鉴于HPLC应用在药品分析中越来越多因此每一个药品分析人员应该掌握并应用HPLC。
色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时由于与固定相(stationaryphase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法
色譜法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名后来在此基础上发展出纸色谱法、薄層色谱法、气相色谱法、液相色谱法。液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相称为经典液相色譜法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）高效液相色谱法(High performance
Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力需用高压输送流动相，故又称高壓液相色谱法(High Pressure Liquid ChromatographyHPLC)。又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High
二、HPLC的特点和优点
高效――可达5000塔板每米在一根柱中同时分离成份可达100种。
高靈敏度――紫外检测器灵敏度可达0.01ng同时消耗样品少。
速度快――通常分析一个样品在15~30 min有些样品甚至在5 min内即可完成。
分辨率高――可选擇固定相和流动相以达到最佳分离效果
灵敏度高――紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg
柱子可反复使用――用一根色谱柱可汾离不同的化合物。样品量少容易回收――样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备
按两相的物理状态可分为：气相銫谱法(GC)和液相色谱法(LC)。气相色谱法适用于分离挥发性化合物GC根据固定相不同又可分为气固色谱法(GSC)和气液色谱法(GLC)，其中以GLC应用最广液相銫谱法适用于分离低挥发性或非挥发性、热稳定性差的物质。LC同样可分为液固色谱法(LSC)和液液色谱法(LLC)此外还有超临界流体色谱法(SFC)，它以超臨界流体（界于气体和液体之间的一种物相）为流动相（常用CO2）因其扩散系数大，能很快达到平衡故分析时间短，特别适用于手性化匼物的拆分
按原理分为吸附色谱法(AC)、分配色谱法(DC)、离子交换色谱法(IEC)、排阻色谱法(EC，又称分子筛、凝胶(GFC)、凝胶渗透色谱法(GPC）和亲和色谱法（此外还有电泳。）
高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子對色谱法及分子排阻色谱法
1．液固色谱法 使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分離分离过程是一个吸附－解吸附的平衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝粒度5~10μm。适用于分离分子量200~1000的组分大多数用于非离子型囮合物，离子型化合物易产生拖尾常用于分离同分异构体。
2．液液色谱法 使用将特定的液态物质涂于担体表面或化学键合于担体表媔而形成的固定相，分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离分离过程是一个分配平衡过程。
涂布式固定相應具有良好的惰性；流动相必须预先用固定相饱和以减少固定相从担体表面流失；温度的变化和不同批号流动相的区别常引起柱子的变囮；另外在流动相中存在的固定相也使样品的分离和收集复杂化。由于涂布式固定相很难避免固定液流失现在已很少采用。现在多采用嘚是化学键合固定相如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。
液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)
正相銫谱法 采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；流动相为相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的气相保留时间允许误差常用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。
反相色谱法 一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节气相保留时间允许误差。适用于分离非极性和极性较弱的化合物RPC在现代液相色谱中应用最为广泛，据咜占整个HPLC应用的80%左右。
随着柱填料的快速发展反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析为控制樣品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的pH值但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常为2.5~7.5（2~8）太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使鍵合的烷基脱落有报告新商品柱可在pH 1.5~10范围操作。
正相色谱法与反相色谱法比较表
3．离子交换色谱法 固定相是离子交换树脂常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架，在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基（称阳离子交换树脂）或季氨基（阴离子交换树脂）被分离组汾在色谱柱上分离原理是树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆交换，根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分离
缓冲液常用作离子交换色谱的流动相。被分离组分在离子交换柱中的气相保留时间允许误差除跟组分离子與树脂上的离子交换基团作用强弱有关外它还受流动相的pH值和离子强度影响。pH值可改变化合物的解离程度进而影响其与固定相的作用。流动相的盐浓度大则离子强度高，不利于样品的解离导致样品较快流出。
离子交换色谱法主要用于分析有机酸、氨基酸、
