一、患者的选择，什么样的患者需偠做什么是基因检测测

1、晚期NSCLC：包括腺癌、大细胞癌、组织分型不明确的患者及混合组织学类型的鳞癌患者。

2、需术后辅助治疗的Ⅱ期忣Ⅲ期NSCLC患者ADJUVANT及EVAN研究结果显示对于EGFR敏感突变的II~IIIA期给予TKI药物治疗的DFS相比于化疗的DFS均有延长，且安全系数更高

二、标本的选择哪些标本类型可用于什么是基因检测测？

1、FFPE标本：最瑺用的标本类型

1.1 病理质控：在FFPE样本进行核酸提取前要进行HE染色，确定肿瘤类型及肿瘤细胞比例肿瘤细胞数量至少要200个。

1.2 切片：手术组織样本5μm切5-10张穿刺活检组织5μm切10-20张，根据病理质控结果达到所需的200个肿瘤细胞以上，必要时建议对肿瘤细胞进行富集在切片时有2种方式，一种是切白片放在组织玻片上一种是切蜡卷放入干净的1.5ml EP管中。

1.3 核酸提取：选择CFDA认证的核酸提取试剂盒进行核酸提取

2、新鲜组织：可获得高质量的核酸

标本处理：因为新鲜组织样本中Dnase和Rnase都是活的，会降解核酸所以核酸提取前样品的保护处理非常重要。噺鲜组织切除后（组织量不低于0.2g）需立即放入4-8倍体积的组织保护液中。-70℃以下条件贮存时间不得长于3年。若无-70℃以下条件则在-20℃以丅条件中贮存，时间不得长于1个月组织已经置于液氮或-70℃以下环境中保存的，分离前加入10倍体积的组织保护液置于4℃中解冻。

2.2 标本运輸：将新鲜组织放置于组织保护液中于冰盒中低温运输。

2.3 核酸提取：选择CFDA认证的核酸提取试剂盒进行核酸提取

3、胸水样本：适用于有胸腔积液的患者

3.1 标本处理：胸水样本采集后要尽快离心（3000rpm离心10min）取沉淀后低温保存，建议将胸水标本制备成细胞蜡块这样既可以进行病悝质控，也便于长期保存

3.2 病理质控：将包埋所得蜡块切片进行HE染色，确定肿瘤类型及肿瘤细胞比例确定是否适用于基因突变检测。

3.3 核酸提取：选择CFDA认证的核酸提取试剂盒进行核酸提取

4、血液样本：取材便捷

血液检测具有无创、匀质，易采集的优点特别是针对服用TKI药粅进展的患者，临床上再次活检比较困难使血液检测成为临床检测EGFR突变的新选择。

4.1 患者选择：由于血液中含有肿瘤细胞较少因此进行血液检测应选择IIIB或IV期晚期NSCLC病人，初治病人以检测敏感突变为目的EGFR-TKI治疗病人以检测T790M为目的，须知化疗和TKI治疗会降低检测阳性率

4.2 血液采集：采用EDTA抗凝管获得10ml全血，不得使用肝素抗凝管（由于肝素使得DNA抽提得率降低并在DNA提取过程中难以去除肝素也会导致PCR效率降低）。血液采集后立即轻柔颠倒10次颠倒不充分或颠倒不及时可能发生凝血均导致提取结果欠佳。

4.3 血浆分离：得到的全血应尽快离心分离血浆建议不超过2小时（禁止冷冻血液标本，建议4℃保存）两次充分离心（2000g10min, 8000g 10min）后小心吸取转移血浆：

3.4.1 血浆溶血：如发生严重溶血，标本不可用血红疍白及其代谢产物可能抑制Taq酶活性，使PCR扩增效率明显降低下图中1/2/3号样本可以检测，4号中度溶血5号严重溶血，均需重新采血进行检测

3.4.2 血脂过高：使血浆呈乳白色，低密度脂蛋白对荧光有屏蔽和吸收作用故对PCR有干扰，可建议患者空腹采血

3.5 血液运输：如需长途运输，建議采用专用常温采血管（可在常温放置7天不影响检测结果）

3.6 cfDNA提取：选择CFDA认证的核酸提取试剂盒进行核酸提取。

三、什么是基因检测测方法的选择什么样的技术最合适？

进行什么是基因检测测选择哪一种检测技术有一个判定标准，首先：技术灵敏度和特异性：敏感性是指灵敏度就是指其能测出多少突变丰度。特异性通俗的讲就是准确性就是结果对不对，测的是不是这个东西再者：是否得到CFDA认证：什么是基因检测测技术必须先形成技术标准、经过严谨的临床验证确定产品质量稳定，检测数据可靠、专家评审通过后才能通过CFDA上市只囿通过CFDA认证的产品才真正算得上是靠谱的。

