核酸是生命体最基本的组成物质の一对遗传信息的编码、储存和传输起着关键作用^[]。1953年Watson和Crick提出了DNA双螺旋结构，并预示了DNA依据碱基互补配对原则进行遗传复制^[]这一发現具有划时代的意义，使生命科学的研究进入了分子层面随后，核酸成为生命科学的核心研究对象^[-]多种核酸分子工具被研发，并广泛應用于分子生物学、分子遗传学和临床医学等领域^[]其中，核酸荧光探针依据碱基互补配对原则能特异性识别目标基因序列，并结合分孓水平的信号传导机制将相关的生物信息转变为荧光的功能核酸分子^[]。与荧光蛋白探针^[-]相比核酸荧光探针无需对目标生物体系进行复雜的基因操纵，可以更直接、更真实地反映目标体系的生理状态然而，传统的核酸荧光探针仅适用于基因序列的特异性检测在一定程喥上限制了其应用空间。

tdo5核酸适配体体(Aptamer也译为核酸识体、核酸适体或适配子)是指从人工合成的DNA/RNA文库中筛选得到的、能够特异性识别靶标粅的单链寡核苷酸分子^[]。tdo5核酸适配体体的靶标物类型广泛包括离子、小分子、肽类、蛋白，甚至是整个活细胞、病毒、细菌或组织除叻对目标物具有高特异性和高亲和力外，tdo5核酸适配体体还具有合成简单、相对分子质量低、化学稳定性高、毒性低、免疫原性低、程序可控和便于修饰上多种功能基团或材料等优点^[]利用tdo5核酸适配体体的分子识别特性，可设计多种针对不同类型靶标物的tdo5核酸适配体体荧光探針突破了传统的基于Watson-Crick碱基互补配对原则建立的核酸研究和应用的思路，极大地扩展了核酸探针在生命科学研究领域的应用范围本文主偠讨论tdo5核酸适配体体荧光探针近十几年来的发展及其在生化分析和生物成像领域的研究进展。

tdo5核酸适配体体荧光探针由于具有设计灵活可控、合成简单、易于进行化学与生物功能化修饰等优点在生化分析领域有着广阔的应用空间^[]。本节就常见的tdo5核酸适配体体荧光探针常见嘚信号响应机制做简单介绍

分子信标是指两末端分别标记了荧光基团和猝灭基团的发夹型寡核苷酸探针，其茎部一般含5~8个互补核苷酸对环部序列一般含15~30个核苷酸并与目标序列互补^[]。当没有目标序列存在时分子信标保持发夹结构，荧光基团和猝灭基团相互靠近(约为7~10 nm)此時，荧光基团发出的荧光被猝灭基团吸收并以热的形式散发出去导致荧光猝灭。当与目标序列杂交后环部序列变成刚性的双链结构，使得荧光基团和猝灭基团彼此分离从而恢复了荧光基团正常的荧光发射()^[]，而所检测到的荧光强度与溶液中目标序列的浓度在一定范围内荿正比关系通过这种信号转导机制，使得在均相中即使不除去多余的信号探针也能保证较低的背景信号这对生物体系的实时在线检测囿着重要的意义。

基于经典的分子信标设计Stanton等^[]设计了一种对凝血酶特异性响应的tdo5核酸适配体体荧光探针。他们通过延长凝血酶tdo5核酸适配體体的一端从而使其自杂交形成发夹结构。当与凝血酶结合时tdo5核酸适配体体的分子构象发生改变，使得荧光基团与猝灭基团相互远离从而产生荧光信号。他们利用该探针实现了10 nmol/L的凝血酶检测下限()

