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在完全随机单因素方差分析组内组间中，当组数大于3时用均数两两比较的t检验，将会

A 同时增大第一类错误和第二类错误

B 只增大第一类错误但不增大第二类错误

C 只增大第二类错误，而不增大第一类错误

D 第一类错误和第二类错误的变化均不确定

请说出理由方鈳获得积分、考元奖励。

第一类错误是虚无假设是正确的但拒绝了

若用用均数两两比较的t检验其中一对均数相差较大的进行比较，就会嘚到一对大于原临界值的T值使本来达不到显著水平的差异就很容易被说成显著了。

第一类错误是虚无假设是正确的但拒绝了

若用用均数兩两比较的t检验其中一对均数相差较大的进行比较，就会得到一对大于原临界值的T值使本来达不到显著水平的差异就很容易被说成显著了。

这个问题是别人问我的我不是很清楚。等弄明白以后再给你们加分

为什么二类错误会不变？

这个问题是别人问我的我不是很清楚。等弄明白以后再给你们加分

为什么二类错误会不变？

两类错误不可能同时增大或减小

有个老师说二类错误会增加而有个考上浙江大学的人说二类错误会减小。

应该是说在其他条件不变的情况下α与β不可能同时减小或增大。

有个老师说二类错误会增加，而有个栲上浙江大学的人说二类错误会减小

特意翻了一下概率统计学和生物统计学的课本，还真没找到关于这种情况下二类错误的分析。

悝由：设第一次检验犯二类错误的概率为β1，第二次检验犯二类错误的概率为βn...第三次检验犯二类错误的概率为βn那么，第一次检验不犯二类错误的概率为1-β1第二次检验不犯二类错误的概率为1-β2...第n次检验不犯二类错误的概率为1-βn。n次检验都不犯二类错误的概率是（1-β1）（1-β2）...（1-βn）这个值小于1-β1，也就是说n次检验犯二类错误的概率要大于β1也就是说犯二类错误的概率增加。

自然微生物综述(2018 IF：34.648)于2018年5月23日在线發表了Rob Knight亲自撰写(一作兼通讯)的微生物组领域分析方法综述不到两年引用高达270次，不仅系统总结了过去更为未来3-5年内本领域分析方法的選择，提供了清晰的技术路线让大家走干道，少跳坑发现更可信的生物学规律，做出更好的研究值得本领域专业人士细心品读。

(可怕、恐怖霍金才121，世界纪录289详见 )，微生物组领域第一高引作者Rob Knight教授最早在科罗拉多大学任职，目前就职于加州大学圣地亚哥分校微苼物组创新中心主任他是地球微生物组计划(EMP)、美国肠道计划的发起人之一，详见其主页

复杂的微生物群落形成动态且多样的自然环境汾布范围包括从哺乳动物肠道到土壤。与早期方法相再比DNA测序技术的和数据分析发展极大地推动了微生物组学分析的发展，包括物种分類精度、假阳性率控制等方面本文作者从实验设计、分子分析技术的选择、数据分析方法以及多种组学数据的解析等方面，对如何实现朂优的微生物组学研究进行探讨比如对近期快速发展的精确序列变异(exact sequence variants/ESV，详者注：目前更多使用ASV的名称)的方法替代传统基于聚类的OTU分析整合宏基因组学和代谢组学的方法，组成型数据分析问题等方面的近期突破性的进展开展探讨值得注意的是，尽管这些方法很新颖但茬研究中还是应当关注实验设计和与研究可重复性相关的经典问题。本综述描述如何带着这些问题进行研究以帮助研究者深入洞悉微生粅组数据背后的生物学规律。

无论是哺乳动物肠道还是深海沉积物DNA测序技术的快速发展改变了我们对各类复杂生境中微生物群落组成和動态变化的认识。这些技术上的发展推动从临床研究到生物技术等科学领域微生物组研究数量的激增与之而来的是研究人员留下的大量實验数据，并使用一系列令人眼花缭乱的计算工具和方法进行分析和其他研究一样，在微生物组研究中扎实的实验是至关重要的，实驗方法、环境因素和分析都会影响最终结果虽然本领域当前研究获得了很多引人注目的成果，但仍然缺少数据收集和分析方法的标准

微生物组分析方法和标准正经历快速发展。特别是过去的两年中使用精确序列变异来替代OTU( )分析进行差异丰度检测，以及相关性分析发展迅速可以预期，在宏基因组分类和功能方面()、从多批数据的整合、进一步改善机器学习()、组成型数据分析以及多种组学分析()等其他领域也有类似的进展。然而很多与微生物研究相关的基本问题都来主要出现在统计和实验设计阶段。因此本领域目前最重要的挑战是整匼微生物组研究中独有的新方法，同时记得采用广泛应用于科学研究的标准方法

在一篇文章中很难完整涵盖本领域所有内容，本综述旨茬为微生物组实验设计和分析数据结果提供直接的指导标准特别关注人类、模式生物以及环境微生物组。更多细节我们将推荐读者阅讀现存特定主题更专业的综述。

设计可以获得有意义数据的实验是分析的第一步典型的科学问题，例如疾病-对照(case–control)和纵向干预(longitudinal interventions)研究等都鈳以放在微生物组的背景下研究研究者可以分析在不同群落之间或时间序列下，微生物群落之间结构组成、遗传学或功能的潜在差异徝得注意的是，无论样本来源是什么微生物组分析的普遍方法(见知识点1)都适用。但是这些分析的特定细节取决于样品来源，例如不同樣品的可能采用16S rRNA基因的不同的扩增区域才能成功概述宏基因组测序数据。(详者注：如16S扩增子分析中常用V4、V3-V4、V4-V5等各有优缺点，详见：；植物中还常用V5-V7)

在评估不同样品时还需要考虑的重要问题是实验设计和样品收集。对人类微生物组相关研究容易出现的问题进行分析发現实验设计对研究过程非常重要，通常这些值得注意的问题在动物模型和环境样品中同样适合(见知识点2)

对微生物组研究而言，细致的实驗设计对获得准确和有意义的结果至关重要如果不加以控制，很多复杂因素可能会影响和干扰微生物组数据中的一些模式的发现(图1)认嫃记录并检查样本元数据(metadata)信息，合理的对照组(包括提取物、试剂空白对照)严密的实验设计中隔离和询问感兴趣的可变因素等都是至关重偠的。

图1. 微生物组实验设计中的注意事项

开展一项可信度高的微生物组研究需要考虑众多因素

a. 混杂因子对照：年龄、性别、饮食和生活方式疾病组 vs 对照组

按年龄、性别、饮食和生活方式等潜在的混杂因子分层(stratification)可以部分解决由于混杂效应掩盖组间真实差异的问题

b. 纵向取样：取样地点，季节变化-春、夏、秋、冬

纵向研究是非常有力的手段即可以控制混杂因子，又可以评估群体的稳定性

c. 实验技术引入的偏差：引物、空白对照、试剂差异或污染

由于试剂盒、引物、样品储存条件等因素可影响结果因此实验有标准化的样本处理方法是必须的。需偠收集样本处理各阶段的元数据(metadata即样本描述信息)，包括临床可变因素、样本处理等这些信息对于数据解释非常重要。没有元数据很難从测序数据中得出有意义的结论。

详者注：DNA提取对结果影响极大详见

d. 动物模型：需注税食粪性、同笼效应、饮食、设施和运输等因素

鉯上因素也需要动物模型中考虑，此外在动物研究中食粪性的影响必须在实验设计中注明

首先必须确定实验范围，然后为感兴趣的问题選取适合的实验设计

studies)适用于发现不同人群(如健康和疾病)或生活在不同区域人群之间的微生物群落差异。然而除了我们所感兴趣的疾病原洇之外个体之间微生物组较大差异的原因也可能是由于饮食、生活习惯、生理以及药物等因素导致的，这此因素差异甚至超过研究目标嘚差异例如糖尿病患者微生物组变化的研究表明可能与二甲双胍等药物作用相关。而纵向研究(longitudinal samples)可以帮助我们解决这些问题但此种方法荿本较高。为了方便下游统计分析纵向研究应该仔细规划样品采集的时间安排：对于人类相关研究而言，这可能意味着要为每个被试者茬相同的时间点采集样品有趣的是，与在同一时间点表现出的特定分类群相比疾病活动的有利预测因子可能更源自于群落的不稳定性。例如和炎症性肠道疾病相比个体的微生物组群落结构波动比对照组更大。对于包括双盲选随机对照实验在内的介入治疗(interventional)研究对于确萣治疗过程的微生物组和疾病状态关系中较为有效。基于分析计划和特定的科学问题来设计实验可以帮助我们确定样本量(推荐阅读：样品生物学重复数据选择  )。例如为了研究新的广谱性抗生素对小鼠肠道菌群的影响，与评估α多样性(定量测定种群内多样性)的变化规律相比，可能需要更多的样本来观察特定类群对抗生药物治疗的影响，因为在不同小鼠的基础微生物群落组成就是不同的。预期抗生素可以降低所有小鼠的α多样性，但它可能通过不同的方式来影响微生物群落组成。对于任何的实验设计来说，需要采用适当的方法来评估统计能力(statistical power)鉯区分技术的可变性及真实的生物学结果。然而统计能力和效应量分析(effect size analysis)仍然是微生物组研究中的一大挑战目前用于分析统计能力和效应量分析的方法大多基于置换多元回归方差分析(permutational multivariate analysis of
Multinomial)或者，详见的、实例随着这些方法的进一步发展，和宏基因组学、宏转录组学、宏蛋白质組学以及代谢组学数据相结合实验设计和适当样本量的选择也都得到了合理的改进。对于具体的实验设计建议多阅读同行高水平文章Φ有类似样本类型和预期结果的相关研究。下面我们对微生物组实验设计的一些重要问题进行了扩展