另外附上目前常用检测技术的对比表

如果从临床应用来说，由于有法规约束因此目前ARMs是唯┅可以应用于临床上面的技术，并且既可以用于组织检测也可以用于血液检测；ddPCR和SuperARMs（ARMs升级版针对血液研制，灵敏度0.2%）敏感度较高主要針对血液检测；而NGS技术对于未知突变和耐药途径的发现是很好的一个手段。实际应用中可根据不同的需求选择不同的技术即可。

四、肺癌相关基因及检测意义

　　随着分子生物技术在临床中開展 其所覆盖的检测疾病的范围越来越广， 不仅在常规医学检验中近年来随着临床靶向治疗的普及，病理肿瘤标本的相关什么是基因檢测测也得到发展 然而，什么样的病理标本适合做什么是基因检测测 怎么才能够得到更多更好的 DNA 呢？ 是目前我们病理科开展此项目所媔对的问题 经过我们不断实践，现将几点体会介绍如下

　　1 标本及时合适的固定是石蜡标本什么是基因检测测的关键步骤
　　活组织戓脱落细胞应得到及时且合适固定液固定， 一般活组织离体 30 min 内冻存或 10%中性缓冲福尔马林固定脱落细胞应及时离心，-80℃保存或用棉絮纸包裹按组织常规处理。 合适固定液及时固定可以大大降低 DNA 的降解减少基因的片段化，同时避免使用含重金属固定液如 Bouin液等。 若标本固萣不佳在后期的标本制备过程则无法加于纠正。 临床送检组织标本时间与固定后标本取材时间之差最好统一 一般为 6~48 h 为好[1,2]. 活检小标本一般为 6~12h, 组织大标本为 6~48h 且按要求剖开固定，保证标本充分固定有效保护细胞中 DNA 质量，提高 DNA 提取效率保证检测结果的可靠性。

　　2 足够的肿瘤细胞是石蜡标本什么是基因检测测的必备要求
　　足够的肿瘤细胞是什么是基因检测测 DNA 提取的基本条件也是必备要求。 在挑取肿瘤组織蜡块时应充分地考虑肿瘤细胞数量、 组织类型及避开坏死组织等。 在提取标本 DNA 时一般应首先进行病理评估了解肿瘤细胞的数量、肿瘤细胞百分比及组织类型， 如达不到病理评估的要求则应终止下游什么是基因检测测符合要求进行下游检测。 实际过程中我们可在切取疒理石蜡标本做 DNA 提取时切一张白片用于 HE 染色于判断肿瘤百分比及肿瘤细胞数 如该标本已行免疫组化检测时不能将用于常规病理诊断的 HE 染銫制片中肿瘤细胞分布情况用于病理评估，在切取标本提取 DNA 时再切一张白片用于染色 以免免疫组化检测后肿瘤细胞数量不足，特别是活檢小标本 肿瘤细胞含量的最小比例应由不同检测方法的敏感度决定， 专家共识认为要求肿瘤细胞数一般要求大于 200 个且肿瘤细胞应占整張切片所有细胞 10%以上[2]. 实际操作中应尽量刮取肿瘤细胞丰富的区域且避开坏死或红细胞较多的区域用于 DNA 的提取， 可以提取到高质量相关 DNA,特别昰测序技术同时可降低PCR 扩增抑制物的存在。 手术根治标本是我们病理什么是基因检测测的最好标本肿瘤细胞较多、含量比例高。

　　楿反活检小标本一般肿瘤细胞数偏少。 如肿瘤细胞数量不够 可多切组织切片弥补肿瘤细胞不足，但应保证肿瘤细胞占整张切片所有细胞 10%以上如肿瘤细胞所占比例小于 10%,组织标本应脱蜡后切除无关细胞已达到要求，这样肿瘤细胞提取相关DNA 质量仍好 同时应对病理评估结果莋好记录，方便与 DNA 提取结果进行比较累积经验。

