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Graham Pockley 现任英國诺丁汉特伦特大学 John Van Geest 癌症研究中心副主任他重点研究的是健康和疾病中的免疫调节机制。Graham 在他的职业生涯中一直使用并支持流式细胞仪細胞增殖检测细胞术

Ian Dimmick 的事业始于临床领域，他曾在多个研究岗位工作并将流式细胞仪细胞增殖检测细胞术作为 HIV、白血病、淋巴瘤和各種免疫学检测的主要诊断和研究工具。Ian 现在负责管理英国纽卡斯尔大学的流式细胞仪细胞增殖检测细胞仪核心实验室

大家好！欢迎参加 Abcam 嘚流式细胞仪细胞增殖检测细胞仪颜色补偿网络研讨会。今天的演讲嘉宾是 Graham Pockley 和 Ian DimmickGraham 的研究方向主要集中在健康和疾病中的免疫调节机制。他現在是英国诺丁汉特伦特大学 John Van Geest 癌症研究中心的副主任Graham 在他的职业生涯中一直使用并支持流式细胞仪细胞增殖检测细胞术。

Ian 的事业始于临床领域他曾在多个研究岗位工作，并将流式细胞仪细胞增殖检测细胞术作为 HIV、白血病、淋巴瘤和各种免疫学检测的主要诊断和研究工具Ian 现在负责管理英国纽卡斯尔大学的流式细胞仪细胞增殖检测细胞仪核心实验室。

今天与 Ian 和 Graham 一起为我们带来讲座的还有在 Abcam 波士顿办事处工莋的供应经理 Ken在我们开始之前，先简单提醒一下在网络研讨会期间，您可通过您屏幕右侧的问答面板提交任何问题另外，当您退出這次网络研讨会时界面会跳转至一个页面，您可以在那里下载演示文稿的副本现在，就有请 Graham 开始本次网络研讨会

GP：    谢谢 Lucy。欢迎各位參加今天的颜色补偿网络研讨会正如 Lucy 所说，我的研究中有大量时间花在了流式细胞仪细胞增殖检测细胞术上我认为，如果流式细胞仪細胞增殖检测细胞术有某个方面仍然引起关注那么它应该是关于色彩补偿以及介绍如何正确设计实验的。随着新一代仪器中激光器和检測器数量的增加这些问题只会越来越难解决。在我把这场网络研讨会的主要部分转交给 Ian 之前我们先大致浏览一下今天将要讨论的网络研讨会核心内容。那么我们今天要讲的是：为什么要做多色实验？我想也许我们对此都有自己的看法，但重要的是要考虑：我们为什麼做多色实验这有必要吗？实验提供的信息将在多大程度上帮助我们深入理解特定实验问题目前有各种各样的荧光染料，在这些实验Φ究竟应该使用哪些什么是光谱重叠？为什么我们需要补偿还有一项核心内容是：补偿的过程是什么样的？

在实例中看问题是最好的所以 Ian 会带我们浏览一些溢出的情况，并讨论如何计算溢出对任何实验过程来说，在实验中设置正确的对照都是至关重要的所以他也會讨论实验设计的相关内容。言归正传现在让我把时间交给 Ian。再提醒大家一下如果您有任何问题，不必等到研讨会结束您可以在会議进行期间将问题提交给我们，这样我们可以在网络研讨会进行过程中就开始试着回答Ian？

ID：    非常感谢Graham。我们来看第一个问题：为什么偠做多色实验对于我们的全部研究而言很关键的是，我们实际上是从实验中积累尽可能多的数据下面一张幻灯片将有力地向您展示，洳果我们在两个管中使用例如六种抗血清那么，您会看到您最多将从中得到 18 种表型。因此您只能得到由每管抗血清表示的实际表型。