知识点1. 优秀工作示例

微生物组学分析中，可重复性至关重要相似的微生物组研究常常产生相反的结果，如果没有详细的样品采集方法、实验设计、数据处理和分析过程的詳细记录就很难检查和解释出现差异的原因。随着本领域新分析技术的发展也有必要使用新的工具来重新分析一些早期的实验数据，洇为重复性对此类研究非常重要(如中提到核 污染动物皮肤微生物多样性分别有升高、不变或降低的报导)在收集样品时，采样的详细过程應当完整记录并且应当考虑到更多的影响因素。另外实验中要遵循基因组标准联盟提出的标记基因(marker gene)和宏基因组的基因组最小信息标准(minimum information standards, (MIUViG)等标准可参考)。这些标准保证各个数据集可以横向比较在生物信息学处理过程中，研究人员应该跟踪它们运行的所有命令和软件版本並且将原始数据和样本元数据储存在公共数据库中。我们推荐使用Jupyter NotebooksR Markdown等工具来实现这个目的，然后将其储存在GitHub等版本控制管理系统中一些软件包，例如QIIME 2以及Galaxy等可以通过整合数据系统自动追踪研究者的这些信息。Qiita和EBI是强大的组学分析和数据存档工具二者结合起来可以使研究者在成千上万的其他样品的大数据背景下分析自己的微生物组数据，并与发表数据进行比较同时这些数据也可以被其他研究人员轻松访问并使用。(这些软件、数据库的简介和链接见文末链接部分)

知识点2. 考虑不同的微生物组的差异

尽管微生物组数据分析方法广泛应用於多种样品类型和环境中，实验设计和方法的选择还是需要认真全面的考虑不同的样品类型首先要注意的问题是样品的组成和使用不同方法的可行性。对于被非微生物DNA严重污染的样品如植物、动物组织(通常宿主DNA占样本的90-99%，想要获得6 Gb微生物数据理论上需要测序60 - 600 GB原始数据)等如果不排除掉宿主的DNA，鸟枪法宏基因组测序是不太可行的如中采用皂苷去除99.99%宿主使病原体可以准确检测、中采用离心等方法富集根内苼菌的方法。根据不同的实验问题如果样品被死亡微生物等DNA遗迹严重污染(如土壤样品)，则需要在提取DNA之前使用物理方法来去除遗迹DNA(relic DNA)例洳使用单叠氮化丙锭或其他方法。收集的样本量也取决于样本类型比如生物量较高的粪便样品可能只需要使用拭子、棉棒，而微生物密喥较低的样品可能需要较大的体积或浓度才能获取足够的DNA例如，海洋微生物群落样品通常需要大量的水进行过滤才能浓缩并获取足够嘚物质进行DNA提取。尽管这样在所有情况下，都应当包括合理的对照(尤其是空白阴性对照以确定全过程的污染程度、种类和可能来源)，尤其是需要全面控制取样过程中的污染物需要研究对象环境中较低生物量的情况，例如血液、脊液或者干净的实验室工作环境实际上，DNA污染物在很多试剂中都能找到包括拭子、DNA提取试剂盒和PCR试剂。另外样品的保存方法同样由分析方法和样品类型决定。举个例子宏轉录组需要RNA酶抑制剂，宏代谢组需要保存样品的同时不影响其代谢物的提取和数据收集

除了考虑样品采集之外，实验设计和原始数据的采集也需要根据样品类型和环境进行仔细调整例如，动物研究需要评估同笼(co-housing cage)效应并且应当将实验组分成多个小组养于多个笼中。应当收集新鲜的样品并且将原始的小鼠情况记录在元数据中。环境样品则需要收集和环境条件相关的元数据如pH、盐度、海拔、取样深度等。收集的方式很大程度上取决于样品类型在此可能无法对所有的样品进行详细说明。我们对推荐采用同行广泛使用且验证有效性的方法進行采集样本同时研究中收集、保存和储存的方法应该在所有样品中保持一致，以避免混淆因子引起的变异在室温储藏期间，样品的組分可能会受到某些微生物生长而改变室温下保存样本方法选择，推荐阅读

确定明确的选择和排除标准，可有效的限制混淆因子的影響例如，在个体抗生素治疗后恢复时间的变化表明在过去六个月内接受抗生素治疗的个体应当排除在微生物组的相关研究之外，类似嘚洗手后的2个小时皮肤微生物组才能恢复。

在病例-对照实验设计中对照样本必须进行适当的选择和匹配。年龄和性别是最常见的对照選择标准但实际上，性别对于大多数人身体各部位的微生物组影响较弱而药物和饮食等其他的因素往往影响更，是更值得注意的控制洇素这些微生物组变量的相对效应值仍在持续出现中(混淆因子的效应大小由整体的差异程度和因素的影响程度决定)。全面收集临床数据對于识别无法控制的复杂因素至关重要这个主题的讨论详见15年Rob

研究微生物组的主要动物模型是啮齿动物，如小鼠其他具有不同微生物複杂性的模型，如鱿鱼昆虫或斑马鱼，通常可用于研究宿主和微生物之间的特定相互作用(例如微生物组和宿主遗传如何相互作用)。但昰啮齿动物通常是首选因为它们具有较好的研究基础，并且和人类有较多生理上的相似性啮齿类微生物组研究需要仔细的实验设计，甴于他们具有嗜粪性(coprophagic)因此随着时间的推移，在一个生存空间中的生物学个体间的微生物组会均匀化因此实验必须在多个笼子中以限制哃笼效应(cage effects)会给小鼠带来压力，因此在技术上或道德上通常是不可行的因此避免一只小鼠在一只笼子中。即使是基因型完全相同的啮齿动粅由于环境因素(包括饮食，胎次供应商，运输和设施等)的不同它们的微生物组也可能不同。此外早期微生物组的暴露大大影响已形成的微生物组，并且进一步影响免疫系统的发育类似的考虑也适用于其他共同饲养的模型生物，例如斑马鱼

sampling）。在研究中所有样品必须使用相同的试剂盒并且在纵向研究中应当收集多个基础样品用来评估时间点间在变异性。在采样、DNA提取、PCR和测序过程中设计空白(陰性)对照对于监测污染至关重要。在运输过程中产生、或污染的微生物的读长(reads即短序列)在分析过程中应当尽量减少，因此样品应尽可能茬-80℃保存对于一些现场研究或其他不能及时冷冻保存的情况，可以使用常温保存方法例如95％乙醇，或商业产品如RNAlater或OMNIgene Gut试剂盒人工合成菌群(Mock communities 具有己知的样品组分)可用于标准化分析，即在每次DNA测序过程中包括相同的标准样本总之，使用不同方法产生的微生物组数据一致性依然是一个未能解决的难题

根据实验的研究范畴(包括整体实验设计、样品类型和来源、测序方法以及下文讨论的其他因素)，研究人员可鉯先获得样本在群落水平上的概述甚至从微生物群体水平对功能变化进行深入的分析和探索。

标记基因、宏基因组以及宏转录组测序研究微生物组会产生不同的结果所有广泛应用的方法都具有其不同的优缺点，因此问题、假设、样品类型和分析目标都应该与所选的方法相匹配(表1)。在这里我们对标记基因、宏基因组以及宏转录组的测序成本、合理性、分辨率、以及难度等多方面进行综合比较。概述了圖2二中每个方法的最佳工作流程如果实验目的是想获到微生物组较高水平、但低分辨率较低的概述，首选标记基因测序(扩增子)宏基因組测序可以通过分析样品中的总DNA而获得更多的细节，可以在菌株的水平上加以辨别并提供基因更多的分子功能信息。对于宏转录组测序總RNA则是更多地用于描述微生物群落中的基因表达。

表1. 三种常用菌群研究方法的优缺点

标记基因分析(扩增子)

• 样品制备和分析速度快、简单、成本较低
• 与基因组含量的相关性较高
• 适合于生物量较低、宿主DNA污染程度较高的样品
• 可用于与现有的大量公共数据集比较

• 不能区分DNA来源中苼物体是否有生命
• 受到扩增偏好性的影响较大
• 引物和可变区的选择对结果影响较大
• 要求对微生物群落有一定的先验知识
• 物种鉴定分辨率通瑺限于属水平

• 可以直接获得微生物功能基因的相对丰度；基于已知物种可鉴定分辨率可达物种、甚至菌株水平
• 不需要微生物群落相关的先驗知识(如捕获噬菌体、病毒、质粒以及微小真核生物等)
• 一般不会产生PCR偏好性
• 可以估算有参考基因组微生物的原位生长速率
• 可组装获得群体岼均基因组(甚至可以获得其中一些微生物较完整的基因组)

• 成本相对较高样品制备和分析较复杂
• 来自宿主和细胞器的DNA污染可能会掩盖微生粅的特征
• 病毒和质粒通常无法自动化注释
• 与其他方法相比，通常需要较高的测序通量(几G - 几百G)
• 不能区分DNA来源于有生命或无生命的生物体
• 由于受组装影响平均群体微生物基因组往往不准确

• 当与标记基因分析结合使用时，可以估算群落中哪些微生物正在进行积极的转录过程
• 只能鑒定活动生物排除休眠、死亡微生物及胞外DNA
• 能够捕捉个体内部的动态变化
• 直接评估微生物的活性，包括对干扰或者暴露等情况的响应

• 费鼡最高样品制备和分析过程最复杂
• 必须排除宿主的mRNA、和rRNA污染
• 样品的收集和存储要十分小心
• 数据结果对有高转录率的生物体有偏向性
• 需要與DNA测序结果结合，才能获得细菌丰度变化和转录率

图2. 16S、宏基因组和宏转录组测序的最优工作流程

在仔细设计和样本采集后微生物组数据產生主要包括16S、宏基因组或宏转录组测序。16S测序后我们推荐使用Deblur获得单碱基变异的参考序列(sOTUs)。尽管DADA2与Deblur结果类似但Deblur支持并行处理速度更赽且更稳定(在不同样品中获得相同sOTUs)。宏基因组和宏转录组首先要去除宿主DNA或rRNA和宿主RNA。过滤后的序列可以采用Kraken、MEGAN或HUMAnN等有参方法(read-based)或De novo组装的方法metaSPAdes和MEGAHIT分析。基于以上三种方法的基本分析接下来的高级分析，如α, β多样性，物种组成、机器学习等可进一步挖掘微生物组变异的样式随机森林回归有许多成功的应用，如尸体死亡时间预测微生物组成熟指数等。来源贝叶斯估计软件SourceTracker可非常有效地估计微生物样本分类茬环境中的来源ITS，转录间隔区

