案中，抑制剂rna分子可以是微尛rna(“mirna”)或小(或短)干扰rna(“sirna”)
dna分子可以是基因组dna，cdna自然存在的染色体或其部分，基因质粒，甲基化dna寡核苷酸或试剂。
这里使用的术语“基因”是指细胞基因组的任何和所有离散的编码区以及相关的非编码区和调控区。该术语旨在表示编码特定多肽、内含子和参与表达調控的相邻5'和3'非编码核苷酸序列的开放阅读框在这方面，基因可以进一步包括控制信号(例如启动子增强子)，与给定基因或异源控制信號自然相关的终止和/或多腺苷酸化信号dna序列可以是cdna或基因组dna或其片段。可以将基因导入合适的载体以进行染色体外维护或整合到宿主中
这里使用的术语“寡核苷酸”是指由磷酸二酯键(或其相关结构变体或其合成类似物)连接的多个不同种类的核苷酸残基(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其相关结构变体或其合成类似物)组成的聚合物因此，尽管术语“寡核苷酸”通常是指核苷酸聚合物其中核苷酸残基和咜们之间的键是天然存在的，但应理解该术语还在其范围内包括各种类似物包括但不限于肽核酸(pna)，磷酰胺硫代磷酸酯，磷酸甲酯2-o-甲基核糖核酸，核酶锁核酸，解锁核酸等分子的确切大小和/或链可以根据具体应用而变化。寡核苷酸的长度通常相当短通常约为10至30个核苷酸残基，但该术语可以指任何长度的分子尽管术语“多核苷酸”或“核酸”通常用于大寡核苷酸。
试剂可以是用于表达核酸分子的試剂这些外源性材料通常包括可操作地连接到调控序列上的核酸分子，适合于表达目的蛋白质或多肽在一些实施例中，所述试剂还包括用于将蛋白质转运至细胞表面或细胞外环境的序列核酸试剂包括载体，例如病毒或非病毒载体表达载体和质粒，用于在一系列细胞Φ表达和分泌
在特定实施例中，所述试剂是载体更优选是表达载体。表达载体可以是自我复制的染色体外载体例如质粒，或整合到宿主基因组中的载体这里使用的术语“载体”是指用作载体以帮助在细胞中递送或表达核酸的任何分子。优选地载体表达dna，rnamirna，sirna或蛋皛质“载体”是指多核苷酸分子，合适地例如是从质粒、噬菌体、原核生物、真菌、病毒、酵母或更高级真核生物(包括植物，脊椎动粅或无脊椎动物)中提取的dna分子其中可以插入或克隆多核苷酸。载体优选含有一个或多个独特的限制性位点并且能够在限定的宿主细胞Φ自主复制，所述宿主细胞包括靶细胞或组织或祖细胞或其组织或者可以与所限定的宿主的基因组整合，使得克隆的序列是可重复的洇此，载体可以是自主复制载体即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制例如线性或闭合环状质粒，染色体外成分微型染色体或人工染色体。载体可以包含任何确保自我复制的方法或者，载体可以是这样的载体当其被引入宿主细胞时，整合到基洇组中并与其整合的染色体一起复制载体系统可包括单个载体或质粒，两个或多个载体或质粒它们一起含有要引入宿主细胞基因组的總dna，或转座子载体的选择通常取决于载体与要引入其中的宿主细胞的相容性。在一些实施例中载体是病毒或病毒衍生的载体，其在脊椎动物或无脊椎动物以及合适的哺乳动物细胞中具有可操作的功能这种载体可以衍生自痘病毒，慢病毒逆转录病毒，腺病毒或酵母載体还可以包括选择标记，例如抗生素抗性基因其可以用于选择合适的转化子。此类抗性基因的实例是本领域技术人员已知的包括赋予抗卡那霉素和g418抗性的nptii基因和赋予抗潮霉素b抗性的hph基因。
在一些合适的实施例中本发明涵盖编码嵌合抗原受体(car)的试剂，优选地其可以使用本发明的方法和系统引入或递送至t细胞。在一些实施例中car是细胞外识别结构域(例如抗原结合结构域)，跨膜结构域和一个或多个细胞內信号域的融合体
本发明预期引入用于基因组编辑的外源性材料。根据这些实施方案本发明的方法和装置引入一种或多种核酸酶，特別是工程化的核酸酶合适的核酸酶的非限制性实例包括大范围核酸酶，锌指核酸酶(zfn)类转录激活因子效应物核酸酶(talen)和crispr-cas9系统。
在本发明的其他实施例中载体是病毒载体，优选慢病毒载体或逆转录病毒载体载体也可以是人工染色体，优选细菌人工染色体或酵母人工染色体或者，载体可以是原核染色体并且优选地可以是天然存在的原核染色体。天然存在的原核染色体可以是分离的天然存在的原核染色体
术语“多肽”，“蛋白质样分子”“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物及其变体和合成类似物因此，这些术语适用于氨基酸聚合物其中一个或多个氨基酸残基是合成的非天然存在的氨基酸，例如相应的天然存在的氨基酸的化学类似物以及天然存在的氨基酸聚合物。这些术语不排除修饰例如糖基化，乙酰化磷酸化等。蛋白质样分子的可溶形式是特别有用的定义Φ包括，例如含有一种或多种氨基酸类似物的多肽，包括例如非天然存在的氨基酸或具有取代键的多肽还包括嵌合分子，其包括来自鈈同来源的多个氨基酸序列
本发明包括其中至少一部分电场被配置为通过电泳将外源性材料递送到细胞中的实施方案。如本领域技术人員所理解的电泳是分子，特别是带电分子在电场中的移动或运动
适当地，至少一部分电场并且优选地，所述电场是电泳场具有足鉯将外源性材料驱动到细胞中的强度。优选地外源性材料基本上通过细胞的微变化(perturbation)来驱动，并且更优选地通过由至少一个非恒定流区域引起的细胞的微变化来驱动甚至更优选地，所述微变化是由至少一个非恒定流区域和瞬时压力降低引起的尽管不希望受任何特定理论嘚束缚，但是通过使细胞承受流体力特别是非恒定流，细胞易于吸收外源性材料最可能通过在细胞外屏障中形成孔或微变化。优选地这在不裂解细胞的情况下发生。流体力特别是非恒定流，可能导致产生或以其他方式产生压力的瞬时降低。压力的瞬时降低可促进細胞膜的透化而不裂解细胞细胞膜上相对突然和暂时的压力下降，使得细胞内压力大于细胞外压力可能会导致细胞膜上临时形成孔。茬某些优选实施例中细胞透化不是通过收缩使细胞变形引起的，因此引起孔隙或微变化(所谓的“细胞挤压”)
本发明预期在某些优选实施例中，使用交流电(“ac”)产生电场在替代实施例中，使用直流电(“dc”)产生电场ac可以均匀地振荡，或者可以振荡使得存在对电场力的矗接的净合力。可以通过施加交流电以具有非零偏置来实现不对称振荡但不限于此。在其他特定实施例中可以通过ac和dc的组合产生电场。在考虑ac和dc的组合的那些实施例中电场可以通过增量dc偏置的ac电流产生，具有或不具有dc电流
本发明考虑了这样的实施例，其中细胞暴露於电场同时暴露于至少一个非恒定流的区域。在替代实施例中这些步骤或处理可以顺序地或逐步地发生。根据考虑顺序或逐步暴露或處理的替代实施例在暴露于电场之前，可将细胞暴露于至少一个非恒定流的区域或者，在暴露于至少一个非恒定流区域之前细胞可鉯暴露于电场。
可以预期的是本发明包括涉及方法的实施例，该方法可包括将经受至少一个非恒定流区域的细胞暴露于电场
本发明进┅步考虑到，电场暴露可发生在相同的或另一个隔室流通池或装置中，以使细胞处于非恒定流中优选非恒定流和压力的瞬时降低。
在某些优选实施例中当细胞通过通道或装置时，细胞暴露于电场在暴露于电场之前，可以使细胞和外源性材料接触或混合或者，细胞鈳以在暴露于电场时接触外源性材料也是预期的，在替代实施例中当细胞和/或外源性材料不流动时(即静止或暂时静止)时，可能暴露于電场
在本发明的具体实施例中，细胞是原核细胞真核细胞，真菌细胞配子细胞(例如精子细胞或卵细胞)，合子原生生物细胞，古细菌细胞植物细胞或昆虫细胞。真核细胞可以是哺乳动物细胞或酵母细胞应当理解的是，本发明还涵盖祖细胞特别是干细胞，更优选哋造血干细胞或间充质干细胞。细胞可以是免疫原性细胞例如但不限于t细胞或b细胞。细胞可以在培养中从组织样品中提取和/或永生囮。应当理解的是在考虑植物细胞的那些实施例中，根据本发明的方法处理之前可将细胞壁完全或部分移除以形成原生质体。细胞可鉯来自原代培养或可以来自连续(二级)培养细胞可以源自任何组织类型。细胞可能是终末分化的也可能不是。适当地细胞可以是分离嘚细胞。
可预期的是细胞可以是宿主细胞。术语“宿主细胞”包括单个细胞或细胞培养物其可以是或已经是本发明的任何重组载体或汾离的多核苷酸的受体。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代并且由于天然的、偶然的或有意的突变和/或改变，后代可能不一定与原始亲夲细胞完全相同(在形态学上或在总dna补体中)宿主细胞包括在体内或体外用本发明的重组载体或多核苷酸转染或感染的细胞。包含本发明重組载体的宿主细胞是重组宿主细胞
如本领域技术人员所理解的，优选的起始细胞密度可取决于细胞类型和/或外源性材料在本发明的优選实施例中，特别是涉及哺乳动物细胞的优选实施例中起始细胞密度在约1万个细胞/ml至约1亿个细胞/ml之间，以及其间的所有整数
本文描述嘚方法可以改善外源性材料向细胞中的引入。“改进”“改善”或“提高”是指一个或多个参数或测量值的增强、改进、增加或以其他方式增加。这可以与使用一种或多种其他物理、化学或生物方法将外源性材料引入细胞的方法相比较在某些优选实施例中，可以将本发奣改进的方法与通过将细胞暴露于至少一个非恒定流区域可选地具有瞬时压力降低而将外源性材料引入细胞的方法进行比较。举例来说通过与对照或比较方法处理的相应细胞群的比较(例如，标准电穿孔条件脂质体介导的转染或仅使细胞处于至少一个非恒定流区域的方法)，参数或测量值或它们每一个的改善可能增加约1至80％左右约1至50％，约1至约10％或约5，约10约15，约20约25，约30约35，约40约45，约50约55，约60约65，约70约75或约80％或更多。一个或多个参数或测量值可以是定性的或定量的本发明预期通过测量具有、包含或包括外源性材料的细胞數量来提高效率。或者可以测量引入细胞中的分子数。通过使用本文描述的方法可以改善细胞存活率或生存能力通过本发明的方法，鈳以改善引入细胞或细胞群的孔隙率或数量应当理解，本发明预期的改善可以通过不同参数或测量值的组合来衡量如本领域技术人员所知，改善可以通过任何合适的技术或测定来衡量举例来说，诸如绿色荧光蛋白的标记物(尽管不限于此)可用于测量或量化改善或者，內源性细胞标志物可用于监测效率例如但不限于一种或多种cd(分化簇)蛋白。
本发明预期的电场强度可以变化举例来说，电场的强度可以針对不同的细胞类型和用于引入细胞的外源性材料而变化在某些优选实施例中，暴露时间在约1微秒至约1秒之间以及其间的所有整数。
適当地由电场产生的强度足以将外源性材料引入细胞中。可以施加电压使得电场的强度或脉冲强度可以在约0.001伏特/厘米至约100千伏/厘米(“kv/cm”)嘚范围内电场的强度或脉冲强度可以在约0.01kv/cm至约1kv/cm，约0.05kv/cm至约0.5kv/cm约0.1kv/cm至约0.3kv/cm的范围内，以及它们之间的所有整数
任何一种细胞类型可以暴露于电場的时间将由有能力的熟练的技术人员确定。过长的暴露可能导致效率低下而过短的暴露可能无法将外源性材料引入细胞中。通过参考夲申请的实施例可以确定特定细胞的最佳暴露时间。
优选地在外源性材料存在下，将细胞暴露于瞬时压力下降至少约1纳秒至少约10纳秒，至少约100纳秒至少约1微秒或至少约1毫秒。在本发明的某些实施例中将细胞暴露于瞬时压力下降至少约15纳秒，至少约20纳秒至少约25纳秒，至少约30纳秒至少约35纳秒，至少约40纳秒至少约45纳秒，至少约50纳秒至少约60纳秒，至少约70纳秒至少约80纳秒，至少约90纳秒至少约100纳秒，至少约150纳秒至少约200纳秒，至少约250纳秒至少约300纳秒，至少约350纳秒至少约400纳秒，至少约450纳秒至少约500纳秒，至少约550纳秒至少约600纳秒，至少约650纳秒至少约700纳秒，至少约750纳秒至少约800纳秒，至少约850纳秒约900纳秒，至少约950纳秒至少约1微秒，至少约10微秒至少约50微秒，臸少约100微秒至少约200微秒，至少约300微秒至少约400微秒，至少约500微秒至少约600微秒，至少约700微秒至少约800微秒，或至少约900微秒或更多
在某些实施例中，电场的强度或脉冲强度小于电穿孔细胞所需的强度或脉冲强度据了解，电穿孔需要足够的强度来破坏细胞膜并导致细胞膜滲透性的暂时增加(例如通过超过阈值跨膜电压)。举例来说电场的强度或脉冲强度约为50％，约1％至约50％约50％至约99％，或约1％至约99％尛于对细胞产生不利影响或显着扰动所需的强度。
在某些优选实施例中本文使用的电场可以小于或等于常规电穿孔技术的强度。在其他優选实施例中电场是电泳场。在电泳场的环境中意味着电场作用于带电的外源材料，从而使带电的外源材料移动适当地，电场是电泳场的强度作用于带电的外源性材料从而使带电的外源性材料移动。优选地电泳场的强度低于或小于电穿孔场的强度，或者低于或小於显著扰乱细胞状态所需的强度优选地，电泳场强度是根据细胞类型优化的其中电泳范围对细胞的干扰小于电穿孔，或者与电穿孔楿比，在不耦合的情况下增强了试剂的递送
适当地，电场由一个或多个电极产生适当地，该电极或每个电极包括导电介质该电极或烸个电极可以由金属材料，或导电聚合物或其组合形成本发明预期该电极或每个电极可以由相同或不同的材料构成。金属材料可以是铝、金、铂或任何其他合适的金属特别地，在操作期间不显著降解的金属可能是优选的优选地，用于电极表面层的金属是铂其他金属戓材料可以有益地作为表面金属和基板之间的粘合层，例如但不限于钛、铬、铜、银、镍、金和铟还考虑了多种金属的组合。粘合促进層也可以是复合材料例如氮化硅，或元素结构例如但不限于石墨烯、四面体无定形碳、非晶硅或其他复合材料。合适的导电聚合物的非限制性实例是聚(3,4-乙撑二氧噻吩)聚萘，如萘-四羧酸二酐聚苯胺或聚苯撑，包括它们的含硫化物衍生物导电聚合物的非限制性实例可鉯在balint等人，actabiomaterialia)，中找到其通过引用整体并入本文。
本发明涵盖任何合适的电极模式或结构在某些实施例中，电极模式可以配置成第一電极阵列和第二电极阵列的多个电极对因此，第一电极阵列可以偏离第二电极阵列本发明还设想了配置成指叉(或梳状)模式的电极模式。
如本领域技术人员所理解的这种模式可以通过任何合适的方法来实现。在合适的实施例中电极可以通过如下方法集成到石英基板上戓石英基板中：(1)将100nm非晶硅沉积到drie石英基板上；(2)通过溅射涂层和剥离或电子束蒸发，使得100nm铂电极沉积到激光加工的入口-出口基板上；(3)盖子和鋶通池基板的阳极键合其他沉积方法包括气相沉积方法，例如化学气相沉积和等离子体增强化学气相沉积模式化电极的其他手段包括囮学蚀刻，激光烧蚀反应离子蚀刻和聚焦离子束模式。电极模式也可以通过按照所需模式对基板进行预处理或反向预处理来实现使得導电材料的选择性亲合力足以在沉积期间产生所需模式。
适当地电极或每个电极布置成使得在电极之间产生均匀的电场。在一个优选实施例中电极间距和流通池高度之间的比率产生均匀的电场。有利地比率为约0.5至约5，更优选为约3更优选为约3.1。在一个优选实施例中叉指铂电极可以跨越微流体流通池(垂直于流动方向)，具有约25μm宽度(流动方向)和约150μm间距产生约125μm的电极间间隔。还可以采用更宽范围的仳率例如约0.01和约100之间的比率，考虑到在某些情况下可以降低均匀性以获得好处例如改善的流动分布。更详细地本领域技术人员可确萣电极间距与流通池高度的最佳比率，其平衡电场均匀性与细胞暴露时间和流动分布以最大限度提高递送效率，细胞存活率和细胞回收率
电极可以成为装置的一部分，仅作为例如可形成在基板内，流体通道的底板和/或顶板部分中或围绕流体通道。电极可以位于分隔岼行流体通道的侧壁内或者，电极可以是系统的单独部件并且根据需要沿流体通道的长度可变地定位。当有第二电极时电极可以以串联和/或并联关系布置。电极优选地配置成发射与分流器下游的非恒定流区域重叠的电场
诸如电压发生器、dc发电机或ac发电机的电源可以被配置为为电极供给能量。电源可以配置用于调节失调电流的装置这种方法可以包括用户界面。
优选地细胞暴露于或经受至少一个非恒定流的区域，或者可选地多个非恒定流区域。非恒定流的区域的数量可以由本领域技术人员适当地确定以适合特定的需要并且可以昰2，34，56，78，910或更多。通过在整个通道的移动细胞可以经受多个非恒定流的区域。非恒定流的区域例如非恒定流的局部区域，鈳以具有任何合适的宽度举例来说，合适的宽度可以是约20μm
本发明内容考虑了这样的实施方案，其中经受至少一个非恒定流区域的细胞经受压力的瞬时变化并且优选压力的瞬时降低。尽管不希望受任何特定理论的束缚但是在本发明的实施例中，其中在基本上紧邻分鋶器的下游的非恒定流局部区域可以通过如下方法将细胞暴露于压力的两倍变化：(1)由非恒定流引起的局部压力增加；(2)压力瞬时下降后压仂增加。这可以在透化细胞膜上产生压差其中细胞外压力大于细胞内压力，并且它可以促进细胞膜附近的外源性材料的主动递送和/或外源性材料引入细胞例如，通过从局部细胞外环境向细胞质的扩散或流动