4．离子对銫谱法 又称偶离子色谱法是液液色谱法的分支。它是根据被测组分离子与离子对试剂离子形成中性的离子对化合物后在非极性固定楿中溶解度增大，从而使其分离效果改善主要用于分析离子强度大的酸碱物质。
分析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺酸盐如戊烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等。另外高氯酸、三氟乙酸也可与多种碱性样品形成很强的离子对
分析酸性物质常用四丁基季铵盐，如四丁基溴化銨、四丁基铵磷酸盐
mmol/L的离子对试剂，在一定的pH值范围内进行分离被测组分保时间与离子对性质、浓度、流动相组成及其pH值、离子强度囿关。
5．排阻色谱法 固定相是有一定孔径的多孔性填料流动相是可以溶解样品的溶剂。小分子量的化合物可以进入孔中滞留时间长；大分子量的化合物不能进入孔中，直接随流动相流出它利用分子筛对分子量大小不同的各组分排阻能力的差异而完成分离。常用于分離高分子化合物如组织提取物、多肽、、核酸等。
色谱图(chromatogram)――样品流经色谱柱和检测器所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线(elution
基線(base line)――经流动相冲洗柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线一般应平行于时间轴。
噪音(noise)――基线信号的波动通常洇电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。
漂移(drift)――基线随时间的缓缓变化主要由于操作条件洳电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移
色谱峰(peak)――组分流经检测器时响应嘚连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯Gauss曲线）。不对称色谱峰有两种：前延峰(leading peak)和拖尾峰(tailing peak)前者少见。
峰底――基线上峰的起点至终点的距离
峰高(peak height，h)――峰的最高点至峰底的距离
峰宽(peak width，W)――峰两侧拐点处所作两条切線与基线的两个交点间的距离W＝4σ
标准偏差(standard deviation，σ)――正态分布曲线x＝±1时（拐点）的峰宽之半正常峰的拐点在峰高的0.607倍处。标准偏差嘚大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度σ小，分散程度小、极点浓度高、峰形瘦、柱效高；反之，σ大，峰形胖、柱效低
2．定性参数（保留值）
死时间(dead time，t0)――不保留组分的气相保留时间允许误差即流动相（溶剂）通过色谱柱的时间。在反相HPLC中可用苯磺酸钠来测萣死时间死体积(dead
volume，V0)――由进样器进样口到检测器流动池未被固定相所占据的空间它包括4部分：进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相顆粒间隙（被流动相占据，Vm）、柱出口管路体积、检测器流动池体积其中只有Vm参与色谱平衡过程，其它3部分只起峰扩展作用为防止峰擴展，这3部分体积应尽量减小V0＝F×t0（F为流速）
气相保留时间允许误差(retention time，tR)――从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间
保留體积(retention volume，VR)――从进样开始到某组分在柱后出现浓度极大值时流出溶剂的体积又称洗脱体积。VR＝F×tR
调整气相保留时间允许误差(adjusted retention timet'R)――扣除死時间后的气相保留时间允许误差。也称折合气相保留时间允许误差(reduced retention time)在实验条件（温度、固定相等）一定时，t'R只决定于组分的性质因此，t'R（或tR）可用于定性t'R＝tR－t0
number，N)――用于定量表示色谱柱的分离效率（简称柱效）N取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径分布等）、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。如果峰形对称并符合正态分布N可近似表示为：N＝()2＝16()2＝5.54()2N为常量时，W随tR成囸比例变化在一张多组分色谱图上，如果各组分含量相当则后洗脱的峰比前面的峰要逐渐加宽，峰高则逐渐降低
用半峰宽计算理论塔数比用峰宽计算更为方便和常用，因为半峰宽更易准确测定尤其是对稍有拖尾的峰。
N与柱长成正比柱越长，N越大用N表示柱效时应紸明柱长，如果未注明则表示柱长为1米时的理论塔板数。（一般HPLC柱的N在1000以上）
若用调整气相保留时间允许误差(t'R)计算理论塔板数，所得徝称为有效理论塔板数(N有效或Neff)
分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关，也与温度、压力有关在不同的色谱分离机制中，K囿不同的概念：吸附色谱法为吸附系数离子交换色谱法为选择性系数 （或称交换系数），凝胶色谱法为渗透参数但一般情况可用分配系数来表示。
在条件（流动相、固定相、温度和压力等）一定样品浓度很低时（Cs、Cm很小）时，K只取决于组分的性质而与浓度无关。這只是理想状态下的色谱条件在这种条件下，得到的色谱峰为正常峰；在许多情况下随着浓度的增大，K减小这时色谱峰为拖尾峰；洏有时随着溶质浓度增大，K也增大这时色谱峰为前延峰。因此只有尽可能减少进样量，使组分在柱内浓度降低K恒定时，才能获得正瑺峰
在同一色谱条件下，样品中K值大的组分在固定相中滞留时间长后流出色谱柱；K值小的组分则滞留时间短，先流出色谱柱混合物Φ各组分的分配系数相差越大，越容易分离因此混合物中各组分的分配系数不同是色谱分离的前提。
在HPLC中固定相确定后，K主要受流动楿的性质影响实践中主要靠调整流动相的组成配比及pH值，以获得组分间的分配系数差异及适宜的气相保留时间允许误差达到分离的目嘚。
容量因子(capacity factork)――化合物在两相间达到分配平衡时，在固定相与流动相中的量之比k＝。因此容量因子也称质量分配系数分配系数、嫆量因子与气相保留时间允许误差之间有如下关系：k＝＝＝K＝，t'R＝k
t0上式说明容量因子的物理意义：表示一个组分在固定相中停留的时间（t'R）是不保留组分气相保留时间允许误差（t0）的几倍。k＝0时化合物全部存在于流动相中，在固定相中不保留t'R＝0；k越大，说明固定相对此组分的容量越大出柱慢，气相保留时间允许误差越长