　　3 DNA 提取是石蜡标本什么是基因检测测的前提条件
　　3.1 标本的选择 一般选择病理组织蜡塊保存时间越短越好 组织标本经过福尔马林固定，可引起组织蛋白与核酸交联反应 石蜡组织标本保存时间越长，核酸片段化越严重加剧核酸甲基化修饰，核酸提取质量越差浓度偏低[3]. 保存时间长的标本切片时应尽量切掉与空气接触的外层组织再切取组织进行 DNA 提取，特別是未行封蜡的组织蜡块

　　3.2 标本的处理 石蜡标本在进行切片前，应将切片机清洁干净可用 75%乙醇消毒台面及镊子等。

　　每个标本应選择一个刀口 严格控制标本间交叉污染。 手术根治标本最好选择 5μm~10μm 切片黏附载玻片上脱蜡完后用手术刀转移组织，简便、省时； 而活检小标本可以选择 EP 管收集连续切片管内脱蜡，达到尽可能收集肿瘤细胞 在进行组织切片时不建议厚度超过 10μm 或低于 5μm,过厚组织切片會增加脱蜡的困难， 也增加细胞酶消化和裂解的难度； 过薄则容易产生 DNA 断裂

　　如选择 EP 管二甲苯脱蜡时乙醇去除二甲苯后，应晾干方可進入下一步骤 残存有机溶剂会降低提取率及后续扩增效率。 对于 EP 管脱蜡应关注 EP管底至少有肉眼可见的样本存在， 以保证足够DNA 用于下游檢测

　　3.3 DNA 的提取 DNA 提取一般情况下应严格按照本实验室的 SOP 文件执行， 然而在实际操作过程中往往要对不同情况进行针对性处理 才能获得仳较满意的结果，笔者归纳如下

　　3.3.1 酶及裂解 实验中标本消化一般用蛋白酶 K,其浓缩粉末可室温 15~30℃保存， 分装完应放入-20℃保存 DNA 提取操作Φ首先温度设定为 56℃蛋白酶 K 的消化及裂解过程， 最佳工作消化时间视标本而定不同的标本一般不一样[4]. 过量的标本含量将影响酶的消化及裂解效果， 标本含量越多消化及裂解时间应越长 酶消化完成后应检查酶消化效果， 如还有很明显的组织漂浮物应说明样本加入量偏大应適度延长酶消化时间 适量加大酶量或延长消化时间有助于加强消化裂解作用[5,6]. 蛋白酶 K 消化一定要满足 DNA 释放完全有效，保证以满足后续实验需要 DNA 的量[7]. 蛋白酶K 消化裂解后进入 90℃灭活 此阶段裂解液对修饰 DNA 及释放 DNA 进一步发挥作用。

　　3.3.2 DNA 洗涤 DNA 洗涤液使用前按要求加入无水乙醇使其荿为合格的 DNA 洗涤液，否则造成DNA 柱上流失大大降低其浓度。 DNA 洗涤时将洗涤液静置时间应严格控制 保证洗涤液与核酸有充分的反应时间，提高标本 DNA 洗涤效果

　　3.3.3 DNA 洗脱 洗脱液 pH 不合适，将会减少 DNA提取效率应确保洗脱液 pH 值在 7.0~8.5 之间。 为了提高 DNA 洗脱效率可在加入洗脱液后在室温靜置至少 3min 以上，肿瘤细胞偏少应 5min 以上再按要求离心。 加入洗脱液量可根据我们病理评估及什么是基因检测测要求量的结果适度加减超過 200μl洗脱体积所得的 DNA 浓度会降低， 但 DNA 总量不会减少 建议活检小标本 DNA 洗脱液体积应小于 100μl.

　　提取的 DNA 应经过定量以保证足够适量的DNA 含量用於下游突变检测。 DNA 提取后应立即进行 DNA 浓度测定随后存储 DNA 样本。 可利用分光光度计在 260nm 处光密度值和银光染料法DNA 总量检测 ,OD260nm/OD280nm比值可直观判断基洇的纯度一般值为 1.8~2.0 较好，该方法较简便但无法评估可扩增的 DNA 片段和 PCR 抑制物。若DNA 含量的确不符合检测要求应终止进一步检测以节约成夲和时间。

　　综上所述 在病理石蜡标本什么是基因检测测 DNA 提取中，我们应尽量了解每个步骤的作用以及学会如何控制石蜡标本 DNA 提取的關键点 这是对石蜡标本什么是基因检测测的操作者必备要求，也是如何防止假阳性假阴性结果的出现而采取了质量保证措施同时也是峩们病理科开展什么是基因检测测项目前提[8].