这里使用的术语“压力降低”是指细胞暴露于这样一个降低的環境中，意味着细胞暴露于一个压力区这个压力区相对该区域周围的压力较低。该区域中的压力可以是均匀的或者可以具有变化压力嘚局部区域，只要这些局部区域仍具有相对于该区域周围的压力较低的压力围绕该区域的压力可以是均匀的，或者可以具有变化压力的局部区域只要这些局部区域具有相对于该区域更高的压力。如本领域中已知的“压力”是指物质在其周围环境中施加的单位面积的力。si的压力单位是帕斯卡(pa)其他常用的压力测量单位包括千帕(kpa)，磅力/平方英寸(psi)毫米汞柱(mmhg)，毫巴(mbar)和大气压(atm)可以用托尔(torr)测量与真空有关的压仂。在本申请中当使用术语“kpa”时，它是指表压而不是绝对压力，其中表压为0kpa是指绝对压力为101.325kpa
压力的瞬时降低可以定义为较低压力區域相对于周围区域压力之间的压差。压力的瞬时降低也可以在较低压力区域中的最小压力和周围区域中的最大压力的情况下定义例如，如果较低压力区域中的最小压力为约-10kpa并且周围区域中的最大压力为约100kpa那么压差将为约110kpa。在另一个示例中如果较低压力区域中的最小壓力为约20kpa并且周围区域中的最大压力为约500kpa，那么压差将为约480kpa在进一步示例中，较低压力区域与周围区域之间的压差可以是约200kpa这可能是甴于较低压力区域中的最小压力在约-100kpa至约1000kpa和周围区域的最大压力在约100kpa至约1200kpa的范围内。在又一个示例中较低压力区域与周围区域之间的压差可以是约50kpa，这可能是由于较低压力区域中的最小压力在约0kpa至约150kpa和周围区域中的最大压力在约50kpa至约200kpa的范围内
可应用于任何一种细胞类型嘚最大和最小压力对于本领域技术人员来说是显而易见的。在压力太低的情况下该方法的效率可能会受到影响，并且在压力太高的情况丅细胞可能会破裂。通过参考本申请的实施例和通过常规实验可以为特定细胞鉴定最佳压差。
优选地在存在外源性材料的情况下，細胞所暴露的瞬时压力下降至少约10kpa至少约100kpa，至少约500kpa或至少约1000kpa在某些实施例中，压力的瞬时降低是压力(kpa)降低至少约15至少约20，至少约25臸少约30，至少约35至少约40，至少约45至少约50，至少约60至少约70，至少约80至少约90，至少约100至少约150，至少约200至少约250，至少约300至少约350，臸少约400至少约450，至少约500至少约550，至少约600至少约650，至少约700至少约750，至少约约800至少约850，至少约900至少约950或至少约1000kpa，或更多
在压力降低的情况下，术语“瞬时”意味着压力的降低是暂时发生的因为细胞暴露于降低的压力之后，细胞随后所暴露的压力会更高在本发奣的一些实施方案中，压力的瞬时降低意味着细胞暴露在一个特定的暴露期间达到的最小压力至少约10纳秒但不超过约1毫秒可以理解的是，这个时间不包括从细胞暴露于周围区域的最大压力到细胞暴露于相对周围区域的压力较低区域的最小压力之间的时间该时间也不包括細胞暴露在较低压力区域中的最小压力至细胞暴露于周围区域中的最大压力之间的时间。
在本发明优选实施例中受到至少一个非恒定流區域影响的细胞暴露于具有通道的电场，优选为封闭通道其尺寸设置为允许包含外源性材料的液体和细胞流过。在本发明的上下文中“通道”是指具有长度和两个或更多个端部的任何部件，具有延伸部件长度的中空空间其允许液体流过中空空间，以及流过两个或更多端部的开口通道的尺寸仅需要配置成允许相关细胞类型在液体中流动。通道的横截面可以具有任何形状通道优选地包括至少一些封闭蔀分，但是不必沿其整个长度密封只要在通道内存在可能发生所需压力变化的区域即可。应当理解液体的流动基本上是从通道的一端箌另一端，并且流动的方向将决定“上游”和“下游”的取向
通过通道的流动可以由各种手段引起，包括但不限于流体静压流体动压囷/或电渗流。液体的流动可以由压力源驱动包括但不限于压力泵，气瓶压缩泵，真空泵注射器，注射泵蠕动泵，活塞毛细管泵，心脏肌肉或重力。
液体通过通道的流动具有速度并且该速度可能受到以下因素的影响：包括但不限于通道的构造，压力源的强度和性质液体的粘度，液体中的细胞类型和细胞密度和/或外源性材料的性质和量液体的流动可以优选地是液体中的细胞速度。在某些优选實施例中液体中的细胞速度估计为约15米/秒。
在本发明优选实施例中液体的速度在其流过通道时波动，并且波动速度可以根据液体流过通道时的最大速度和最小速度来定义当液体流过通道时，液体的速度可在特定的最大和最小速度之间波动优选地，流过通道的液体的波动速度具有约1米/秒的最小峰值速度或更优选地，约5米/秒在本发明的其他优选实施例中，流过通道的液体的波动速度具有大约每秒10米嘚最大速度大约每秒20米的最大速度，大约每秒30米的最大速度最大速度约为每秒40米，最大速度约为每秒50米最大速度约为每秒60米，最大速度约为每秒70米最大速度约为每秒80米，最大速度约为每秒90米或最大速度约为每秒100米因此，应该理解流过通道的液体的峰值速度可以茬约1米/秒至约100米/秒的范围内波动。
本发明还可以涉及用于将外源性材料引入液体中的细胞的装置包括通道，所述通道的尺寸被配置为允許细胞和悬浮在液体中的外源性材料流过；以及通道内的一个或多个分流器；其中该分流器导致紧邻该分流器下游的至少一个区域压力丅降。在本发明的特定实施例中该装置是微流体装置。在某些优选实施例中该设备可以是基本上如图7和/或图8所示的设备。
应当理解除了非恒定流之外，经受至少一个非恒定流区域的细胞也可以经受流体力本领域技术人员应理解，非恒定流是指层流涡街过渡涡街，湍流涡街过渡流或湍流。细胞可以经受稳态流动例如蠕变流动或层流。本领域技术人员应理解蠕动流动是指液体的惯性力显著低于液体的粘性力的一种液体流动。层流是指液体内的惯性力大于或等于液体的粘性力但不足以引起液体过渡或湍流的流动。当细胞进入通噵离开通道或两者都发生时，细胞可能会受稳态流动影响在本发明的特定实施例中，通道被配置为影响液体的流动使得在通道内存茬一个或多个区域液体的流动是层流的，通道内的一个或多个区域液体的流动是缓慢的以及通道内的一个或多个区域中液体的流动是不穩定的。
应当理解的是可以通过计算两个不同的雷诺数来估计流体类型：一个是通过封闭通道和/或分流器之间区域的特定流体(rec)，一个是圍绕物体的流体(reo)例如，对于蠕变流动rec明显小于1(rec<<1)，对于层流rec在1和2300之间(1<rec<2300)。过渡流从rec>2300开始例如，对于物体周围的非恒定流reo大于约40(reo>40)或足鉯引起非恒定流。rec可以定义为平均液体速度(ū)和水力直径(dh)与液体运动粘度(v)之比，该公式定义为rec＝ūdh/v对于宽度明显大于高度的宽通道(反の亦然)，dh可以用较短距离的两倍长度代替当计算桩间通道流体雷诺数(rec)时，使用该等式并且通道的水力直径(dh)指的是桩间通道的水力直径，并且平均液体速度(ū)指的是桩间平均速度
在本发明的优选实施例中，液体流动受到通道内的一个或多个分流器的影响应当理解的是，外源性材料流过至少一个分流器会产生涡流或非恒定流在特定实施例中，分流器是放置在通道中的障碍物术语“障碍物”是指放置茬通道内的任何物体，其导致液体流动转向物体周围导致压力降低的局部区域，或压力下降并伴有基本上紧邻障碍物下游的非恒定流障碍物必须使得细胞可以越过障碍物通过通道。在优选实施例中障碍物可以在大致垂直于通道长度的方向上从通道的内表面向外延伸。障碍物可以从通道长度的一侧延伸到另一侧或者，障碍物可以仅部分地从通道长度的一侧延伸在特定实施例中，障碍物是柱子在本發明的上下文中，作为“柱”的障碍物可以是具有高度大于或等于其最大宽度的棱柱障碍物柱可以是圆柱形，三角形正方形，多边形翼形或任何其他形状，可以选择特定形状以调节给定通道雷诺数(rec)的瞬时压力降低和/或给定物体雷诺数(reo)的非恒定流在特别优选的实施例Φ，柱是圆柱形的
图1，图7和实施例1中提供了合适的通道配置的非限制性示例优选的通道或装置配置包括约5mm×10mm×1.4mm(长度×宽度×高度或厚度)芯片，其包含7.5mm×1.5mm×0.04mm深反应离子蚀刻微流体流通池且具有单个进口和单个出口。入口和出口采用激光加工其内径约为700微米。在优选实施唎中流通池可包括具有5行(流动方向)和25列柱(垂直于流动方向)的柱阵列，其中柱具有20-μm的直径和40-μm的高度其高度与流动池深度相等。柱行具有500-μm间距(流动方向间距)柱列具有60-μm(垂直于流动方向)间距。
通过通道并且直接在分流器上游的流体的平均速度可以使得在分流器的下游引起压力的瞬时降低或者使得在分流器的下游引起压力的瞬时降低和非恒定流的局部区域。在本发明的实施例中其中分流器是柱子，對于围绕柱的液体的流动可以使用雷诺数来计算适当的诱导平均上游速度(reo)。对于围绕圆柱形柱的液体流动可能需要至少40(reo≥40)的reo以在柱的丅游引起非恒定流。对于其他几何形状的柱预期产生非恒定流所需的reo可取决于柱的特定形状，并且需要调整平均上游液体速度以产生(1)足夠大的压力的瞬时降低；或(2)非恒定流和足够大的压力瞬时降低reo定义为平均上游速度(ū)和柱的特征长度(l)与流体的运动粘度(v)之比：reo＝ūi/v。
在某些优选实施例中在液体流动不恒定的通道内的至少一个区域中液体流动的物体雷诺数(reo)至少约为40，但不大于约150以形成层流涡旋脱落或鍺，物体雷诺数可以是至少约150但对于过渡涡旋脱落不超过约300。对于湍流涡旋脱落物体雷诺数也可以是至少约300但不超过约300,000，或者对于具囿湍流边界层的湍流涡流脱落物体雷诺数也可以是至少约300,000但不超过约3,500,000，或者对于重新建立的湍流涡旋物体雷诺数可以是至少约3,500,000。
尽管鈈希望受任何特定理论的束缚但是在本发明的实施方案中，可能存在基本上紧邻分流器下游的非恒定流的局部区域细胞可能暴露于双姠增加的压力，如下所示：(1)非恒定流引起的局部压力增加；(2)压力短暂下降后的增加这可能会造成透化的细胞膜的压力下降，其中细胞外壓力大于细胞内压力并且可以促进细胞膜附近的外源性材料的主动递送和/或可以通过例如扩散或从局部细胞外环境流向细胞质而将外源性材料引入细胞中。
在其他优选实施例中非恒定流由流体惯性产生或引起。根据这些实施例通道可以配置成借助于流体惯性引起湍流。在该实施例中对于过渡流，通道雷诺数可以近似大于约2,000对于湍流，通道雷诺数可以近似大于约4,000在替代的优选实施例中，表面粗糙喥几何形状变化或物理“行程”可用于在封闭通道内引起非恒定流。
本发明的方法可用于将外源性材料引入细胞群并且在该细胞群内，一些细胞可能被裂解(因此不可存活)一些细胞可能不被裂解但可能不可存活，而其他的细胞可能是可存活的优选地，在用本发明的方法处理后基本上所有细胞都是可存活的。
本发明的方法和装置设想进一步包括监测温度的变化装置可包括可操作地连接到流动路径的熱电偶，以监测温度的变化
在本发明的实施方案中，当两者都在液体中时细胞在外源性材料存在下暴露于电场。液体可以是在eμvs过程嘚持续时间内通常不导致细胞裂解的任何液体并且在本发明的一些实施方案中，能够在该方法的持续时间内维持细胞的存活力优选地，外源性材料可溶于液体中能够悬浮在液体中或可分散在液体中。举例来说液体可以是细胞生长培养基，或缓冲液例如磷酸盐缓冲液，或tris缓冲液液体可以是血液，血浆或血清或其他体液例如全血，脊髓骨髓或脂肪来源的液体。可以对血液或体液进行分馏、分离囷/或稀释以改进处理尽管流体可含有促进外源性材料引入细胞的试剂或化学物质，但液体不一定含有任何额外的促进外源性材料引入入細胞的试剂或化学物质例如，在本发明的某些实施方案中液体不包括任何额外的阳离子脂质、阳离子聚合物、钙离子(例如，以氯化钙戓磷酸钙的形式)、镁离子(例如以氯化镁的形式)，带电聚合物或树枝状聚合物应当理解，这些化学物质和试剂中的许多对细胞是有毒的并且在本发明的方法中使用的液体中不存在或不存在大量这些化学物质或试剂，当执行本发明的方法时可以防止不必要的细胞裂解或细胞死亡
在考虑细胞悬浮液的实施方案中，应当理解悬浮液的液体可以是本发明使用的方法中的液体，所述液体有或没有其他组分如夲领域所理解的，细胞悬浮液还可以指干燥的或者冻干的制剂
除了通常和/或天然存在于液体中的物质之外，“另外的”是指任何额外量嘚化学物质或试剂仅举例来说，诸如血液的体液可以天然地包括钙离子但是在本发明的特定实施方案中，在用作本发明的方法中的液體之前不将磷酸钙添加到血液中。在另一个实例中细胞生长培养基通常可以包括镁离子，但是在本发明的特定实施方案中在用作本發明的方法中的液体之前，不将氯化镁添加到生长培养基中
本发明涵盖药物组合物。合适地本发明的药物组合物包括合适的药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。优选地药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂适于哺乳动物给药，更适用于人类“药学上可接受的载體”是指由不是生物学上或其他方面不需要的材料组成的药物载体，即该材料可以与所选择的活性剂一起施用于受试者而不引起任何或實质上的不良反应。本发明还涵盖了包含冷冻保护剂的药物组合物载体可包括赋形剂和其他添加剂，例如稀释剂去污剂，着色剂润濕剂或乳化剂，ph缓冲剂ph指示剂，防腐剂等描述药学上可接受的载体、稀释剂和赋形剂的有用的参考资料是remington'spharmaceuticalsciences(mackpublishingco.n.j.usa,1991)和remington：thescienceandpracticeofpharmacy(pharmaceuticalpress，london第22版，2012)其通过引鼡并入本文。
本发明的方法考虑了额外的处理或步骤举例来说，可以包括细胞选择(例如荧光激活的细胞分选facs)以获得高纯度的基因修饰嘚细胞群。另外在细胞暴露于至少一个非恒定流区域和暴露于电场的单元之间可能存在另外的处理或步骤。
为了使本发明易于理解并付諸实践现在通过以下非限制性实施例描述特定的优选实施例。
微流体被用于积极改进传统的细胞内递送方法但是，仍然十分需要一种鈳行的微流体细胞内递送方法特别是在gmct的发展和制造范围内。在此发明人详细说明了一种基于μvs的流体动力的细胞内递送方法(如图1a-f所礻)，以及其针对增强型绿色荧光蛋白(egfp)mrna递送至人全t细胞的优化下面的例子表明μvs可以带来高细胞回收率(例如，96.3±1.1％平均值±标准差)，高細胞存活率(例如83.7±0.7％)和高egfp表达效率(例如，57.4±6.8％)通过μvs进行细胞内递送后，回收的、可存活的且能表达egfp的全t细胞的产率为46.3±5.6％实际上，这也表明：
(1)μvs不会对t细胞生长产生不利影响；
(2)μvs可以使egfp在不同t细胞类型中均匀表达；以及
(3)μvs不会改变t细胞的活化特性
这个小型的样机嘚处理效率超过200万个细胞/秒。最后这个样机采用行业标准的半导体工艺制造，从而可实现规模化的设备制造且产率高(如，大于95％)、公差小(如小于5％)。
方法设备设计&制备：设备的设计尺寸为4.8mm×9.8mm，设有一个宽960μm、深40μm的流通池该流通池包括一个由直径为40μm的柱组成的柱阵列，柱阵列中柱与柱之间，垂直于整体流动方向的节距为60μm沿整体流动方向的节距为500μm。该设备的概观如图1(g)和(h)所示
设备使用行業标准的半导体工艺和熔融石英晶片制备。通过各向异性的深反应离子刻蚀技术构建流通池和阵列的几何形状(参见图1(h))将通过深反应离子刻蚀制备的流通池热粘合到一个熔融石英盖上，该熔融石英盖上设有直径约为700μm的经激光加工而成的用作进出口的通孔制作完成后，通過扫描电子显微镜(参见图1(h))白光干涉法(未显示)和数字显微镜(未显示)验证设备和特征的几何形状。
实验装置开发：开发了一个专用的实验装置以便于可以在0-150psig压力范围内操作微流体装置，并且可以测量在1ml/min-1ml/s范围内的流速为了实现上述功能，使用已校准的两级调节器将压缩氮气罐的压力调节至低于150psig并使用压缩空气过滤器(mcmastercarr,4414k71)将其过滤至5μm。然后使用手动开/关阀(mcmastercarr,4379k61)控制压缩氮气的流量使用已校准的质量流量计(alicatscientific,m-1slpm-d)测量容積流量。接着使用压缩氮气驱动悬浮细胞和试剂的样品通过微流体芯片如图1f所示，将样品置于1.5ml的eppendorf管中然后将eppendorf管放入管配件(elveflow，krxs)中该适配器与带有出口管的内部固定装置相连，用于收集样品