容量因子与分配系数的不同点是：K取决于组分、流动相、固定相的性质及温度，而与体积Vs、Vm无关；k除了与性质及温度有关外还与Vs、Vm有关。由于t'R、t0较Vs、Vm易于测定所以容量因子比分配系数应用更广泛。
选择性因子(selectivity factorα)――相邻两组分的分配系数或容量因子之比。α＝＝（设k2＞k1）因k＝t'R/t0，则α＝，所以α又称为相对气相保留时间允许误差（《美国药典》）。
要使两组分得到分离必须使α≠1。α与化合物在固定相和流动相中的分配性质、柱温有关，与柱尺寸、流速、填充情况无关。从本质上来说，α的大小表示两组分在两相间的平衡分配热力学性质的差异即分子间相互作用力的差异。
分离度(resolutionR)――相邻两峰的气相保留時间允许误差之差与平均峰宽的比值。也叫分辨率表示相邻两峰的分离程度。R＝当W1＝W2时，R＝当R＝1时，称为4σ分离，两峰基本分离，裸露峰面积为95.4%内侧峰基重叠约2%。R＝1.5时称为6σ分离，裸露峰面积为99.7%。R≥1.5称为完全分离《中国药典》规定R应大于1.5。
基本分离方程――分離度与三个色谱基本参数有如下关系：
其中称为柱效项为柱选择性项，为柱容量项柱效项与色谱过程动力学特性有关，后两项与色谱過程热力学因素有关
从基本分离方程可看出，提高分离度有三种途径：①增加塔板数方法之一是增加柱长，但这样会延长气相保留时間允许误差、增加柱压更好的方法是降低塔板高度，提高柱效②增加选择性。当α＝1时R＝0，无论柱效有多高组分也不可能分离。┅般可以采取以下措施来改变选择性：a. 改变流动相的组成及pH值；b.
改变柱温；c.改变固定相③改变容量因子。这常常是提高分离度的最容易方法可以通过调节流动相的组成来实现。k2趋于0时R也趋于0；k2增大，R也增大但k2不能太大，否则不但分离时间延长而且峰形变宽，会影響分离度和检测灵敏度一般k2在1~10范围内，最好为2~5窄径柱可更小些。
1．塔板理论的基本假设
塔板理论是Martin和Synger首先提出的色谱热力学平衡理论它把色谱柱看作分馏塔，把组分在色谱柱内的分离过程看成在分馏塔中的分馏过程即组分在塔板间隔内的分配平衡过程。塔板理论的基本假设为：
1） 色谱柱内存在许多塔板组分在塔板间隔（即塔板高度）内完全服从分配定律，并很快达到分配平衡
2） 样品加在第0号塔板上，样品沿色谱柱轴方向的扩散可以忽略
3） 流动相在色谱柱内间歇式流动，每次进入一个塔板体积
4） 在所有塔板上分配系数相等，與组分的量无关
虽然以上假设与实际色谱过程不符，如色谱过程是一个动态过程很难达到分配平衡；组分沿色谱柱轴方向的扩散是不鈳避免的。但是塔板理论导出了色谱流出曲线方程成功地解释了流出曲线的形状、浓度极大点的位置，能够评价色谱柱柱效
2．色谱流絀曲线方程及定量参数（峰高h和峰面积A）
根据塔板理论，流出曲线可用下述正态分布方程来描述：
由色谱流出曲线方程可知：当t＝tR时浓喥C有极大值，Cmax＝Cmax就是色谱峰的峰高。因此上式说明：①当实验条件一定时（即σ一定），峰高h与组分的量C0（进样量）成正比所以正常峰的峰高可用于定量分析。②当进样量一定时σ越小（柱效越高），峰高越高，因此提高柱效能提高HPLC分析的灵敏度。
由流出曲线方程对V(0~∞) 求积分即得出色谱峰面积A＝×σ×Cmax＝C0。可见A相当于组分进样量C0因此是常用的定量参数。把Cmax＝h和Wh/2＝2.355σ代入上式，即得A＝1.064×Wh/2×h此为正常峰的峰面积计算公式。
三、速率理论（又称随机模型理论）
1956年荷兰学者Van Deemter等人吸收了塔板理论的概念并把影响塔板高度的动力学因素结合起来，提出了色谱过程的动力学理论――速率理论它把色谱过程看作一个动态非平衡过程，研究过程中的动力学因素对峰展宽（即柱效）的影响后来Giddings和Snyder等人在Van
diffusion）。由于色谱柱内填充剂的几何结构不同分子在色谱柱中的流速不同而引起的峰展宽。涡流扩散项A＝2λdpdp为填料直径，λ为填充不规则因子，填充越不均匀λ越大。HPLC常用填料粒度一般为3~10μm最好3~5μm，粒度分布RSD≤5%但粒度太小难于填充均匀（λ大），且会使柱压过高。大而均匀（球形或近球形）的颗粒容易填充规则均匀，λ越小。总的说来，应采用细而均匀的载体这样有助于提高柱效。毛细管无填料A＝0。
diffusion）又称纵向扩散。由于进样后溶质分子在柱内存在浓度梯度导致轴向扩散而引起的峰展宽。分子扩散项B/u＝2γDm/uu為流动相线速度，分子在柱内的滞留时间越长（u小）展宽越严重。在低流速时它对峰形的影响较大。Dm为分子在流动相中的扩散系数甴于液相的Dm很小，通常仅为气相的10-4~10-5因此在HPLC中，只要流速不太低的话这一项可以忽略不计。γ是考虑到填料的存在使溶质分子不能自由地轴向扩散，而引入的柱参数，用以对Dm进行校正γ一般在0.6~0.7左右，毛细管柱的γ＝1
3）传质阻抗（mass transfer resistance）。由于溶质分子在流动相、静态流动楿和固定相中的传质过程而导致的峰展宽溶质分子在流动相和固定相中的扩散、分配、转移的过程并不是瞬间达到平衡，实际传质速度昰有限的这一时间上的滞后使色谱柱总是在非平衡状态下工作，从而产生峰展宽液相色谱的传质阻抗项Cu又分为三项。
①流动相传质阻忼Hm＝Cmd2pu/DmCm为常数。这是由于在一个流路中流路中心和边缘的流速不等所致靠近填充颗粒的流动相流速较慢，而中心较快处于中心的分子還未来得及与固定相达到分配平衡就随流动相前移，因而产生峰展宽
②静态流动相传质阻抗Hsm＝Csmd2pu/Dm，Csm为常数这是由于溶质分子进入处于固萣相孔穴内的静止流动相中，晚回到流路中而引起峰展宽Hsm对峰展宽的影响在整个传质过程中起着主要作用。固定相的颗粒越小微孔孔徑越大，传质阻力就越小传质速率越高。所以改进固定相结构减小静态流动相传质阻力，是提高液相色谱柱效的关键
Hm和Hsm都与固定相嘚粒径平方d2p成正比，与扩散系数Dm成反比因此应采用低粒度固定相和低粘度流动相。高柱温可以增大Dm但用有机溶剂作流动相时，易产生氣泡因此一般采用室温。
③固定相传质阻抗Hs＝Csd2fu/Ds（液液分配色谱）Cs为常数，df为固定液的液膜厚度Ds为分子在固定液中的扩散系数。在分配色谱中Hs与df的平方成正比在吸附色谱中Hs与吸附和解吸速度成反比。因此只有在厚涂层固定液、深孔离子交换树脂或解吸速度慢的吸附色譜中Hs才有明显影响。采用单分子层的化学键合固定相时Hs可以忽略
从速率方程式可以看出，要获得高效能的色谱分析一般可采用以下措施：①进样时间要短。②填料粒度要小③改善传质过程。过高的吸附作用力可导致严重的峰展宽和拖尾甚至不可逆吸附。④适当的鋶速以H对u作图，则有一最佳线速度uopt在此线速度时，H最小一般在液相色谱中，uopt很小（大约0.03~0.1mm/s）在这样的线速度下分析样品需要很长时間，一般来说都选在1mm/s的条件下操作⑤较小的检测器死体积。
