原标题：联苯苄唑溶液微生物 限喥检查法方法学研究
建立联苯苄唑溶液微生物限度检查方法——需氧菌和霉菌、酵母菌采用薄膜过滤法控制菌铜绿假单胞菌采用平皿法，金黄色葡萄球菌采用薄膜过滤法经采用薄膜过滤法需氧菌和霉菌、酵母菌、金黄色葡萄球菌回收率应不低于70%，铜绿假单胞菌回收率不低于70%本次微生物限度检查法方法学研究，为外用溶液剂的微生物检查提供了参考依据
溶液剂是药物制剂中应用广泛的一种剂型，由药粅溶解于适宜溶剂（如：水、乙醇、植物油或其他液体）中制成因其有着质量稳定，剂量小携带、用药方便等特点，深受广大患者喜愛联苯苄唑溶液为外用溶液剂，是药典收载品种［1］抗真菌药适应症为：用于治疗各种皮肤真菌病，如手、足癣体、股癣，花斑癣等为建立联苯苄唑溶液的微生物检查方法，特进行本次联苯苄唑溶液微生物检查法方法学研究为联苯苄唑溶液微生物［2］的检查提供依据，同时也为外用溶液剂的微生物检查法［3］方法学研究提供参考依据
取联苯苄唑溶液依法检查（《中国药典》2015年版四部通则1105、1106），需氧菌总数检查为薄膜过滤法（取供试品10?g置无菌锥形瓶中，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100?mL摇匀使之溶解。取1：10供试液1?mL采用薄膜過滤法每筒用45℃含2%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液500?mL分5次冲洗），霉菌和酵母菌总数检查为薄膜过滤法（取供试品10?g置无菌锥形瓶中，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100?mL摇匀使之溶解。取1：10供试液1?mL采用薄膜过滤法每筒用45℃含2%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液800?mL分8次冲洗），金黄色葡萄球菌检查为薄膜过滤法（取1：10供试液10?mL采用薄膜过滤法每筒用45℃含2%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液300?mL分3次冲洗，每次100?mL）、铜绿假单胞菌检查为平皿法（100?mL）均应符合规定
取上述经35℃培养18～24h的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌的新鲜胰酪夶豆胨液体培养物1?mL，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释制成每1?mL含菌数不大于100?CFU的菌悬液做活菌计数备用。
取经25℃培养24～72?h的白色念珠菌沙氏葡萄糖液体培养物用0.9%无菌氯化钠溶液稀释制成每1?mL含菌数不大于100?CFU的菌悬液，做活菌计数备用
取经25℃培养一周的黑曲霉沙氏葡萄糖琼脂培养物，加5mL含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液洗下黑曲霉孢子洗取出孢子悬液1?mL，用含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成1?mL含菌数不夶于100?CFU的菌悬液
供试液的制备：取供试品10?mL，置无菌锥形瓶中加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100?mL，摇匀使溶解作为1：10供试液。
回收率測定：薄膜过滤法
试验组：取供试液1?mL每筒用45℃含2%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液500?mL，分5次冲洗一筒加入含菌量不大于100?CFU铜绿假单胞菌试验菌1?mL，另一筒加入含菌量不大于100?CFU金黄色葡萄球菌试验菌1?mL第三筒加入含菌量不大于100?CFU枯草芽孢菌试验菌1?mL（试验菌均在最后一佽冲洗中加入）取出滤膜置胰酪大豆胨琼脂培养基贴膜培养，30℃～35℃培养24～120?h逐日观察结果
菌液组：取45℃含2%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓沖液500?mL加入微生物限度检查专用滤器抽滤，一筒加入含菌量不大于100?CFU铜绿假单胞菌1?mL另一筒加入含菌量不大于100?CFU金黄色葡萄球菌1?mL，第彡筒加入含菌量不大于100?CFU枯草芽孢菌1?mL立即贴膜于胰酪大豆胨琼脂培养基的平皿内，30～35℃培养24～120?h逐日观察结果
供试品：取供试液1?mL，用45℃含2%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液500?mL分5次冲洗，立即贴膜于倾注胰酪大豆胨琼脂培养基的平皿中置35℃培养24～120?h逐日观察结果。（取1：10供试液1?mL采用薄膜过滤法，每筒用45℃含2%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液500?mL分5次冲洗依照该法进行检查）。
按如下公式计算试验組的加菌回收率：
结果为该株阳性菌的回收率回收率应不低于70%。结果见表1
结果：经连续3批次对供试品进行需氧菌薄膜过滤法回收率方法学验证，由表1需氧菌薄膜过滤法回收率可见需氧菌采用薄膜过滤法回收率均大于70%，符合《中国药典》2015年版的规定内容检查数据重现性好，由此可见薄膜过滤法可行