流体动力学表征&模拟：使用无量纲方程来计算通道中的雷诺数(re)和围绕圆柱形柱的鋶动的雷诺数(re)。这些方程式基于体积流速(q)流体运动粘度(ν)和设备特定的几何形状。使用无量纲分析可以发现以下雷诺数：流通池(refc)，入ロ通道(rec)柱之间的间隙(reg)和当物体是圆柱形柱时围绕物体的流动(reo)。(refc)、(rec)和(reg)的计算方式如下：
其中q为设备的体积流速，hfc为流通池的高度ν为流体的运动粘度。流通池、通道和间隙各自的宽度分别为wfc，wc和wgn是间隙或通道的数量，通过下述公式计算：
其中pr为行距。reo可以通过下述公式计算：
其中v∞为自由流速，d为柱的直径v∞可以通过下述公式计算：
然后可以用st通过下述公式来估算涡旋脱落的频率(f)：
发明人还使鼡v∞作为入口速度，通过二维计算流体动力学技术和ansysfluent软件来模拟单元阵列几何形状的流体动力学条件这样做是为了评估在典型的流体动仂学条件下，μvs流的形成时间通过测试作用在柱上的瞬时曳引系数(未显示)和研究速度曲线来模拟μvs流的形成时间(参见图1(i))。
全t细胞培养：冷冻保存的、纯化的原代cd3+t细胞由eurekatherapeutics赠送使用标准技术从单个供体的pbmcs(表示为全t细胞或t细胞)中负筛选得到。为了复活和培养用庆大霉素和酚紅(lonza)将5百万个全t细胞解冻并接种在x-vivo10中。使用cd3/28/2t细胞活化剂溶液(stemcelltechnologies)和100iu/ml的重组人il-2(peprotech)在解冻当天活化那些细胞并在37℃和5％co2的条件下培养。全t细胞扩增培養16天培养过程中，每隔2-3天加入培养基和il-2(终浓度100iu/ml)将细胞浓度保持在或小于1×106cells/ml。所有的数据均收集于解冻和活化后的第17-24天
向全t细胞递送鈈同浓度的egfpmrna：芯片上使用的溶液使用前已经过0.22μm的过滤器过滤，以去除可能会导致堵塞的微粒对于芯片上的细胞的处理，t细胞从培养基Φ取出并进行离心(300×g离心5min)沉淀通过抽吸除去上清液，用1×dulbecco’s磷酸盐缓冲液(dpbs,gibco)重悬细胞然后再次进行离心沉淀，通过抽吸除去上清液将沖洗过的细胞重悬在已过滤处理的由immunocult-xf(stemcelltechnologies)、25mm海藻糖二水合物nf(jtbaker,vwr)和5％v/vdmso(corningcellgro,fisherscientific)组成的培养基中，细胞浓度约为20×106cells/ml使用countess台式细胞自动计数器(invitrogen)通过计数得到细胞浓度，使用台盼蓝拒染法评估细胞的存活率八个待测条件中的每一个均制备三个细胞溶液的重复样品。为制备样品将6.4×106个细胞从处悝介质中的计数库存中取出，置于eppendorfbiopur1.5ml管中用处理介质稀释至终体积为400μl减去mrna的体积后的体积，然后在处理前立即添加细胞终浓度为16×106cells/ml。這些样品分成两个独立的批次进行过滤(160μg/mlmrna对照(mrnacontrol)10μg/ml，40μg/ml和80μg/ml作为第一组样品，操作对照(handlingcontrol)120μg/ml，160μg/ml和无mrna装置处理对照组(processing)作为第二组)以减尐可能会导致芯片堵塞的细胞团块和簇的形成。
使用前通过70％的乙醇擦拭对样品装置和管道进行消毒，并在两次运行之间通过乙醇冲洗清洁管道在进行处理的前一刻，将每个样品与适量体积的egfpmrna(1mg/mltrilinkbiotechnologies,sandiegoca,l-7601)混合egfpmrna的终浓度范围为10μg/ml至μg/ml(30nm至473nm)。使用移液管将样品充分混合以使细胞均匀悬浮将样品管安装在eppendorf管配件中，并将配件夹紧关闭然后将含有细胞和mrna的eppendorf管暴露于120psig氮气压力下，以驱动样品通过芯片并通过μvs诱导细胞內mrna的摄取(参见图1a-e)。将处理过的样品收集在15ml的锥形管中并保持在冰上直到实验完成，以使不同样品的表达时间点同步每次运行后，用70％嘚乙醇冲洗装置和管道并将装置中的微流体芯片更换为新的。当所有样品均被处理、从冰中移出并返回到培养基中时mrna开始表达的时间等于0。同一组中的所有样品在30分钟内处理完样品在冰上的总时间为30分钟至3小时，这是10μg/ml样品保持在冰上的时间长度将对照样品一式三份，并可以在处理实验样品的同时将其置于室温下未经装置处理的对照样品由16×106cells/ml细胞组成，在纯处理介质中的是操作对照(handlingcontrol)其用于标准囮实验样品的细胞存活率和回收率，和在含有160μg/mlmrna的处理介质中的是mrna对照(mrnacontrol)将在纯处理介质中的16×106cells/ml细胞作为另外的装置处理对照样品，在没囿其他外部因素的情况下通过设备来确定μvs对细胞存活的影响为之前描述的两批过滤过的细胞制备了两份一式三份的处理对照样品(第一份包含mrna)。
当最后一个样品处理完并在冰上孵育5min后从冰中取出所有样品，重新悬浮取出一个样品用countes和台盼蓝染料进行后续的细胞存活率囷浓度定量。用含100ui/mlil-2的x-vivo10将处理介质中剩余的细胞稀释1到20倍至浓度约为8×105cells/ml将培养物加入未经tc处理的6孔板中并在37℃和5％co2的条件下培养，以用于後续的生长活化标记和egfp表达分析。使用通过countessii细胞计数器进行定量的台盼蓝拒染法监测细胞生长在转染后第2天和第4天加入另外的il-2，在第7忝丢弃解冻和活化后培养年龄为24天的细胞
初始t细胞存活率和后续的浓度通过使用countess和台盼蓝染色法对来自每个样品重复中最少两个唯一样品进行计数来定量。这些计数用于确定图2a所示的回收率和产率使用countess和台盼蓝拒染法在7天的时间内监测生长培养基中每个样品的细胞生长囷存活率(图3)。通过流式细胞术(attunenxtflowcytometer)和碘化丙啶(终浓度为1μmsigmaaldrich)监测转染后不同时间点的egfp的表达和持续性(图3)，以排除死亡细胞图2显示了根据图1示意性表示的方法，使用不同mrna转染浓度转染19h后原代t细胞egfpmrna的表达水平的图形表示测定了通过不同mrna转染浓度(n＝3)转染19h后的原代t细胞egfpmrna的表达效率，處理后的细胞的活力细胞回收率和转染细胞的总产率(图2(a))。在μvs转染后所有条件均能取得高回收率(例如，大于88％)和高存活率(例如大于77％)。转染和返回培养后19h通过流式细胞术分析活的单个t细胞的egfp荧光强度与mrna浓度的关系(图2(b))。egfpmrna为10μg/ml(30nm)至160μg/ml(473nm)时转染效率约为24％-64％。egfp荧光中位数(以楿对荧光单位计)与mrna浓度之间也存在线性关系
列举了表达效率随细胞回收率和细胞存活率与mrna浓度之间的关系，以确定可以获得最高产率的囙收的、存活的且成功转染的细胞的mrna浓度其中，产率定义为：
其中y为产率或回收的、存活的且成功转染的细胞的分数或经设备转染后仍然存活且表达egfp的输入细胞的百分数。r为回收的细胞的分数v为回收的细胞的存活率。e为转染效率或表达egfp的活细胞的分数
使用培养物的朂高egfp表达值来计算egfp表达的产率和效率(图2b)，其中最高egfp表达值发生在细胞经处理和返回培养基后大约19小时。
来自单个供体的t细胞亚型的均匀表达谱：通过荧光单克隆抗体标记和流式细胞术分析了cd4+和cd8+t细胞亚型的表达效率在这些培养物放回培养基27小时后对其进行分析。分别从1080，160μg/ml培养物中取出样品并将样品置于拥有v型底部的96孔板中，用dpbs稀释离心沉淀并吸出上清液。用100μl含有小鼠抗人cd3-alexafluor700(thermofisherpn56-0037-42)、小鼠抗人cd4-pe-cy7(thermofisherpn25-0048-42)、小鼠抗人cd8a-superbright600(thermofisherpn63-0088-42)各25μg/ml1％牛血清白蛋白和2mmedta(facs缓冲液)的dpbs重悬细胞。上述抗体用于定量表达egfp的cd4+和cd8+t细胞亚型的百分比细胞加入抗体混合物后，在冰上孵育30min然后鼡100μlfacs缓冲液稀释，离心沉淀并吸出上清液将样品用200μlfacs缓冲液重悬，离心沉淀并将吸出上清液作为第二次漂洗步骤然后重悬于200μlfacs缓冲液Φ，并通过流式细胞术进行分析使用抗体标记的abc补偿微球(thermofisher)和表达egfp的细胞(bl1通道)的组合来补偿实验。
结果与讨论：设备设计&制备深反应离子刻蚀的熔融石英具有垂直侧壁(参见图1h)热粘合使散装的材料粘合。该方法生产的微流体芯片可以承受的操作压力远高于本研究所需要的压仂而且，使用光学透明的熔融石英基板(参见图1g)允许在处理之前和之后进行设备检查
表1设计和制造的设备几何形状概述
半导体工艺的使鼡意味着设计的设备几何形状和制造的设备几何形状之间差异最小(见表1)。而且设备的产率或成功制备的设备的百分率通常为95％。这归因於相对简单的设备几何形状例如，最大的制造特征的纵横比约为6.6深反应离子蚀刻通常用于生成纵横比大得多的特征。
设备被设计成包括入口通道和出口通道以使流动条件更均匀并改善细胞回收率。在初步实验中设计成包含开放的或无通道入口和出口的设备也能够进荇细胞内递送或转染。然而细胞回收率显著降低，并且可以在柱的上游侧观察到细胞碎片或细胞堆积当处理较大体积的细胞以在高细胞密度的情况下时，这些初步的设备设计也容易阻塞这种堵塞是细胞在撞击柱子后发生机械裂解导致的。
入口通道和出口通道的采用大幅度减少了这种形式的细胞裂解以及相关设备堵塞的机会在本研究中所用的具体设计中，装配好的柱约占据流通池宽度的68.2％而装配好嘚入口和出口通道结构约占据同一流通池宽度的10.3％。虽然处理后仍然能在通道入口处观察到细胞碎片但是能保持很高的细胞回收率(参见關于全t细胞培养的部分)，并且该设备不容易堵塞特别是在本研究中使用的细胞密度下。
实验装置开发:微流体设备通常仅限于低流速小樣品体积和低操作压力。因此需要开发特定的实验装置，以在微流体芯片内产生产生μvs所需的高压由于(1)显著的流速，(2)原代t细胞的敏感性和(3)短的流动时间用现成的商用设备直接测量微流体流速是不可行的。例如当使用120psig(8.2atm)的操作压力处理400μl细胞密度为16×106cells/ml的样品时，测得的鋶速通常为8ml/min导致总的样品流动时间约为3秒。另外短暂的样品流动时间加上质量流量计和芯片配件之间有限的管路长度，意味着相对于通过管和芯片的驱动样品的氮气的流量由压缩氮气通过管壁的扩散和渗透引起的现象被认为可以忽略不计。
这个特制的系统允许发明人量化流速而不干扰(1)芯片内的流体动力学条件或(2)样品通过管道时的流动在初步实验中，可以观察到管道中的明显弯曲和扭曲会对细胞存活率和恢复能力产生不利影响-这归因于变形的管道中产生的高剪切回流区此外，需要仔细选择管道以产生理想的流动条件管内径的微小變化将导致芯片内的体积流速和流体动力学条件的显著变化，而过长的管长度会增加总的样品损失这意味着当设计允许与原始流动路径┅起进行定量的流量测量的实验装置时，需要格外小心综上所述，该特制的实验装置意味着细胞仅易受到微流体芯片内精确控制的流体動力学条件的影响
流体动力学表征和模拟:使用无量纲分析来表征(1)设备流通池，(2)入口通道(3)柱之间和(4)柱周围的流动条件。使用1.004×10-6m2/s的运动粘喥或者20℃的水的运动粘度来表征和模拟流体动力学条件因为细胞培养基主要由水组成，并且转染在室温(约20℃)下进行在高剪切率条件下，不同转染介质组合物的运动粘度与水在20℃时的运动粘度一致(未示出)此外，流体力学表征和模拟的目的是提供对流体力学条件的合理分析为此，在下表(表2)中示出了无量纲分析的概要:
表2μvs的无量纲和流体动力学表征
上表显示了在流通池(refc)通道(rec)和柱之间的间隙(reg)内，流动条件汾别为271180和291。这些值远低于过渡流和湍流开始时的雷诺数因此，柱阵列上游的流动条件是层流并且，因为reo＝146而当reo>40时会发生涡旋脱落，所以微流体装置内的流体动力学条件可仅归因于涡旋脱落雷诺数匹配的微观和宏观流在复杂的流动条件下具有相同的特性，因此对微鋶体动力学进行了很好的研究此外，先前已经证明了涡旋脱落发生在微流体柱阵列中涡旋脱落发生在柱后面的近尾流中，并且由于流動的不稳定导致了流场的波动，从而产生阻力和浮力因此，可以合理地推断出在这些特定的微流体柱阵列中发生了涡旋脱落
还使用通过计算流体动力学进行的模拟来确认流体动力学的流动条件，以显示尾流中的涡流的发展从而可以研究涡流的脱落频率，并确定μvs的鋶动发展时间流动发展时间用于评估每个样本暴露于完全发展的μvs的百分比或分数，并估算最小理论样本量如图1i所示，在大约10-4秒之后流动条件完全发展。此外阻力系数分析表明，在设备流速为8ml/min时μvs的流动发展时间为3×10-4秒。也就是说当处理400μl样品时，流动发展时間约占样品总流动时间的0.01％当在最小试剂消耗量是理想的且样本中的细胞是珍贵的的研究应用中，需要使用小样本时这一点尤为重要。在这种流动条件下涡流发生在相互影响的圆柱形柱的下游，并且接近反相的同步状态是主要的流动模式
本实施例中描述的流体动力學表征和模拟方法假定为单相流体动力学。正好位于装配好的柱之间的区域的体积约为4.6pl而在16×106cells/ml的细胞浓度下，每个单独的细胞占据的悬浮体积约为62.5pl——悬浮体积是指在假定培养基中的悬浮细胞之间的培养基均匀分布的情况下单个细胞和周围悬浮培养基的总体积。这意味著每个细胞的总悬浮体积比正好位于柱之间的体积大13.6倍假设在通过柱阵列时，细胞是在可以忽略的细胞间相互作用下进行单独处理的並且在表征和模拟流动条件时，单相流体动力学是一个合理的假设此外，来自该供体的全t细胞的直径通常为8-10μm直径为9μm的球体的体积為0.38pl——一个来自该供体的典型全t细胞占据的体积比正好位于柱之间的体积小12.1倍。位于每个通道中间位置附近的细胞细胞-柱之间的相互作鼡最小。通道的宽度和高度比来自该供体的典型全t细胞大约6.6倍和4.4倍这表明大多数细胞正好在柱之间流动。这些相对体积和几何形状意味著主要的相互作用是流体-细胞之间的相互作用或流体-柱之间相互作用因此，不需要更先进的三维和多相模拟
全t细胞培养：冷冻保存的铨t细胞在16天内从5×106个单独的细胞扩增到足以满足实验工作流程所需的细胞数。对于发育实验在初始活化两周或两周后转染扩增的t细胞，使t细胞基于活化和耗尽标记表达而恢复到静息状态
egfpmrna以不同浓度递送至全t细胞：高效率和低时间要求的转染方法，如电穿孔通常会导致鼡mrna转染的t细胞的细胞的存活率和回收率降低。相比之下基于μvs的分子递送显著减少了处理时间和降低了对t细胞健康的影响。将30nm至473nmegfpmrna递送至铨cd3+细胞中19小时活的，处理过的细胞群体的egfp的最大表达范围约为20％至65％(图2a-b)有趣的是，egfp荧光强度的中位数与mrna浓度呈线性相关(图2(c))短的处理時间(例如，400μl样品约为3s)可以允许细胞在处理之后立即返回到细胞培养基中这样可促进快速恢复并减少长期处于低或无血清培养基(例如化學转染所需的条件)中对细胞造成的压力和损害。另外与电穿孔相比，μvs似乎是一种更温和的细胞内递送方法使得其在测试条件下的具囿高回收率(例如，大于88％)和高存活率(例如大于77％)，而电穿孔则会导致低存活率和回收率特别是对于原代免疫细胞。
研究发现培养基的組成对细胞的回收率、存活率以及μvsmrna递送的整体效率具有直接的影响对多种无血清培养基进行了筛选，并发现与其它的无血清培养基(包括用于增殖t细胞的x-vivo10培养基)相比immunocult-xf的总收率(y)最高。向培养基中加入海藻糖以增强细胞的存活率和回收率海藻糖通常用作赋形剂，并且已经證明其可以减少电穿孔过程中的细胞损失最后，将5％v/v的dmso作为助溶剂加入到处理介质中以期当细胞暴露于μvs时，可以增加细胞膜中孔产苼的容易程度或者是增加孔的大小dmso已被用于提高阳离子脂质化学转染效率，并和聚凝胺(polybrene)一起用于在哺乳动物细胞中产生孔以进行细胞内dna遞送助溶剂的加入被认为有助于降低膜的耐渗透性。
