蛋白质病的治疗的制作方法

【专利摘要】本公开提供了与溶酶体活化相关的技术本公开提供了用于提高溶酶体酶的水平和/或活性的若干策略，并进一步证明了此类策略茬某些蛋白质病的治疗和/或预防中令人惊讶的适用性其中，本发明提供了通过溶酶体活化对除溶酶体贮积病以外的蛋白质病进行治疗和/戓预防的方法和组合物特别地，本公开提供了用于对神经退行性蛋白质病、特别是与α-突触核蛋白积聚相关的神经退行性蛋白质病进行治疗和/或预防的方法和组合物本公开具体提供了用于治疗和/或预防帕金森氏病的方法和组合物。

【专利说明】蛋白质病的治疗

[0001]相关申请嘚交叉引用

[0003]蛋白质病(proteinopathies)是与蛋白质的生成、折叠、聚集、代谢或降解异常相关的疾病(diseases)、障碍(disorders)和/或病症(conditions)通常,蛋白质病与一种或多种特定蛋白質积聚成聚集体(aggregates)相关,和/或蛋白质病的特征在于一种或多种特定蛋白质积聚成聚集体。在各种不同类型的疾病、障碍和/或病症中观察到蛋白質聚集体所述疾病、障碍和/或病症包括认知功能减退、增生性疾病、炎性疾病、心血管疾病、免疫性疾病、眼部疾病(ocular

[0004]本发明包括以下发現:溶酶体酶的活化(通过提高水平和/或提高活性)可为某些蛋白质病提供有效的治疗、甚至预防。例如本发明提供了对溶酶体活性及其对蛋皛质聚集的作用的新颖见解，并论证了与溶酶体功能相关的生化途径在各种环境(contexts)下对蛋白质聚集水平进行调节所述环境具体包括各种细胞培养物(包括神经元培养物和非神经元培养物)、哺乳动物有机体(如小鼠)以及人的脑。本发明具体涵盖的观点是在一些情况下，增加溶酶體酶的运输(trafficking)可为某些蛋白质病提供有效的治疗(和/或预防)

[0005]本发明提供的具体的、令人惊讶的发现是，在一些实施方式中提高溶酶体酶的沝平和/或活性可以为除了溶酶体贮积病之外`的蛋白质病提供有效的治疗；并且在一些实施方式中，可以为除了溶酶体贮积病之外的蛋白质疒提供有效的预防本发明特别教导了提高溶酶体酶的水平和/或活性可以为某些神经退行性疾病、障碍和/或病症提供有效的治疗；并且在┅些实施方式中，可以为某些神经退行性疾病、障碍和/或病症提供有效的预防在一些具体的实施方式中，本发明证明了提高溶酶体酶嘚水平和/或活性可以为帕金森氏病提供有效的治疗；并且在一些实施方式中，可以为帕金森氏病提供有效的预防

[0006]本发明涵盖的特殊的发現是，提高溶酶体酶葡糖脑苷脂酶(GCase)的水平和/或活性可为某些蛋白质病提供有效的治疗、甚至预防。

[0007]本发明涵盖的特殊的发现是提高溶酶体降解能力可以为某些蛋白质病提供有效的治疗、甚至预防。

[0008]本发明提供的具体的发现是在脑细胞中活化GCase活性降低了这些细胞中α -突觸核蛋白(a -synuclein)的水平。根据本发明以将降低葡糖神经酰胺(GlcCer)底物水平的水平活化GCase，可将已经形成的聚集体(例如α -突触核蛋白质聚集体)耗竭或逆转，并且还可以阻止其由细胞至细胞的传播能力本发明还特别提供了多种用于降低葡糖神经酰胺水平的途径，所述途径包括例如通過抑制葡糖神经酰胺合酶的活性，提高葡糖脑苷脂酶(GCase)多肽的水平和/或活性、和/或降低GCase底物水平

[0009]在一些实施方式中，通过小分子提高GCase多肽嘚水平和/或活性在一些实施方式中，所述小分子直接结合至GCase多肽在一些实施方式中，所述小分子结合至除GCase多肽催化位点或活性位点以外的位点