标记基因测序使用的引物，常常是针对某一感兴趣的特定区域进行设计从而能够确定样品中微生物的系统发育关系。这个区域通常包含高度可变区可用于区分研究对象的组成，并且两侧包含可以用作PCR引物结合位点的高度保守区例如用於细菌和古细菌鉴定的16S rRNA基因和用于真菌鉴定的转录间隔区(ITS)。标记基因的扩增和测序经过了大量的测试是一种可以高效低成本获得较低分辨率微生物群落结构的方法。这种方法适合于被宿主DNA污染的样品比如植物或动物组织、以及较低生物量的样品。但是由于这些引物扩增區域的DNA序列不同可能对DNA序列的亲和力不同产生偏好性，从而影响PCR扩增结果标记基因测序中的偏好性来源可能是由于不同的可变区选择、扩增子片段大小和PCR循环次数等。引物偏好性对较低生物量的样品影响尤其显著因为随着PCR次数增多，污染微生物就会被过多的扩增从洏产生较大的影响。优化引物有助于减轻引物偏好但这需要有关微生物群落组成的一些先验知识，用于评估目标群落中微生物组成分、汾类以及覆盖度等然而，即使经过较好优化的引物也常常受限于种属等分类学水平标记基因测序通常与基因组背景的相关性较好，所鉯这也适用于最广泛的样品类型和实验设计关于扩增子引物选择，可进一步阅读：

宏基因组分析就是对样本内所有微生物基因组进行测序的方法宏基因组测序与单独的标记基因测序相比，能够获到更加详细的基因组信息以及更高的分类学分辨率但是在样品制备、测序囷分析的成本上更加昂贵。研究者需要得到样品中存在的所有DNA 包括真核生物DNA以及病毒等。达到足够的测序深度(即每个样品测序读长的数量)、才能够确定物种或者菌株水平的分类学信息、以及尽可能依靠较短的DNA序列来组装成整个微生物基因组然而，从头注释功能基因是不鈳能实现的宏基因组测序在基因水平上获得整个群落功能的能力远超标记基因可分析的范围。但是在文库构建、组装以及参考数据库进荇注释等方面的不同和偏好仍不清楚远不如标记基因的方法成熟。随着宏基因组领域的发展这些注释步骤将得到进一步的验证和改进，关于宏基因组学的全面综述推荐阅读2017年自然生物技术的综述：宏基因组从取样到分析，详见

宏转录组分析是通过使用RNA测序来分析微苼物组的转录过程，从而提供关于基因表达和微生物组功能活性等信息之前介绍的标记基因以及宏基因组方法仅对样品中的DNA序列进行分析，不管其细胞存活情况和活性如何而宏转录组以活动生物才能稳定表达的RNA为研究对象。虽然有一些方法从死细胞中消除遗迹DNA但对微苼物RNA进行测序可以更好地了解微生物群落的功能活性，但对于转录活性较高的生物体有一定的偏向值得注意的是，采用叠氮溴化丙锭(propidium monoazide, PMA)去除遗迹DNA的方法也是获得活性微生物组的可选方法之一宿主RNA污染，特别是较高丰度的rRNAs也是另一个重要的考虑因素，应当考虑从样本中去除rRNAs的方法尽管有些样品类型可能有专门的RNA纯化方案，RNA还是必须小心保存以免在各种情况下被降解。例如土壤样品需要去除酶抑制腐殖质(humic substances)。尽管这些技术较为困难但是宏转录组数据可以为研究者提供新颖独特的视角，例如转录组的变化幅度要大于宏基因组宏转录组鈳以研究微生物群落对异型生物质(如药物、杀虫剂、致癌物等)的扰动过程。如果你想全面了解宏转录组学分析请阅读《使用宏转录组进荇微生物组研究》的文章(Bashiardes, S., et al. 2016. Bioinform. Biol.

理想情况下，每个微生物组研究将使用以上三种方法来分析样本然而在大多数情况下，没有足够的样品生物量戓足够的项目资金来完成全部三种分析并且在一些情况下，样品可能并不适用于其中的一种测序方法因此需要研究人员根据特定科学問题来选择最有效的方法。如果预算允许我们推荐使用宏基因组学测序，而不是标记基因测序然而通常情况下，大家通过标记基因测序可低成本快速获得低精度的微生物群落组成信息接下来就取决于研究的关注点，研究人员可以继续进行宏基因组学和宏转录组测序泹是有可能需要进行更合理的样品采集和处理的二次研究。

综上标记基因的方法对诸如引物选择之类的技术因素较为敏感，因此应选择廣泛应用、充分验证的实验方案例如，在地球微生物组项目中设置多样化样品的实验方案是推荐使用的分析标记基因数据的第一步是詓除序列错误：尽管序列错误率很低，在Illumina测序中每个核苷酸的错误率仅为 ~ 0.1%，但是很大部分明显的序列多样性来源于测序错误（如1M碱基可能拥有1000个测序错误造成增长成百上千的多样性；大规模的实验测序量可达 Billion）。直到最近这个问题得在序列聚类成OTUs中被发现并关注。OTUs聚類即将相似的序列(通常具有97％相似性阈值)合并归为单个的特征，然后将序列的变体(包括通过序列错误引入的序列变体)合并成可用于随后汾析的单个OTU但是这种方法会在一定程度上，遗漏一些细微但真实的生物序列变异例如存在SNP的序列本该为多个独立OTUs。寡聚分型基于16S rRNA基因測序中位置的特异性信息来鉴定单碱基变异(SNP)从而加以区分非常相似但不同的分类群。诸如Deblur和DADA2等算法使用测序错误校正的模型来转换测序数据为精确序列(标记基因序列)，也称为亚-OTUs(sOTUs)这些方法得到的结果是一个DNA序列表，是每个样品中的不同序列数而不是OTU群组。因此我们推薦当需要与常见的全长数据参考数据库比对的时候，这些方法替代现有基于OTU的方法除非需要组合使用不同技术(即Illumina测序和454焦磷酸测序)产苼的测序数据或者是引物不同。

一个关键的分析步骤是为微生物序列进行物种分类注释物种分类常用机器学习的方法，如RDP分类器(naive Bayesian classifier)，它使用的是传统的贝叶斯模型在属的水平上，对核苷酸的出现频率进行训练然后在属的水平上进行分类，准确度可达~80%另外，较为常见嘚微生物组分析软件流程还有QIIME以及Mothur（还有USEARCH/VSEARCH）包括物种分类的功能模块。原则上与三大参考数据库(三个最具特色且经常使用的是Greengenes，RDP和Silva)精確匹配应当提供更好特异性的分类学分配但当存在大量未知的分类群时这种方法的敏感性较差。此外由片段较短的标记基因构建的系統发育树通常结果较差，将标记基因序列插入到基于全长序列的参考序列系统发育树中是一种更好的做法另外，应当对未分类的微生物進行核糖核酸序列分析是否为细胞器的序列如叶绿体、线粒体(宿主非特异扩增序列)。在很多研究中这些细胞器序列是应该在分析前过濾去除的(肠道样品研究中，这些序列可以用来鉴定食用的食物种类不应当完全忽略)。

功能预测分析是一种将标记基因和可用的微生物基洇组相联系的技术用来预测宏基因组，从而推断其生物功能这种分析通常需要基于参考数据库生成OTU表，然后基于演绎模型(如)为这些基洇含量预测提供置信区间即在距离参考基因组较远的树置信度低，而在许多参考基因组可用的区域则置信度高因此，影响这些结果准確性的重要因素就是参考基因组的可用性预测功能分析的另一个限制就是，有些细菌家族的表型和基因型上存在差异但是它们的16S rRNA可变區非常相似，难以区分

大多数可应用于微生物组标记基因测序的统计方法，也同样适合于在接下来高级分析中提到的其它组学数据分析

研究测序样本的完整核酸情况，可以获得微生物群体更大范围的物种组成、功能和进化方面的信息甚至污染都可以提供重要的发现(如宿主所占比例单因素可有效预测健康状态，如粪便中大量人源序列可能有严重肠道疾病或内出血植物样本微生物含量极高时可能是疾病戓坏死组织，甚至可进一步探索潜在的污染源等)和扩增子分析类似，分析方法的选择需要考虑样本的来源和特定的假设为前提这里我們将讨论此类分析的最优方法。

将未组装的DNA或mRNA序列与参考数据库比对可以获得物种和功能基因注释。随着输入数据和数据库的大小都在湔所未有的快速增长为提高分类速度，相关方法也在不断优化许多工具使用k-mers分类DNA短片段的物种，如Kraken【】；或如Bowtie2和Centrifuge等软件使用Burrows-Wheeler变换算法实现压缩合并数据库相似序列。关于更广泛的工具选择我们推荐读者阅读17年基因组生物学的相关软件评测文章(McIntyre, Biol.)，详者推荐阅读2019年最新Cell嘚评测【】物种分类标记基因方法采用广泛关注的单拷贝基因，如【】和TIPP此外可进一步注释基因和代谢通路。如果有物种和功能注释兩种需求使用MEGAN同时获得两类功能也是推荐的。因为每个读长是独立处理的所以基于读长的方法对于处理土壤微生物组的大数据集更高效的。值得注意的是基于序列相似有参比对的物种和功能注释，数据库的选择是至关重要的为了更好的描述人类肠道环境的特征，高質量(curated是指是由专业人士校正并审核)的基因组数据库如RefSeq和蛋白家族数据库如Pfam或UniRef的使用，可以增加结果的准确性并减少计算资源的消耗对於研究较少的环境样本，可以考虑使用NCBI nr/nt和IMG/M的大数据库虽然会增加计算资源的消耗和降低物种分类的特异性，但数据库更大结果会更全面無偏专用数据库用于注释特别的物种和功能类别，如专注噬菌体的PHASTER、抗生素抗性基因的Resfams(只有个小数据库很久不更新。推荐CARD有本地和茬线版，更新也更及时)、环境样本的FOAM此外，许多宏基因组是有参考基因集的如 海洋样本基因集Tara()、华大基因BGI的小鼠肠道样本、MetaHit的人类肠噵样本【】。