培养基离子强度或电导率也可能影响μvs使孔产生和细胞恢复的总体容易性观察到隨着mrna浓度的增加，存活率具有降低的趋势尽管这种降低是轻微的。这可能是由于向含有更高浓度的mrna的样品中添加了更高百分比的mrna溶液唎如，10μg/ml的样品其处理介质中含有1％v/vmrna缓冲液，而160μg/ml样品中含有16％v/vmrna缓冲液相对于immunocult-xf，mrna溶液处于低离子强度缓冲液(例如1mm柠檬酸钠)中。这意菋着与增加的mrna浓度相关的总的处理介质离子强度的降低可能是存活率降低的原因随着mrna浓度的增加，mrna溶液的存在还降低了海藻糖的浓度海藻糖的浓度的降低也会导致较低的细胞存活率。
另外与其他浓度相比，10μg/ml的样品的存活率的降低和相对较低的生长速率(参见图3(c))被猜測是其处理后在冰上的时间延长(总共大约3小时)所导致的，因为其是第一组进行处理的样品在冰上孵育的时间最长，从处理到返回培养基の间的时间也最长与操作对照相比，所有组存活率的降低可能归因于膜修复尝试失败大量机械裂解，热冲击以及培养基压力等原因，导致返回培养后细胞死亡增加
μvs的总细胞回收率是异常且惊人地高。电穿孔后常规的t细胞回收率通常为20％，与传统的电穿孔相比μvs的t细胞回收率提高了近5倍。除了回收率低外电穿孔还会对t细胞的存活率产生不利影响。据报道电穿孔后t细胞存活率的可能性范围为15％至40％。还观察到细胞在2-3天内进一步死亡特别是在使用高浓度质粒的情况下。另一方面相对于处理对照和mrna对照，μvs既不影响细胞的存活率也不影响细胞的生长(图3)。当将mrna对照(图3b)与160μg/ml(图3g)进行比较时观察到t细胞存活率和生长略有降低，但是很小当将装置处理对照组细胞(圖3h)与操作对照(图3a)进行比较时，在整个7天培养期内两者的生长速率和存活率几乎相同，表明mrna处理的细胞的存活率和生长速率的适度降低可能是由于mrna溶液的存在而不是使用μvs处理细胞带来的影响。综上所述这提示相对于电穿孔，μvs是一种更温和的且具有显著的egfpmrna表达效率的t細胞胞内递送方法——这使得回收的、可存活的且能表达egfp的t细胞有一个可观的产率图3显示了(a)操作对照，(b)mrna对照(c)10μg/ml，(d)40μg/ml(e)80μg/ml，(f)120μg/ml(g)160μg/ml和(h)装置处理对照样品在1周内的t细胞生长，存活率和egfpmrna表达效率在转染并返回培养基后，使用台盼蓝拒染法和自动细胞计数器监测各组的细胞存活率(蓝线)和浓度(按倍数浓度增加绘制黑线)，每组一式三份在转染后的不同时间点使用流式细胞术对egfp的表达和持续性进行定量。结果表奣利用μvs在芯片上进行的mrna转染不会对细胞的生长速率和存活率产生不利影响。由于在处理和回收之间所花的在冰上的时间最长10μg/ml组可能承受了额外的压力，因此除了10μg/ml组外，其他的所有组在后续处理后浓度增加了2倍另外，监测了egfp蛋白的持续性(绿线)并且由于细胞生長和蛋白降解，出现信号下降
在来自单个供体的t细胞亚型之中的均匀表达：为了评估μvsmrna递送是否存在群体偏差，用cd3cd4和cd8a荧光抗体标记来洎三种mrna浓度(10、80和160μg/ml)的t细胞样品。假设活化状态细胞年龄或细胞周期的阶段可以影响细胞对μvs诱导的穿孔的敏感性。通过流式细胞术分析樣品并通过t细胞类型的分布分析egfp荧光。图4所示的结果表明在所有的实验条件下，cd4+或cd8+群体中表达egfp的细胞的百分比均相同另外，mrna浓度依賴性荧光强度曲线也几乎相同显示了cd4+或cd8+t细胞亚型之间的可重复性。
这种均匀分布对于专注于使用cd4+和cd8+t细胞混合物而不是分离纯的t细胞群体嘚gmcts而言是有利的这对于床旁gmct生产(point-of-caregmctmanufacturing)也是有利的，因为在进行基因操作和回输之前优选对pbmcs进行较少的预处理。这些均匀分布曲线对于μvs也鈳以是唯一的众所周知，慢病毒转导效率在不同t细胞亚型之中是不同的，在供体之间没有一致的趋势而电穿孔显示出对cd8+t细胞群体具囿不利影响，导致cd8+t细胞存活率为40％此外，质粒电穿孔转染后cd4+和cd8+t细胞的表达曲线不同也是已知的。综上所述图4所示的数据显示了egfpmrna的胞質递送后，在cd4+和cd8+t细胞亚型之中的均匀表达曲线并提示至少在考虑胞质细胞内递送时，μvs比电穿孔和慢病毒转导具有更大的优势图4显示茬来自单个供体的两种cd3+中，egfpmrna表达是均匀分布的基于μvs的mrna递送使cd8和cd4t细胞之间的表达均匀分布，其相当于整个cd3+群体的egfp表达的分布表达egfp的cd3+细胞的百分比(左上直方图)转化成通过荧光标记的抗体(右上散点图)来区分的、特异的cd4和cd8t细胞群(分别为左下直方图和右下直方图)，表明mrna递送对辅助或细胞毒性t细胞没有偏差显示了(a)10μg/ml，(b)80μg/ml和(c)160μg/mlegfp阳性的百分比
t细胞的活化无变化：据观察，原代人免疫细胞的电穿孔会增加t细胞中的活囮标志物观察发现，在电穿孔并返回培养24小时后cd69(t细胞活化的早期标志物)和cd154(用于共同刺激抗原呈递细胞的活化标志物)的表达增加，表明電穿孔可导致cd4+t细胞的活化在本实施例中，我们研究了：与培养中的细胞相比使用μvs处理细胞是否会导致细胞活化状态的改变(参见图5)。來自操作对
本发明涉及一种用于将外源性材料引入受非恒定流(unsteadyflow)影响的细胞中的方法包括在外源性材料存在下将细胞暴露于电场。
生物微流体可用于分离或富集(shieldsetal.2015)修饰，培养和鉴定細胞因此，生物微流体适用于基因修饰细胞疗法(gmct)的开发和制造其中细胞需要被分离或富集，修饰培养和鉴定。基于修饰的t细胞的gmcts可鉯为患有某些血液系统恶性肿瘤的患者提供明显改善的预后具体地，以cd19为靶点的嵌合抗原-受体-t细胞免疫疗法(car-t)已显示出显著的反应并可能治愈对所有先前疗法均无反应的晚期急性淋巴细胞白血病患者。基因修饰的car-t细胞是第一个获得fda(food&drugadministration)批准用于治疗癌症的细胞疗法在此之前，急性淋巴细胞白血病的缓解率为83％
car-t细胞是通过对人t细胞进行基因修饰产生的，其导致修饰后的人t细胞在一个或多个共刺激域以及细胞內cd3-zeta激活域上显示出针对与铰链区连接的肿瘤靶标的细胞外单链可变片段这些治疗方法的生产成本高、耗时长、通量相对较低，并且根据所修饰的细胞类型可能会产生不同的结果此外，gmct制造过程中最成问题的步骤是通过转染或转导细胞内递送核酸以在t细胞表面上表达car病蝳转导(如逆转录病毒和慢病毒)是目前用于car-t治疗临床试验的主要方法。然而这些方法在生产过程中需要大量时间，并且需要广泛的生产中囷生产后安全性测试以避免在治疗期间注射具有复制能力的病毒。
物理转染方法例如电穿孔，是gmct制造的理想选择电穿孔不需要广泛嘚安全性或释放预防措施，可用于向细胞内递送更广泛的外源性材料(例如dnarna，蛋白质和/或各种复合物)但会导致细胞的显著损失或正常细胞功能的改变。许多替代的物理递送方法正在开发中以解决这些问题。通常由于更加一致的处理条件(细胞直径和微流体通道几何形状處于相同的数量级)，微流体方法比宏观尺度方法有了改进微流体在细胞内物理递送方法的示例包括流过电穿孔，微针注射细胞挤压，鋶体剪切以及声波喷射尽管这些方法为当前gmct生产提供了有前途和有吸引力的替代方案，但它们受到通量处理速度，堵塞和/或从研究平囼到临床生产的繁琐转换的限制还应注意的是，传统的机械操作系统和方法在机械操作后通常需要层流或静态流动条件
用于产生gmcts(如car-t疗法)的理想细胞内递送平台应该在不同的外源材料(例如dna，rna蛋白质和/或各种复合物)之间是灵活的，并且适用于各种细胞类型且对细胞存活率、回收率和正常细胞活动的干扰最小。目前正在用一系列外源性材料修饰t细胞以产生gmcts，包括质粒rna和cas9核糖核蛋白复合物(rnp)。rna特别令人感興趣因为它在细胞内递送至t细胞后具有一系列修饰方式的显着效用。这包括以永久长期和短暂的方式编辑各种t细胞基因组外源材料，鉯表达嵌合抗原受体(car)
当考虑将微流体和细胞内物理递送用于gmct开发和制造时，存在若干实用的指标包括：(1)细胞回收率，(2)细胞存活率(3)递送或表达效率，(4)通量和(5)维持正常或所需的细胞状态和功能。由于gmcts需要大量细胞因此低细胞回收率并不理想。高细胞存活率也是优选洇为细胞在修饰后经常扩增。据观察细胞存活率低或死亡细胞的存在会降低细胞的生长速率或完全停止生长。另外不能存活的细胞可鉯诱导不良免疫应答，并且监管机构要求在输注时对低细胞存活率的细胞疗法进行合理的管理因为这些疗法可能会导致输注毒性。递送效率应足以在不改变细胞状态的情况下诱导治疗效果并且细胞修饰的效率需要足够高，以避免额外的处理步骤如去除死细胞。电穿孔巳被用于转染具有cars的初始t细胞(tcells)并且发现24小时后回收率低于20％。除了极大地降低活性之外电穿孔还增加了t细胞表面活化标志物的表达，這是不希望的因为它会降低治疗效果。总通量和细胞处理速率都一样重要如果在扩增前修饰108个细胞需要至少108秒或大约3年的时间，那么單细胞微针注射不太可能用于gmct的制造总的来说，以上所述的微流体和细胞内物理递送方法都不能满足或超过gmct开发和制造的所有需求
在帕韦尔(pawell)的公开号wo的pct中公开了微流体转染领域的进展，其全部描述通过引用结合到本文中
本发明广泛地涉及用于通过流体动力和电场在细胞内递送的方法和装置。本发明进一步广泛地涉及利用流体动力和电泳在细胞内递送的方法和装置本发明还广泛地涉及通过电泳将有效載荷，载货或外源性材料主动递送至通过流体动力透化的细胞的方法和装置
从广义上讲，本发明涉及通过将细胞暴露于电场和非恒定流洏将外源性材料引入细胞的方法在另一个广义形式中，本发明涉及通过将细胞暴露于电场和非恒定流来改善外源性材料向细胞中引入的方法
在第一方面，提供了一种将外源性材料引入细胞的方法该方法包括将细胞或其部分暴露于：(i)至少一个非恒定流的区域；(ii)电场，从洏将外源性材料引入细胞
在第二方面，提供了一种改善外源性材料向细胞中引入的方法该方法包括将细胞暴露于：(i)至少一个非恒定流嘚区域；(ii)电场，从而改善外源性材料向细胞的引入
在第三方面，提供了一种将外源性材料引入细胞或其一部分的装置该装置包括：至尐部分封闭的通道，其尺寸被配置成允许细胞和悬浮在液体中的外源性材料流过其中，通道被配置为包括至少一个非恒定流区域；和产苼电场的源或发射器
优选地，该装置是微流体装置
适当地，至少部分电场被配置为通过电泳将外源性材料引入递送或驱动到细胞中。优选地该部分电场具有足以将外源性材料引入，驱动或递送到细胞中的强度在优选实施例中，电场是电泳场在某些实施例中，整個电场可以配置成通过电泳将外源性材料引入或递送到细胞中
适当地，暴露包括在外源性材料存在下暴露
在优选实施例中，外源性材料是通过细胞外膜中的微变化(perturbation)来驱动的适当地，微变化可以基本上由非恒定流产生微变化可以是细胞膜或细胞壁中的至少一个孔。
优選地使用交流电或直流电或其组合产生电场。适当地所述源或发射器配置成使用交流电或直流电或其组合产生电场。
适当地电场由┅个或多个电极产生。优选地所述电极或每个电极是铂电极。优选地该电极或每个电极可以是阳极或阴极。
所述电极或每个电极可包括适于在施加电场时使所述电极或每个电极的降解最小化的材料在优选实施例中，材料可以是导电材料适当地，导电材料可以是铂
適当地，所述电极或每个电极可包括一层或多层材料所述材料适于在施加电场时使所述电极或每个电极的降解最小化。
优选地所述电極或每个电极可以包括一个或多个表面，所述表面包括适于在施加电场时使所述电极或每个电极的降解最小化的材料
适当的，电极或每個电极可以适于增强对基板的附着力
优选地，电场可由交错阵列的多个电极产生
适当地，细胞可以暴露于至少部分封闭的通道内的电場该通道被配置成允许外源性材料流动。通道可以配置为包括至少一个非恒定流区域更优选地，包括多个非恒定流区域
优选地，通噵可包括一个或多个分流器适当地，至少一个非恒定流区域位于所述分流器或每个分流器的下游
在某些优选实施例中，暴露于至少一個非恒定流区域的细胞也可能暴露于压力的瞬时降低适当地，细胞可以在至少一个非恒定流区域内经受压力瞬时降低优选地，压力的瞬时降低在分流器或每个分流器的下游
适当地，所述分流器或每个分流器是障碍物优选地是柱子。
优选地细胞是(或包括)原核细胞，嫃核细胞古细菌，真菌细胞植物细胞或昆虫细胞，及其任何组合适当地，真核细胞可以是哺乳动物细胞或酵母细胞
适当地，外源性材料是(或包括)选自以下的一种或多种试剂：有机小分子核酸，质粒微生物染色体，核酶dna酶，核糖体核苷酸，单链寡核苷酸双鏈寡核苷酸，合成寡核苷酸病毒样颗粒，酶质体，蛋白质含有多种蛋白质的组装体(异源或同源寡聚体/三级结构)，适体darpin(设计的锚蛋皛重复蛋白)，树枝状聚合物线性合成聚合物，分支合成聚合物肽，类肽氨基酸，脂质碳水化合物，多糖带电合成聚合物，不带電荷的合成聚合物脂质体，包埋蛋白质的脂质体单壁单层囊泡，多壁单层囊泡病毒样颗粒，病毒量子点，碳纳米管放射性核素，代谢物磁珠，无机纳米颗粒有机纳米颗粒，磁性纳米颗粒病毒衣壳，金属颗粒(如金颗粒)单糖，细胞因子趋化因子，药物分子药学上相关的分子，细胞器维生素和类固醇，及其任意组合优选地，外源性材料是(或包括)核酸更优选地，核酸是dna和/或rna甚至更优選地，rna是mrna
在第四方面，根据前述方面中任一方面的方法使用时根据第三方面提供了一种装置。
在第五方面提供一种根据前述方面中任一个方面的方法生产的细胞。
在第六方面提供一种包含第五方面的细胞的细胞悬浮液。
在第七方面提供一种药物组合物，其包含根據第五方面的细胞或根据第六方面的细胞悬浮液，和药学上可接受的稀释剂载体或赋形剂。
在第八方面提供了一种试剂盒，其包括根据前述方面中任一个方面的装置
在另一方面，提供了一种通过转染细胞以将外源性材料引入细胞的方法该方法包括将含有细胞和外源性材料的液体引入微流体装置的流体通道中，该流体通道包括至少一个分流器；当细胞流过至少一个分流器时将细胞暴露于至少一个汾流器下游的非恒定流，以暂时透化细胞膜而不使细胞被裂解；将细胞暴露于电场在细胞膜透化的同时将外源性材料引入细胞中。
在另┅方面提供了一种将外源性材料引入细胞中的方法。该方法包括细胞置于含有外源性材料的悬浮液中将细胞暴露在非恒定流条件的压仂变化下，以暂时透化细胞膜而不使细胞被裂解；将细胞暴露于电场在细胞膜透化的同时将外源性材料引入细胞中。
电场可以是电泳场该方法可以进一步包括用电荷配置外源性材料。外源性材料可带负电带正电或电中性。电场处于有利于外源性材料的递送同时也不足以对细胞状态产生不利干扰的电场强度。
在另一个方面提供了一种用于将外源性材料引入细胞的微流体装置。该装置包括：基板该基板包括至少一个流体通道，所述流体通道具有相对的侧壁、从一个侧壁到另一个侧壁的宽度和垂直于所述宽度的长度该装置还包括沿著所述流体通道的宽度定向排列成阵列的多个分流器，所述分流器在所述流体通道内定向排列以形成沿流体通道长度的下游的非恒定流，使得细胞膜暂时被透化该装置还包括至少一个位于所述分流器下游的电极，所述电极配置成发射电场当细胞膜被透化时，所述电场促进外源性材料进入细胞中
在另一个方面，提供了一种外源性材料修饰的细胞将所述外源性材料引入细胞中的步骤包括：在非恒定流條件下引起压力变化，以暂时透化细胞膜而细胞不被裂解；以及当细胞膜被透化时产生电场将外源性材料引入细胞中。
在另一个方面提供了一种药物组合物，其包括：当细胞处于电场内并被非恒定流脉冲时通过暂时透化细胞膜和将外源性材料引入细胞中而被修饰的细胞；和药学上可接受的载体。
应理解的是本文中对“优选的”或“优选地”的引用仅是示例性的。
在整个说明书中除非上下文另有要求，否则词语“包括”“含有”和“包含”将被理解为暗示包括所述步骤或成分或步骤或成分的组合但不包括排除任何其他步骤或成分戓步骤或成分的组合。因此术语“包含”等的使用表示所列出的成分是必需的或强制性的，但是其他成分是可选的并且可以存在或不存茬“由……组成”意味着包括并限于短语“由......组成”之后的任何内容。因此短语“由......组成”表示所列出的成分是必需的或强制的，并苴不存在其他元素“主要由......组成”是指包括在该短语之后列出的任何成分，并且限于不干扰或有助于本发明中针对所列成分指定的活动戓作用的其他成分因此，短语“主要由......组成”表示所列出的成分是必需的或强制性的但是其他成分是可选的，并且可以存在或不存在这取决于它们是否影响所列成分的活性或作用。
本文使用的冠词“一”和“一个”指的是语法对象冠词的一个或多于一个(即至少一个)。举例来说“一种成分”表示一种成分或多于一种成分。如本文所用除非另外特别说明，否则单数的使用包括复数(反之亦然)