然而如果您将六种抗血清（在这里由每管三种抗血清表示）全都放到一个管中，您就可以看到这些较暗的区域是饲养细胞类型，这昰将抗血清分在两个管中时永远不会看到的所以，如果您认识到您只需要在更昂贵的仪器方面或许多一点考虑，在实际实验设置和实驗方案本身上多花一点心思您就能够大大增加可从实验中提炼出的数据。这里得到了 36 个离散的表型比 18 个表型翻了一倍。不过这里没囿显示非离散表型，因此当您开始研究可以在离散表型之间看到的非常细微的表型变化时会增强倍增效应。您将得到的数据量也会呈指數增加

这就引出了一个问题：我该使用哪种荧光染料？这是一个极其关键的问题您不能只是登录到网站的目录上，然后随便选择适合您所用激光的荧光染料您需要考虑在实际创建实验时会遇到的相当多的变量。荧光染料基本上都以相同的原理工作我们用激光激发荧咣染料，而该激光应大致在荧光染料的最大消光系数范围内一旦电子进入相当不稳定的较高轨道，它随后就会回到稳定的轨道在这个過程中有一定量的散热，这是由激发波长和返回到更稳定构型时光子的发射波长引起的发射波长总是比激发波长更长。这是所有荧光染料都会出现的基本状况您将以较低的波长进行激发，然后将接收更高的波长

这个极其有用的工具是光谱查看器，这个工具的优点在于咜让您在一定程度上能够查看哪些荧光染料适合您的特定仪器但是，请记住这是高度图形化的，很多时候您可能会被这个工具误导所以使用这个工具时要非常小心，不要根据这个工具来排除荧光染料不过，就其基本功能而言它是一个特别有用的工具。

如我已经讨論的那样荧光染料本身是按照消光系数被激发的，其在所吸收的某个最大波长下被激发并且在该波长下的激发是最佳的。在很少的几個例子中荧光染料的激发从不在最大吸光度处，而是与最大吸光度差很远发射是通过量子荧光描述的，发射程度由该特定荧光染料的量子荧光描述我们为量子荧光提供的值是在全光谱发射值上测量的值。您不用测量荧光染料的全光谱发射除了在使用非常广谱的长通濾光片时偶尔会需要，但并不在您的仪器上测量；再说这也不会是常态因此，您所得到的表示荧光染料的理论值应为消光系数乘以量子熒光实际上这个理论值从未达到，但会给出消光系数和量子荧光通常量子荧光的这个值在 /Flow-Cytometry。使用我们的多色选择器工具可以搜索和比較已通过流式细胞仪细胞增殖检测细胞术验证的 2500 多种偶联一抗其搜索范围涵盖 20 多种荧光团，其中包括 6 种串联染料无论是查找已知的 CD 抗原还是新的标记物，所有的搜索结果都按照克隆编号进行分组便于您确定目标产品。请访问我们的博客观看该新工具的简短教程

Abcam 不仅提供一抗，我们还增加了蛋白质、试剂盒和染料偶联物产品以推动各位的流式细胞仪细胞增殖检测细胞术研究。此外Abcam 还拥有一系列领先的流式细胞仪细胞增殖检测细胞术实验方案、海报以及目前使用的研究方法相关文献。通过给出的链接您可以查看更多 Abcam 的流式细胞仪细胞增殖检测细胞术资源现在我将详细地介绍这类新产品中的部分产品，同时我要强调一下在研讨会的最后我们将提供折扣代码，使用這些代码可享受七五折优惠很多这类产品都可使用。

我们提供多种生物素结合蛋白包括亲和素、链霉亲和素及去糖基化亲和素。这些疍白能够可靠而稳定地结合生物素分子因此是蛋白质检测研究中非常实用的工具。您可以任意选购与荧光团或酶偶联的产品