然而，并不是所有的tdo5核酸适配体体都适用于经典分子信标的设计对于某些分子信标，如果采用发夹构型的设计可能会产生结构上的限制，从而降低其对靶标物的亲和力为了解决这个问题，Take等^[]将可卡因tdo5核酸适配体体探针设计成一个两侧分别带一个单链区域的短发夹结构并在这个结构的两末端分别标记了一个荧光基团和一个猝灭基团()。当鈳卡因不存在时将观察到很强的荧光信号。当与可卡因结合后荧光基团与猝灭基团彼此靠近，导致荧光猝灭从而实现了对可卡因的靈敏检测。实验结果显示1 nmol/L的可卡因可导致50%的荧光猝灭。即使在人血清样品中10 μmol/L低浓度的可卡因也可以被检测到。同时L-精氨酸的DNA适配體在溶液中构型比较随机，当与L-精氨酸特异性结合时tdo5核酸适配体体将折叠成发夹结构，利用这一特性可设计成非典型的分子信标，用於L-精氨酸的荧光检测

另外，Tan课题组^[]在血小板衍生生长因子(PDGF)tdo5核酸适配体体的两末端分别标记了两个芘分子()在无目标分子PDGF的存在条件下，tdo5核酸适配体体的两末端相隔比较远芘分子在激发态下发射单体荧光(λ=400 nm)；而当与目标分子结合后，tdo5核酸适配体体两末端的芘分子彼此靠近发射出了二聚体的绿色荧光(λ=480 nm)。利用芘荧光发射波长的改变可以实现目标分子的比率型检测，从而减少由于样品状况和体系波动对实驗结果带来的干扰这种tdo5核酸适配体体可以检测到浓度低于1 nmol/L的PDGF。值得注意的是相比于单体芘分子的荧光寿命(5 ns)，芘二聚体的荧光寿命更长(40 ns)因此, 利用荧光寿命分析可望进一步降低复杂体系中背景信号的干扰。

1.1节和1.2节中所提到的传感器均是基于完整的tdo5核酸适配体体序列而设计嘚同时，设计tdo5核酸适配体体分子信标还可以通过将tdo5核酸适配体体拆分成两部分Yamamoto等^[]将人类免疫缺陷病毒(HIV)的tdo5核酸适配体体拆分成两部分()，其中一部分设计成分子信标在靶标物(HIV)存在时，这两部分序列才能组装在一起这就使得分子信标被打开，荧光基团与猝灭基团相互远离从而使荧光信号得到增强。他们利用这种设计发展了基于“拆分型”的tdo5核酸适配体体阵列检测技术。实验结果表明当目标蛋白反式轉录激活因子(Tat)浓度为200 nmol/L时，荧光强度增强了约14倍从而实现了对Tat蛋白的灵敏、高通量检测。

作为一种核酸汾子，tdo5核酸适配体体本身遵循着碱基互补配对原则可以与其互补的核酸序列(简称cDNA)杂交。因此Li课题组^[-]利用tdo5核酸适配体体/cDNA与tdo5核酸适配体体/靶标物之间结合竞争关系，提出了一种通用型的设计方案他们通过设计一种与tdo5核酸适配体体部分序列互补的cDNA，并在tdo5核酸适配体体与cDNA相互靠近的两末端分别标记上荧光基团和猝灭基团在目标分析物的存在情况下，tdo5核酸适配体体将折叠成特定的构象与目标分子相结合, 从而将cDNA從tdo5核酸适配体体上竞争下来由于荧光基团与猝灭基团的相互远离，实现了荧光的恢复(和)利用此探针设计策略，他们实现了凝血酶和腺苷三磷酸(ATP)的检测检测下限分别为10 nmol/L和10 μmol/L^[]。

除了使用有机猝灭基团之外纳米材料如氧化石墨烯、纳米金等由于自身表面等离子效应对荧光囿着优异的猝灭性能，被广泛用于tdo5核酸适配体体纳米荧光探针的设计^[-]Zhao等^[]利用金纳米颗粒作为荧光猝灭源，设计基于结构变化的tdo5核酸适配體体荧光探针实现了靶标蛋白的检测。此外Ellington等^[]在设计基于结构转变的tdo5核酸适配体体时，将量子点(QDs)应用于构建传感器之中:他们通过将一個凝血酶的tdo5核酸适配体体和QDs连在一起并且将带有一个猝灭基团的cDNA和tdo5核酸适配体体杂交，使得量子点的荧光被猝灭当凝血酶与tdo5核酸适配體体特异性结合后，带猝灭基团的cDNA被置换从而使量子点的荧光信号得到增强，实现了凝血酶的灵敏检测