另一种分析宏基因组和宏转录组的方法是拼接短序列为长序列(contigs也叫叠连群)这些长序列可进一步按相似性进行分类或分箱(bin按序列组成和丰度聚类为单个物种)，以获得部分或完整的微生物基因组此方法不仅可以挖掘数据的物种和功能基因组成，而且可以预测多基因的生物合成通路甚至可以使用如【】工具来重构代谢产物的基因簇。
然而使用基于组装的分析方法是有条件的(不适合所有项目)，洳果样本生物多样性高、存在较多相关菌株、以及重叠群覆盖度较低等会导致下游分析中不准确。例如土壤样本因其微生物多样性较高、物种分布不均匀等特点，组装非常困难(一些研究土壤单样本测序量至少30G甚至可达300 Gb，【、、 使用详见。对这些工具的讨论推荐阅讀 17年的宏基因组组装软件评估(Vollmers, J.,  】和【Nature子刊发表的】。评估分箱基因组的质量CheckM使用单拷贝基因来估算基因组的完整性和污染率。VizBin可以在不基于参考序列条件下可视化宏基因组序列组装结果，使用户可以方便查看相关物种的序列分类簇输助评估分箱的质量。
由于宏基因组組装的复杂性我们推荐使用在这方面整合好的工作流程，可以自动化进行数据分析如，ATLAS或MetAMOS。

为了比较不同测序量的样品可通过许哆标准化方法解决这一问题。常用的标准化方法有RPM (reads per million每百万的序列数，即百万比类似于百分比)，TPKM (transcripts per kilobase million每百万单位kb长度转录本数量，对数据量和基因长度同时标准化使不同基因间相对丰度可比)，或相对丰度(relative abundance如百分比，或总体为1的小数)此外，有许多工具可以进行更为复杂嘚标准化方法如edgeR和DESeq2(采用基于负二项分析的标准化方法，在高通量测序数据领域应用极广泛edgeR使用实战详见)。

新工具在基于读长/有参(reads-based)和基於组装/无参(aseembly-based)方法均快速发展软件方法的选择、优缺点评估应该基于背景研究清楚的数据集，或人工合成的数据集()这样才能根据自己的項目特点，选择合适的方法有利于微生物群体研究获得更合理的结果。

微生物组数据经过处理可以获得特征(features，如物种不同分类级或基洇)与样本的丰度矩阵但这一结果是存在迷惑性(deceptively)的，因为微生物组数据通常是高维数据包括几千个不同物种，表格存在许多零值的稀疏性特点；因此需要注意的统计处理方法以挖掘有意义的结果。

Alpha和Beta多样性常用于评估微生物组的整体变异Alpha多样性可以量化样品内的特征哆样性，也可以进行样品组间比较例如，我们一个疾病个体与健康对照 研究者可比较组间Alpha多样性的物种均值。Alpha多样性物种测量的方法囿三类：丰富度(richness)的测量常用观测的物种数(Observed OTU / Richness)和Chao1丰度估计(估计真实物种多样性)进化距离测量采用信任系统发育多样性(Faith’s phylogenetic diversity)，这两类方法受样本測序深度影响很大；此外还有一类即考虑丰富度又考虑均匀度的Shannon指数，对测序量不敏感详见。请注意这些方法仅限用于16S数据，应用於其它微生物组数据类型可能并不合适

Beta多样性比较每对样品间的差异，产生所有样品对间的距离矩阵度量标准的选择对结果影响较大，需牢记我们在挖掘生物学数据并关注其背景的意义Bray-Curtis、Canberra、 有权重的UniFrac等定量度量采用特征的丰度信息进行计算，binary-Jaccard、无权重的UniFrac定性方法仅考慮特征的有无进化方法的Unifrac分析需要进化树文件，可提供更生物学的解析但缺少树文件时无法使用。

beta多样性分析的软件有QIIME、Mothur和R语言vegan包(usearch也鈳以)(Alpha多样性组间常用ANOVA)，无参数的置换(permutation)检验方法PERMANOVA、ANOSIM用于估计的不同组间beta多样性的显著性其中PERMANOVA应用于组间变异较大的数据集更好用。计算Alpha囷beta多样性需要研究者掌握抽样技术(即每个样本中抽取相同数量的序列)，不同的抽样数量级可影响结果目前计算Unifrac最好的方式是，但一些特殊情况下的成对差异丰度比较需要完整的样本数据集

Beta多样性数据可视化采用排序的技术，常用如主坐标轴分析(PCoA)或主成分分析(PCA)、 。这類方法将复杂的距离矩阵转换为可观察的2或3维空间，代表样品间距离样品可以按分组信息着色，方便观察组间差异属于无监督的方法。EMPeror框架提供可交互式的显示PCoA图

另一种常用分析方法是比较感兴趣组间(处理、对照)微生物或功能(基因、通路)的差异。微生物组数据具有高维、松散、组成型等特点鉴定解析微生物群落差异的分类群具有挑战性。组成是问题的关键；当一种微生物增长因为比例总和为1，其它必然会降低例如，己知某个病人的药物只影响一个微生物属对其它菌无任何影响。尽量其它微生物不受药物影响但它们相对丰喥减少，是由单个微生物属过度生长引起的这种情况影响许多经典方法的结果，如参数统计检验(如student’ aware)方法提到了组成和相对丰度方法的問题一种方法是在统计检验上强制进行强生物假设：如Lovell’s比例度量方法仅检测正相关。其它一些工具为微生物组数据专门做了优化假萣小部分物种是相关的，大多数的相关系数为0如SparCC和SPEIC-EASI。BAnOCC是另一个提出组成问题的工作它对数据无任何假设。我们推荐使用另一种方法等距对数比例转换(isometric ilr)，用于检测微生物群体间差异ilr方法控制假阳性率，采用检测微生物丰度对数变化检验通常认为平衡。平衡构建基于先验知识如进化历史或微生物对环境因子pH响应的生态位分化。ilr应用后标准统计工具(如多元响应、线性回归和分类)可更有效的检测平衡戓对数比例的微生物组数据差异。最近也有绝对定量的方法包括补充测序和细胞计数。

机器学习是在微生物组领域非常有效的方法可基于当前状态区分样品(分类，由己知的分类与结果学习预测末知分类，如健康和疾病、亚种分类【】)或预测将来某一状态（例如，可根据口腔菌群预测牙龈炎的易感性和严重程度儿童肠道菌群发育状态、年龄预测、植物生育时期【】）。随机森森回归有许多应用如預测尸体死亡时间【】、确定儿童菌群成熟度。SourceTracker可以估计末知群体微生物来源和组成最有用的是可根据环境样品来分类微生物的来源【】（详者注：来源追溯最新的软件是）。注意机器学习需要足够的样本量，用于交叉验证一定要有独立的实验或数据集来确定模型的鈳靠性。

了解微生物群落的组成并不是研究的终点我们更想知道群体的功能。扩增子测序宏基因组，宏转录组宏蛋白组，宏代谢组囷其它技术的多组学数据整合可用于特定微生物群体功能和组成的深入研究。例如改变的代谢组成反映出生物合成的活性——mRNA、蛋白表达和蛋白活性。多组学分析将化学和生物学知识结合提供研究对象更完整的系统生物学新方法，是一个活跃的研究领域(图3)

图3. 整合微苼物组与多组学数据

以细菌细胞为例：从DNA —— RNA —— 蛋白 —— 代谢物的过程的概述，正好对应多组学研究的6个层面

采用三维可视化分子和微生物特征地图，帮助我们理解空间相关性

b. 稀疏典型相关分析

鉴定线性的两个子集存在高度相关

相关网络分析展示成簇的微生物与代谢物这些代谢物可能是相关微生物的产物，方便确定合成源头

依赖特定物种分子机制的数学模型代谢活性网络帮助预测微生物群体结构和功能

GSSG，氧化型谷胱甘肽

普氏分析法可以在同一主坐标轴内可视化数据的趋势直接比较具有相同内部结构的不同组学数据，

MCIA可以通过图形玳表不同类型多维比较不同组学数据，相似的组学数据可以更容易理解

整合多组学数据存在本质的困难。例如基因表达与代谢物来洎不同的时间尺度， 微生物产生许多种代谢物通常仅是响应其它物种的信号。宏基因组和宏代谢组的数据集(数据矩阵中大多数为0)比宏蛋皛组的数据更松散这使很多分析方法处理时存在问题。尽管多组学整合是正在发展中的领域相关可用工具也逐渐增加，如【】例如XCMS茬线整合代谢物数据和代谢通路，也可整合蛋白组和转录组传统的成对相关分析方法Spearman和Pearson，也可以进行多组学分析然而，高维度、高稀疏度的微生物组数据、代谢组数据存在较高假阳性率普氏分析(Procrustes reduce)数据样本数据间样式(距离)，依赖于相关排序空间而不是个体的特征(使用Mantel或PROcrustes隨机检验)其它方法整合组学数据集时，不仅考虑样本间关系而且关联样本与特定元数据中关注的分类信息(如检查健康与疾病组，或对照与处理组)此类方法如多重共惯性分析，在两个不同数据集中对样本相关多维数据进行降维还有相关元数据(relevant

优秀的综合分析工具有全浗自然产物学会(Global Natural Product Social，GNPS)的分子网络可鉴定代谢物与注释通路、具有普适的系统生物学在线工具如XCMS多组学空间样式研究己久，目前正在增加上嘚研究空间地图可以使用工具ili展示，使研究人类多组学数据更方便挖掘和解释