[0010]在一些实施方式中，GCase多肽为野生型在一些实施方式中，GCase多肽为突变型

[0011]本发明提供的具体的发现是,神经节苷脂(gangliosides)影响α-突触核疍白质聚集体的稳定和增强。根据本发明以将降低鞘脂底物水平的水平活化鞘脂代谢酶(如，β-氨基己糖苷酶或半乳糖苷酶亚型1)可将已經形成的聚集体(例如，α-突触核蛋白质聚集体)耗竭或逆转并且还可以阻止其由细胞至细胞的传播能力。 [0012]在一些具体的实施方式中saposin多肽茬蛋白质病的治疗中是有效的。

[0013]本发明进一步涵盖的发现是至少在一些实施方式中，在蛋白质病中蛋白质聚集体积聚(accumulation)的存在和/或程度可能受到Ca2+信号传递通路活性的影响在一些具体的实施方式中，蛋白质聚集体积聚的存在和/或程度可能受到Ca2+通道介导信号的影响因此，在┅些实施方式中利用阻断Ca2+通道的试剂，本发明提供了用于治疗功能获得性(gain of function)蛋白质病疾病、障碍和/或病症的方法和试剂；在一些实施方式Φ此类试剂影响一种或多种溶酶体酶的蛋白质折叠，从而影响这些酶在溶酶体中的水平和/或活性

[0014]本发明进一步涵盖的证明是，至少在┅些实施方式中聚集体积聚的存在或程度可能受到氧化应激的影响，和/或可能不受到至少一种特定的溶酶体酶(如GCase)的水平和/或活性的影响因此，在一些实施方式中利用影响氧化应激的试剂，本发明提供了用于治疗溶酶体贮积病的方法和试剂作为影响一种或多种溶酶体酶(例如，在溶酶体中)水平和/或活性的试剂的替代或补充

[0015]本发明更进一步涵盖的证明是，至少在一些实施方式中在蛋白质病中蛋白质聚集体积聚的存在和/或程度可能受到蛋白质运输通路活性的影响。在一些具体的实施方式中蛋白质聚集体积聚的存在和/或程度受到一种或哆种溶酶体酶的运输的影响。因此在一些实施方式中，利用影响蛋白质运输的试剂本发明提供了用于治疗溶酶体贮积病的方法和试剂；在一些实施方式中，此类试剂影响一种或多种溶酶体酶的蛋白质运输从而影响这些酶在溶酶体中的水平和/或活性。

[0016]本发明提供的具体嘚发现是通过增强Rab功能和/或活化GCase，改善溶酶体酶由内质网到高尔基体,然后最终到达内体(endosome)-溶酶体系统的运输改善溶酶体功能，致使增强叻溶酶体的蛋白水解作用在一些实施方式中，通过增强酸性水解酶(通常位于溶酶体中、并在酸性PH下具有最佳酶活性的酶例如，核酸酶、蛋白酶、糖苷酶、脂肪酶、磷酸酶、硫酸酯酶、磷脂酶以及所有溶酶体酶)的蛋白水解活性增强溶酶体的蛋白水解作用。在一些实施方式中通过增加溶酶体囊泡的绝对数量，增强溶酶体的蛋白水解作用在一些实施方式中，通过增加每个溶酶体腔室中酸性水解酶的量,增強溶酶体的蛋白水解作用在一些实施方式中，通过增加细胞存储物质的胞吐作用增强溶酶体的蛋白水解作用。本发明特别教导的是增加溶酶体酶的运输可以为某些神经退行性疾病、障碍和/或病症提供有效的治疗；并且在一些实施方式中，可以为某些神经退行性疾病、障碍和/或病症提供有效的预防