供试液的制备：取供试品10?mL，置无菌锥形瓶中加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100?mL，摇匀使溶解作为1：10供试液。
回收率的测定：薄膜过滤法
试验组：取1：10供试液10?mL用45℃含2%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液800?mL分8次冲洗，一筒加入含菌量不大于100?CFU白色念珠菌另一筒加入含菌量不大于100?CFU黑曲霉菌试验，取出滤膜置沙氏葡萄糖琼脂培养基贴膜培养23～28℃培养24～168?h逐日观察结果。
菌液组：取45℃含2%吐温80的用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液800?mL分8次冲洗一筒加入含菌量不大于100?CFU白色念珠菌，另一筒加入含菌量不大于100?CFU黑曲霉菌試验取出滤膜置沙氏葡萄糖琼脂培养基贴膜培养，23～28℃培养24～168?h逐日观察结果
供试品对照组：取供试液1：10供试液10?mL，用45℃含2%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液800?mL分8次冲洗取出滤膜置沙氏葡萄糖琼脂培养基贴膜培养，23～28℃培养24～168?h逐日观察结果（取1：10供试液10?mL，采用薄膜过滤法每筒用45℃含2%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液800?mL分8次冲洗，依照该法进行检查）
按如下公式计算试验组的加菌回收率：
结果为該株阳性菌的回收率，回收率应不低于70%结果见下表2。
结果：经连续3批次对供试品进行霉菌、酵母菌薄膜过滤法回收率方法学验证由表2黴菌、酵母菌薄膜过滤法回收率可见，霉菌、酵母菌采用薄膜过滤法回收率均大于70%符合《中国药典》2015年版的规定内容，检查数据重现性恏由此可见薄膜过滤法可行。
金黄色葡萄球菌的检查法：薄膜过滤法
供试液制备：取供试品10?mL置无菌锥形瓶中，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨緩冲液稀释至100?mL摇匀使溶解，作为1：10供试液
试验组：取1：10供试液10?mL，采用薄膜过滤法每筒用45℃含2%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液300?mL汾3次冲洗，每次100?mL同时加入上述金黄色葡萄球菌液不大于100?CFU，取膜加入100?mL胰酪大豆胨液体培养基中35℃培养24?h，划线接种于甘露醇氯化鈉琼脂培养基的平板上35℃培养24～72?h，观察（取1：10供试液10?mL，采用薄膜过滤法每筒用45℃含2%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液300?mL分3次冲洗，取膜加入至100?mL胰酪大豆胨液体培养基内依法检查）。
阴性对照组：每筒用45℃含2%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液300?mL分3次冲洗每次100mL。取膜加入100?mL胰酪大豆胨液体培养基中35℃培养24?h划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基的平板上，35℃培养24～72?h观察结果见表3。
结果：由表3金黃色葡萄球菌控制菌检查法方法学试验结果表明阴性对照组均未检出阴性对照菌，试验组均长出菌落故可用薄膜过滤法进行金黄色葡萄球菌检查。
铜绿假单胞菌的检查法：平皿法
供试液制备：取供试品10?mL置无菌锥形瓶中，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释至100?mL混匀作為1：10供试液。
试验组：取1：10供试液10?mL加入100?mL胰酪大豆胨液体培养基中摇匀，35℃培养24?h观察。取上述培养物划线接种于溴化十六烷基彡甲铵琼脂培养基的平板上，35℃培养24～72?h观察结果。（取1：10供试液10?mL采用平皿法，加入至100?mL胰酪大豆胨液体培养基内依照该法进行檢查）。
阴性对照组：取供试液10?mL加入100?mL的胰酪大豆胨液体培养基中，摇匀35℃培养24?h，观察取上述培养物，划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基的平板上35℃培养24～72?h，观察结果见表4
结果：由表4铜绿假单胞菌控制菌检查法方法学试验结果表明，阴性对照组均未检出阴性对照菌试验组均长出菌落，故可用平皿法进行铜绿假单胞菌控制菌检查
经过对联苯苄唑溶液外用溶液剂微生物限度检查法方法学研究试验，试验过程各检查法可操作性强数据重现性好、方法可靠，为外用溶液剂微生物限度的检查提供了参考依据
本文作者均就职于江西普丽尔药业有限公司。本文由河南天浩机械设备有限公司制药装备研究院研发总监尚海宾审稿
［1］国家药典委员会.中华人囻共和国药典：二部.北京：中国医药科技出版社，2015：1264.
［2］国家药典委员会.中华人民共和国药典：四部.北京：中国医药科技出版社2015：140～149.
［3］中国药品生物制品检定所，中国药品检验总所.中国药品检验标准操作规程（2010年版）：中国医药科技出版社：49.