流式细胞儀细胞增殖检测细胞术可用于快速、可靠地分析细胞凋亡和细胞活力。在本幻灯片中我们列出了 Abcam 提供的一些可用于通过流式细胞仪细胞增殖检测细胞术检测和定量凋亡标记物的产品。例如磷脂酰丝氨酸暴露是晚期细胞凋亡的标志，其可以通过经典的膜联蛋白 V-FITC 染色进行测萣或使用我们的 Kinetic 凋亡试剂盒。这种新试剂盒包含一种可逆探针该探针只与暴露于外膜的磷脂酰丝氨酸残基结合，使得该试剂盒成为测量可挽救的细胞凋亡的理想工具要了解更多关于该试剂盒以及可用于通过流式细胞仪细胞增殖检测细胞术检测细胞凋亡的其他方法，请訪问给出的链接

DRAQ5 是一种可靠的 DNA 染料，可帮助您染色活细胞和已固定的细胞其可用于流式细胞仪细胞增殖检测细胞术、免疫细胞化学分析以及微阵列技术等多种平台。Abcam 新增的荧光染料产品还包括选择性标记死亡的不可渗透细胞的 DRAQ7以及可用于检测罕见细胞活动的 CyTRAK Orange。

找不到您需要的偶联抗体EasyLink 抗体偶联试剂盒提供快速、简单的抗体标记方法。该系列有 18 种标记物供您选择且具有多种产品规格，使实验设计更為灵活化学反应依赖于标记物与自由氨基的共价连接产生的完美稳定结合。我们的实验方案实际操作时间只有 30 秒是获得所需偶联一抗嘚快速、经济的解决方案。大家可通过所显示的链接了解更多有关 EasyLink 的信息

二抗都在内部进行了广泛的测试，确保提供良好的染色和低背景我们有大量的预吸附抗体可供选择，确保低物种交叉反应和内源性免疫球蛋白识别如果您想在 ICC 中使用这些产品，假设以 1/200 的比例进行稀释可进行至少 250 次实验。可登录 了解更多信息

如有任何问题和疑问，Abcam 科学支持团队很高兴为您服务我们可提供多种语言的技术支持，包括中文、日语、西班牙语、法语和德语如果您在北美、中美或者南美，请联系我们的美国团队如果您在欧洲，请联系我们的英国團队如果您在中国和亚太地区，可以联系我们的香港团队而如果您在日本，则请联系我们的日本团队

最后，我想重点推荐几个即将舉行的会议第一个是将于 5 月在比利时布鲁日举行的“过敏和哮喘”会议。本次会议的亮点是参会者都是这一新兴领域的重要科学家登錄会议网站可以了解到更多信息，包括完整的演讲者名单以及有关演讲或海报的信息

第二个会议是“健康和疾病中的炎症小体”学术会議。该会议将在马萨诸塞州剑桥市的哈佛大学举行涵盖了多个主题，包括炎症小体激活的分子机制概述、IL1、IL18 及副凋亡在免疫防御系统中嘚作用以及炎症小体在感染性和无菌性炎性疾病中的作用研究查看网站了解更多详细信息，包括已确认的演讲者名单以及他们的演讲主題

希望今天的研讨会能帮到大家。即将举行的几个网络研讨会包括 2 月 28 日举行的“”以及 3 月 6 日举行的“”。现在我要把时间交还给我們的主讲人，由他来回答大家在研讨会期间提交的问题

Ken，太精彩了好的，那么我们花几分钟时间来看一下通过界面发过来的一些问题我想每个人都从今天的会议中收获了一些关键的信息，我也记住了三点主要就是，在特定的实验中铬的特定流量强度不一定会直接影響所需的补偿量如果您使用荧光染料套装，了解该套装在多大程度上受到多种激光激发也是非常关键的因为将荧光染料套装放在一起會对您的决策过程产生重大影响。Ian 提出的另一个有趣和关键的因素是如果您在单色实验中滴定抗体，则需要确保在多色实验中使用该抗體浓度可获得相同的值因为您可能需要更改使用的抗体稀释倍数。

这里我们收到了一些问题其中一个是 PeCy5 是否是最好和最亮的荧光团，洏 APC-H7 是最差的这里我强调下，您需要做的是掌握您个人实验的主导权因为在某些实验中，某个特定组合或某个特定荧光染料会比其他的哽好所以很抱歉，我认为这个问题没有固定的答案但是使用何种染料应该基于您对仪器配置的全面了解以及您想要进行的实验。好了嗎Ian？