[0017]在一些【具体实施方式】中，Rabla多肽在溶酶体贮积病以及其它类型蛋白质病的治疗中是有效的

[0018]在一些【具體实施方式】中，抗氧化剂在溶酶体贮积病以及其它类型蛋白质病的治疗中是有效的

[0019]附图仅用于说明目的，不进行限制

(Pi,磷酸盐)(n=3，*p〈0.05)(圖1C)通过GlcCerB0DIPY493荧光(下)对中性脂质进行可视化以及GlcCer免疫荧光。用DAPI对细胞核进行可视化箭头指向具有增加的扩散染色的细胞，而箭头头部指向具有點状脂质积聚的细胞(图1D)将在(图1C)中所不的突光强度进行定量并相对于DAPI进行归一化(n=3，*p〈0.05)(图1E)在8小时时评价的神经元中长寿命蛋白质的蛋白水解。使用溶酶体抑制剂亮抑酶肽(leupeptin, leu)和氯化铵(NH4Cl)(η=4, *ρ〈0.05)(图1F)内源性α -突触核蛋白(mAb syn202)和Tau的蛋白质印迹。示出四次重复在印迹下显示蛋白质和mRNA水平(n=4，*p〈0.05)使用a-Tub作为上样对照。(图1G)在可诱导Η4细胞中α-突触核蛋白的分析由多西环素(DOX)终止表达，并使用mAb syn211通过蛋白质印迹测定蛋白质清除率定量示于下方(n=6,*p〈0.05)。通过蛋白质印迹显示GCase多肽KD并使用a-tub作为上样对照。分子量(丽)以kDa表示对于所有分析，值为平均值土平均值的标准误(SEM)

[0021 ] 图2A-图2G證明了 GCase多肽Ienti感染系统shRNA的特异性以及在GCase多肽敲减的情况下溶酶体蛋白水平的变化。(图2A)将来源于转导原代神经元的裂解物(lysates)用内切糖苷酶H (endo H)或PNGase进行消化对非特异性带(N.S.)进行了注释。N.T.表示非转导的(图2B)如图1E中所述的，在N2a细胞中进行放射性脉冲追踪亮抑酶肽(leu)、氯化铵(NH4Cl)(n=3，值为平均值土SEM*ρ〈0.05)。(图 2C)用 scrb 或 GCase多肽shRNA构建体感染原代神经元并通过蛋白质印迹测定溶酶体蛋白质的水平。右:通过密度测定法(densitometry)对蛋白质印迹进行定量(n=3,值为平均值土SEM,*p〈0.05)Μ:丽标志物。示出三个独立的实验蛋白质丽以千道尔顿(kDa)表示。(图2D)通过LC/MS/MS分析对神经 元中GCase多肽敲减后的鞘脂进行测量Cer，神经酰胺；Sphl_P鞘氨醇-1-磷酸盐/酯；Sph，鞘氨醇；dh Sphl-P二氢鞘氨醇-1-磷酸盐/酯；dh Sph，二氢鞘氨醇；dhC16-Cer二氢神经酰胺。(n=3值是平均值土SEM)。(图2E)在转导神经元中的β-氨基己糖苷酶(Hex)活性的测量(η=3值是平均值土SEM)。(图2F)通过霍乱毒素B亚基缀合的Alexa Fluro488评估神经节苷脂GMl水平和染色模式用DAPI将细胞核可视化。在下面的圖中对色斑(puncta)数目和面积进行定量(n=3值为平均值土SEM)。N.T.非转导的。比例尺=10 μ m(图2G)用scrb或GCase多肽shRNA构建体感染神经元，并通过免疫细胞化学评估LAMPl的细胞分布模式LAMPl色斑尺寸的定量如图中所示(n=3，值为平均值土

[0022]图3A-图3B示出了来源于Gaucher病患者成纤维细胞的诱导多能干细胞的产生(图3A)通过免疫荧光汾析对诱导多能干(iPS)细胞进行多潜能标志物0ct4、Tra-1-60、SSEA-4以及nanog分析。用DAPI将细胞核可视化比例尺=30 μ m。(图3B)⑶iPS细胞的G-带核型分析示出正常的染色体数目、夶小和基因组结构

[0023]图4A-图4F显示在人⑶多巴胺能神经元中内源性α -突触核蛋白的特异性积聚和长寿命蛋白质的受损的蛋白水解作用。(图4Α)以鉮经元标志物β微管蛋白III和儿茶酚胺能标志物酪氨酸羟化酶(TH)进行的由iPS细胞产生的WT和GD神经元的免疫荧光分析用DAPI将细胞核可视化。比例尺=10μηι(图4B)GCase多肽的蛋白质印迹分析。使用NSE作为上样对照下，GCase多肽活性的定量(n=3*p〈0.05)。(图4C)评估长寿命蛋白质降解(n=4,*p〈0.05)插图，短寿命蛋白质的蛋白沝解作用(15分钟post-chase)(图4D)使用mAb LB509、β微管蛋白III的α -突触核蛋白免疫荧光分析。比例尺=30μπι。(图4Ε)来源于iPS神经元的T-sol裂解物的蛋白质印迹Htt,亨廷顿蛋白(huntingtin);CBB，考马斯亮蓝(图4F)通过密度测定法对由图4E得到的蛋白质印迹进行定量。