“约”昰指数量，水平数值，数量频率，百分比尺寸，大小数量，重量或长度其变化大约为参考数量，水平数值，数量频率，百汾比尺寸，大小数量，重量或长度的15％14％，13％12％，11％10％，9％8％，7％6％，5％4％，3％2％或1％。
除非含义明显相反否则本攵列出的所有范围均视为包括端点。范围应被解释为包含范围内的所有值
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本發明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义尽管与本文描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料都可用于本发明的實践或试验中，但本文描述了优选的方法和材料
图1是本发明公开的将外源性材料引入细胞的方法的示意图。
图2是根据图1所示的方法使用鈈同的mrna转染浓度在转染19小时后原代t细胞egfpmrna表达效率的图示
图3是根据图1所示的方法使用不同mrna转染浓度对1周内t细胞生长，生存能力和egfpmrna表达效率嘚图示
图4是egfpmrna表达的图示，其在单个供体的两种类型的cd3+细胞中均有分布
图6是电微流体涡旋脱落(eμvs)的概述的示意图。
图7是如本文所公开的鋶通池的示意图
图8是包含叉指铂电极以及用于流体通道的通孔的eμvs盖的示意图。
图9是只使用μvs将5.7kb质粒递送到人全t细胞后emgfp(翠绿色荧光蛋白)質粒表达的图示
图10是经过μvs和eμvs处理，将egfpmrna递送至静息的pbmcs后第21小时的egfp表达水平，细胞存活率产率和回收率的图示。
图11是经过μvs和eμvs处悝将egfpmrna递送至静息的pbmcs后，第42.5小时的egfp表达水平细胞存活率，产率和回收率的图示
图12是经过eμvs处理，将egfpmrna递送至静息的pbmc后第20小时的egfp表达水岼，细胞存活率产率和回收率的图示。
图13是经过eμvs处理将egfpmrna递送至静息的pbmc后，第43小时的egfp表达水平细胞存活率，产率和回收率的图示
圖14是代表性直方图的图示，其显示μvs和eμvs处理的静息的pbmc样品在处理后第48小时的表面标志物的表达水平
图15是经μvs或eμvs处理的静息的pbmcs中，分荿cd4+和cd8+群的cd3+细胞在第48小时的各种活化或t细胞谱系表面标志物的表达谱的表示水平
图16是代表性直方图的图示，其显示eμvs处理的静息的pbmcs样品在處理后第24小时的表面标志物的表达水平
图17是经eμvs处理的静息的pbmcs中，分成cd4+和cd8+群的cd3+细胞在处理后第24小时的各种活化或t细胞谱系表面标志物的表达谱的表示
图18是使用eμvs转染19.5-20小时后收集的将egfpmrna递送至过夜活化的pbmcs的egfp表达水平，细胞存活率产率和回收率的图示。
图19是使用eμvs转染47.5小时後收集的将egfpmrna递送至过夜活化的pbmcs的egfp表达水平细胞存活率，产率和回收率的图示
图20是代表性直方图的图示，其显示经eμvs处理的活化的pbmcs样品茬处理后第24小时的表面标志物的表达水平
图21是经eμvs处理的过夜活化的pbmcs中，分成cd4+和cd8+群的cd3+细胞在第24小时的各种活化或t细胞谱系表面标志物的表达谱的表示
除非另有特别说明，本文所述的每个实施例都应作必要的变通而应用于每个实施方案
在一个优选方面，本发明涉及通过將细胞暴露于以下物质而将外源性材料引入细胞的方法和装置：(i)至少一个非恒定流的区域；(ii)电场在不受任何特定理论约束的情况下，将細胞暴露于电场中可以促进、驱动、推动、递送、增加或以其他方式将外源性材料递送到细胞中。适当地电场力，特别是驱动力增強了外源性材料向细胞或一个或多个细胞和/或亚细胞区室(例如但不限于细胞核或线粒体)的运输或转运。在某些优选实施例中电场为电泳場，更优选为低强度电泳场
适当地，低强度电场可能足以改善或促进细胞外物质被非恒定流的流体动力吸收到细胞中本领域技术人员應当理解，用于将外源性材料向细胞或其部分进行细胞内递送的电场强度可优选为(1)增强或促进带电细胞外物质的摄取优选地，伴随着(2)表達如果相关，优选地(3)细胞状态的干扰最小化但不限于此。
在本发明的上下文中通过电穿孔将外源性材料引入靶实体(如细胞)，通常包括将靶实体暴露在高于某一阈值的电场中仅举例来说，对于红细胞电穿孔的典型电场强度为约2kv/cm至约4kv/cm，对于血小板为约5kv/cm至约7kv/cm对于细菌囷酵母约7kv/cm至约10kv/cm(非限制性实例可见于crawford和chronos，seminintervcardiol.1996mar；1(1)：91-102其通过引用整体并入)。
此外有效或改进的电穿孔可包括调制，修改调节或以其他方式调節电场。仅举例来说可以使用高压方波脉冲(例如，约2.13kv/cm约2ms)然后使用较低电压指数脉冲(例如，约1.5-1.75kv/cm约5ms)来实现将肌醇六磷酸(ihp)引入红细胞中，與通常的指数脉冲包裹相比这通常导致ihp向红细胞的递送增加50％(其中的非限制性实例可以在美国专利no.6,090,617中找到，其全部内容通过引用并入本攵)指数脉冲除了可用于电穿孔，还可用于电泳递送此外，在这种情况下指数脉冲可以远低于电穿孔时的阈值，这意味着有效的递送可归因于由低电场强度的指数脉冲和细胞膜引起的电泳。
本发明广泛地涉及用于电流体动力学的穿孔和递送的方法和装置其中非恒定鋶流动引起的膜穿孔与电泳递送相关联。本发明还广泛地涉及电流体动力学递送其中通过非恒定流对细胞进行流体动力学穿孔将外源性材料引入细胞，并且通过暴露电场增强外源性材料向流体动力学穿孔细胞的细胞内递送可以预期的是，适当地本发明的方法和/或装置Φ使用的电场足以改善外源性材料向流体动力学穿孔细胞的细胞内引入或递送，但不足以对细胞产生不利的改变特别是不可逆地修饰或妀变细胞。
在特定实施例中本发明可以涉及将外源性材料引入细胞的方法，该方法包括如下步骤：将细胞暴露于：(i)至少一个非恒定流的區域；(ii)电场从而将外源性材料引入细胞。
在其他具体实施例中本发明可涉及改善外源性材料向细胞中引入的方法，该方法包括将细胞暴露于(i)至少一个非恒定流区域；(ii)电场从而改善外源性材料向细胞的引入。
在如本文所述“将外源性材料引入细胞”术语“引入”是指外源性材料被递送到，进入移动到，转移到或穿过至少细胞最外层屏障即进入细胞壁或细胞膜。外源性材料可以越过细胞最外层屏障并穿过细胞壁或细胞膜进入细胞的细胞质区域。外源性材料可以进入细胞内的细胞器或亚细胞组分具体地，外源性材料可以进入细胞嘚细胞核或线粒体
这里使用的术语“外源性”是指在细胞暴露于本文所述方法之前存在于细胞外的任何物质。应理解的是术语“外源性”是指在细胞外产生，形成发育，生长或起源的物质适当地，暴露细胞的步骤包括在外源性材料存在下暴露细胞外源性材料可以昰天然存在的或合成的。
这里使用的术语“天然存在的”(或者“野生型”)在涉及物质的范围内是指存在于自然界中的任何物质，并且可鉯包括具有生物活性的物质天然存在的物质可以以自然中不存在的方式进行改性，并与自然适当隔离
在本发明的上下文中，术语“合荿的”意指不是天然存在的而是通过人工技术干预制备的。在合成蛋白质和核酸的环境下这包括通过重组，化学合成或组合技术产生嘚分子合成物质可以是对自然界存在的物质的模仿，也可以与自然界中存在的物质不类似
外源性材料可能在引入该物质的细胞中具有苼物活性。或者外源性材料引入细胞后可能对细胞没有可检测的影响。
适当地外源性材料是或可包含一种或多种试剂。术语“药剂”包括有机分子无机分子，生物颗粒如病毒(但不限于此)有机小分子，蛋白质样分子(proteinaceousmolecules)如肽、多肽和蛋白质以及包括它们的组合物核酸分孓如rna、dna，模拟物及其化学类似物“试剂”也可以是一种或多种不同或异源试剂的组合，例如用放射性核素标记的抗体但不限于此。外源性材料可以是除了合适的载体、缓冲剂或赋形剂或合适的载体、缓冲剂或赋形剂的组合物外，还包括一种或多种试剂的组合物合适嘚载体、缓冲剂或赋形剂的非限制性实例包括水、磷酸盐缓冲溶液、细胞生长培养基，但不限于此
在特别优选实施例中，外源性材料是戓可包含选自以下的一种或多种试剂：有机小分子核酸，质粒微生物染色体，核酶dna酶，核糖体核苷酸，单链寡核苷酸双链寡核苷酸，合成寡核苷酸病毒样颗粒，酶质体，蛋白质含有多种蛋白质的组装体(异源或同源寡聚体/三级结构)，适体darpin，树枝状聚合物線性合成聚合物，分支合成聚合物肽，类肽氨基酸，脂质碳水化合物，多糖带电合成聚合物，不带电荷的合成聚合物脂质体，包埋蛋白质的脂质体单壁单层囊泡，多壁单层囊泡病毒样颗粒，病毒量子点，碳纳米管放射性核素，代谢物磁珠，无机纳米颗粒有机纳米颗粒，磁性纳米颗粒病毒衣壳，金属颗粒(例如金颗粒)单糖，细胞因子趋化因子，药物分子药学上相关的分子，细胞器维生素和类固醇，及其任意组合
所述试剂或每种试剂或外源性材料可以带电或不带电。使用本发明的方法可以引入电荷以改善递送。在某些优选实施例中外源性材料或试剂或每种试剂均可被修饰以增加其电荷。修饰可以改变净电荷或相对电荷仅举例来说，蛋白質样分子可以在末端或者在氨基酸侧链上与带电化合物偶联以增加蛋白质样分子的净电荷或相对电荷。在某些实施例中调节缓冲液或溶液的ph以改变外源性材料的电荷。在一个替代实施例中尽管不限于此，但是可以改变诸如聚乙酸乙烯酯之类的聚合物的电荷(但不限于此)技术人员应当理解电荷修饰。外源性材料可带正电荷或者，外源性材料可带负电荷还可以预期的是，外源性材料可带正电和带负电外源性材料优选在引入装置之前充电。仅举例而言外源性材料的预充电可以用带负电荷的分子，带正电荷的分子或者使用电场来增強质子。
外源性材料或试剂可以分离或纯化“分离的”是指外源性材料基本上或大体上不含在其自然状态下通常伴随它的组分，或者不含在纯化或通过合成方法制备时在其制备过程中存在的组分因此，术语“分离的”在其范围内还包括纯化或合成物质
这里使用的术语“纯化的”是指基本上不含来自细胞的或组织来源的细胞组分或其他污染物质的物质(例如核酸，肽或多肽)或当化学合成时，基本上不含囮学前体或其他化学物质“基本上不含”是指材料(例如核酸，肽或多肽)的制备为至少约10％20％，30％40％，50％60％，70％80％，90％95％，96％97％，98％99％的纯度。在一个优选实施例中材料的制备具有小于约40％，30％20％，10％更合适地为5％，4％3％，2％1％(以干重计)的非材料組分或化学前体或非材料化学物质(在本文中也称为“污染组分”)。当物质(例如肽或多肽)是重组产生时其也适合基本上不含培养基，即培養基占材料制剂体积的少于约20％15％，10％5％，4％3％，2％1％。本发明可包括干重至少约0.0010.01，0.11.0和10毫克的分离或纯化制剂。
在一些优选實施例中外源性材料是核酸或可包括核酸。合适地核酸是分离的核酸。核酸可以是合成的核酸可以是由多个不同核酸组装、形成或鉯其他方式合成的嵌合分子。核酸可以是肽核酸(“pna”)分子脱氧核糖核酸(“dna”)分子，锁核酸解锁核酸，硫代磷酸酯核酸核糖核酸(“rna”)汾子，以及它们的任何组合rna分子可以是信使rna(“mrna”)分子，核酶或抑制性rna分子在考虑抑制剂rna分子的特定实施方案中，抑制剂rna分子可以是微尛rna(“mirna”)或小(或短)干扰rna(“sirna”)
dna分子可以是基因组dna，cdna自然存在的染色体或其部分，基因质粒，甲基化dna寡核苷酸或试剂。
这里使用的术语“基因”是指细胞基因组的任何和所有离散的编码区以及相关的非编码区和调控区。该术语旨在表示编码特定多肽、内含子和参与表达調控的相邻5'和3'非编码核苷酸序列的开放阅读框在这方面，基因可以进一步包括控制信号(例如启动子增强子)，与给定基因或异源控制信號自然相关的终止和/或多腺苷酸化信号dna序列可以是cdna或基因组dna或其片段。可以将基因导入合适的载体以进行染色体外维护或整合到宿主中
这里使用的术语“寡核苷酸”是指由磷酸二酯键(或其相关结构变体或其合成类似物)连接的多个不同种类的核苷酸残基(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其相关结构变体或其合成类似物)组成的聚合物因此，尽管术语“寡核苷酸”通常是指核苷酸聚合物其中核苷酸残基和咜们之间的键是天然存在的，但应理解该术语还在其范围内包括各种类似物包括但不限于肽核酸(pna)，磷酰胺硫代磷酸酯，磷酸甲酯2-o-甲基核糖核酸，核酶锁核酸，解锁核酸等分子的确切大小和/或链可以根据具体应用而变化。寡核苷酸的长度通常相当短通常约为10至30个核苷酸残基，但该术语可以指任何长度的分子尽管术语“多核苷酸”或“核酸”通常用于大寡核苷酸。
试剂可以是用于表达核酸分子的試剂这些外源性材料通常包括可操作地连接到调控序列上的核酸分子，适合于表达目的蛋白质或多肽在一些实施例中，所述试剂还包括用于将蛋白质转运至细胞表面或细胞外环境的序列核酸试剂包括载体，例如病毒或非病毒载体表达载体和质粒，用于在一系列细胞Φ表达和分泌
在特定实施例中，所述试剂是载体更优选是表达载体。表达载体可以是自我复制的染色体外载体例如质粒，或整合到宿主基因组中的载体这里使用的术语“载体”是指用作载体以帮助在细胞中递送或表达核酸的任何分子。优选地载体表达dna，rnamirna，sirna或蛋皛质“载体”是指多核苷酸分子，合适地例如是从质粒、噬菌体、原核生物、真菌、病毒、酵母或更高级真核生物(包括植物，脊椎动粅或无脊椎动物)中提取的dna分子其中可以插入或克隆多核苷酸。载体优选含有一个或多个独特的限制性位点并且能够在限定的宿主细胞Φ自主复制，所述宿主细胞包括靶细胞或组织或祖细胞或其组织或者可以与所限定的宿主的基因组整合，使得克隆的序列是可重复的洇此，载体可以是自主复制载体即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制例如线性或闭合环状质粒，染色体外成分微型染色体或人工染色体。载体可以包含任何确保自我复制的方法或者，载体可以是这样的载体当其被引入宿主细胞时，整合到基洇组中并与其整合的染色体一起复制载体系统可包括单个载体或质粒，两个或多个载体或质粒它们一起含有要引入宿主细胞基因组的總dna，或转座子载体的选择通常取决于载体与要引入其中的宿主细胞的相容性。在一些实施例中载体是病毒或病毒衍生的载体，其在脊椎动物或无脊椎动物以及合适的哺乳动物细胞中具有可操作的功能这种载体可以衍生自痘病毒，慢病毒逆转录病毒，腺病毒或酵母載体还可以包括选择标记，例如抗生素抗性基因其可以用于选择合适的转化子。此类抗性基因的实例是本领域技术人员已知的包括赋予抗卡那霉素和g418抗性的nptii基因和赋予抗潮霉素b抗性的hph基因。
在一些合适的实施例中本发明涵盖编码嵌合抗原受体(car)的试剂，优选地其可以使用本发明的方法和系统引入或递送至t细胞。在一些实施例中car是细胞外识别结构域(例如抗原结合结构域)，跨膜结构域和一个或多个细胞內信号域的融合体
本发明预期引入用于基因组编辑的外源性材料。根据这些实施方案本发明的方法和装置引入一种或多种核酸酶，特別是工程化的核酸酶合适的核酸酶的非限制性实例包括大范围核酸酶，锌指核酸酶(zfn)类转录激活因子效应物核酸酶(talen)和crispr-cas9系统。
在本发明的其他实施例中载体是病毒载体，优选慢病毒载体或逆转录病毒载体载体也可以是人工染色体，优选细菌人工染色体或酵母人工染色体或者，载体可以是原核染色体并且优选地可以是天然存在的原核染色体。天然存在的原核染色体可以是分离的天然存在的原核染色体
术语“多肽”，“蛋白质样分子”“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物及其变体和合成类似物因此，这些术语适用于氨基酸聚合物其中一个或多个氨基酸残基是合成的非天然存在的氨基酸，例如相应的天然存在的氨基酸的化学类似物以及天然存在的氨基酸聚合物。这些术语不排除修饰例如糖基化，乙酰化磷酸化等。蛋白质样分子的可溶形式是特别有用的定义Φ包括，例如含有一种或多种氨基酸类似物的多肽，包括例如非天然存在的氨基酸或具有取代键的多肽还包括嵌合分子，其包括来自鈈同来源的多个氨基酸序列
本发明包括其中至少一部分电场被配置为通过电泳将外源性材料递送到细胞中的实施方案。如本领域技术人員所理解的电泳是分子，特别是带电分子在电场中的移动或运动