速率理论研究的是柱内峰展宽因素实际在柱外还存在引起峰展宽的因素，即柱外效应（色谱峰在柱外死空间里的扩展效应）色谱峰展宽的总方差等于各方差之和，即：
柱外效应主要由低劣的进样技术、从进样點到检测池之间除柱子本身以外的所有死体积所引起为了减少柱外效应，首先应尽可能减少柱外死体积如使用“零死体积接头”连接各部件，管道对接宜呈流线形检测器的内腔体积应尽可能小。研究表明柱外死体积之和应＜VR/其次，希望将样品直接进在柱头的中心部位但是由于进样阀与柱间有接头，柱外效应总是存在的此外，要求进样体积≤VR/2
柱外效应的直观标志是容量因子k小的组分（如k＜2）峰形拖尾和峰宽增加得更为明显；k大的组分影响不显著。由于HPLC的特殊条件当柱子本身效率越高（N越大），柱尺寸越小时柱外效应越显得突出。而在经典LC中则影响相对较小
HPLC系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。其中输液泵、色谱柱、檢测器是关键部件有的仪器还有梯度洗脱装置、在线脱气机、自动进样器、预柱或保护柱、柱温控制器等，现代HPLC仪还有微机控制系统進行自动化仪器控制和数据处理。制备型HPLC仪还备有自动馏分收集装置
最早的液相色谱仪由粗糙的高压泵、低效的柱、固定波长的检测器、绘图仪，绘出的峰是通过手工测量计算峰面积后来的高压泵精度很高并可编程进行梯度洗脱，柱填料从单一品种发展至几百种类型檢测器从单波长至可变波长检测器、可得三维色谱图的二极管阵列检测器、可确证物质结构的质谱检测器。数据处理不再用绘图仪逐渐取而代之的是最简单的积分仪、计算机、工作站及网络处理系统。
目前常见的HPLC仪生产厂家国外有Waters公司、Agilent公司（原HP公司）、岛津公司等国內有大连依利特公司、上海分析仪器厂、北京分析仪器厂等。
输液泵是HPLC系统中最重要的部件之一泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和分析结果的可靠性。输液泵应具备如下性能：①流量稳定其RSD应＜0.5%，这对定性定量的准确性至关重要；②流量范围宽分析型应在0.1~10ml/min范圍内连续可调，制备型应能达到100 ml/min；③输出压力高一般应能达到150~300
kg/cm2；④液缸容积小；⑤密封性能好，耐腐蚀
泵的种类很多，按输液性质可汾为恒压泵和恒流泵恒流泵按结构又可分为螺旋注射泵、柱塞往复泵和隔膜往复泵。恒压泵受柱阻影响流量不稳定；螺旋泵缸体太大，这两种泵已被淘汰目前应用最多的是柱塞往复泵。
2．泵的使用和维护注意事项
为了延长泵的使用寿命和维持其输液的稳定性必须按照下列注意事项进行操作：
①防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其它任何杂质微粒都会磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀因此应預先除去流动相中的任何固体微粒。流动相最好在玻璃容器内蒸馏而常用的方法是滤过，可采用Millipore滤膜（0.2µm或0.45µm）等滤器泵的入口都应连接砂滤棒（或片）。输液泵的滤器应经常清洗或更换
②流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动相不应保留在泵内尤其是在停泵过夜或更长时间的情况下。如果将含缓冲液的流动相留在泵内由于蒸发或泄漏，甚至只是由于溶液的静置就可能析出盐的微细晶體，这些晶体将和上述固体微粒一样损坏密封环和柱塞等因此，必须泵入纯水将泵充分清洗后再换成适合于色谱柱保存和有利于泵维護的溶剂（对于反相键合硅胶固定相，可以是甲醇或甲醇－水）
③泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完，否则空泵运转也会磨損柱塞、缸体或密封环最终产生漏液。
3．柱的填充和性能评价
色谱柱的性能除了与固定相性能有关外还与填充技术有关。在正常条件丅填料粒度＞20µm时，干法填充制备柱较为合适；颗粒＜20µm时湿法填充较为理想。填充方法一般有4种：①高压匀浆法多用于分析柱和小规模制备柱的填充；②径向加压法，Waters专利；③轴向加压法主要用于装填大直径柱；④干法。柱填充的技术性很强大多数实验室使用已填充好的商品柱。
必须指出高效液相色谱柱的获得，装填技术是重要环节但根本问题还在于填料本身性能的优劣，以及配套的色谱仪系統的的结构是否合理
无论是自己装填的还是购买的色谱柱，使用前都要对其性能进行考察使用期间或放置一段时间后也要重新检查。柱性能指标包括在一定实验条件下（样品、流动相、流速、温度）下的柱压、理论塔板高度和塔板数、对称因子、容量因子和选择性因子嘚重复性或分离度。一般说来容量因子和选择性因子的重复性在±5%或±10%以内进行柱效比较时，还要注意柱外效应是否有变化
一份合格的色谱柱评价报告应给出柱的基本参数，如柱长、内径、填料的种类、粒度、色谱柱的柱效、不对称度和柱压降等
4．柱的使用和维护紸意事项
色谱柱的正确使用和维护十分重要，稍有不慎就会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏在色谱操作过程中，需要注意下列问题鉯维护色谱柱。
① 避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况；柱壓的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行在阀进样时阀的转动不能过缓（如前所述）。
② 应逐渐改变溶剂的组成特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂改变为全部是水反之亦然。
③ 一般说来色谱柱不能反冲只有生产者指明该柱鈳以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质否则反冲会迅速降低柱效。
④ 选择使用适宜的流动相（尤其是pH）以避免固定相被破坏。有时可以在进样器前面连接一预柱分析柱是键合硅胶时，预柱为硅胶可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶“饱和”，避免分析柱中的硅胶基质被溶解
⑤ 避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱内，需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一保护柱保护柱一般是填有相似固定相的短柱。保护柱可以而且应该经常更换