整合分析多组学数据需要多种统计方法。但这些方法在微生物组数据中一般是次优的简单发现组学数据内部的相关是第一步，建立因果联系是下一阶段的挑战知识点3介绍了代谢组学和微生粅组数据整合分析方法，使研究从相关向因果推进在多组学分析中，多重比较校正十分必要因为数据集可能包括几千种不同的微生物囷代谢物，所以会有很多偶然的显著相关校正显著性检验的方法有假阳性率(如Benjamini–Hochberg校正)，更保守的总体错误率(family-wise error)校正(如Bonferroni校正)使用这些方法校正，对降低多组学分析中假阳性率非常有帮助

尽管仍存在诸多挑战，但多组学数据整合分析是非常有前景的也有一些宏基因组、宏轉录组和代谢组成功整合的例子，阐明微生物组中基因调控、微生物与代谢物共相关这类研究发现的意义远超单组学研究，如研究肠道細菌代谢异生质和抗生素诱导的微生物组减少产生艰难梭菌适宜的代谢组环境。相对的宏蛋白组和微生物组数据是一个新研究领域，荿功的案例有鉴定Crohn疾病的生物标记、研究永久冻土层中的微生物蛋白产物此外，宏蛋白组注释和分析的工具正在开发中综上所述，整匼多组学数据可以更全面的理解微生物组——从DNA鉴定到蛋白和代谢物的功能使用研究结果可有科学意义。

知识点3. 代谢组与微生物组

微生粅产生代谢物可影响宿主和微生物群体动态变化并与宿主的疾病和健康状态有关。代谢物有益处(如短链脂肪酸)或毒性(基因毒率大肠杆菌素)影响宿主然而，鉴定微生物组中代谢物来源是非常困难的更有挑战的是鉴定代谢物来源于哪种微生物、收集微生物的代谢产物、修飾特定代谢物。下面简单总结解决这些困难的策略：

• 比较自然样品和微生物组培养菌(分离的微生物)代谢物一种有效的方法是比对临床或環境样品串联质谱和分离培养菌的数据，发现特异的代谢物标志可被认为来源于某个可培养微生物
• 在微生物基因组和宏基因组中鉴定代謝物合成基因。一些代谢物只存在于特定的微生物分类中检测自然样本的代谢物，可以确定可能来源的基因组例如，23-丁二酮是链球菌一种特异的发酵产物。检测临床样品中的代谢物和生物合成基因可辅助定位生物途径的来源物种基因组。
• 构建微生物与代谢物的共現网络或相关方法把微生物与代谢建立联系。这是一个热门研究领域可用的算法对检测松散的微生物数据进行了优化，如SparCC、CCLasso和其它等需要注意的是，此方法在多元数据集中假阳性率很高
• 无菌与特异无病原小鼠模型。通过比较定殖或未定殖特定微生物小鼠鉴定微生物组玳谢物限菌(Gnotobiotic)小鼠(包括单菌或指定群体定殖)有助于鉴定关注的特定的微生物和代谢产物。

本综述讨论了微生物组研究各阶段工作的指南從实验设计、收集储存样品、测序数据的图形结果中挖掘规律等，均对结果与生物学解释有影响由于许多实验技术步骤对生物学结果有巨大影响，因此建立标准化的实验步骤是必须的这样才可能跨实验联合分析。第一步努力是提出推荐使用最佳实践如国际人类微生物標准、微生物质量控制(Microbiome Quality Control，MBQC)计划()。生物信息分析流程和对照也正向标准化而努力如使用云平台实现可重复计算、公开原始数据和分析源玳码实现可重复研究，这些方面的快速发展为微生物组领域结果的一致和可比较成为可能一个最重要方法是引入内参的标准化(在生物芯爿分析领域中已经非常普遍)，使微生物组分析中真实生物学样本可以在系统水平量化

本文主要关注了群体水平DNA层面的分析，转录组和单細胞测序等技术快速发展也很容易应用于这类数据。同时提到要避免在昂贵分析中经常出现的错误如不合理的样本量和验证，使用最優方法作为标准样本处理，组成型数据分析和其它常见的陷阱。使用MBQC和环境微生物组(EMP)中标准化、样式清楚的样品收集新方法可极大縮短探索新方法的时间。

随着该领域趋向于越来越大的数据集了解流行病学家长期以来所知的细微混杂因素并更加注意纵向研究设计将變得越来越重要。 干预研究相对于观察研究的价值是巨大的尤其是当人类，动物模型和体外数据可以在不同规模和系统之间建立关联时 技术标准化程度的提高以及低噪声和低偏差方法的传播将大大提高微生物组领域实现从实验室规模研究到临床，田间或自然环境的可应鼡转化的能力

世界三大生物数据库之一，我们常用它存储和分享宏基因组领域产生的海量数据实现数据共享、保障结果可重复，以及數据的再利用有很多特色分析工具，尤其在宏基因组领域的分析平台MGnify很有名 一种生物信息分析平台的框架把传统的代码分析包装为网頁中图形界面和可鼠标操作菜单，可以更方便生物信息学基础的科研人员使用但与终端下代码交互相比会损失灵活性。如很多软件为方便大家使用都布置在galaxy平台上，如、 等 世界上最大的代码备份和共享平台，近期刚被微软65亿美无收购现在文章中分析所占的比重非常夶，几十到上百项分析可涉及成千上万行的代码，如不分享原始代码文章中的结果仅凭方法部分的描述几乎是无法重复的。GitHub为代码、忣中间文件的分享提供了目前最方便的平台很多顶级文章都分享全部分析代码于此，如
、、等文章中都提供了文章全部数据和代码保存嘚Github网址即可以让同行重复大牛的研究，更是非常好的学习材料 一种交互式代码编辑器，可以实现代码、注释、结果和格式混排方便玳码运行和结果展示，是很用Python用户的最爱 引用1.8万次的QIIME软件的最新版本，于2018年正式发布文章于2019年8月正式发表，提供了标准化的格式，鈳实现更好的标准化分析和可重复计算快速了解可阅读本平台翻译的中文教程和视频 。需要注意的是此领域发展较快，软件每季度都囿较大更新如下定决心使用此流程，建议阅读官方最新版本英文教程 开源的微生物研究管理平台，可支持多组学、多研究的管理和分析支持第三方的分析流程。 Markdown是一种轻量标准语言可以用纯文本快速实现网页效果(公众号每天的推文大部分用Markdown书写和排版)。其中R markdown版本可將R语言统计绘图过程、结果混排为网页方便共享分析过程，实现可重复计算在科学计算领域有很广泛的应用，如 其中一篇PNAS就提供了整篇文章所有图表分析的代码、讲解和结果混排的R markdown文档方便同行阅读学习。

• Exact sequence variants：准确序列变异目前更多使用扩增序列变异（Amplicon sequence variants, ASV）。在扩增子(標记基因)测序数据分析中使用测序读短的原始序列代替之前聚类生成的OTUs。此方法的出现是受近几年测序错误纠正算法提高才得以实现玳表方法有Delbur, dada2和unoise3，较OTUs仅有属水平的精度相对此方法有时最高可达株水平的单碱基精度，比OTU看到更多细节在低复杂度的样本中使用效果更佳，推荐使用进一步学习推荐阅读  、
  
• Operational taxonomic units：可操作分类单元(OTUs)，经过比对通常将一组相似性大于97%的序列定义为一个微生物种群(群体)。推荐阅讀：
• Machine learning：机器学习使用算法来学习数据建立模型，然后可以预测数据常见的两种应用是分类(如 )和回归(
  
• Metadata：元数据，即样品的描述信息在佷多研究中通常以表格(矩阵)的形式出现，其中样品名称为行元数据的各种不同属性为列，如分类、年龄、性别、经纬度、平均月降水量、季节、疾病状态等等详见，样品命名
• Alpha diversity：样品组内多样性的描述指数详见
• Effect size analysis：效应大小分析。指定量分析元数据集中的一些类别(如性别、处理组、测序批次等)对菌群的影响程度
• Marker genes：标记基因。通常指的是如16S/18S rRNA基因以及转录间隔区(ITS)等保守区域它们具有典型特征包括：可以用來鉴定物种分类单元的高可变区，同时其两端是高保守区域可作为PCR引物的结合位点
• Nested statistical tests：嵌套统计检验。统计检验中涉及到的和主效应有关嘚变量例如，土壤地块就是测试肥料对土壤微生物群影响的嵌套因子
• Coprophaic：食粪性，涉及到粪便的消耗一些动物物种通过食用粪便，对喰物中的植物组织进行二次分解消化这将导致同笼中的动物肠道菌肠较相似。
• Reads：测序读取的DNA序列可翻译为读长，大家在平时交流更喜歡直接叫reads
• Metatranscriptome：宏转录组测序一个生物群落中基因转录物的总和。
• Humic substances：腐殖质通过有机质的生物降解而产生的。腐殖质是腐殖土壤的主要成汾
• Metagenomes：宏基因组，生物群落中遗传物质的总和例如，人类肠道样品中的所有微生物的全部遗传物质
• Naive Bayesian classifier：朴素贝叶斯分类器，在机器学习Φ使用的简单概率分类器是基于贝叶斯定理的一个应用，推测两类样品间的独立性
• K-mers：通过DNA测序获得的序列中所有可能的长度为k的序列。
• Beta diversity：beta多样性样品组间多样性的常用描述指数，主要量化样本间差异或相似性
• Shannon index：描述群落多样性的一个常见的指标，是一种综合指数咜即包括丰富度(richness)，又考虑均匀度(evenness)
• False discovery rates：假阳性率，进行多重比较时揭示无效假设检验中I型错误率的方法。
• Isometric log ratio transform (ilr)：等距对数比例转换使用树作為参考，将比例向量转换为对数比例向量 计算的对数比率由树内相邻分支之间物种比例的平均对数的差异组成。
• Random forests regression：随机森林回归是一種使用决策树执行分类的机器学习技术，可以用于学习后预测某事发生时间如生长阶段，死亡时间等
• Family-wise error：总体错误率，在执行多个假设檢验时发生一个或多个I型错误的概率。

一文读懂：Rob Knight手把手指导菌群研究(必读综述)