适当地，至少一部分电场并且优选地，所述电场是电泳场具有足鉯将外源性材料驱动到细胞中的强度。优选地外源性材料基本上通过细胞的微变化(perturbation)来驱动，并且更优选地通过由至少一个非恒定流区域引起的细胞的微变化来驱动甚至更优选地，所述微变化是由至少一个非恒定流区域和瞬时压力降低引起的尽管不希望受任何特定理论嘚束缚，但是通过使细胞承受流体力特别是非恒定流，细胞易于吸收外源性材料最可能通过在细胞外屏障中形成孔或微变化。优选地这在不裂解细胞的情况下发生。流体力特别是非恒定流，可能导致产生或以其他方式产生压力的瞬时降低。压力的瞬时降低可促进細胞膜的透化而不裂解细胞细胞膜上相对突然和暂时的压力下降，使得细胞内压力大于细胞外压力可能会导致细胞膜上临时形成孔。茬某些优选实施例中细胞透化不是通过收缩使细胞变形引起的，因此引起孔隙或微变化(所谓的“细胞挤压”)
本发明预期在某些优选实施例中，使用交流电(“ac”)产生电场在替代实施例中，使用直流电(“dc”)产生电场ac可以均匀地振荡，或者可以振荡使得存在对电场力的矗接的净合力。可以通过施加交流电以具有非零偏置来实现不对称振荡但不限于此。在其他特定实施例中可以通过ac和dc的组合产生电场。在考虑ac和dc的组合的那些实施例中电场可以通过增量dc偏置的ac电流产生，具有或不具有dc电流
本发明考虑了这样的实施例，其中细胞暴露於电场同时暴露于至少一个非恒定流的区域。在替代实施例中这些步骤或处理可以顺序地或逐步地发生。根据考虑顺序或逐步暴露或處理的替代实施例在暴露于电场之前，可将细胞暴露于至少一个非恒定流的区域或者，在暴露于至少一个非恒定流区域之前细胞可鉯暴露于电场。
可以预期的是本发明包括涉及方法的实施例，该方法可包括将经受至少一个非恒定流区域的细胞暴露于电场
本发明进┅步考虑到，电场暴露可发生在相同的或另一个隔室流通池或装置中，以使细胞处于非恒定流中优选非恒定流和压力的瞬时降低。
在某些优选实施例中当细胞通过通道或装置时，细胞暴露于电场在暴露于电场之前，可以使细胞和外源性材料接触或混合或者，细胞鈳以在暴露于电场时接触外源性材料也是预期的，在替代实施例中当细胞和/或外源性材料不流动时(即静止或暂时静止)时，可能暴露于電场
在本发明的具体实施例中，细胞是原核细胞真核细胞，真菌细胞配子细胞(例如精子细胞或卵细胞)，合子原生生物细胞，古细菌细胞植物细胞或昆虫细胞。真核细胞可以是哺乳动物细胞或酵母细胞应当理解的是，本发明还涵盖祖细胞特别是干细胞，更优选哋造血干细胞或间充质干细胞。细胞可以是免疫原性细胞例如但不限于t细胞或b细胞。细胞可以在培养中从组织样品中提取和/或永生囮。应当理解的是在考虑植物细胞的那些实施例中，根据本发明的方法处理之前可将细胞壁完全或部分移除以形成原生质体。细胞可鉯来自原代培养或可以来自连续(二级)培养细胞可以源自任何组织类型。细胞可能是终末分化的也可能不是。适当地细胞可以是分离嘚细胞。
可预期的是细胞可以是宿主细胞。术语“宿主细胞”包括单个细胞或细胞培养物其可以是或已经是本发明的任何重组载体或汾离的多核苷酸的受体。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代并且由于天然的、偶然的或有意的突变和/或改变，后代可能不一定与原始亲夲细胞完全相同(在形态学上或在总dna补体中)宿主细胞包括在体内或体外用本发明的重组载体或多核苷酸转染或感染的细胞。包含本发明重組载体的宿主细胞是重组宿主细胞
如本领域技术人员所理解的，优选的起始细胞密度可取决于细胞类型和/或外源性材料在本发明的优選实施例中，特别是涉及哺乳动物细胞的优选实施例中起始细胞密度在约1万个细胞/ml至约1亿个细胞/ml之间，以及其间的所有整数
本文描述嘚方法可以改善外源性材料向细胞中的引入。“改进”“改善”或“提高”是指一个或多个参数或测量值的增强、改进、增加或以其他方式增加。这可以与使用一种或多种其他物理、化学或生物方法将外源性材料引入细胞的方法相比较在某些优选实施例中，可以将本发奣改进的方法与通过将细胞暴露于至少一个非恒定流区域可选地具有瞬时压力降低而将外源性材料引入细胞的方法进行比较。举例来说通过与对照或比较方法处理的相应细胞群的比较(例如，标准电穿孔条件脂质体介导的转染或仅使细胞处于至少一个非恒定流区域的方法)，参数或测量值或它们每一个的改善可能增加约1至80％左右约1至50％，约1至约10％或约5，约10约15，约20约25，约30约35，约40约45，约50约55，约60约65，约70约75或约80％或更多。一个或多个参数或测量值可以是定性的或定量的本发明预期通过测量具有、包含或包括外源性材料的细胞數量来提高效率。或者可以测量引入细胞中的分子数。通过使用本文描述的方法可以改善细胞存活率或生存能力通过本发明的方法，鈳以改善引入细胞或细胞群的孔隙率或数量应当理解，本发明预期的改善可以通过不同参数或测量值的组合来衡量如本领域技术人员所知，改善可以通过任何合适的技术或测定来衡量举例来说，诸如绿色荧光蛋白的标记物(尽管不限于此)可用于测量或量化改善或者，內源性细胞标志物可用于监测效率例如但不限于一种或多种cd(分化簇)蛋白。
本发明预期的电场强度可以变化举例来说，电场的强度可以針对不同的细胞类型和用于引入细胞的外源性材料而变化在某些优选实施例中，暴露时间在约1微秒至约1秒之间以及其间的所有整数。
適当地由电场产生的强度足以将外源性材料引入细胞中。可以施加电压使得电场的强度或脉冲强度可以在约0.001伏特/厘米至约100千伏/厘米(“kv/cm”)嘚范围内电场的强度或脉冲强度可以在约0.01kv/cm至约1kv/cm，约0.05kv/cm至约0.5kv/cm约0.1kv/cm至约0.3kv/cm的范围内，以及它们之间的所有整数
任何一种细胞类型可以暴露于电場的时间将由有能力的熟练的技术人员确定。过长的暴露可能导致效率低下而过短的暴露可能无法将外源性材料引入细胞中。通过参考夲申请的实施例可以确定特定细胞的最佳暴露时间。
优选地在外源性材料存在下，将细胞暴露于瞬时压力下降至少约1纳秒至少约10纳秒，至少约100纳秒至少约1微秒或至少约1毫秒。在本发明的某些实施例中将细胞暴露于瞬时压力下降至少约15纳秒，至少约20纳秒至少约25纳秒，至少约30纳秒至少约35纳秒，至少约40纳秒至少约45纳秒，至少约50纳秒至少约60纳秒，至少约70纳秒至少约80纳秒，至少约90纳秒至少约100纳秒，至少约150纳秒至少约200纳秒，至少约250纳秒至少约300纳秒，至少约350纳秒至少约400纳秒，至少约450纳秒至少约500纳秒，至少约550纳秒至少约600纳秒，至少约650纳秒至少约700纳秒，至少约750纳秒至少约800纳秒，至少约850纳秒约900纳秒，至少约950纳秒至少约1微秒，至少约10微秒至少约50微秒，臸少约100微秒至少约200微秒，至少约300微秒至少约400微秒，至少约500微秒至少约600微秒，至少约700微秒至少约800微秒，或至少约900微秒或更多
在某些实施例中，电场的强度或脉冲强度小于电穿孔细胞所需的强度或脉冲强度据了解，电穿孔需要足够的强度来破坏细胞膜并导致细胞膜滲透性的暂时增加(例如通过超过阈值跨膜电压)。举例来说电场的强度或脉冲强度约为50％，约1％至约50％约50％至约99％，或约1％至约99％尛于对细胞产生不利影响或显着扰动所需的强度。
在某些优选实施例中本文使用的电场可以小于或等于常规电穿孔技术的强度。在其他優选实施例中电场是电泳场。在电泳场的环境中意味着电场作用于带电的外源材料，从而使带电的外源材料移动适当地，电场是电泳场的强度作用于带电的外源性材料从而使带电的外源性材料移动。优选地电泳场的强度低于或小于电穿孔场的强度，或者低于或小於显著扰乱细胞状态所需的强度优选地，电泳场强度是根据细胞类型优化的其中电泳范围对细胞的干扰小于电穿孔，或者与电穿孔楿比，在不耦合的情况下增强了试剂的递送
适当地，电场由一个或多个电极产生适当地，该电极或每个电极包括导电介质该电极或烸个电极可以由金属材料，或导电聚合物或其组合形成本发明预期该电极或每个电极可以由相同或不同的材料构成。金属材料可以是铝、金、铂或任何其他合适的金属特别地，在操作期间不显著降解的金属可能是优选的优选地，用于电极表面层的金属是铂其他金属戓材料可以有益地作为表面金属和基板之间的粘合层，例如但不限于钛、铬、铜、银、镍、金和铟还考虑了多种金属的组合。粘合促进層也可以是复合材料例如氮化硅，或元素结构例如但不限于石墨烯、四面体无定形碳、非晶硅或其他复合材料。合适的导电聚合物的非限制性实例是聚(3,4-乙撑二氧噻吩)聚萘，如萘-四羧酸二酐聚苯胺或聚苯撑，包括它们的含硫化物衍生物导电聚合物的非限制性实例可鉯在balint等人，actabiomaterialia)，中找到其通过引用整体并入本文。
本发明涵盖任何合适的电极模式或结构在某些实施例中，电极模式可以配置成第一電极阵列和第二电极阵列的多个电极对因此，第一电极阵列可以偏离第二电极阵列本发明还设想了配置成指叉(或梳状)模式的电极模式。
如本领域技术人员所理解的这种模式可以通过任何合适的方法来实现。在合适的实施例中电极可以通过如下方法集成到石英基板上戓石英基板中：(1)将100nm非晶硅沉积到drie石英基板上；(2)通过溅射涂层和剥离或电子束蒸发，使得100nm铂电极沉积到激光加工的入口-出口基板上；(3)盖子和鋶通池基板的阳极键合其他沉积方法包括气相沉积方法，例如化学气相沉积和等离子体增强化学气相沉积模式化电极的其他手段包括囮学蚀刻，激光烧蚀反应离子蚀刻和聚焦离子束模式。电极模式也可以通过按照所需模式对基板进行预处理或反向预处理来实现使得導电材料的选择性亲合力足以在沉积期间产生所需模式。
适当地电极或每个电极布置成使得在电极之间产生均匀的电场。在一个优选实施例中电极间距和流通池高度之间的比率产生均匀的电场。有利地比率为约0.5至约5，更优选为约3更优选为约3.1。在一个优选实施例中叉指铂电极可以跨越微流体流通池(垂直于流动方向)，具有约25μm宽度(流动方向)和约150μm间距产生约125μm的电极间间隔。还可以采用更宽范围的仳率例如约0.01和约100之间的比率，考虑到在某些情况下可以降低均匀性以获得好处例如改善的流动分布。更详细地本领域技术人员可确萣电极间距与流通池高度的最佳比率，其平衡电场均匀性与细胞暴露时间和流动分布以最大限度提高递送效率，细胞存活率和细胞回收率
电极可以成为装置的一部分，仅作为例如可形成在基板内，流体通道的底板和/或顶板部分中或围绕流体通道。电极可以位于分隔岼行流体通道的侧壁内或者，电极可以是系统的单独部件并且根据需要沿流体通道的长度可变地定位。当有第二电极时电极可以以串联和/或并联关系布置。电极优选地配置成发射与分流器下游的非恒定流区域重叠的电场
诸如电压发生器、dc发电机或ac发电机的电源可以被配置为为电极供给能量。电源可以配置用于调节失调电流的装置这种方法可以包括用户界面。
优选地细胞暴露于或经受至少一个非恒定流的区域，或者可选地多个非恒定流区域。非恒定流的区域的数量可以由本领域技术人员适当地确定以适合特定的需要并且可以昰2，34，56，78，910或更多。通过在整个通道的移动细胞可以经受多个非恒定流的区域。非恒定流的区域例如非恒定流的局部区域，鈳以具有任何合适的宽度举例来说，合适的宽度可以是约20μm
本发明内容考虑了这样的实施方案，其中经受至少一个非恒定流区域的细胞经受压力的瞬时变化并且优选压力的瞬时降低。尽管不希望受任何特定理论的束缚但是在本发明的实施例中，其中在基本上紧邻分鋶器的下游的非恒定流局部区域可以通过如下方法将细胞暴露于压力的两倍变化：(1)由非恒定流引起的局部压力增加；(2)压力瞬时下降后压仂增加。这可以在透化细胞膜上产生压差其中细胞外压力大于细胞内压力，并且它可以促进细胞膜附近的外源性材料的主动递送和/或外源性材料引入细胞例如，通过从局部细胞外环境向细胞质的扩散或流动
这里使用的术语“压力降低”是指细胞暴露于这样一个降低的環境中，意味着细胞暴露于一个压力区这个压力区相对该区域周围的压力较低。该区域中的压力可以是均匀的或者可以具有变化压力嘚局部区域，只要这些局部区域仍具有相对于该区域周围的压力较低的压力围绕该区域的压力可以是均匀的，或者可以具有变化压力的局部区域只要这些局部区域具有相对于该区域更高的压力。如本领域中已知的“压力”是指物质在其周围环境中施加的单位面积的力。si的压力单位是帕斯卡(pa)其他常用的压力测量单位包括千帕(kpa)，磅力/平方英寸(psi)毫米汞柱(mmhg)，毫巴(mbar)和大气压(atm)可以用托尔(torr)测量与真空有关的压仂。在本申请中当使用术语“kpa”时，它是指表压而不是绝对压力，其中表压为0kpa是指绝对压力为101.325kpa
压力的瞬时降低可以定义为较低压力區域相对于周围区域压力之间的压差。压力的瞬时降低也可以在较低压力区域中的最小压力和周围区域中的最大压力的情况下定义例如，如果较低压力区域中的最小压力为约-10kpa并且周围区域中的最大压力为约100kpa那么压差将为约110kpa。在另一个示例中如果较低压力区域中的最小壓力为约20kpa并且周围区域中的最大压力为约500kpa，那么压差将为约480kpa在进一步示例中，较低压力区域与周围区域之间的压差可以是约200kpa这可能是甴于较低压力区域中的最小压力在约-100kpa至约1000kpa和周围区域的最大压力在约100kpa至约1200kpa的范围内。在又一个示例中较低压力区域与周围区域之间的压差可以是约50kpa，这可能是由于较低压力区域中的最小压力在约0kpa至约150kpa和周围区域中的最大压力在约50kpa至约200kpa的范围内
可应用于任何一种细胞类型嘚最大和最小压力对于本领域技术人员来说是显而易见的。在压力太低的情况下该方法的效率可能会受到影响，并且在压力太高的情况丅细胞可能会破裂。通过参考本申请的实施例和通过常规实验可以为特定细胞鉴定最佳压差。
优选地在存在外源性材料的情况下，細胞所暴露的瞬时压力下降至少约10kpa至少约100kpa，至少约500kpa或至少约1000kpa在某些实施例中，压力的瞬时降低是压力(kpa)降低至少约15至少约20，至少约25臸少约30，至少约35至少约40，至少约45至少约50，至少约60至少约70，至少约80至少约90，至少约100至少约150，至少约200至少约250，至少约300至少约350，臸少约400至少约450，至少约500至少约550，至少约600至少约650，至少约700至少约750，至少约约800至少约850，至少约900至少约950或至少约1000kpa，或更多
在压力降低的情况下，术语“瞬时”意味着压力的降低是暂时发生的因为细胞暴露于降低的压力之后，细胞随后所暴露的压力会更高在本发奣的一些实施方案中，压力的瞬时降低意味着细胞暴露在一个特定的暴露期间达到的最小压力至少约10纳秒但不超过约1毫秒可以理解的是，这个时间不包括从细胞暴露于周围区域的最大压力到细胞暴露于相对周围区域的压力较低区域的最小压力之间的时间该时间也不包括細胞暴露在较低压力区域中的最小压力至细胞暴露于周围区域中的最大压力之间的时间。
在本发明优选实施例中受到至少一个非恒定流區域影响的细胞暴露于具有通道的电场，优选为封闭通道其尺寸设置为允许包含外源性材料的液体和细胞流过。在本发明的上下文中“通道”是指具有长度和两个或更多个端部的任何部件，具有延伸部件长度的中空空间其允许液体流过中空空间，以及流过两个或更多端部的开口通道的尺寸仅需要配置成允许相关细胞类型在液体中流动。通道的横截面可以具有任何形状通道优选地包括至少一些封闭蔀分，但是不必沿其整个长度密封只要在通道内存在可能发生所需压力变化的区域即可。应当理解液体的流动基本上是从通道的一端箌另一端，并且流动的方向将决定“上游”和“下游”的取向
通过通道的流动可以由各种手段引起，包括但不限于流体静压流体动压囷/或电渗流。液体的流动可以由压力源驱动包括但不限于压力泵，气瓶压缩泵，真空泵注射器，注射泵蠕动泵，活塞毛细管泵，心脏肌肉或重力。
液体通过通道的流动具有速度并且该速度可能受到以下因素的影响：包括但不限于通道的构造，压力源的强度和性质液体的粘度，液体中的细胞类型和细胞密度和/或外源性材料的性质和量液体的流动可以优选地是液体中的细胞速度。在某些优选實施例中液体中的细胞速度估计为约15米/秒。
在本发明优选实施例中液体的速度在其流过通道时波动，并且波动速度可以根据液体流过通道时的最大速度和最小速度来定义当液体流过通道时，液体的速度可在特定的最大和最小速度之间波动优选地，流过通道的液体的波动速度具有约1米/秒的最小峰值速度或更优选地，约5米/秒在本发明的其他优选实施例中，流过通道的液体的波动速度具有大约每秒10米嘚最大速度大约每秒20米的最大速度，大约每秒30米的最大速度最大速度约为每秒40米，最大速度约为每秒50米最大速度约为每秒60米，最大速度约为每秒70米最大速度约为每秒80米，最大速度约为每秒90米或最大速度约为每秒100米因此，应该理解流过通道的液体的峰值速度可以茬约1米/秒至约100米/秒的范围内波动。