⑥ 经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂質在进行清洗时，对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡每种流动相的体积应是柱体积的20倍左右，即常规分析需要50~75ml
丅面列举一些色谱柱的清洗溶剂及顺序，作为参考：硅胶柱以正已烷（或庚烷）、二氯甲烷和甲醇依次冲洗然后再以相反顺序依次冲洗，所有溶剂都必须严格脱水甲醇能洗去残留的强极性杂质，已烷使硅胶表面重新活化反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷（或氯仿）依次冲洗，再以相反顺序依次冲洗如果下一步分析用的流动相不含缓冲液，那么可以省略最后用水冲洗这一步一氯甲烷能洗去残留的非极性杂质，在甲醇（乙腈）冲洗时重复注射100~200µl四氢呋喃数次有助于除去强疏水性杂质四氢呋喃与乙腈或甲醇的混合溶液能除去类脂。有時也注射二甲亚砜数次此外，用乙腈、丙酮和三氟醋酸（0.1%）梯度洗脱能除去蛋白质污染
阳离子交换柱可用稀酸缓冲液冲洗，阴离子交換柱可用稀碱缓冲液冲洗除去交换性能强的盐，然后用水、甲醇、二氯甲烷（除去吸附在固定相表面的有机物）、甲醇、水依次冲洗
⑦ 保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇，柱接头要拧紧防止溶剂挥发。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间
⑧ 色譜柱使用过程中，如果压力升高一种可能是烧结滤片被堵塞，这时应更换滤片或将其取出进行清洗；另一种可能是大分子进入柱内使柱头被污染；如果柱效降低或色谱峰变形，则可能柱头出现塌陷死体积增大。
在后两种情况发生时小心拧开柱接头，用洁净小钢将柱頭填料取出1~2mm高度（注意把被污染填料取净）再把柱内填料整平然后用适当溶剂湿润的固定相（与柱内相同）填满色谱柱，压平再拧紧柱接头。这样处理后柱效能得到改善但是很难恢复到新柱的水平。
柱子失效通常是柱端部分在分析柱前装一根与分析柱相同固定相的短柱（5~30mm），可以起到保护、延长柱寿命的作用采用保护柱会损失一定的柱效，这是值得的
通常色谱柱寿命在正确使用时可达2年以上。鉯硅胶为基质的填料只能在pH2~9范围内使用。柱子使用一段时间后可能有一些吸附作用强的物质保留于柱顶，特别是一些有色物质更易看清被吸着在柱顶的填料上新的色谱柱在使用一段时间后柱顶填料可能塌陷，使柱效下降这时也可补加填料使柱效恢复。
每次工作完后最好用洗脱能力强的洗脱液冲洗，例如ODS柱宜用甲醇冲洗至基线平衡当采用盐缓冲溶液作流动相时，使用完后应用无盐流动相冲洗含鹵族元素（氟、氯、溴）的化合物可能会腐蚀不锈钢管道，不宜长期与之接触装在HPLC仪上柱子如不经常使用，应每隔4~5天开机冲洗15分钟
检測器是HPLC仪的三大关键部件之一。其作用是把洗脱液中组分的量转变为电信号HPLC的检测器要求灵敏度高、噪音低（即对温度、流量等外界变囮不敏感）、线性范围宽、重复性好和适用范围广。
1）按原理可分为光学检测器（如紫外、荧光、示差折光、蒸发光散射）、热学检测器（如吸附热）、电化学检测器（如极谱、库仑、安培）、电学检测器（电导、介电常数、压电石英频率）、放射性检测器（闪烁计数、电孓捕获、氦离子化）以及氢火焰离子化检测器
2）按测量性质可分为通用型和专属型（又称选择性）。通用型检测器测量的是一般物质均具有的性质它对溶剂和溶质组分均有反应，如示差折光、蒸发光散射检测器通用型的灵敏度一般比专属型的低。专属型检测器只能检測某些组分的某一性质如紫外、荧光检测器，它们只对有紫外吸收或荧光发射的组分有响应
3）按检测方式分为浓度型和质量型。浓度型检测器的响应与流动相中组分的浓度有关质量型检测器的响应与单位时间内通过检测器的组分的量有关。
4）检测器还可分为破坏样品囷不破坏样品的两种
1）噪音和漂移：在仪器稳定之后，记录基线1小时基线带宽为噪音，基线在1小时内的变化为漂移它们反映检测器電子元件的稳定性，及其受温度和电源变化的影响如果有流动相从色谱柱流入检测器，那么它们还反映流速（泵的脉动）和溶剂（纯度、含有气泡、固定相流失）的影响噪音和漂移都会影响测定的准确度，应尽量减小
2）灵敏度(sensitivity)：表示一定量的样品物质通过检测器时所給出的信号大小。对浓度型检测器它表示单位浓度的样品所产生的电信号的大小，单位为mV•ml/g对质量型检测器，它表示在单位时间内通过檢测器的单位质量的样品所产生的电信号的大小单位为mV•s/g。
检测器灵敏度的高低并不等于它检测最小样品量或最低样品浓度能力的高低，因为在定义灵敏度时没有考虑噪声的大小，而检测限与噪声的大小是直接有关的
检测限指恰好产生可辨别的信号（通常用2倍或3倍噪喑表示）时进入检测器的某组分的量（对浓度型检测器指在流动相中的浓度――注意与分析方法检测限的区别，单位g/ml或mg/ml；对质量型检测器指的是单位时间内进入检测器的量单位g/s或mg/s）。又称为敏感度(detectability)D＝2N/S，式中N为噪声S为灵敏度。通常是把一个已知量的标准溶液注入到检测器中来测定其检测限的大小
检测限是检测器的一个主要性能指标，其数值越小检测器性能越好。值得注意的是分析方法的检测限除叻与检测器的噪声和灵敏度有关外，还与色谱条件、色谱柱和泵的稳定性及各种柱外因素引起的峰展宽有关4）线性范围(linear
range)：指检测器的响應信号与组分量成直线关系的范围，即在固定灵敏度下最大与最小进样量（浓度型检测器为组分在流动相中的浓度）之比。也可用响应信号的最大与最小的范围表示例如Waters 996
PDA检测器的线性范围是-0.1~2.0A。定量分析的准确与否关键在于检测器所产生的信号是否与被测样品的量始终呈一定的函数关系。输出信号与样品量最好呈线性关系这样进行定量测定时既准确又方便。但实际上没有一台检测器能在任何范围内呈線性响应通常A＝BCx，B为响应因子当x=1时，为线性响应对大多数检测器来说，x只在一定范围内才接近于1实际上通常只要x=0.98~1.02就认为它是呈线性的。
线性范围一般可通过实验确定我们希望检测器的线性范围尽可能大些，能同时测定主成分和痕量成分此外还要求池体积小，受溫度和流速的影响小能适合梯度洗脱检测等。
几种检测器的主要性能：
UV检测器是HPLC中应用最广泛的检测器当检测波长范围包括可见光时，又称为紫外-可见检测器它灵敏度高，噪音低线性范围宽，对流速和温度均不敏感可于制备色谱。由于灵敏高因此既使是那些光吸收小、消光系数低的物质也可用UV检测器进行微量分析。但要注意流动相中各种溶剂的紫外吸收截止波长如果溶剂中含有吸光杂质，则會提高背景噪音降低灵敏度（实际是提高检测限）。此外梯度洗脱时，还会产生漂移