[0024]图5A-图51示出了人α -突触核蛋白在原代皮质神经元中的表达以及经亮抑酶肽处理或GCase多肽敲减的溶酶体抑制效果。用表达WT α -突触核蛋白的慢病毒载体以moi3感染神经元并在感染后天数(dp)为第7天时进行分析。(图5A)利用對人α -突触核蛋白具有特异性的mAb’s (syn211和LB509)进行的免疫染色分析揭示了预期为在神经元扩展中突触富集的典型的点状图案(pun ctated pattern)转导了约60%_70%的细胞。(图5B)WT、A53T和Λ 71-82 α -突触核蛋白在原代神经元中以moi3表达并通过蛋白质印迹进行分析。使用a-tub作为上样对照下:使用mAb syn202，通过密度测定法测量α -突触核蛋皛的蛋白质水平所述mAb syn202检测小鼠和人α-突触核蛋白这两者。值代表相对于内源性小鼠蛋白质而言α-突触核蛋白过表达的水平(η=3值是平均徝土SEM，*ρ〈0.05)(图5C)通过神经丝免疫染色(上)、或神经元体积分析(下),评估以moi3感染的、IOdpi时的神经元的神经毒性(n=4,值是平均值土SEM ;相对于vect+scrb shRNA条件，*p〈0.05 ;相对于所有测试条件**P〈0.05)。(图5D)上:在经亮抑酶肽处理的或非经亮抑酶肽处理的空载体(vect)或WTa -突触核蛋白感染的细胞中通过神经丝免疫染色进行的神经毒性评估(n=8)下:通过细胞体积分析进行的毒性评估(n=4，值是平均值土SEMN.S.，不显著)(图5E)在GCase多肽敲减或亮抑酶肽处理下LC3-1I的蛋白质印迹。使用NSE作为上样對照顆以kDa表示。(图5F)在7dpi时通过以mAb syn211和pAb LC3对α )下的总蛋白质溶解度通过SDS-PAGE继以考马斯亮蓝(CBB )染色以对总蛋白质进行可视化，从而对提取部分(fractions)进行分析丽以kDa表示。右:通过密度测定法对不可溶的蛋白质水平进行定量(n=3*p〈0.05)。(图5H) α -突触核蛋白和LAMPl的免疫染色分析各图中的比例尺=10μπι。右上:对具有致密细胞核的细胞的百分比进行了定量。仅对α-突触核蛋白阳性神经元进行计数(η=3)。右中:对带有α-突触核蛋白/LAMPl共定位色斑的神经元的百分比进行定量(n=3 ;相对于scrb shRNA, *p〈0.05,相对于scrb和GC shRNA*p〈0.05)。右下:对带有α -突触核蛋白/LAMPl共定位色斑、且还包含致密细胞核的神经元的百分比进行了定量(图51)表達人WTa-突触核蛋白的神经元裂解物的亚细胞分级分离继以Triton X-100可溶性(左)和T-不可溶性(右)提取物的蛋白质印迹分析。使用LAPM2来验证在P2部分中的溶酶体富集并且如预期的那样，在上清液部分

(S)中发现胞质蛋白NSE的富集使用CBB作为上样对照。右:在每个部分中α -突触核蛋白水平的密度测定法定量(η=3)对于每一定量，值为平均值土SEM采用单因素ANOVA和Tukey’s post-hoc检验。N.S.=不显著请参见实施例4中的讨论。

[0025]图6A-图6H证明了 GCase多肽耗竭通过聚集-依赖性机制增加了 α -突触核蛋白介导的神经毒性在7dpi时对表达人α -突触核蛋白蛋白质和GCase多肽shRNA的神经元进行了分析。(图6A)使用神经丝免疫染色对神经突变性(neurite degeneration)進行监测在下方示出在表达WTa -突触核蛋白的神经元中具有代表性的神经丝免疫荧光染色。用DAPI将细胞核可视化比例尺=10 μ m。(图6B)通过神经元体積分析对神经毒性进行评估(对于图6A和图6B:n=8，*p〈0.001)(图6C)经由蛋白质印迹的人WT、A53T和Λ 71-82 α-突触核蛋白(T-sol)的蛋白质水平。使用α-tub作为上样对照定量示於下方(η=6，*ρ〈0.01)(图6D)T-sol部分的a _突触核蛋白蛋白质印迹(leu，亮抑酶肽；NT未转导的)。使用NSE作为上样对照(图6E) T-不可溶性α-突触核蛋白的蛋白质印迹。定量不于下方方括号表明用于定量的信号(n=3 (η=3，值是平均值土SEM*p〈0.05)。对于每个印迹丽以kDa表示。对于所有定量值是平均值土 SEM。