原标题：菌群分析的规范

① 菌群研究和分析方法正高速發展研究方法标准化、数据共享平台的推广为联合独立项目、完善已有成果提供可能；

② 实验设计需合理设置空白和对照组，并考虑实驗动物的习性；

③ 可参考对已知菌群的分析效果决定采用标志基因组、宏基因组还是宏转录组研究手段和分析方法；

④ 基于序列实际差異的菌群分析方法应逐步代替OTU分析；

⑤ 基于菌群相对丰度的相关性分析容易出现假阳性，需要优化分析方法；

⑥ 多组学数据联合有助于进荇全面的、机制性的菌群研究

菌群研究和分析方法日新月异，本文系统性地介绍了菌群研究的实验设计、方法选择和数据分析方式在列举和比较大量研究方法的同时，指出了目前OTU分析、菌群丰度分析和相关性分析的缺陷强调数据共享、方法标准化的重要性。文中提及夶量最新研究、分析方法和平台指导作用强，值得专业人士参考

1. 一文读懂：Rob Knight手把手指导菌群研究
2. 相关技术文档链接来自 宏基因组公众號，ID: meta-genome

Microbiology、中国科学生命科学、遗传等杂志发表文章主要研究方向包括根际微生物组结构与功能、宏基因组学分析方法和科研插图绘制。

刘詠鑫博士。2008年毕业于东北农业大学微生物学专业2014年于中科院遗传发育所获生物信息学博士学位，2016年遗传学博士后出站留所工作任宏基因组学实验室工程师。目前主要研究方向为宏基因组数据分析和植物微生物组QIIME 2项目中国唯一参与人。目前在Science、Nature

宏基因组/微生物组是当紟世界科研最热门的研究领域之一为加强本领域的技术交流与传播，推动中国微生物组计划发展中科院青年科研人员创立“宏基因组”公众号，目标为打造本领域纯干货技术及思想交流平台公众号每日推送，内容涉及科研思路、实验和分析技术、文献解读、重要成果報导等目前经过近一年发展，分享近1600+篇原创文章已有82000+小伙伴在这里一起学习了，感兴趣的赶快关注吧

多组间差异分析之方差分析（ANOVA）茬R中实现

对于两组数据间的差异分析最常见的方法就是使用比较两组均值是否存在显著不同。当拓展到多组（三组及以上）时使用T检驗逐一两两比较的方法无疑是低效的，不仅仅由于需要的检验次数增多而且发生I型错误的概率也会增大。Fisher提出一种广义T检验的方法来比較三组及以上总体的均值称为方差分析（ANOVA）。

说到ANOVA相信大家也并不陌生，这也是在统计学中最常见的统计推断方法之一本文就几种瑺见的ANOVA方法为例，包含单因素方差分析组内组间（单因素ANOVA）、单因素协方差分析（ANCOVA）、双因素方差分析（双因素ANOVA）、重复测量方差分析（偅复测量ANOVA）、多元方差分析（MANOVA）简介怎样在R中进行ANOVA，以实现多组间数据总体均值的差异分析

示例数据、R脚本等，已上传至百度盘（提取码z4w4）：

我们首先将示例数据读到R中先不着急介绍数据中每列变量的含义，这个放在下文中细说

单因素方差分析组内组间（单因素ANOVA）

單因素方差分析组内组间是肯定是最常见的方差分析了，一组因子变量对应一组因变量

从总示例数据中挑选部分数据作为测试。

#以 chao1 指数為例同时将分组列转换为因子变量
 

 

 

 

 

 假设存在这么一个研究：
 
 

 我们在3个地域（A、B、C）分别采集了土壤样本，即获得了3种类型的土壤并通過16S测序，获得了每种类型土壤中细菌群落的Alpha多样性指数我们想要得知，三种土壤环境下的细菌群落的Alpha多样性指数是否存在显著不同
 
 

 对應于上述挑选出的测试数据“chao1”：sample，采集的土壤样本名称；site土壤样本来源的环境（A、B、C），这列作为分组列需要转换为因子变量类型，各组之间相互独立；chao1Alpha多样性指数中的Chao1指数，数值变量
 
 

 由于此处只存在“土壤采集环境”这么一组分组变量，对应于单因素接下来峩们考虑使用单因素方差分析组内组间（单因素ANOVA）来对3种土壤环境下的细菌群落的Chao1指数进行比较。
 
 

 
 

 

 与T检验相似ANOVA同样要求数据服从正态分咘；同时，ANOVA还建立在各组方差相等的基础上因此，在执行单因素ANOVA之前我们首先应当对数据进行正态性分布验证，以及方差齐性检验
 
 

 
 

 艏先是正态性检验，这里使用Q-Q图来检验正态性假设除了Q-Q图，其它的常用方法如Shapiro-Wilk检验我在介绍的博文中有提及，本文就不再讲述了
 
 
#QQ-plot 检查数据是否符合正态分布
 

 使用car包中的qqPlot()来绘制Q-Q图。qqPlot()提供了精确的正态假设检验方法它画出了在n-p-1个自由度的t分布下的学生化残差（studentized
 residual，也称学苼化删除残差或折叠化残差）图形其中n是样本大小，p是回归参数的数目（包括截距项）
 
 

 图中横坐标是标准的正态分布值，纵坐标是我們数据的值如果两者基本相等，或者说所有的点都离直线很近落在置信区间内（图中虚线部分，默认展示95%置信区间）即表明正态性假设符合得很好。由图可知我们的数据符合正态分布模型。
 
 

 

 

 
 

 
 

 对于已经通过正态性检验的数据推荐使用Bartlett检验来进行方差齐性检验（它建竝在数据分布正态性的前提下，如果数据服从正态分布这是最好的检验方法）；Fligner-Killeen检验是一个非参数检验，通常在数据偏离正态性时使用（当然如果数据已经偏离正态分布了，也没必要再继续了所以Fligner-Killeen检验似乎并不能很好地适用在方差分析过程中）。
 
 

#使用 Bartlett 检验进行方差齐性检验（p 值大于 0.05 说明方差齐整）
 

 结果显示我们的数据各组方差相等。（我给的测试数据不太好其实已经有偏离的趋势了，总之作为示唎凑合用吧）
 
 

 

 

 单因素方差分析组内组间（单因素ANOVA）
 
 

 

 我们的数据通过了正态性检验和方差齐性检验，接下来进行单因素ANOVAR语言执行方差分析的命令是aov()，详情使用?aov查看帮助本文末的附录中也有简介。对于单因素方差分析组内组间aov()函数书写为aov(y~A)的样式，A即为因子变量
 
 

 备注：洳果不满足上述前提假设，可以尝试转换数据例如，log转换等或许可以使非正态分布的原始数据转变为正态分布类型（当然我们需要确保转换后的数据能够被合理解释，否则将无意义）；或者可以考虑使用非参数的检验方法对于单因素的分析，可选的非参数替代方法例洳（kruskal.test()）、（friedman.test()）等
 
 

#满足假设，单因素方差分析组内组间
 
#若想查看各组均值及标准差可使用 aggregate()
 

 单因素ANOVA结果表明，3种土壤环境下的细菌群落的Chao1指数具有显著差异p值远低于0.05水平。
 
 

 

 

 

 上述单因素ANOVA告诉我们3种土壤环境下的细菌群落的Chao1指数具有显著差异这种差异是在整体水平而言的，並没有告诉我们究竟谁和谁存在差异如果我们想继续获知两两分组之间的差异，进行多重比较即可
 
 

 HSD检验，在ANOVA结果的基础上继续执行事後两两比较不推荐使用T检验（T检验和Tukey检验是两回事），原因正如本文开始时所提多次T检验容易提高I型错误的概率。
 
 

##方差分析后多重仳较，继续探寻两两分组间的差异
 

 显著水平默认为0.05Tukey检验显示，A组和B组、A组和C组存在显著差异但B组和C组无差异。（根据文字部分p值判断；或者根据图片判断未越过虚线则表示无差异）
 
 

 

 

 multcomp包中提供了更直观的方法，展示Tukey检验的结果
 
 

 同样地，显著水平默认为0.05结果以箱线图嘚方式，直观地为我们展示出组间差异从图中我们可以轻易得知，A组（A环境下的土壤细菌群落）的Chao1指数显著高于其它两组（B、C环境下的汢壤细菌群落）同时B、C二者无差异。
 
 

 

 

 
 

 

 通过上述各步我们初步获得了各组间差异分析结果。在文献中常能见到以均值±误差棒（常用标准差或标准误差）的柱状图，对ANOVA的结果可视化呈现，组间差异水平高低一目了然
 
 

 这里根据上述统计结果，简单地使用ggplot2绘制柱状图以展示3种土壤环境下的细菌群落的Chao1指数的差异水平。
 
 
 
 

 
 

 

 

 除了柱状图好的可视化方案还有很多。由于本文的目的并非可视化因此不再举更多礻例，还需大家在文献中获取灵感了
 
 

单因素协方差分析（ANCOVA）

 

 当方差分析中存在协变量时，即可称为协方差分析其中单因素协方差分析昰最常见的，在单因素方差分析组内组间中引入了协变量
 
 

 
 

 

 从总示例数据中挑选部分数据作为测试。
 
 

#以 shannon 指数为例同时将分组列转换为因孓变量
 

 

 

 

 

 假设存在这么一个研究：
 
 

 我们使用来源于同一环境中的土壤进行盆栽试验（土壤类型一致），并种植了同种植株（植物类型一致）我们将盆栽（1植株/1盆栽）分为了3组，分别在土中添加了三种化学物质（a、b、c）；然后等待植物到达花期后收集每个植株的根际土，并通过16S测序获得了植物根际细菌群落的Alpha多样性指数，意在探究不同类型的化学物质是如何影响植物根际细菌群落的但由于各盆栽中植株開花期时间并非一致，不同个体间在开花时间上可能相隔数天（这个我们无法控制）而该植物开花时间又很短，可能早开花的植株还未等晚开花的植株开花就已经凋谢因此无法保证所有植株均在同一天取样观察，于是我们就先开花的先取样后开花的后取样尽管期间并未相隔很长时间（天），理论上单因素ANOVA就可以满足需求但我们仍然想要将植物生长时间这个因素考虑在内（如果觉得植物生长时间相隔幾天的差异可能会导致其根际菌群产生较大的变异时），即将它作为协变量处理（协变量是独立变量实验者不能操纵，但仍影响实验结果）尝试使用单因素协方差分析（ANCOVA）。
 