ID：    第二个问题：是不是任何超过 35％ 的补偿值都是不可接受的例如在 FL9 和 FL10 之间？这个不是的您不能用补偿的有限值来限定什么是可接受的，什么是不可接受的因为您必须要考虑您的荧光染料、您要达到的目的以及您仪器上的滤光片。但我想说的是应该将补偿值保歭在尽可能低的水平。就我个人来说我从未使用超过 80% 或 90% 的补偿，因为我认为这会变得不稳定这也意味着，如果您的补偿超过 100％那么坦白说，当你在一个 PMT 中测定荧光染料并试图通过另一个 PMT 来补偿时则需要对其重新测定。所以我们从来没用过超过 100％ 的补偿，而且我们試图将所有补偿值尽可能降低但是，容我再次强调您需要确保您的补偿值尽可能低，并且需要在实验中采取其他的方法这样才能尽鈳能地保持低水平。但是 35%

GP：    来看另一个问题：我们怎么知道何时准备的补偿较好? 我觉得有张图可以胜过千言万语我认为有一些实验数据 — Ian 出示的实际实验数据，肯定能清楚地说明这一点这是一个设置了正确对照物的示例，并且知道单染色细胞是什么样的当使用抗体组匼时可确保您得到的数据和阳性百分比相同。另外一般来说，在你们所看到的两个通道中单染色细胞会有明显区别。概括地说情况基本上都发生在方形区，如果您得到的是方形图像那么这通常意味着您获得了正确的补偿设置。但是同样的，设置所有实验的关键对照以及了解仪器的工作原理十分重要

ID：    来看下一个问题：更亮的荧光染料总是具有比较暗的荧光染料更低的光谱重叠吗？不并不是这樣的，这个问题不妨这样说如果使用较暗的荧光染料来设置补偿，那么得到的误差范围会更大荧光染料越亮，在将阴性细胞群中值调荿阳性细胞群中值时就越准确相比于使用较暗的荧光染料，所处理的荧光染料越亮、数量越多就能在当天结束时获得更准确的结果，洇此这种说法是不对的

GP：    下面一个问题是：串联染料的分子是否应该更大，分子大小会妨碍染料渗入细胞吗本质上讲，串联染料显然昰两种荧光团通过共价结合偶联在一起的那么问题是分子大小会阻碍染料内化到细胞中吗？答案是否定的因为这些分子的大小在这种實验中是不受限制的。

相反另一个真正的问题是串联染料是否适合或不适合细胞内实验？在这些实验中固定和透化过程对这些串联染料的功能有影响吗？是有一些串联染料在细胞内实验中表现不太好比如 PeCy7。但我认为对于大多数其他染料，这将受到多种因素的影响咜在很大程度上取决于您在实验中所分析的细胞。所以再次重申，您需要了解系统并进行一些初步实验以确保实验设置符合我们的目的

与此相关的另一个问题是补偿或补偿需要是否受到存在的固定细胞的影响？那么不是的这不会受到影响，因为补偿与荧光特征有关洏不是细胞状态。虽然很明显，如果您的实验设置如 Ian 在他其中一张幻灯片中介绍的那样也就是以不正确的方式保存细胞，那么您的串聯染料可能会降解届时你可能才开始注意到补偿问题。但是如果实验处理正确并且细胞保存得当，那么就不会有任何问题

ID：    我们对此有一些疑问并不奇怪。下面一个问题: 为什么我们会有这么多关于串联染料的问题该如何解决这些问题? 解决方法非常简单，就是小心处悝这些染料我倾向于不在任何已添加串联染料的实验中加入固定剂，但是串联染料种类非常多比如 PerCPCy5.5，它几乎就像单一荧光染料一样確实非常地稳定。而另一方面PeCy7 可能存在一些问题。但即使是 PeCy7如果处理得当，例如没有将它在工作台上放置太久或样品分析相当快，幾个小时内就准备好样品那么这也不是问题。所以我想说串联染料获得这个不太好的名声是不合理的。很多串联染料是绝对好用的您会经常需要使用它们，但也可以找到替代品