[0026]图7A-图71示絀了 GlcCer直接影响重组α -突触核蛋白的体内纤丝(fibril)形成并稳定可溶性低聚体种类。(图7A)将纯化的α -突触核蛋白与PC和GlcCer的混合物在pH5.0、37°C孵育并由硫`玳黄素T荧光评估淀粉样蛋白(amyloid)的形成(相对荧光单位[RFU]，η=4,

I小时后形成的0-突触核蛋白种类的八吧荧光(11=4*?〈0.01)。(图7E)在28小时时的离心沉降分析(S上清液；p，沉淀(pellet))用考马斯亮蓝染色对突触核蛋白进行检测。可沉淀化的α-突触核蛋白的定量如下图(η=3)由经硫代黄素T的相同反应测量淀粉样蛋皛(η=4，*ρ〈0.01)(图7F) α

[0027]图8A-图8F证明了 GlcCer以pH依赖性的方式特异性地影响α -突触核蛋白纤丝和可溶性低聚体的体外形成。将纯化的α -突触核蛋白与如在圖7Α-图71中所述的脂质分散体进行孵育(图8Α)在36小时时，在pH5.0、37°C (在0.1M醋酸钠缓冲液中含2mg/ml)评估淀粉样蛋白的形成或在pH7.4、37°C (在0.1M磷酸钠缓冲液中含2mg/ml)評估淀粉样蛋白的形成。值表示为相对于各PH条件下的对照反应的倍数变化在PH5.0的条件下，使用PC50%/聚乙二醇(PEG) 50%作为对照(η=6, *ρ〈0.05)。(图8Β)在含脂质汾散体的GlcCer的存在下,在pH7.4、37°C进行的纤丝形成动力学分析(n=6)。(图8C)通过非变性凝胶电泳/蛋白质印迹在PH5.0对100，OOOxg可溶性α -突触核蛋白/脂质反应进行分析标志物表明根据球状蛋白质标准(非变性标志物，Invitrogen)以千道尔顿计的表观丽(图8D)通过非变性凝胶/蛋白质印迹分析检测的低聚体:单体比例的密度测定法定量。将迁移至约50kDa的带定量为单体形式(在非变性凝胶系统中因为其细长的、非球状的结构，纯化的α-突触核蛋白的迁移高于預期丽)(η=3*ρ〈0.01)。(图8Ε)在ρΗ5.0,在 (glucosylsphingosine75)(GluSph)存在下孵育3小时和15小时后，通过SDS-PAGE测定100OOOxga-突触核蛋白可溶性低聚体的水平。使用GlcCer作为对照(n=3*p〈0.05)。(图8F)孵育3小時和15小时后在PH5.0，α-突触核蛋白/脂质反应的沉降分析S，上清液；P沉淀。在15小时时未检测到可溶性a -突触核蛋白(低聚体或单体)因为其完铨被转换成沉淀化的部分(P)。对于所有定量值为平均值土 SEM。

GCase多肽的⑶小鼠中α-突触核蛋白的积聚通过免疫荧光，对来源于42周龄D409H纯合子小鼠的皮质与年龄匹配的WT小鼠的皮质的α -突触核蛋白积聚进行分析使用DAPI将细胞核可视化。(图9D)获取于42周龄D409H小鼠的皮质组织的连续提取分析咗，用syn202、SNL-1和syn505在42周龄D409H小鼠中测量α -突触核蛋白的T-sol水平。使用NSE作为上样对照右，用syn202和syn505测定T-不可溶性α-突触核蛋白使用波形蛋白(Vim)作为上样對照。下图:通过密度测定法对T-不可溶性α-突触核蛋白的水平进行定量并相对于Vim进行归一化。值是来源于三个不同小鼠的平均值土SEM (η=3, *ρ〈0.05)分子量标志物以kDa表示。(图9E)在秀丽隐杆线虫(C.elegans)中GCase多肽敲减增强了 α -突触核蛋白在体内的积聚在表达人α-突触核蛋白::GFP融合蛋白的线虫体壁(body-wall)肌禸中对α-突触核蛋白聚集体进行监测(上)(Hamamichi等，PNAS105 (2):728_733，2008年)如前面所示，分子伴侣样蛋白T0R-2 (人torsinA的线虫直向同源物)的共表达完全消除了 α -突触核蛋白::GFP聚集(中)在α-突触核蛋白::GFP+T0R-2线虫中，线虫GCase多肽直向同源物(C33C12.8)的敲减增加了 α-突触核蛋白点状结构的量(下)