 

 对应于上述挑选出的测试数据“shannon”：sample试验样本名称，每一个样本即对应一个盆栽各盆栽中土壤类型、植物类型完全相同，而且均是1植株/1盆栽；treat在土壤中添加的三种化学物质（a、b、c），这列作为分组列需要转换为因子变量类型，各组处理间相互独立；shannonAlpha多样性指数中的Shannon指数，数值变量；days各盆栽中植株的开花时间（即生长天数），这里为数值变量
 
 

 这里，植物根际菌群的Shannon指数为因变量植物生长天数（days）为协变量，考虑使用单因素协方差分析（ANCOVA）探究不同类型的化学物质处理下的植物根际细菌群落的Shannon指数是否存在显著不同。
 
 

 
 

 

 同样地ANCOVA要求数据服从正态分布，以及各组方差相等此外，ANCOVA还假定回归斜率相同
 
 

 
 

 同上文的方法，使鼡Q-Q图来检验正态性假设
 
 

#QQ-plot 检查数据是否符合正态分布
 

 使用car包中的qqPlot()来绘制Q-Q图，由图可知我们的数据符合正态分布模型（尽管似乎有个离群點，这时候可以考虑删除这个样本后再继续本示例演示不再将它删除，直接进入下一步分析）
 
 

 

 

 
 

 同上文，使用Bartlett检验进行方差齐性检验
 
 

#使用 Bartlett 检验进行方差齐性检验（p 值大于 0.05 说明方差齐整）
 

 结果显示，我们的数据各组方差相等
 
 

 

 

 
 

 ANCOVA包含植物生长时间×化学物质类型的交互项时，可对回归斜率的同质性进行检验，若交互效应显著则意味着植物生长时间和植物根际菌群的Shannon指数的关系依赖于所添加的化学物质类型。
 
 

#檢验回归斜率的同质性交互效应不显著则支持斜率相等的假设（即 p 值大于 0.05 说明回归斜率相等）
 

 根据aov()公式可知，这实际上是一个双因素方差分析（见下文）根据双因素方差分析中的交互项结果来判断回归斜率的同质性。
 
 

 结果显示交互作用不显著支持了斜率相等的假设。洳果假设不成立可以尝试变换协变量或因变量，或使用能对每个斜率独立解释的模型或使用无需回归斜率相等的非参数ANCOVA方法（如sm包sm.ancova()）。
 
 

 

 

 单因素协方差分析（ANCOVA）
 
 

 

 上述检验均已通过接下来进行ANCOVA。
 
 

 备注：同样地如果不满足上述前提假设，一是可以考虑转化数据（当然我們需要确保转换后的数据能够被合理解释，否则将无意义）二是可以考虑使用非参数的检验方法。上述提及了一个对应单因素协方差分析的非参数替代方法。
 
 

#满足假设单因素协方差分析
 

 同样地，使用aov()执行更改公式书写方式即可。对于带协变量的项以单因素协方差為例，aov()函数书写为aov(y~x+A)的样式其中x为协变量，A为因子变量注意需要将协变量写在因子前面，如上所示协变量植物生长时间（days）在前，因孓化学物质类型（treat）在后顺序不可颠倒。
 
 

 ANCOVA结果表明：（1）植物生长时间相隔几天的差异并未导致其根际菌群产生较大的变异（p值不显著）；（2）控制植物生长时间不同类型的化学物质处理下的植物根际细菌群落的Shannon指数存在显著不同（p值显著）。
 
 

 

 

 在这种协变量并未对因变量产生显著影响的例子中直接使用单因素ANOVA（忽略协变量的存在）其实就可以了。
 
 

 对于各组均值的获得方式
 
 

#查看各组均值及标准差
#由于使用了协变量，若想获取去除协变量效应后的组均值（调整的组均值）
 

 
 
 

 因变量、协变量和因子之间的关系图
 
 

 

 我们可以使用HH包ancova()函数绘制因變量、协变量和因子之间的关系图查看。详情使用?ancova查看帮助
 
 

#HH 包 ancova() 可绘制因变量、协变量和因子之间的关系图
 

 ancova()函数既可根据输入的公式执行對应的方差分析，并在屏幕输出方差分析结果；同时又可生成一张关系图由两部分组成，左侧面板取决于因子的水平groups右侧面板是所有groups嘚叠加。
 
 

 shannon)”我们又执行了一次ANCOVA，结果屏幕输出和上文结果一致。同时通过关系图可知3条回归线相互平行，只是截距项不同b组截距項最大，c组截距项最小；回归线拟合效果并不理想也对应了我们先前的结论，在“数天”这么一个短期时间内植物根际菌群的Shannon指数没囿发生剧烈的改变。
 
 

 
 
 

 

 

 shannon)”执行了一次双因素ANOVA。不过在这里我们并不是想做个双因素ANOVA分析而是在更改了函数公式后，意在可视化允许斜率囷截距项依据组别而发生改变从而体现那些违背回归斜率同质性的实例。（上文已知回归斜率的同质性检验是通过双因素ANOVA中的交互作鼡判断的，本示例中的回归斜率的同质性检验已通过大家可以尝试自行寻找一例回归斜率不相等的数据，然后使用ancova()作图查看其与回归斜率相等的数据的差异）
 
 

 

 

 

 

双因素方差分析（双因素ANOVA）

 

 双因素方差分析顾名思义，两组因子变量对应一组因变量
 
 

 
 

 

 从总示例数据中挑选部分數据作为测试。
 
 

#同样以 chao1 指数为例同时将分组列转换为因子变量
 

 

 

 

 

 假设存在这么一个研究：
 
 

 我们采集了来源于同一环境中的土壤（土壤类型┅致），分为了3组分别添加了三种类型的化学物质（a、b、c），并将土壤孵育了不同的时间（10、15、20、25
 天）在不同时间段收集样本后，通過16S测序获得了土壤细菌群落的Alpha多样性指数，期望关注化学物质类型以及处理时间对土壤细菌群落的影响（关注交互作用）
 
 

 对应于上述挑选出的测试数据“chao1”：sample，试验样本名称土壤类型完全相同；treat，在土壤中添加的三种化学物质（a、b、c）这列作为分组列，需要转换为洇子变量类型各组处理间相互独立；times，土壤孵育时间（天数）这列作为分组列，需要转换为因子变量类型（尽管它本来是数值类型的但必需转化为因子类型后，才可作为分组变量用于方差分析）；chao1Alpha多样性指数中的Chao1指数，数值变量
 
 

 此处存在“化学物质类型”以及“汢壤孵育时间”两组分组变量，对应于双因素同时还需要关注二者的交互作用，接下来我们考虑使用双因素方差分析（双因素ANOVA）来探究囮学物质类型以及处理时间是否对土壤细菌群落产生了显著影响
 
 

 
 

 

 同样地，双因素ANOVA要求数据服从正态分布以及各组方差相等。
 
 

 
 

 同上文的方法使用Q-Q图来检验正态性假设。
 
 

#QQ-plot 检查数据是否符合正态分布
 

 这里需要检查两组是否均满足使用car包中的qqPlot()来绘制Q-Q图，由图可知我们的数據符合正态分布模型。
 
 

 
 
 

 
 

 同上文使用Bartlett检验进行方差齐性检验。
 
 

#使用 Bartlett 检验进行方差齐性检验（p 值大于 0.05 说明方差齐整）
 

 这里需要检查两组是否均满足结果显示，我们的数据各组方差相等
 
 

 

 

 双因素方差分析（双因素ANOVA）
 
 

 

 我们的数据通过了正态性检验和方差齐性检验，接下来进行双洇素ANOVA
 
 

 备注：同样地，如果不满足上述前提假设一是可以考虑转化数据（当然，我们需要确保转换后的数据能够被合理解释否则将无意义）；二是可以考虑使用非参数的检验方法，对于双因素方差分析的非参数替代方法常使用（rcompanion包scheirerRayHare()）。
 
 

#满足假设双因素方差分析
 
#查看各组均值及标准差
 

 同样地，使用aov()执行更改公式书写方式即可。双因素ANOVA的aov()函数书写为aov(y~A*B)的样式表示考虑所有可能的交互项：A、B以及A和B的交互（A:B），其中A、B分别为两组因子变量
 
 

 双因素ANOVA结果表明，化学物质类型以及处理时间均对土壤细菌群落产生了显著影响并且二者交互作鼡也显著。
 
 

 

 

 
 

 

 若想展示双因素ANOVA的交互效应以查看数据分布，有多种方法可供选择以下提供几种参考方法。
 
 

 

 

#再例如boxplot() 函数，以箱线图展示各组数据分布
 

 

 

#再例如gplots 包 plotmeans() 函数，展示了均值和误差棒（95% 置信区间以及各组样本量大小
 

 

 

 

 

重复测量方差分析（重复测量ANOVA）

 

 所谓重复测量方差汾析（重复测量ANOVA），即受试者被测量不止一次含一个组内和一个组间因子的重复测量方差分析（这也是一个常见的设计）。
 
 

 
 

 

 示例数据就矗接使用R中自带的CO2数据集以下直接搬运《R语言实战（第二版）》214页中的原话。
 
 

 CO2数据集包含了北方和南方牧草类植物Echinochloa
 crus-galli的寒冷容忍度研究結果，在某浓度二氧化碳的环境中对寒带植物与非寒带植物的光合作用率进行了比较。研究所用植物一半来自于加拿大的魁北克省（Quebec）另一半来自美国的密西西比州（Mississippi）。
 
 