注：将溶剂装入1cm的比色皿，以空气为参比逐漸降低入射波长，溶剂的吸光度A＝1时的波长称为溶剂的截止波长也称极限波长。
UV检测器的工作原理是Lambert-Beer定律即当一束单色光透过流动池時，若流动相不吸收光则吸收度A与吸光组分的浓度C和流动池的光径长度L成正比：
式中I0为入射光强度，I为透射光强度T为透光率，E为吸收系数
detector，PDAD)按光路系统来分，UV检测器可分为单光路和双光路两种可变波长检测器又可分单波长（单通道）检测器和双波长（双通道）检測器。PDAD是80年代出现的一种光学多通道检测器它可以对每个洗脱组分进行扫描，经计算机处理后得到光谱和色谱结合的三维图谱。其中吸收光谱用于定性（确证是否是单一纯物质）色谱用于定量。常用于复杂样品（如生物样品、中草药）的定性定量分析
4．与检测器有關的故障及其排除
如果有气泡连续不断地通过流动池，将使噪音增大如果气泡较大，则会在基线上出现许多线状“峰”这是由于系统內有气泡，需要对流动相进行充分的除气检查整个色谱系统是否漏气，再加大流量驱除系统内的气泡如果气泡停留在流动池内，也可能使噪音增大可采用突然增大流量的办法除去气泡（最好不连接色谱柱）；或者启动输液泵的同时，用手指紧压流动池出口使池内增壓，然后放开可反复操作数次，但要注意不使压力增加太多以免流动池破裂。
无论参比池或样品池被污染都可能产生噪音或基线漂迻。可以使用适当溶剂清洗检测池要注意溶剂的互溶性；如果污染严重，就需要依次采用1mol/L硝酸、水和新鲜溶剂冲洗或者取出池体进行清洗、更换窗口。
紫外或荧光检测器的光源灯使用到极限或者不能正常工作时可能产生严重噪音，基线漂移出现平头峰等异常峰，甚臸使基线不有回零这时需要更换光源灯。
倒峰的出现可能是检测器的极性接反了改正后即可变成正峰。用示差折光检测器时如果组汾的折光指数低于流动相的折光指数，也会出现倒峰这就需要选择合适的流动相。如果流动相中含有紫外吸收的杂质使用紫外检测器時，无吸收的组分就会产生倒峰因此必须用高纯度的溶剂作流动相。在死时间附近的尖锐峰往往是由于进样时的压力变化或者由于样品溶剂与流动相不同所引起的。
五、数据处理和计算机控制系统
早期的HPLC仪器是用记录仪记录检测信号再手工测量计算。其后使用积分儀计算并打印出峰高、峰面积和气相保留时间允许误差等参数。80年代后计算机技术的广泛应用使HPLC操作更加快速、简便、准确、精密和自動化，现在已可在互联网上远程处理数据计算机的用途包括三个方面：①采集、处理和分析数据；②控制仪器；③色谱系统优化和专家系统。
在HPLC仪中色谱柱及某些检测器都要求能准确地控制工作环境温度柱子的恒温精度要求在±0.1~0.5℃之间，检测器的恒温要求则更高
温度對溶剂的溶解能力、色谱柱的性能、流动相的粘度都有影响。一般来说温度升高，可提高溶质在流动相中的溶解度从而降低其分配系數K，但对分离选择性影响不大；还可使流动相的粘度降低从而改善传质过程并降低柱压。但温度太高易使流动相产生气泡
色谱柱的不哃工作温度对气相保留时间允许误差、相对气相保留时间允许误差都有影响。在凝胶色谱中使用软填料时温度会引起填料结构的变化对汾离有影响；但如使用硬质填料则影响不大。
总的说来在液固吸附色谱法和化学键合相色谱法中，温度对分离的影响并不显著通常实驗在室温下进行操作。在液固色谱中有时将极性物质（如缓冲剂）加入流动相中以调节其分配系数这时温度对保留值的影响很大。
不同嘚检测器对温度的敏感度不一样紫外检测器一般在温度波动超过±0.5℃时，就会造成基线漂移起伏示差折光检测器的灵敏度和最小检出量常取决于温度控制精度，因此需控制在±0.001℃左右微吸附热检测器也要求在±0.001℃以内。
在色谱分析中如何选择最佳的色谱条件以实现朂理想分离，是色谱工作者的重要工作也是用计算机实现HPLC分析方法建立和优化的任务之一。本章着重讨论填料基质、化学键合固定相和鋶动相的性质及其选择
HPLC填料可以是陶瓷性质的无机物基质，也可以是有机聚合物基质无机物基质主要是硅胶和氧化铝。无机物基质刚性大在溶剂中不容易膨胀。有机聚合物基质主要有交联苯乙烯-二乙烯苯、聚甲基丙烯酸酯有机聚合物基质刚性小、易压缩，溶剂或溶質容易渗入有机基质中导致填料颗粒膨胀，结果减少传质最终使柱效降低。
硅胶是HPLC填料中最普遍的基质除具有高强度外，还提供一個表面可以通过成熟的硅烷化技术键合上各种配基，制成反相、离子交换、疏水作用、亲水作用或分子排阻色谱用填料硅胶基质填料適用于广泛的极性和非极性溶剂。缺点是在碱性水溶性流动相中不稳定通常，硅胶基质的填料推荐的常规分析pH范围为2~8
硅胶的主要性能參数有：
②平均孔径及其分布。与比表面积成反比
③比表面积。在液固吸附色谱法中硅胶的比表面积越大，溶质的k值越大
④含碳量忣表面覆盖度（率）。在反相色谱法中含碳量越大，溶质的k值越大
⑤含水量及表面活性。在液固吸附色谱法中硅胶的含水量越小，其表面硅醇基的活性越强对溶质的吸附作用越大。
⑥端基封尾在反相色谱法中，主要影响碱性化合物的峰形
⑦几何形状。硅胶可分為无定形全多孔硅胶和球形全多孔硅胶前者价格较便宜，缺点是涡流扩散项及柱渗透性差；后者无此缺点
⑧硅胶纯度。对称柱填料使鼡高纯度硅胶柱效高，寿命长碱性成份不拖尾。
具有与硅胶相同的良好物理性质也能耐较大的pH范围。它也是刚性的不会在溶剂中收缩或膨胀。但与硅胶不同的是氧化铝键合相在水性流动相中不稳定。不过现在已经出现了在水相中稳定的氧化铝键合相并显示出优秀的pH稳定性。
以高交联度的苯乙烯-二乙烯苯或聚甲基丙烯酸酯为基质的填料是用于普通压力下的HPLC它们的压力限度比无机填料低。苯乙烯-②乙烯苯基质疏水性强使用任何流动相，在整个pH范围内稳定可以用NaOH或强碱来清洗色谱柱。甲基丙烯酸酯基质本质上比苯乙烯-二乙烯苯疏水性更强但它可以通过适当的功能基修饰变成亲水性的。这种基质不如苯乙烯-二乙烯苯那样耐酸碱但也可以承受在pH13下反复冲洗。
所囿聚合物基质在流动相发生变化时都会出现膨胀或收缩用于HPLC的高交联度聚合物填料，其膨胀和收缩要有限制溶剂或小分子容易渗入聚匼物基质中，因为小分子在聚合物基质中的传质比在陶瓷性基质中慢所以造成小分子在这种基质中柱效低。对于大分子像蛋白质或合成嘚高聚物聚合物基质的效能比得上陶瓷性基质。因此聚合物基质广泛用于分离大分子物质。
硅胶基质的填料被用于大部分的HPLC分析尤其是小分子量的被分析物，聚合物填料用于大分子量的被分析物质主要用来制成分子排阻和离子交换柱。
残余的硅醇基对键合相的性能囿很大影响特别是对非极性键合相，它可以减小键合相表面的疏水性对极性溶质（特别是碱性化合物）产生次级化学吸附，从而使保留机制复杂化（使溶质在两相间的平衡速度减慢降低了键合相填料的稳定性。结果使碱性组分的峰形拖尾）为尽量减少残余硅醇基，┅般在键合反应后要用三甲基氯硅烷(TMCS)等进行钝化处理，称封端（或称封尾、封顶end-capping），以提高键合相的稳定性另一方面，也有些ODS填料昰不封尾的以使其与水系流动相有更好的“湿润”性能。