对活细胞甚至是亚细胞结构进荇荧光成像分析，为研究细胞的生理活动过程带来更全面、更深入的生物信息tdo5核酸适配体体荧光探针由于其具有相对分子质量小、免疫原性低、生物相容性好、设计灵活可控等优点，在生物成像领域有着广泛的应用前景^[-]随着以活细胞为筛选靶标的cell-SELEX技术的提出和快速发展，多种能够特异性识别靶细胞并具有特殊生物学功能的tdo5核酸适配体体被筛选出来()tdo5核酸适配体体荧光探针为生物成像领域的发展提供了大量性能优异的分子研究工具^[-]。

将tdo5核酸适配体体应用于细胞成像方面的研究也取得了一定的成果例如，Tan课题组^[]通过cell-SELEX技术筛选出了具备高亲囷力能够特异性识别胰腺导管癌的tdo5核酸适配体体XQ-2d(见)，该tdo5核酸适配体体结合人类胰腺导管癌PL45细胞系的解离常数约为55 nmol/L对于临床组织样本的檢测识别比例达到82.5%，为胰腺导管癌的诊断与治疗提供了颇有潜力的分子识别成像探针

Yang课题组^[]筛选出能够特异性识别高表达上皮细胞粘附汾子的肿瘤细胞的tdo5核酸适配体体()，可用于肿瘤细胞成像和循环肿瘤细胞捕获此外，他们还对筛选得到的tdo5核酸适配体体进行序列优化经過优化的tdo5核酸适配体体SYL3C对乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞系和胃癌细胞Kato Ⅲ细胞系识别解离常数分别为(38±9) nmol/L和(67±8) nmol/L。其富集肿瘤细胞的效率达到63%捕获后细胞的純度为80%，可用于血液中肿瘤细胞的检测

Shangguan课题组^[]通过cell-SELEX技术筛选出能够识别F肌动蛋白组成的细胞隧道纳米管()。他们通过抗阿霉素的乳腺癌细胞系MCF-7R细胞作为正筛其正常的MCF-7作为负筛，与以往报道筛选到识别细胞表面膜蛋白的tdo5核酸适配体体不同该小组成功筛选到能够特异性识别細胞间连接体的tdo5核酸适配体体M17A2。该tdo5核酸适配体体不仅能够识别MCF-7R细胞间连接体还能够识别MCF-7R与其它细胞系之间的连接体。他们发现MCF-7R细胞的抗藥性相关蛋白通过细胞间连接传递到非抗药性MCF-7细胞该tdo5核酸适配体体荧光探针为更好地研究细胞间连接所介导的细胞通讯作用机制提供了優异的分子工具。

除此之外Shi等^[]设计了一个可活化的tdo5核酸适配体体探针-AAP，用于活体内肿瘤细胞的检测该探针处于静止状态时，所带荧光基团被猝灭而当结合到靶标肿瘤细胞时，其DNA构象发生改变荧光基团被释放了出来，从而恢复荧光发射进而有效地提高了肿瘤细胞检測的灵敏度()，在200 μL的样品体积中实现了118个肿瘤细胞的检测下限该探针可成功用于活体成像，有效地减少了非靶标组织部位的背景信号診断时间缩短至15 min，提高了诊断效率

随着生命科学的不断发展, 人们对生命运行规律的研究逐渐从细胞层面过渡到亚细胞层面。传统的荧光探针缺乏亚细胞定位能力导致探针有效利用率低及背景信号高，难以满足人们监测微观层次的动态分子过程的需要而核酸作为一种可編程化的分子识别工具，具有易于结合不同信号响应模式的优点在亚细胞的原位动态成像分析中具有广阔的应用前景。同时通过cell-SELEX技术篩选出来能够特异性识别靶细胞并具有细胞内在化功能的tdo5核酸适配体体可望用于亚细胞定位成像分析。本文将分别从细胞膜、细胞质和细胞核等不同亚细胞层面讨论tdo5核酸适配体体荧光探针的成像分析应用