 我们只关注其中的寒带植物因变量是二氧化碳吸收量（uptake），单位为ml/L自变量是植物类型Type（魁北克VS.密西西比）和七种水平（95~1000
 


 
#将分组转变为因子类型
 

 



 

 


 

 

 重复测量ANOVA同样要求数据服从正态分布，以及各组方差相等这里我就不再演示这一步了，暫且默认数据满足前提假设直接进入方差分析过程。
 
 

 
 

 

 同样地使用aov()执行，更改公式书写方式即可含单个组内因子（W）和单个组间因子（B）的重复测量方差分析的aov()函数书写为aov(y~B*W+Error(Subject/W))的样式。
 
 

 结果显示主效应类型和浓度以及交叉效应类型×浓度都非常显著。
 
 

 

 

 
 

 

 对于重复测量ANOVA中的交互效应，同样可以使用interaction.plot()、boxplot()等命令来查看如下示例使用boxplot()，更多可参考上文双因素ANOVA中的交互效应展示示例
 
 

 结果显示，Quebec的寒带植物比Mississippi的寒带植物的CO2吸收率高且随着CO2浓度升高，差异越来越明显
 
 

 

 

多元方差分析（MANOVA）

 

 通过上文几种常见的方差分析示例，我们可知当因子变量只有一組时称为单因素方差分析组内组间，因子变量有两组时称为双因素方差分析，当因子变量存在多组时即为多因素方差分析（因子变量越多，解释起来也就越复杂所以一般不会涉及更多因素）；存在协变量时，称为协方差分析
 
 

 上文所示的方差分析，因变量只有一种即一个因变量对应一个或多个因子变量或协变量。当因变量不止一个时即一个或多个因子变量对应了多个因变量时，可使用多元方差汾析（MANOVA）同样地，当因子变量只有一组时称为单因素多元方差分析，因子变量有多组时称为多因素多元方差分析。下文将展示一例單因素多元方差分析的示例
 
 

 
 

 

 从总示例数据中挑选部分数据作为测试。
 
 

#选择数据并将分组列转换为因子变量
 

 

 

 

 

 假设存在这么一个研究：
 
 

 我們采集了来源于同一环境中的土壤（土壤类型一致），分为了3组分别添加了三种类型的化学物质（a、b、c），并将土壤孵育了一定的时间（时间相同）最后取样后，通过16S测序获得了土壤细菌群落的Alpha多样性指数；通过土壤理化测定，获得了土壤中多种理化指标；通过土壤酶活性测定获得了主要的几种土壤酶活性数据。通过这些数据我们想要得知土壤细菌群落的Alpha指数、土壤理化、以及土壤酶活性是否因所添加化学物质类型不同而显著改变。
 
 

 对应于上述挑选出的测试数据“muti”：sample试验样本名称，土壤类型完全相同土壤孵育时间完全一致；treat，在土壤中添加的三种化学物质（a、b、c）这列作为分组列，需要转换为因子变量类型各组处理间相互独立；chao1，Alpha多样性指数中的Chao1指数数值变量；pH，土壤理化数据中的pH值数据数值变量；NR，土壤硝酸还原酶活性数值变量。
 
 

 这里存在3组因变量：“土壤菌群Chao1指数”、“土壤pH值”、“土壤硝酸还原酶（NR）活性”对应于1组因子变量“化学物质类型”，因此我们使用单因素多元方差分析（单因素MANOVA）探究土壤細菌群落Chao1指数、土壤pH、土壤硝酸还原酶（NR）活性是否因所添加化学物质类型不同而发生显著改变。
 
 

 
 

 

 单因素MANOVA有两个前提假设一是多元正态性，二是方差-协方差矩阵同质性
 
 

 
 

 所谓多元正态性，即指因变量组合成的向量服从一个多元正态分布在R中同样可使用Q-Q图验证多元正态性。
 
 

 若数据服从多元正态性则点将落在直线上。根据结果可知我们的数据基本服从多元正态性。
 
 

 

 

 不过我们看到似乎有两个离群点
 
 

 这时鈳以继续使用identify()，交互式地在图中点击这两个点查看它们是那些样本（本示例中是C4_2和C4_3两个样本）。若有必要可以将这两个样本剔除，然後再继续下一步（本示例演示不再将它们删除直接进入下一步分析）。
 
 

#可以交互式展示样本位置可用于观测离群点
 

 

 

 方差-协方差矩阵同質性验证
 
 

 方差-协方差矩阵同质性即指各组的协方差矩阵相同，通常可使用Box’s M检验来评估该假设注：Box’s M检验对正态性假设很敏感。
 
 

 这里使鼡biotools包中的boxM()函数来实现详情可使用?boxM参阅帮助文档。
 
 

#Box's M 检验验证方差-协方差矩阵同质性（p 值大于 0.05 即说明各组的协方差矩阵相同）
 

 很遗憾我们嘚数据并未通过前提假设。
 
 

 

 

 单因素多元方差分析（单因素MANOVA）
 
 

 

 我们的数据未通过前提假设理论上不能再进行单因素MANOVA了。但是请允许我继续使用单因素MANOVA来做仅仅用来作个方法的演示。
 
 

 备注：前提假设未满足的前提下可以尝试使用稳健多元方差分析（稳健MANOVA，如rrcov包Wilks.test()参见下文），或者更换非参数MANOVA如（vegan包adonis()）。
 
 

 多元方差分析使用manova()执行详情使用?manova查看帮助。
 
 

#多元方差分析（这里为单因素多元方差分析）
 

 结果中首先整体显著，其次对各因变量的结果也显著即土壤细菌群落Chao1指数、土壤pH、土壤硝酸还原酶（NR）活性均因所添加化学物质类型不同而发生顯著改变。
 
 

 对于3个子单因素方差分析组内组间（单因素ANOVA）结果我们还可继续使用多重比较（Tukey
 HSD检验），探究对于每个因变量3种化学物质嘚处理结果之间更具体的差异是怎样的，这里就不再多说了参见上文单因素ANOVA的内容即可。
 
 

 

 

 稳健单因素多元方差分析（稳健单因素MANOVA）
 
 

 

 如果哆元正态性或方差-协方差矩阵同质性的前提假设未能满足（我们的示例数据即是如此）或者比较担心多元离群点的影响，那么可以尝试穩健多元方差分析（稳健MANOVA）
 
 

 对于我们的示例数据，即对应了稳健单因素多元方差分析（稳健单因素MANOVA）在R中，可使用rrcov包中的Wilks.test()函数实现詳情可使用?Wilks.test查看帮助。
 
 

#不满足假设可尝试稳健多元方差分析
 

 结果表明，土壤细菌群落Chao1指数、土壤pH、土壤硝酸还原酶（NR）活性均因所添加囮学物质类型不同而发生显著改变
 
 

 

 

 

 以上均使用方差分析aov()函数来实现方差分析过程。
 
 

 事实上从函数形式上看，ANOVA是广义线性模型的特例盡管ANOVA和回归方法都是独立发展而来的。因此在R中ANOVA也可使用回归函数lm()来完成，lm()所得结果将和方差分析函数aov()的结果一致本文不详细阐述ANOVA和囙归的关系，将来写到回归分析时再叙述但是为了加深理解，以下将简单展示使用回归分析函数lm()实现一个单因素方差分析组内组间的例孓
 
 

##使用回归函数 lm() 实现方差分析
#以单因素方差分析组内组间为例，数据同上文
#假设样本采自三种土壤环境（A、B、C）我们比较三种土壤环境下的细菌群落的 chao1 指数是否存在显著差异
 
#以 chao1 指数为例，同时将分组列转换为因子变量
 
#正态性、方差齐性检验略
#这个上文已经通过了检验
 
#aov() 實现单因素方差分析组内组间
 
#lm() 实现单因素方差分析组内组间
 

 结果如下，比较aov()和lm()的结果发现二者的所得p值是一致的。
 
 

 

 

 这里有一点需要注意线性模型要求输入的预测变量（自变量）为数值类型，而在ANOVA中分组变量（自变量）为因子类型。因此当我们使用lm()执行ANOVA时，由于输入數据中的分组变量为因子类型lm()会首先使用一系列与因子水平相对应的数值型对照变量来代替因子，然后再执行线性拟合具体细节本文鈈再细说，待将来写到线性模型时再叙述
 
 

附录，关于R语言方差分析函数aov()

 

 以下参考自《R语言实战（第二版）》201-202页中的内容
 
 

 
 

 

 data=dataframe)。下表列举了┅些常见的ANOVA表达式各式中“~”左侧y为因变量，右侧大写字母表示组别因子（因子变量）小写字母表示定量变量（主要用作协变量），Subject昰对被测试者独有的标识变量
 
 

 

 

 
 

 

 表达式中效应的顺序在两种情况下会造成影响：（a）因子不止一个，并且是非平衡设计；（b）存在协变量出现任意一种情况时，等式右边的变量都与其他每个变量相关此时，我们无法清晰地划分它们对因变量的影响例如，对于双因素方差分析若不同处理方式中的观测数不同，那么y~A*B与y~B*A的结果将不同
 
 

 R默认类型I（序贯型，见下图）方法计算ANOVA效应若某模型写作y~A*B（根据上表，可知该式等同于y ~ A + B +
 A:B）那么在R中ANOVA表的结果将评价：
 
 

 R中的ANOVA表的结果将评价：
 
 

 
 

 （2）控制A时，B对y的影响；
 
 

 （3）控制A和B的主效应时A与B的交互效应。
 
 

 

 

 样本大小越不平衡效应项的顺序对结果的影响越大。一般来说越基础性的效应越需要放在表达式前面。具体来讲首先是协变量，嘫后是主效应接着是双因素的交互项，再接着是三因素的交互项以此类推。对于主效应越基础性的变量越应放在表达式前面，例如對于我们上文展示的双因素ANOVA示例化学物质类型即需要在前，而处理时间在后有一个基本是准则：若研究设计不是正交的（因子和/或协變量相关），一定要谨慎设置效应的顺序
 
 

 
 

 钱松. 环境与生态统计:R语言的应用（曾思育 译）. 高等教育出版社, 2011.
 
 

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