至今仍有人没有跳出条条框框，只是一味地使用同一种染料以 Alexa 532 为例，如果使用的是绿色噭光这将会是一种很好的染料。但如果使用的是紫外激光那么 Alexa 350 会是最佳选择（虽然通常没有人会用它），而且这是一种非常好的分型染料所以，打破陈规您就会拥有更多选择有时也可以不使用串联染料。但是就像 Graham 先前所说的那样，还要考虑使用什么样的激光激发染料是单激光还是双激光，因为如果您正在寻找双阳性染料载体那么要着重考虑弱双阳性细胞。这才是主要的考虑因素而不是试图避免在多色实验中使用串联染料。

GP：    下面是一个关于对照的问题：您是否使用同型对照或荧光扣除对照来确定阴性细胞群同样，在某种程度上这取决于你的实验设置。就个人而言我们倾向于两者都使用，因为它们提供了不同类型的信息但我要重申一下 Ian 之前说过的，僦是如果您使用同型对照那么需要确保同型对照的浓度与所用的抗体浓度相同。最好是从同一家供应商处购买一抗因为您需要确定所偠进行比较的偶联体系是完全相同的。荧光扣除对照也是一个很好的测试手段因为它能让你了解这类抗原的作用，或目标抗体周围的抗體对目标细胞群产生了何种影响特别是如果你发现了弱表达抗原或者弱表达抗原的诱导，你需要确定得到一个已经被多色套装补偿了的信号

所以，对于很多这类问题并没有明确的答案但这确实对了解实验有帮助，需要确保这些可使我们对于结果的分析 100％ 自信的所有对照全部到位

ID：    下面这个问题跟幻灯片中的内容有关，这个问题问在三色示例中为什么 CD3 和 CD8 阳性细胞的设置完全不同? 其实只要可以知道哪些是阴性细胞群，并且阳性和阴性细胞群之间的界限明显那么怎么设置并不重要。所以我的意思是，这是相当随意的如果在美学上，你更喜欢把细胞门调低那也没关系，但是要记住如果降低门控后阴性结果中出现有任何弱阳性结果，那么这些结果就报废了因此，实际的 PMT 设置应基于抗原的实际最大表达以便可以绝对地看到所有阳性事件。现在如果弱阳性结果超出了界限并且只研究非常明亮的倳件，您可以把它们放在任何想要的地方因为这不会影响结果。但是如果你是在观察暗淡的 CD3 或暗淡的 CD8 事件在降低 PMT 电压时就要非常小心，因为你可能会丢失一些暗淡的事件

GP：    谢谢 Ian。下面我将把时间交还给 Lucy但在此之前请允许我代表 Ian 和我自己感谢各位参加今天的研讨会。菢歉的是由于时间有限，我们未能回答所有的问题但我们已经收到了这些问题，我们会线下尽快回复各位Lucy？

谢谢首先，我要感谢 Ian、Graham 和 Ken 为我们带来了本次网络研讨会同时我谨代表 Abcom 感谢各位的参与。正如 Graham 所说对于问题尚未得到回复的听众，我们将尽快与您联络并进荇解答也可下载本网络研讨会的 PDF 文件，当您退出本次网络研讨会时界面将跳转到一个网页，该网页提供 PDF 文档下载以及具体的网络研讨會促销活动相关内容如果您对今天所讲的内容有任何疑问，或者需要任何科学咨询请不妨通过 联系我们的技术支持团队，他们会非常願意帮助您最后，希望您通过本次网络研讨会收获到有用的信息欢迎您以后参加其他网络研讨会。再次感谢各位的聆听祝各位的研究顺利。