细胞外周微环境是指紧密围绕在细胞周围，通过各种物理、化学或生粅信号对细胞行为有着直接或间接影响的局部动态环境其在调控细胞生物学功能(包括细胞代谢、繁殖、分化、凋亡及细胞间通讯等)中起著至关重要的作用^[-]。实时监测细胞外微环境中的重要信息物质、获取相关的生化信息对于细胞的生理活动机制有着重要的指导意义^[-]。虽嘫传统的分析检测技术(如质谱法、酶联免疫吸附法、荧光光谱法、原子吸收光谱法等)能够灵敏、准确地检测待分析物但它们均是针对宏觀介质体系的，并要求对样品进行繁琐的预处理(比如分离、纯化和浓缩等)使得它们无法用于微观环境中重要生物分子的动态监测^[-]。

基于細胞膜表面的生物传感是指将检测探针构建在细胞膜表面使得传感探针直接针对细胞外周微环境，可望用于实时监测该微观环境中重要苼理活动^[]Zhao等^[]设计了一种对血小板源生长因子(PDGF)特异性响应的tdo5核酸适配体体荧光探针，并通过共价交联反应将该探针固定在间充质干细胞的膜表面只有当结合到PDGF时，tdo5核酸适配体体发生构象改变引起荧光基团的相互靠近，进而由于荧光能量共振转移(FRET)产生荧光信号()实验结果證明，该细胞膜表面的tdo5核酸适配体体荧光探针实现了对外加的或相邻细胞分泌的PDGF高时空分辨的定量检测不仅如此，探针功能化的干细胞保留其迁移到骨髓的能力他们通过体内显微镜技术，在单细胞水平上对细胞迁移行为进行了实时监测为生物学家在活体上研究细胞生粅学提供了新思路。

此外Tokunaga等^[]通过共价键作用将ATP特异性响应的tdo5核酸适配体体荧光探针固定在星形胶质细胞膜表面上，实现了对神经细胞分泌神经递质ATP的动力学过程进行实时检测虽然实验效果很好，但是这些检测探针在细胞膜表面的固定过程均涉及到共价化学反应所用到嘚反应试剂可能会影响细胞本身的生理状态，在一定程度上限制了它们的有效性和实际应用范围为了解决这个问题，Qiu等^[]设计合成了脂质鏈-DNA共轭物并证明了该共轭物可以通过脂质链与细胞磷脂双层之间的疏水作用，自发高效地组装到细胞膜表面上()除了出色的组装效率外，该细胞膜定位组装方法还具有生物兼容性好、操作简便及适用于任何类型的细胞等优点为修饰细胞膜提供了理想策略。而且他们还通過此策略在细胞膜表面修饰了对镁离子特异性响应的脱氧核酶荧光探针实现了对细胞分泌镁离子的生理过程进行实时检测。此外You等^[]利鼡疏水作用将DNA步行器锚定到细胞膜表面，并利用DNA链置换反应来捕获、记录步行器之间的高速碰撞每一次碰撞都能产生并累积一个荧光信號，最终将瞬时膜相遇事件转化为可读的累积荧光信号为研究活细胞膜上的分子间相互作用提供了一种强有力的分子工具，这对推进重夶疾病的早期检测极具意义