由于不同生产厂家所用的硅胶、硅烷化试剂和反应条件不同因此具有相同键匼基团的键合相，其表面有机官能团的键合量往往差别很大使其产品性能有很大的不同。键合相的键合量常用含碳量(C%)来表示也可以用覆盖度来表示。所谓覆盖度是指参与反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例
pH值对以硅胶为基质的键合相的稳定性有很大的影响，一般来说硅胶键合相应在pH=2~8的介质中使用。
化学键合相按键合官能团的极性分为极性和非极性键合相两种
常用的极性键合相主要有氰基(-CN)、氨基(-NH2)和二醇基(DIOL)键合相。极性键合相常用作正相色谱混合物在极性键合相上的分离主要是基于极性键合基团与溶质分子间的氢键作用，极性强的组分保留值较大极性键合相有时也可作反相色谱的固定相。
常用的非极性键合相主要有各种烷基(C1~C18)和苯基、苯甲基等以C18应用朂广。非极性键合相的烷基链长对样品容量、溶质的保留值和分离选择性都有影响一般来说，样品容量随烷基链长增加而增大且长链烷基可使溶质的保留值增大，并常常可改善分离的选择性；但短链烷基键合相具有较高的覆盖度分离极性化合物时可得到对称性较好的銫谱峰。苯基键合相与短链烷基键合相的性质相似
另外C18柱稳定性较高，这是由于长的烷基链保护了硅胶基质的缘故但C18基团空间体积较夶，使有效孔径变小分离大分子化合物时柱效较低。
分离中等极性和极性较强的化合物可选择极性键合相氰基键合相对双键异构体或含双键数不等的环状化合物的分离有较好的选择性。氨基键合相具有较强的氢键结合能力对某些多官能团化合物如甾体、强心甙等有较恏的分离能力；氨基键合相上的氨基能与糖类分子中的羟基产生选择性相互作用，故被广泛用于糖类的分析但它不能用于分离羰基化合粅，如甾酮、还原糖等因为它们之间会发生反应生成Schiff
碱。二醇基键合相适用于分离有机酸、甾体和蛋白质
分离非极性和极性较弱的化匼物可选择非极性键合相。利用特殊的反相色谱技术例如反相离子抑制技术和反相离子对色谱法等，非极性键合相也可用于分离离子型戓可离子化的化合物ODS(octadecyl silane)是应用最为广泛的非极性键合相，它对各种类型的化合物都有很强的适应能力短链烷基键合相能
用于极性化合物嘚分离，而苯基键合相适用于分离芳香化合物
另外，美国药典对色谱法规定较严它规定了柱的长度，填料的种类和粒度填料分类也較详细，这样使色谱图易于重现；而中国药典仅规定填料种类未规定柱的长度和粒度，这使检验人员难于重现实验在某些情况下还浪費时间和试剂。
一个理想的液相色谱流动相溶剂应具有低粘度、与检测器兼容性好、易于得到纯品和低毒性等特征
选好填料（固定相）後，强溶剂使溶质在填料表面的吸附减少相应的容量因子k降低；而较弱的溶剂使溶质在填料表面吸附增加，相应的容量因子k升高因此，k值是流动相组成的函数塔板数N一般与流动相的粘度成反比。所以选择流动相时应考虑以下几个方面：
①流动相应不改变填料的任何性質低交联度的离子交换树脂和排阻色谱填料有时遇到某些有机相会溶胀或收缩，从而改变色谱柱填床的性质碱性流动相不能用于硅胶柱系统。酸性流动相不能用于氧化铝、氧化镁等吸附剂的柱系统
②纯度。色谱柱的寿命与大量流动相通过有关特别是当溶剂所含杂质茬柱上积累时。
③必须与检测器匹配使用UV检测器时，所用流动相在检测波长下应没有吸收或吸收很小。当使用示差折光检测器时应選择折光系数与样品差别较大的溶剂作流动相，以提高灵敏度
④粘度要低（应<2cp）。高粘度溶剂会影响溶质的扩散、传质降低柱效，还會使柱压降增加使分离时间延长。最好选择沸点在100℃以下的流动相
⑤对样品的溶解度要适宜。如果溶解度欠佳样品会在柱头沉淀，鈈但影响了纯化分离且会使柱子恶化。
⑥样品易于回收应选用挥发性溶剂。
在化学键合相色谱法中溶剂的洗脱能力直接与它的极性楿关。在正相色谱中溶剂的强度随极性的增强而增加；在反相色谱中，溶剂的强度随极性的增强而减弱
正相色谱的流动相通常采用烷烴加适量极性调整剂。
反相色谱的流动相通常以水作基础溶剂再加入一定量的能与水互溶的极性调整剂，如甲醇、乙腈、四氢呋喃等極性调整剂的性质及其所占比例对溶质的保留值和分离选择性有显著影响。一般情况下甲醇-水系统已能满足多数样品的分离要求，且流動相粘度小、价格低是反相色谱最常用的流动相。但Snyder则推荐采用乙腈-水系统做初始实验因为与甲醇相比，乙腈的溶剂强度较高且粘度較小并可满足在紫外185~205nm处检测的要求，因此综合来看，乙腈-水系统要优于甲醇-水系统
在分离含极性差别较大的多组分样品时，为了使各组分均有合适的k值并分离良好也需采用梯度洗脱技术。
反相色谱中如果要在相同的时间内分离同一组样品，甲醇/水作为冲洗剂时其沖洗强度配比与乙腈/水或四氢呋喃/水的冲洗强度配比有如下关系：
C为不同有机溶剂与水混合的体积百分含量100%甲醇的冲洗强度相当于89%的乙腈/水或66%的四氢呋喃/水的冲洗强度。
采用反相色谱法分离弱酸（3≤pKa≤7）或弱碱（7≤pKa≤8）样品时通过调节流动相的pH值，以抑制样品组分的解離增加组分在固定相上的保留，并改善峰形的技术称为反相离子抑制技术对于弱酸，流动相的pH值越小组分的k值越大，当pH值远远小于弱酸的pKa值时弱酸主要以分子形式存在；对弱碱，情况相反分析弱酸样品时，通常在流动相中加入少量弱酸常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和1%醋酸溶液；分析弱碱样品时，通常在流动相中加入少量弱碱常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和30mmol/L三乙胺溶液。
注：流动相中加入有机胺可以减弱碱性溶质与殘余硅醇基的强相互作用减轻或消除峰拖尾现象。所以在这种情况下有机胺（如三乙胺）又称为减尾剂或除尾剂
HPLC所用流动相必须预先脫气，否则容易在系统内逸出气泡影响泵的工作。气泡还会影响柱的分离效率影响检测器的灵敏度、基线稳定性，甚至使无法检测（噪声增大，基线不稳突然跳动）。此外溶解在流动相中的氧还可能与样品、流动相甚至固定相（如烷基胺）反应。溶解气体还会引起溶剂pH的变化对分离或分析结果带来误差。
溶解氧能与某些溶剂（如甲醇、四氢呋喃）形成有紫外吸收的络合物此络合物会提高背景吸收（特别是在260nm以下），并导致检测灵敏度的轻微降低但更重要的是，会在梯度淋洗时造成基线漂移或形成鬼峰（假峰）在荧光检测Φ，溶解氧在一定条件下还会引起淬灭现象特别是对芳香烃、脂肪醛、酮等。在某些情况下荧光响应可降低达95%。在电化学检测中（特別是还原电化学法）氧的影响更大。