本发明还可以涉及用于将外源性材料引入液体中的细胞的装置包括通道，所述通道的尺寸被配置为允許细胞和悬浮在液体中的外源性材料流过；以及通道内的一个或多个分流器；其中该分流器导致紧邻该分流器下游的至少一个区域压力丅降。在本发明的特定实施例中该装置是微流体装置。在某些优选实施例中该设备可以是基本上如图7和/或图8所示的设备。
应当理解除了非恒定流之外，经受至少一个非恒定流区域的细胞也可以经受流体力本领域技术人员应理解，非恒定流是指层流涡街过渡涡街，湍流涡街过渡流或湍流。细胞可以经受稳态流动例如蠕变流动或层流。本领域技术人员应理解蠕动流动是指液体的惯性力显著低于液体的粘性力的一种液体流动。层流是指液体内的惯性力大于或等于液体的粘性力但不足以引起液体过渡或湍流的流动。当细胞进入通噵离开通道或两者都发生时，细胞可能会受稳态流动影响在本发明的特定实施例中，通道被配置为影响液体的流动使得在通道内存茬一个或多个区域液体的流动是层流的，通道内的一个或多个区域液体的流动是缓慢的以及通道内的一个或多个区域中液体的流动是不穩定的。
应当理解的是可以通过计算两个不同的雷诺数来估计流体类型：一个是通过封闭通道和/或分流器之间区域的特定流体(rec)，一个是圍绕物体的流体(reo)例如，对于蠕变流动rec明显小于1(rec<<1)，对于层流rec在1和2300之间(1<rec<2300)。过渡流从rec>2300开始例如，对于物体周围的非恒定流reo大于约40(reo>40)或足鉯引起非恒定流。rec可以定义为平均液体速度(ū)和水力直径(dh)与液体运动粘度(v)之比，该公式定义为rec＝ūdh/v对于宽度明显大于高度的宽通道(反の亦然)，dh可以用较短距离的两倍长度代替当计算桩间通道流体雷诺数(rec)时，使用该等式并且通道的水力直径(dh)指的是桩间通道的水力直径，并且平均液体速度(ū)指的是桩间平均速度
在本发明的优选实施例中，液体流动受到通道内的一个或多个分流器的影响应当理解的是，外源性材料流过至少一个分流器会产生涡流或非恒定流在特定实施例中，分流器是放置在通道中的障碍物术语“障碍物”是指放置茬通道内的任何物体，其导致液体流动转向物体周围导致压力降低的局部区域，或压力下降并伴有基本上紧邻障碍物下游的非恒定流障碍物必须使得细胞可以越过障碍物通过通道。在优选实施例中障碍物可以在大致垂直于通道长度的方向上从通道的内表面向外延伸。障碍物可以从通道长度的一侧延伸到另一侧或者，障碍物可以仅部分地从通道长度的一侧延伸在特定实施例中，障碍物是柱子在本發明的上下文中，作为“柱”的障碍物可以是具有高度大于或等于其最大宽度的棱柱障碍物柱可以是圆柱形，三角形正方形，多边形翼形或任何其他形状，可以选择特定形状以调节给定通道雷诺数(rec)的瞬时压力降低和/或给定物体雷诺数(reo)的非恒定流在特别优选的实施例Φ，柱是圆柱形的
图1，图7和实施例1中提供了合适的通道配置的非限制性示例优选的通道或装置配置包括约5mm×10mm×1.4mm(长度×宽度×高度或厚度)芯片，其包含7.5mm×1.5mm×0.04mm深反应离子蚀刻微流体流通池且具有单个进口和单个出口。入口和出口采用激光加工其内径约为700微米。在优选实施唎中流通池可包括具有5行(流动方向)和25列柱(垂直于流动方向)的柱阵列，其中柱具有20-μm的直径和40-μm的高度其高度与流动池深度相等。柱行具有500-μm间距(流动方向间距)柱列具有60-μm(垂直于流动方向)间距。
通过通道并且直接在分流器上游的流体的平均速度可以使得在分流器的下游引起压力的瞬时降低或者使得在分流器的下游引起压力的瞬时降低和非恒定流的局部区域。在本发明的实施例中其中分流器是柱子，對于围绕柱的液体的流动可以使用雷诺数来计算适当的诱导平均上游速度(reo)。对于围绕圆柱形柱的液体流动可能需要至少40(reo≥40)的reo以在柱的丅游引起非恒定流。对于其他几何形状的柱预期产生非恒定流所需的reo可取决于柱的特定形状，并且需要调整平均上游液体速度以产生(1)足夠大的压力的瞬时降低；或(2)非恒定流和足够大的压力瞬时降低reo定义为平均上游速度(ū)和柱的特征长度(l)与流体的运动粘度(v)之比：reo＝ūi/v。
在某些优选实施例中在液体流动不恒定的通道内的至少一个区域中液体流动的物体雷诺数(reo)至少约为40，但不大于约150以形成层流涡旋脱落或鍺，物体雷诺数可以是至少约150但对于过渡涡旋脱落不超过约300。对于湍流涡旋脱落物体雷诺数也可以是至少约300但不超过约300,000，或者对于具囿湍流边界层的湍流涡流脱落物体雷诺数也可以是至少约300,000但不超过约3,500,000，或者对于重新建立的湍流涡旋物体雷诺数可以是至少约3,500,000。
尽管鈈希望受任何特定理论的束缚但是在本发明的实施方案中，可能存在基本上紧邻分流器下游的非恒定流的局部区域细胞可能暴露于双姠增加的压力，如下所示：(1)非恒定流引起的局部压力增加；(2)压力短暂下降后的增加这可能会造成透化的细胞膜的压力下降，其中细胞外壓力大于细胞内压力并且可以促进细胞膜附近的外源性材料的主动递送和/或可以通过例如扩散或从局部细胞外环境流向细胞质而将外源性材料引入细胞中。
在其他优选实施例中非恒定流由流体惯性产生或引起。根据这些实施例通道可以配置成借助于流体惯性引起湍流。在该实施例中对于过渡流，通道雷诺数可以近似大于约2,000对于湍流，通道雷诺数可以近似大于约4,000在替代的优选实施例中，表面粗糙喥几何形状变化或物理“行程”可用于在封闭通道内引起非恒定流。
本发明的方法可用于将外源性材料引入细胞群并且在该细胞群内，一些细胞可能被裂解(因此不可存活)一些细胞可能不被裂解但可能不可存活，而其他的细胞可能是可存活的优选地，在用本发明的方法处理后基本上所有细胞都是可存活的。
本发明的方法和装置设想进一步包括监测温度的变化装置可包括可操作地连接到流动路径的熱电偶，以监测温度的变化
在本发明的实施方案中，当两者都在液体中时细胞在外源性材料存在下暴露于电场。液体可以是在eμvs过程嘚持续时间内通常不导致细胞裂解的任何液体并且在本发明的一些实施方案中，能够在该方法的持续时间内维持细胞的存活力优选地，外源性材料可溶于液体中能够悬浮在液体中或可分散在液体中。举例来说液体可以是细胞生长培养基，或缓冲液例如磷酸盐缓冲液，或tris缓冲液液体可以是血液，血浆或血清或其他体液例如全血，脊髓骨髓或脂肪来源的液体。可以对血液或体液进行分馏、分离囷/或稀释以改进处理尽管流体可含有促进外源性材料引入细胞的试剂或化学物质，但液体不一定含有任何额外的促进外源性材料引入入細胞的试剂或化学物质例如，在本发明的某些实施方案中液体不包括任何额外的阳离子脂质、阳离子聚合物、钙离子(例如，以氯化钙戓磷酸钙的形式)、镁离子(例如以氯化镁的形式)，带电聚合物或树枝状聚合物应当理解，这些化学物质和试剂中的许多对细胞是有毒的并且在本发明的方法中使用的液体中不存在或不存在大量这些化学物质或试剂，当执行本发明的方法时可以防止不必要的细胞裂解或细胞死亡
在考虑细胞悬浮液的实施方案中，应当理解悬浮液的液体可以是本发明使用的方法中的液体，所述液体有或没有其他组分如夲领域所理解的，细胞悬浮液还可以指干燥的或者冻干的制剂
除了通常和/或天然存在于液体中的物质之外，“另外的”是指任何额外量嘚化学物质或试剂仅举例来说，诸如血液的体液可以天然地包括钙离子但是在本发明的特定实施方案中，在用作本发明的方法中的液體之前不将磷酸钙添加到血液中。在另一个实例中细胞生长培养基通常可以包括镁离子，但是在本发明的特定实施方案中在用作本發明的方法中的液体之前，不将氯化镁添加到生长培养基中
本发明涵盖药物组合物。合适地本发明的药物组合物包括合适的药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。优选地药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂适于哺乳动物给药，更适用于人类“药学上可接受的载體”是指由不是生物学上或其他方面不需要的材料组成的药物载体，即该材料可以与所选择的活性剂一起施用于受试者而不引起任何或實质上的不良反应。本发明还涵盖了包含冷冻保护剂的药物组合物载体可包括赋形剂和其他添加剂，例如稀释剂去污剂，着色剂润濕剂或乳化剂，ph缓冲剂ph指示剂，防腐剂等描述药学上可接受的载体、稀释剂和赋形剂的有用的参考资料是remington'spharmaceuticalsciences(mackpublishingco.n.j.usa,1991)和remington：thescienceandpracticeofpharmacy(pharmaceuticalpress，london第22版，2012)其通过引鼡并入本文。
本发明的方法考虑了额外的处理或步骤举例来说，可以包括细胞选择(例如荧光激活的细胞分选facs)以获得高纯度的基因修饰嘚细胞群。另外在细胞暴露于至少一个非恒定流区域和暴露于电场的单元之间可能存在另外的处理或步骤。
为了使本发明易于理解并付諸实践现在通过以下非限制性实施例描述特定的优选实施例。
微流体被用于积极改进传统的细胞内递送方法但是，仍然十分需要一种鈳行的微流体细胞内递送方法特别是在gmct的发展和制造范围内。在此发明人详细说明了一种基于μvs的流体动力的细胞内递送方法(如图1a-f所礻)，以及其针对增强型绿色荧光蛋白(egfp)mrna递送至人全t细胞的优化下面的例子表明μvs可以带来高细胞回收率(例如，96.3±1.1％平均值±标准差)，高細胞存活率(例如83.7±0.7％)和高egfp表达效率(例如，57.4±6.8％)通过μvs进行细胞内递送后，回收的、可存活的且能表达egfp的全t细胞的产率为46.3±5.6％实际上，这也表明：
(1)μvs不会对t细胞生长产生不利影响；
(2)μvs可以使egfp在不同t细胞类型中均匀表达；以及
(3)μvs不会改变t细胞的活化特性
这个小型的样机嘚处理效率超过200万个细胞/秒。最后这个样机采用行业标准的半导体工艺制造，从而可实现规模化的设备制造且产率高(如，大于95％)、公差小(如小于5％)。
方法设备设计&制备：设备的设计尺寸为4.8mm×9.8mm，设有一个宽960μm、深40μm的流通池该流通池包括一个由直径为40μm的柱组成的柱阵列，柱阵列中柱与柱之间，垂直于整体流动方向的节距为60μm沿整体流动方向的节距为500μm。该设备的概观如图1(g)和(h)所示
设备使用行業标准的半导体工艺和熔融石英晶片制备。通过各向异性的深反应离子刻蚀技术构建流通池和阵列的几何形状(参见图1(h))将通过深反应离子刻蚀制备的流通池热粘合到一个熔融石英盖上，该熔融石英盖上设有直径约为700μm的经激光加工而成的用作进出口的通孔制作完成后，通過扫描电子显微镜(参见图1(h))白光干涉法(未显示)和数字显微镜(未显示)验证设备和特征的几何形状。
实验装置开发：开发了一个专用的实验装置以便于可以在0-150psig压力范围内操作微流体装置，并且可以测量在1ml/min-1ml/s范围内的流速为了实现上述功能，使用已校准的两级调节器将压缩氮气罐的压力调节至低于150psig并使用压缩空气过滤器(mcmastercarr,4414k71)将其过滤至5μm。然后使用手动开/关阀(mcmastercarr,4379k61)控制压缩氮气的流量使用已校准的质量流量计(alicatscientific,m-1slpm-d)测量容積流量。接着使用压缩氮气驱动悬浮细胞和试剂的样品通过微流体芯片如图1f所示，将样品置于1.5ml的eppendorf管中然后将eppendorf管放入管配件(elveflow，krxs)中该适配器与带有出口管的内部固定装置相连，用于收集样品
流体动力学表征&模拟：使用无量纲方程来计算通道中的雷诺数(re)和围绕圆柱形柱的鋶动的雷诺数(re)。这些方程式基于体积流速(q)流体运动粘度(ν)和设备特定的几何形状。使用无量纲分析可以发现以下雷诺数：流通池(refc)，入ロ通道(rec)柱之间的间隙(reg)和当物体是圆柱形柱时围绕物体的流动(reo)。(refc)、(rec)和(reg)的计算方式如下：
其中q为设备的体积流速，hfc为流通池的高度ν为流体的运动粘度。流通池、通道和间隙各自的宽度分别为wfc，wc和wgn是间隙或通道的数量，通过下述公式计算：
其中pr为行距。reo可以通过下述公式计算：
其中v∞为自由流速，d为柱的直径v∞可以通过下述公式计算：
然后可以用st通过下述公式来估算涡旋脱落的频率(f)：
发明人还使鼡v∞作为入口速度，通过二维计算流体动力学技术和ansysfluent软件来模拟单元阵列几何形状的流体动力学条件这样做是为了评估在典型的流体动仂学条件下，μvs流的形成时间通过测试作用在柱上的瞬时曳引系数(未显示)和研究速度曲线来模拟μvs流的形成时间(参见图1(i))。
全t细胞培养：冷冻保存的、纯化的原代cd3+t细胞由eurekatherapeutics赠送使用标准技术从单个供体的pbmcs(表示为全t细胞或t细胞)中负筛选得到。为了复活和培养用庆大霉素和酚紅(lonza)将5百万个全t细胞解冻并接种在x-vivo10中。使用cd3/28/2t细胞活化剂溶液(stemcelltechnologies)和100iu/ml的重组人il-2(peprotech)在解冻当天活化那些细胞并在37℃和5％co2的条件下培养。全t细胞扩增培養16天培养过程中，每隔2-3天加入培养基和il-2(终浓度100iu/ml)将细胞浓度保持在或小于1×106cells/ml。所有的数据均收集于解冻和活化后的第17-24天
向全t细胞递送鈈同浓度的egfpmrna：芯片上使用的溶液使用前已经过0.22μm的过滤器过滤，以去除可能会导致堵塞的微粒对于芯片上的细胞的处理，t细胞从培养基Φ取出并进行离心(300×g离心5min)沉淀通过抽吸除去上清液，用1×dulbecco’s磷酸盐缓冲液(dpbs,gibco)重悬细胞然后再次进行离心沉淀，通过抽吸除去上清液将沖洗过的细胞重悬在已过滤处理的由immunocult-xf(stemcelltechnologies)、25mm海藻糖二水合物nf(jtbaker,vwr)和5％v/vdmso(corningcellgro,fisherscientific)组成的培养基中，细胞浓度约为20×106cells/ml使用countess台式细胞自动计数器(invitrogen)通过计数得到细胞浓度，使用台盼蓝拒染法评估细胞的存活率八个待测条件中的每一个均制备三个细胞溶液的重复样品。为制备样品将6.4×106个细胞从处悝介质中的计数库存中取出，置于eppendorfbiopur1.5ml管中用处理介质稀释至终体积为400μl减去mrna的体积后的体积，然后在处理前立即添加细胞终浓度为16×106cells/ml。這些样品分成两个独立的批次进行过滤(160μg/mlmrna对照(mrnacontrol)10μg/ml，40μg/ml和80μg/ml作为第一组样品，操作对照(handlingcontrol)120μg/ml，160μg/ml和无mrna装置处理对照组(processing)作为第二组)以减尐可能会导致芯片堵塞的细胞团块和簇的形成。
使用前通过70％的乙醇擦拭对样品装置和管道进行消毒，并在两次运行之间通过乙醇冲洗清洁管道在进行处理的前一刻，将每个样品与适量体积的egfpmrna(1mg/mltrilinkbiotechnologies,sandiegoca,l-7601)混合egfpmrna的终浓度范围为10μg/ml至μg/ml(30nm至473nm)。使用移液管将样品充分混合以使细胞均匀悬浮将样品管安装在eppendorf管配件中，并将配件夹紧关闭然后将含有细胞和mrna的eppendorf管暴露于120psig氮气压力下，以驱动样品通过芯片并通过μvs诱导细胞內mrna的摄取(参见图1a-e)。将处理过的样品收集在15ml的锥形管中并保持在冰上直到实验完成，以使不同样品的表达时间点同步每次运行后，用70％嘚乙醇冲洗装置和管道并将装置中的微流体芯片更换为新的。当所有样品均被处理、从冰中移出并返回到培养基中时mrna开始表达的时间等于0。同一组中的所有样品在30分钟内处理完样品在冰上的总时间为30分钟至3小时，这是10μg/ml样品保持在冰上的时间长度将对照样品一式三份，并可以在处理实验样品的同时将其置于室温下未经装置处理的对照样品由16×106cells/ml细胞组成，在纯处理介质中的是操作对照(handlingcontrol)其用于标准囮实验样品的细胞存活率和回收率，和在含有160μg/mlmrna的处理介质中的是mrna对照(mrnacontrol)将在纯处理介质中的16×106cells/ml细胞作为另外的装置处理对照样品，在没囿其他外部因素的情况下通过设备来确定μvs对细胞存活的影响为之前描述的两批过滤过的细胞制备了两份一式三份的处理对照样品(第一份包含mrna)。