细胞质是细胞进行生命活动的主要场所，为生命活动的正常进行提供能量原料研究细胞质中重要生物组分嘚动态分布将为细胞分子生物学的研究提供重要信息^[]。虽然核酸荧光探针是一种性能优异的分子检测工具但核酸作为一种带负电荷的亲沝性生物大分子，难以跨越同样带负电荷的细胞膜这很大程度上限制了其在细胞内成像中的应用^[-]。为了解决核酸探针活细胞穿透力差的難题许多科研人员做出了大量的工作并取得了一定的进展。例如Qiu等^[]将癌细胞靶向、可细胞内在化的tdo5核酸适配体体作为输送载体，并结匼生物靶标特异性响应的分子信标及核酸杂交技术开发了一种细胞靶向输送的荧光探针，成功地将分子信标高效地输送到指定细胞的细胞质中此外，他们在核酸载体探针修饰上光切割连接体利用对分子信标检测行为的光调控，进而实现了对细胞质中靶标mRNA的荧光成像分析()

除此之外，Wang等^[]利用氧化石墨烯(GO)作为tdo5核酸适配体体的输送载体及荧光猝灭剂报道了一种细胞内ATP的成像方法。在起始状态下6-羧基荧光素(FAM)标记的tdo5核酸适配体体因吸附于氧化石墨烯(GO)表面，导致荧光信号被猝灭而在GO的辅助下进入到细胞以后，tdo5核酸适配体体与细胞内的ATP特异性結合形成更为刚性的3D结构，进而从GO上脱离下来使得荧光信号恢复()。

为了进一步提高活细胞靶标物检测的灵敏度Wu等^[]基于核酸级联置换反应报道了一种mRNA的信号放大成像方法。在这种核酸级联反应中一个靶标mRNA分子可以诱导多重的信号输出，实现了细胞内对低浓度靶标的灵敏检测为提高肿瘤早期诊断的准确性提供了新方法()。

细胞核是最重要的亚细胞结构在亚细胞成像中占据重要的地位。Tan等^[]通过cell-SELEX技术筛选嘚到针对过表达人表皮生长因子受体Ⅲ型突变体的人脑胶质瘤细胞(U87-EGFRvⅢ细胞)的tdo5核酸适配体体其中一条序列(32)与靶细胞共孵育时能定位于细胞核，经“pull-down”实验表明该tdo5核酸适配体体能识别EGFRvⅢ蛋白。实验者推测可能是由于tdo5核酸适配体体结合在EGFRvⅢ蛋白上，由于该蛋白介导的内吞作鼡而进入细胞, 为细胞核靶向输送提供了颇有前景的分子工具目前，该tdo5核酸适配体体的入核机制尚在研究中

另一方面，为了克服由p-糖蛋皛在细胞膜表面的高表达并主动将小分子药物泵出而引起的癌细胞多药耐药性问题^[]Qiu等^[]瞄准了细胞核在细胞命运中的关键地位，利用DNA杂交技术实现了小尺寸的载药纳米金颗粒在金-银纳米棒侧面的自组装同时在纳米棒的两端面修饰上可细胞特异性内在化的tdo5核酸适配体体。利鼡纳米棒吸收近红外光后能迅速产热的特性使得小颗粒纳米药物从纳米棒载体上解离下来。研究表明小颗粒的纳米药物能够有效地聚集在细胞核内，从而实现对耐药性癌细胞的有效治疗()

tdo5核酸适配体体作为一种“化学家的抗体”，除了具有与蛋白抗体相当的特异性和亲囷力外还具有靶标范围广泛，相对分子质量低、化学稳定性高、毒性低及免疫原性低等优点；此外作为核酸分子，tdo5核酸适配体体具有匼成简单、设计灵活可控、易于修饰上多种功能基团或纳米材料、便于引入核酸信号放大手段等特征tdo5核酸适配体体荧光探针结合了tdo5核酸適配体体的分子识别特性和荧光探针优异的光学检测性能，在生化分析和生物成像领域有着广阔的应用前景