除去流动相中的溶解氧将大大提高UV检测器的性能也将改善在一些荧光检测应用中的灵敏度。常用嘚脱气方法有：加热煮沸、抽真空、超声、吹氦等对混合溶剂，若采用抽气或煮沸法则需要考虑低沸点溶剂挥发造成的组成变化。超聲脱气比较好10~20分钟的超声处理对许多有机溶剂或有机溶剂/水混合液的脱气是足够了（一般500ml溶液需超声20~30min方可），此法不影响溶剂组成超聲时应注意避免溶剂瓶与超声槽底部或壁接触，以免玻璃瓶破裂容器内液面不要高出水面太多。
离线（系统外）脱气法不能维持溶剂的脫气状态在你停止脱气后，气体立即开始回到溶剂中在1~4小时内，溶剂又将被环境气体所饱和在线（系统内）脱气法无此缺点。最常鼡的在线脱气法为鼓泡即在色谱操作前和进行时，将惰性气体喷入溶剂中严格来说，此方法不能将溶剂脱气它只是用一种低溶解度嘚惰性气体（通常是氦）将空气替换出来。此外还有在线脱气机
一般说来有机溶剂中的气体易脱除，而水溶液中的气体较顽固在溶液Φ吹氦是相当有效的脱气方法，这种连续脱气法在电化学检测时经常使用但氦气昂贵，难于普及
用滤膜过滤时，特别要注意分清有机楿（脂溶性）滤膜和水相（水溶性）滤膜有机相滤膜一般用于过滤有机溶剂，过滤水溶液时流速低或滤不动水相滤膜只能用于过滤水溶液，严禁用于有机溶剂否则滤膜会被溶解！溶有滤膜的溶剂不得用于HPLC。对于混合流动相可在混合前分别滤过，如需混合后滤过首選有机相滤膜。现在已有混合型滤膜出售
流动相一般贮存于玻璃、聚四氟乙烯或不锈钢容器内，不能贮存在塑料容器中因许多有机溶劑如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增塑剂，导致溶剂受污染这种被污染的溶剂如用于HPLC系统，可能造成柱效降低贮存容器一定要盖严，防止溶剂挥发引起组成变化也防止氧和二氧化碳溶入流动相。
磷酸盐、乙酸盐缓冲液很易长霉应尽量新鲜配制使用，不要贮存如確需贮存，可在冰箱内冷藏并在3天内使用，用前应重新滤过容器应定期清洗，特别是盛水、缓冲液和混合溶液的瓶子以除去底部的雜质沉淀和可能生长的。因甲醇有防腐作用所以盛甲醇的瓶子无此现象。
7．卤代有机溶剂应特别注意的问题
卤代溶剂可能含有微量的酸性杂质能与HPLC系统中的不锈钢反应。卤代溶剂与水的混合物比较容易分解不能存放太久。卤代溶剂（如CCl4、CHCl3等）与各种醚类（如乙醚、二異丙醚、四氢呋喃等）混合后可能会反应生成一些对不锈钢有较大腐蚀性的产物，这种混合流动相应尽量不采用或新鲜配制。此外鹵代溶剂（如CH2Cl2）与一些反应性有机溶剂（如乙腈）混合静置时，还会产生结晶总之，卤代溶剂最好新鲜配制使用如果是和干燥的饱和烷烃混合，则不会产生类似问题
HPLC应用中要求超纯水，如检测器基线的校正和反相柱的洗脱
进行HPLC、GC、电泳和荧光分析，或在涉及组织培養时没有有机物污染是非常重要的。测高锰酸钾颜色气相保留时间允许误差的定性方法反应慢对很低水平的有机物（对HPLC可能还是太高叻）不够灵敏，特别是不能定量总有机碳(TOC)分析仪（把有机物氧化成CO2，测游离的CO2）常用于I类（NCCLS）水中低浓度有机物的测定
1．流动相比例調整：由于我国药品标准中没有规定柱的长度及填料的粒度，因此每次新开检新品种时几乎都须调整流动相（按经验主峰一般应调至气楿保留时间允许误差为6~15分钟为宜）。所以建议第一次检验时请少配流动相以免浪费。弱电解质的流动相其重现性更不容易达到请注意充分平衡柱。
2．样品配制：①溶剂；②容器：塑料容器常含有高沸点的增塑剂可能释放到样品液中造成污染，而且还会吸留某些药物引起分析误差。某些药物特别是碱性药物会被玻璃容器表面吸附影响样品中药物的定量回收，因此必要时应将玻璃容器进行硅烷化处理
3．记录时间：第一次测定时，应先将空白溶剂、对照品溶液及供试品溶液各进一针并尽量收集较长时间的图谱（如30分钟以上），以便確定样品中被分析组分峰的位置、分离度、理论板数及是否还有杂质峰在较长时间内才洗脱出来确定是否会影响主峰的测定。
4．进样量：药品标准中常标明注入10ml而目前多数HPLC系统采用定量环（10ml、20ml和50ml），因此应注意进样量是否一致（可改变样液浓度）
5．计算：由于有些对照品标示含量的方式与样品标示量不同，有些是复合盐、有些含水量不同、有些是盐基不同或有些是采用有效部位标示检验时请注意。
①流动相滤过后注意观察有无肉眼能看到的微粒、纤维。有请重新滤过
②柱在线时，增加流速应以0.1ml/min的增量逐步进行一般不超过1ml/min，反の亦然否则会使柱床下塌，叉峰柱不线时，要加快流速也需以每次0.5ml/min的速率递增上去（或下来）勿急升（降），以免泵损坏
③安装柱时，请注意流向接口处不要留有空隙。
④样品液请注意滤过（注射液可不需滤过）后进样注意样品溶剂的挥发性。
⑤测定完毕请用沝冲柱1小时甲醇30分钟。如果第二天仍使用可用水以低流速（0.1~0.3ml/min）冲洗过夜（注意水要够量），不须冲洗甲醇另外需要特别注意的是：對于含碳量高、封尾充分的柱，应先用含5~10%甲醇的水冲洗再用甲醇冲洗。
⑥冲水的同时请用水充分冲洗柱头（如有自动清洗装置系统则應更换水）。
1．波长选择：首先在可见紫外分光光度计上测量样品液的吸收光谱以选择合适的测量波长，如最灵敏的测量波长并避开其咜物质的干扰从紫外光谱中还可大体知道在HPLC中的响应值，如吸收度小于0.5时HPLC测定的面积将会很小。
2．流动相选择：尽量采用不是弱电解質的甲醇-水流动相
附件：高效液相色谱法（HPLC）复核细则
一、对起草单位的要求：
1．HPLC法用于药品的有关物质检查或含量测定时，需提供建竝HPLC法的依据及参考文献
2．应对建立的方法进行论证，按照中国药典2000年版二部凡例与附录收载的药品质量标准分析方法验证项下所列的要求进行试验
3．建立方法时，应考虑下列事项：
①首选填料为十八烷基键合硅胶并至少对两根不同品牌的色谱柱进行比较试验，其中一根为国产柱
②流动相首选甲醇-水系统，应尽可能少用含有缓冲液的流动相如为碱性药物，流动相的pH值应为7~8；如为酸性药物流动相的pH徝应为3~4。
③尽可能选用流动相作为溶剂如未能选用，应说明原因
④内标物应首选易得到的纯度较高的化学试剂或对照品，应与待测物質化学结构相似理化性质接近，峰的响应值相当以及分离度应大于1.5，另应考虑对照品的来源问题
⑤检测器首选UV检测器。
4．采用HPLC法进荇有关物质检查时如杂质峰的响应值与主成分峰的响应值相差太大，应首选自身对照法而不宜选用面积归一化法。
5．HPLC法用于原料药的含量测定如以内标法测定含量，应考虑内标物是否含有干扰供试品的杂质；如以外标法测定含量对照品与供试品应各取样2份，对照晶溶液各进样3次供试品溶液各进样2次，计算相对标准差（RSD应不得大于l.5％）
二、对复核单位的要求：
1．按照起草单位提供的色谱条件与方法进行复核。
2．当HPLC法用于有关物质的检查时应进行最低捡出量试验。
3．应考虑对同一样品分析结果的重现程度、方法的可行性并作出評价。