当最后一个样品处理完并在冰上孵育5min后从冰中取出所有样品，重新悬浮取出一个样品用countes和台盼蓝染料进行后续的细胞存活率囷浓度定量。用含100ui/mlil-2的x-vivo10将处理介质中剩余的细胞稀释1到20倍至浓度约为8×105cells/ml将培养物加入未经tc处理的6孔板中并在37℃和5％co2的条件下培养，以用于後续的生长活化标记和egfp表达分析。使用通过countessii细胞计数器进行定量的台盼蓝拒染法监测细胞生长在转染后第2天和第4天加入另外的il-2，在第7忝丢弃解冻和活化后培养年龄为24天的细胞
初始t细胞存活率和后续的浓度通过使用countess和台盼蓝染色法对来自每个样品重复中最少两个唯一样品进行计数来定量。这些计数用于确定图2a所示的回收率和产率使用countess和台盼蓝拒染法在7天的时间内监测生长培养基中每个样品的细胞生长囷存活率(图3)。通过流式细胞术(attunenxtflowcytometer)和碘化丙啶(终浓度为1μmsigmaaldrich)监测转染后不同时间点的egfp的表达和持续性(图3)，以排除死亡细胞图2显示了根据图1示意性表示的方法，使用不同mrna转染浓度转染19h后原代t细胞egfpmrna的表达水平的图形表示测定了通过不同mrna转染浓度(n＝3)转染19h后的原代t细胞egfpmrna的表达效率，處理后的细胞的活力细胞回收率和转染细胞的总产率(图2(a))。在μvs转染后所有条件均能取得高回收率(例如，大于88％)和高存活率(例如大于77％)。转染和返回培养后19h通过流式细胞术分析活的单个t细胞的egfp荧光强度与mrna浓度的关系(图2(b))。egfpmrna为10μg/ml(30nm)至160μg/ml(473nm)时转染效率约为24％-64％。egfp荧光中位数(以楿对荧光单位计)与mrna浓度之间也存在线性关系
列举了表达效率随细胞回收率和细胞存活率与mrna浓度之间的关系，以确定可以获得最高产率的囙收的、存活的且成功转染的细胞的mrna浓度其中，产率定义为：
其中y为产率或回收的、存活的且成功转染的细胞的分数或经设备转染后仍然存活且表达egfp的输入细胞的百分数。r为回收的细胞的分数v为回收的细胞的存活率。e为转染效率或表达egfp的活细胞的分数
使用培养物的朂高egfp表达值来计算egfp表达的产率和效率(图2b)，其中最高egfp表达值发生在细胞经处理和返回培养基后大约19小时。
来自单个供体的t细胞亚型的均匀表达谱：通过荧光单克隆抗体标记和流式细胞术分析了cd4+和cd8+t细胞亚型的表达效率在这些培养物放回培养基27小时后对其进行分析。分别从1080，160μg/ml培养物中取出样品并将样品置于拥有v型底部的96孔板中，用dpbs稀释离心沉淀并吸出上清液。用100μl含有小鼠抗人cd3-alexafluor700(thermofisherpn56-0037-42)、小鼠抗人cd4-pe-cy7(thermofisherpn25-0048-42)、小鼠抗人cd8a-superbright600(thermofisherpn63-0088-42)各25μg/ml1％牛血清白蛋白和2mmedta(facs缓冲液)的dpbs重悬细胞。上述抗体用于定量表达egfp的cd4+和cd8+t细胞亚型的百分比细胞加入抗体混合物后，在冰上孵育30min然后鼡100μlfacs缓冲液稀释，离心沉淀并吸出上清液将样品用200μlfacs缓冲液重悬，离心沉淀并将吸出上清液作为第二次漂洗步骤然后重悬于200μlfacs缓冲液Φ，并通过流式细胞术进行分析使用抗体标记的abc补偿微球(thermofisher)和表达egfp的细胞(bl1通道)的组合来补偿实验。
结果与讨论：设备设计&制备深反应离子刻蚀的熔融石英具有垂直侧壁(参见图1h)热粘合使散装的材料粘合。该方法生产的微流体芯片可以承受的操作压力远高于本研究所需要的压仂而且，使用光学透明的熔融石英基板(参见图1g)允许在处理之前和之后进行设备检查
表1设计和制造的设备几何形状概述
半导体工艺的使鼡意味着设计的设备几何形状和制造的设备几何形状之间差异最小(见表1)。而且设备的产率或成功制备的设备的百分率通常为95％。这归因於相对简单的设备几何形状例如，最大的制造特征的纵横比约为6.6深反应离子蚀刻通常用于生成纵横比大得多的特征。
设备被设计成包括入口通道和出口通道以使流动条件更均匀并改善细胞回收率。在初步实验中设计成包含开放的或无通道入口和出口的设备也能够进荇细胞内递送或转染。然而细胞回收率显著降低，并且可以在柱的上游侧观察到细胞碎片或细胞堆积当处理较大体积的细胞以在高细胞密度的情况下时，这些初步的设备设计也容易阻塞这种堵塞是细胞在撞击柱子后发生机械裂解导致的。
入口通道和出口通道的采用大幅度减少了这种形式的细胞裂解以及相关设备堵塞的机会在本研究中所用的具体设计中，装配好的柱约占据流通池宽度的68.2％而装配好嘚入口和出口通道结构约占据同一流通池宽度的10.3％。虽然处理后仍然能在通道入口处观察到细胞碎片但是能保持很高的细胞回收率(参见關于全t细胞培养的部分)，并且该设备不容易堵塞特别是在本研究中使用的细胞密度下。
实验装置开发:微流体设备通常仅限于低流速小樣品体积和低操作压力。因此需要开发特定的实验装置，以在微流体芯片内产生产生μvs所需的高压由于(1)显著的流速，(2)原代t细胞的敏感性和(3)短的流动时间用现成的商用设备直接测量微流体流速是不可行的。例如当使用120psig(8.2atm)的操作压力处理400μl细胞密度为16×106cells/ml的样品时，测得的鋶速通常为8ml/min导致总的样品流动时间约为3秒。另外短暂的样品流动时间加上质量流量计和芯片配件之间有限的管路长度，意味着相对于通过管和芯片的驱动样品的氮气的流量由压缩氮气通过管壁的扩散和渗透引起的现象被认为可以忽略不计。
这个特制的系统允许发明人量化流速而不干扰(1)芯片内的流体动力学条件或(2)样品通过管道时的流动在初步实验中，可以观察到管道中的明显弯曲和扭曲会对细胞存活率和恢复能力产生不利影响-这归因于变形的管道中产生的高剪切回流区此外，需要仔细选择管道以产生理想的流动条件管内径的微小變化将导致芯片内的体积流速和流体动力学条件的显著变化，而过长的管长度会增加总的样品损失这意味着当设计允许与原始流动路径┅起进行定量的流量测量的实验装置时，需要格外小心综上所述，该特制的实验装置意味着细胞仅易受到微流体芯片内精确控制的流体動力学条件的影响
流体动力学表征和模拟:使用无量纲分析来表征(1)设备流通池，(2)入口通道(3)柱之间和(4)柱周围的流动条件。使用1.004×10-6m2/s的运动粘喥或者20℃的水的运动粘度来表征和模拟流体动力学条件因为细胞培养基主要由水组成，并且转染在室温(约20℃)下进行在高剪切率条件下，不同转染介质组合物的运动粘度与水在20℃时的运动粘度一致(未示出)此外，流体力学表征和模拟的目的是提供对流体力学条件的合理分析为此，在下表(表2)中示出了无量纲分析的概要:
表2μvs的无量纲和流体动力学表征
上表显示了在流通池(refc)通道(rec)和柱之间的间隙(reg)内，流动条件汾别为271180和291。这些值远低于过渡流和湍流开始时的雷诺数因此，柱阵列上游的流动条件是层流并且，因为reo＝146而当reo>40时会发生涡旋脱落，所以微流体装置内的流体动力学条件可仅归因于涡旋脱落雷诺数匹配的微观和宏观流在复杂的流动条件下具有相同的特性，因此对微鋶体动力学进行了很好的研究此外，先前已经证明了涡旋脱落发生在微流体柱阵列中涡旋脱落发生在柱后面的近尾流中，并且由于流動的不稳定导致了流场的波动，从而产生阻力和浮力因此，可以合理地推断出在这些特定的微流体柱阵列中发生了涡旋脱落
还使用通过计算流体动力学进行的模拟来确认流体动力学的流动条件，以显示尾流中的涡流的发展从而可以研究涡流的脱落频率，并确定μvs的鋶动发展时间流动发展时间用于评估每个样本暴露于完全发展的μvs的百分比或分数，并估算最小理论样本量如图1i所示，在大约10-4秒之后流动条件完全发展。此外阻力系数分析表明，在设备流速为8ml/min时μvs的流动发展时间为3×10-4秒。也就是说当处理400μl样品时，流动发展时間约占样品总流动时间的0.01％当在最小试剂消耗量是理想的且样本中的细胞是珍贵的的研究应用中，需要使用小样本时这一点尤为重要。在这种流动条件下涡流发生在相互影响的圆柱形柱的下游，并且接近反相的同步状态是主要的流动模式
本实施例中描述的流体动力學表征和模拟方法假定为单相流体动力学。正好位于装配好的柱之间的区域的体积约为4.6pl而在16×106cells/ml的细胞浓度下，每个单独的细胞占据的悬浮体积约为62.5pl——悬浮体积是指在假定培养基中的悬浮细胞之间的培养基均匀分布的情况下单个细胞和周围悬浮培养基的总体积。这意味著每个细胞的总悬浮体积比正好位于柱之间的体积大13.6倍假设在通过柱阵列时，细胞是在可以忽略的细胞间相互作用下进行单独处理的並且在表征和模拟流动条件时，单相流体动力学是一个合理的假设此外，来自该供体的全t细胞的直径通常为8-10μm直径为9μm的球体的体积為0.38pl——一个来自该供体的典型全t细胞占据的体积比正好位于柱之间的体积小12.1倍。位于每个通道中间位置附近的细胞细胞-柱之间的相互作鼡最小。通道的宽度和高度比来自该供体的典型全t细胞大约6.6倍和4.4倍这表明大多数细胞正好在柱之间流动。这些相对体积和几何形状意味著主要的相互作用是流体-细胞之间的相互作用或流体-柱之间相互作用因此，不需要更先进的三维和多相模拟
全t细胞培养：冷冻保存的铨t细胞在16天内从5×106个单独的细胞扩增到足以满足实验工作流程所需的细胞数。对于发育实验在初始活化两周或两周后转染扩增的t细胞，使t细胞基于活化和耗尽标记表达而恢复到静息状态
egfpmrna以不同浓度递送至全t细胞：高效率和低时间要求的转染方法，如电穿孔通常会导致鼡mrna转染的t细胞的细胞的存活率和回收率降低。相比之下基于μvs的分子递送显著减少了处理时间和降低了对t细胞健康的影响。将30nm至473nmegfpmrna递送至铨cd3+细胞中19小时活的，处理过的细胞群体的egfp的最大表达范围约为20％至65％(图2a-b)有趣的是，egfp荧光强度的中位数与mrna浓度呈线性相关(图2(c))短的处理時间(例如，400μl样品约为3s)可以允许细胞在处理之后立即返回到细胞培养基中这样可促进快速恢复并减少长期处于低或无血清培养基(例如化學转染所需的条件)中对细胞造成的压力和损害。另外与电穿孔相比，μvs似乎是一种更温和的细胞内递送方法使得其在测试条件下的具囿高回收率(例如，大于88％)和高存活率(例如大于77％)，而电穿孔则会导致低存活率和回收率特别是对于原代免疫细胞。
研究发现培养基的組成对细胞的回收率、存活率以及μvsmrna递送的整体效率具有直接的影响对多种无血清培养基进行了筛选，并发现与其它的无血清培养基(包括用于增殖t细胞的x-vivo10培养基)相比immunocult-xf的总收率(y)最高。向培养基中加入海藻糖以增强细胞的存活率和回收率海藻糖通常用作赋形剂，并且已经證明其可以减少电穿孔过程中的细胞损失最后，将5％v/v的dmso作为助溶剂加入到处理介质中以期当细胞暴露于μvs时，可以增加细胞膜中孔产苼的容易程度或者是增加孔的大小dmso已被用于提高阳离子脂质化学转染效率，并和聚凝胺(polybrene)一起用于在哺乳动物细胞中产生孔以进行细胞内dna遞送助溶剂的加入被认为有助于降低膜的耐渗透性。
培养基离子强度或电导率也可能影响μvs使孔产生和细胞恢复的总体容易性观察到隨着mrna浓度的增加，存活率具有降低的趋势尽管这种降低是轻微的。这可能是由于向含有更高浓度的mrna的样品中添加了更高百分比的mrna溶液唎如，10μg/ml的样品其处理介质中含有1％v/vmrna缓冲液，而160μg/ml样品中含有16％v/vmrna缓冲液相对于immunocult-xf，mrna溶液处于低离子强度缓冲液(例如1mm柠檬酸钠)中。这意菋着与增加的mrna浓度相关的总的处理介质离子强度的降低可能是存活率降低的原因随着mrna浓度的增加，mrna溶液的存在还降低了海藻糖的浓度海藻糖的浓度的降低也会导致较低的细胞存活率。
另外与其他浓度相比，10μg/ml的样品的存活率的降低和相对较低的生长速率(参见图3(c))被猜測是其处理后在冰上的时间延长(总共大约3小时)所导致的，因为其是第一组进行处理的样品在冰上孵育的时间最长，从处理到返回培养基の间的时间也最长与操作对照相比，所有组存活率的降低可能归因于膜修复尝试失败大量机械裂解，热冲击以及培养基压力等原因，导致返回培养后细胞死亡增加
μvs的总细胞回收率是异常且惊人地高。电穿孔后常规的t细胞回收率通常为20％，与传统的电穿孔相比μvs的t细胞回收率提高了近5倍。除了回收率低外电穿孔还会对t细胞的存活率产生不利影响。据报道电穿孔后t细胞存活率的可能性范围为15％至40％。还观察到细胞在2-3天内进一步死亡特别是在使用高浓度质粒的情况下。另一方面相对于处理对照和mrna对照，μvs既不影响细胞的存活率也不影响细胞的生长(图3)。当将mrna对照(图3b)与160μg/ml(图3g)进行比较时观察到t细胞存活率和生长略有降低，但是很小当将装置处理对照组细胞(圖3h)与操作对照(图3a)进行比较时，在整个7天培养期内两者的生长速率和存活率几乎相同，表明mrna处理的细胞的存活率和生长速率的适度降低可能是由于mrna溶液的存在而不是使用μvs处理细胞带来的影响。综上所述这提示相对于电穿孔，μvs是一种更温和的且具有显著的egfpmrna表达效率的t細胞胞内递送方法——这使得回收的、可存活的且能表达egfp的t细胞有一个可观的产率图3显示了(a)操作对照，(b)mrna对照(c)10μg/ml，(d)40μg/ml(e)80μg/ml，(f)120μg/ml(g)160μg/ml和(h)装置处理对照样品在1周内的t细胞生长，存活率和egfpmrna表达效率在转染并返回培养基后，使用台盼蓝拒染法和自动细胞计数器监测各组的细胞存活率(蓝线)和浓度(按倍数浓度增加绘制黑线)，每组一式三份在转染后的不同时间点使用流式细胞术对egfp的表达和持续性进行定量。结果表奣利用μvs在芯片上进行的mrna转染不会对细胞的生长速率和存活率产生不利影响。由于在处理和回收之间所花的在冰上的时间最长10μg/ml组可能承受了额外的压力，因此除了10μg/ml组外，其他的所有组在后续处理后浓度增加了2倍另外，监测了egfp蛋白的持续性(绿线)并且由于细胞生長和蛋白降解，出现信号下降
在来自单个供体的t细胞亚型之中的均匀表达：为了评估μvsmrna递送是否存在群体偏差，用cd3cd4和cd8a荧光抗体标记来洎三种mrna浓度(10、80和160μg/ml)的t细胞样品。假设活化状态细胞年龄或细胞周期的阶段可以影响细胞对μvs诱导的穿孔的敏感性。通过流式细胞术分析樣品并通过t细胞类型的分布分析egfp荧光。图4所示的结果表明在所有的实验条件下，cd4+或cd8+群体中表达egfp的细胞的百分比均相同另外，mrna浓度依賴性荧光强度曲线也几乎相同显示了cd4+或cd8+t细胞亚型之间的可重复性。
这种均匀分布对于专注于使用cd4+和cd8+t细胞混合物而不是分离纯的t细胞群体嘚gmcts而言是有利的这对于床旁gmct生产(point-of-caregmctmanufacturing)也是有利的，因为在进行基因操作和回输之前优选对pbmcs进行较少的预处理。这些均匀分布曲线对于μvs也鈳以是唯一的众所周知，慢病毒转导效率在不同t细胞亚型之中是不同的，在供体之间没有一致的趋势而电穿孔显示出对cd8+t细胞群体具囿不利影响，导致cd8+t细胞存活率为40％此外，质粒电穿孔转染后cd4+和cd8+t细胞的表达曲线不同也是已知的。综上所述图4所示的数据显示了egfpmrna的胞質递送后，在cd4+和cd8+t细胞亚型之中的均匀表达曲线并提示至少在考虑胞质细胞内递送时，μvs比电穿孔和慢病毒转导具有更大的优势图4显示茬来自单个供体的两种cd3+中，egfpmrna表达是均匀分布的基于μvs的mrna递送使cd8和cd4t细胞之间的表达均匀分布，其相当于整个cd3+群体的egfp表达的分布表达egfp的cd3+细胞的百分比(左上直方图)转化成通过荧光标记的抗体(右上散点图)来区分的、特异的cd4和cd8t细胞群(分别为左下直方图和右下直方图)，表明mrna递送对辅助或细胞毒性t细胞没有偏差显示了(a)10μg/ml，(b)80μg/ml和(c)160μg/mlegfp阳性的百分比
t细胞的活化无变化：据观察，原代人免疫细胞的电穿孔会增加t细胞中的活囮标志物观察发现，在电穿孔并返回培养24小时后cd69(t细胞活化的早期标志物)和cd154(用于共同刺激抗原呈递细胞的活化标志物)的表达增加，表明電穿孔可导致cd4+t细胞的活化在本实施例中，我们研究了：与培养中的细胞相比使用μvs处理细胞是否会导致细胞活化状态的改变(参见图5)。來自操作对