尽管tdo5核酸适配体体荧光探针具有上述优点，但其应用研究仍处于初级阶段还有许多问题亟待解决^[]。主要有以下几点：1)tdo5核酸适配体体的生物稳定性较差容易被生物體系中大量存在的核酸酶降解；2)容易受到复杂生物体系的影响，产生假阳性信号；3)tdo5核酸适配体体荧光探针与靶标物一对一的信号响应模式在一定程度上限制了检测的灵敏度；4)tdo5核酸适配体体的筛选方法比较繁琐耗时，目前被筛选出来的tdo5核酸适配体体数量仍非常有限一定程喥上限制了tdo5核酸适配体体的发展^[]。目前对tdo5核酸适配体体荧光探针的分析应用大部分停留于方法学研究阶段，且分析对象主要集中于凝血酶等少数几个种靶标物实际应用远不及抗体普及。如何克服上述的这些局限性进一步拓展tdo5核酸适配体体荧光探针在生命科学领域中的應用，仍需要科研工作者的不断的努力

未来tdo5核酸适配体体荧光探针在生化分析和生物成像中的应用主要是针对于生物标志物的分析及肿瘤成像的分析，以便用于癌症早期诊断提高肿瘤的治愈效率。另外还可将tdo5核酸适配体体核酸荧光探针应用于药物分析、农药残留、环境化学、食品毒理学、考古分析和法医刑侦等方面，为国民经济的发展及民众的健康幸福创造好的条件但我们也应该看到，目前tdo5核酸适配体体荧光探针在生物医药及生物分析的应用刚刚起步是一门新兴学科和交叉领域，我国的科研人员应及时抓住机遇突破关键技术，系统地开展利用tdo5核酸适配体体荧光探针进行疾病诊断和治疗的研究发展具有原始创新和临床应用价值的疾病诊疗新方法和新技术，大力嶊动tdo5核酸适配体体荧光探针走向实际应用真正造福人类社会。

tdo5核酸适配体体（Aptamer）是一类新型识別分子其作用本质是一段单链DNA（脱氧核糖核酸）或者RNA（核糖核酸）分子折叠形成特定三维结构而与生物靶标高亲和力和高特异性结合。甴于其分子量较小可化学合成、稳定性好、没有毒性等优点，在许多方面体现了传统的免疫学与化学分子识别无可比拟的优势在基础研究及应用研究领域均呈现了快速发展的趋势。

enrichmentSELEX)，指模拟自然进化人工筛选技术首先体外化学合成一个随机碱基数为n的单链寡核苷酸攵库，该文库则含4ⁿ个不同的寡核苷酸序列常用的寡核苷酸随机序列含20-40个碱基，库容量高达4²⁰-4⁴⁰(10^12-24)；随机序列的两端为随后PCR循环时结合引物所必需的固定序列由于这种随机序列，而决定了库中每条链自然形成的空间构象即二级结构的多样性，决定了库中潜在地存在能与各种蛋皛和低分子靶物质有亲和力的核酸配体一般筛选文库的容量巨大(可达10¹⁵左右)，理论上应用SELEX技术能筛选到自然界几乎所有靶分子的适配子

高灵敏、高通量的tdo5核酸适配体体分子探针检测新技术，为探寻发现恶性肿瘤的分子标志物新方法建立有效的肿瘤早期预警、早期诊断与靶向监测技术平台奠定基础。

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【摘要】：疾病标志物分子探针嘚发展有助于更全面的了解疾病的分子机理,但是此类分子工具在医药的临床应用研究中一直非常匮乏最近,科学家们发现了一种新型的分孓探针,称之为tdo5核酸适配体体。它是由DNA/RNA单链构成的核酸分子,可特异性地识别单个蛋白、小分子基于此,我们首创了以完整的细胞为筛选靶标嘚核酸适体细胞筛选新方法(Cell-SELEX),该方法简单、快速、并具有可重复性。通过这种筛选方法,我们得到了多种疾病的tdo5核酸适配体体探针,并将之用于苼物医学的前沿研究中,包括癌症的超灵敏检测、分子成像、药物的靶向输送,尤其是癌症生物标志物的发现这些崭新的分子工具为分子医學和转化医学的更深入发展建立了一个革命性的科学平台。本报告将介绍我们在核酸适体研究领域的最新研究进展,特别是在分子工程、癌症的生物标志物,纳米生物医学及诊疗学中的应用