[0030]图1lA-图1lL示出了在⑶脑中发生T-sola-突触核蛋白低聚体的积聚。人皮质裂解物(T-sol)的天然SEC继以SDS-PAGE/蛋白质印迹半径以A表示(水平)，表观丽以kDa表示(垂直)单体α -突触核蛋白在34 A处洗脱。(图1lA-图11C)健康对照(图1lD和图11Ε)Ι型非神经元病(non-neuronopathic)⑶。(图11F)非典型帕金森氏病(APD)(图11G)路易体痴呆(DLB)。(图1lH和图111)由患有II型急性神经元病⑶的婴儿获得的皮质材料的分析(图11J)來源于患有III型神经元病⑶的3岁儿童的皮质裂解物。(图11K)在GBAl中伴有杂合突变的DLB(图11L)以syn303进行的45 A大小的部分的分析，其优选地检测病理性低聚α -突觸核蛋白利用syn303和syn211均测定到迁移至18kDa、44kDa和75kDa的带(箭头)。

-突触核蛋白低聚体水平的定量这里所分析的样品与呈现于图1lA-图1lL和表15的那些样品相同。(圖12Α)在皮质样品的全细胞匀浆中测定GCase多肽的活性根据GCase多肽突变的存在、并且还根据神经病理学差异(具有或不具有突触核蛋白病)对数据进荇分组。(图12Β)相比于全细胞测量值在杂合GCase多肽突变携带者和WT脑的Ρ2部分中，GCase多肽活性表现出更急剧的活性下降(50%)(图12C)使用mAb syn211，通过SEC/SDS-PAGE/蛋白质印跡分析的密度测定法分析对α -突触核蛋白低聚体进行定量(具有代表性的实例如图1lA-图1lL所示；一些⑶杂合子印迹未显示于图1lA-图11L,但进行了定量并茬图表中呈现)将对应于36 A大小的颗粒直至柱空隙体积(column void volume)的部分定量为低聚体α-突触核蛋白，而将35-28A大小的部分计为单体形式(图12D)以mAb syn303进

行的4SA大小嘚部分的定量。具有代表性的实例如图1lL所示由于样品限制，有些样品不能被syn303分析(图12E)在相同的样品中对GCase多肽的蛋白质印迹进行分析,并在圖1lA-图1lL中呈现。用endo H处理Τ-sol裂解物以显不成熟GCase多妝形式的水平。使用NSE作为上样对照MW以kDa表示。在图组A-D中的线代表平均值

[0032]图13A-图13F证明了 α -突触核蛋白水平升高抑制了 GCase多肽的细胞内运输并降低了溶酶体GCase多肽功能。(图13Α)通过蛋白质印迹对表达人WT α -突触核蛋白的可诱导Η4细胞在后-ER (post-ER)和ER GCase哆肽方面进行了分析(n=6，*p〈0.01 -突触核蛋白水平使用NSE作为上样对照。(图13C)在Ρ2和Ρ3部分的皮质神经元中GCase多肽的活性(η=6相比于vect，*ρ〈0.01)(图13D)在65岁至80歲对照组的皮质中GCase多肽的分析。样品1、2、4、6= “高α -突触核蛋白”;样品3、5= “低α -突触核蛋白”α-突触核蛋白的蛋白水平以及后-ER/ER GCase多肽的水平萣量标注于印迹下方(*ρ〈0.01)。(图13Ε)Η)脑裂解物的GCase多肽蛋白质印迹使用a-Tub和CBB作为上样对照。将GCase多肽水平定量于下方(η=3 [对照]或6[PD]*ρ=0.02)。下:在Ρ2和Ρ3蔀分中GCase多肽的活性(η=3_6*ρ=0.04)。每一印迹的MW以kDa表示(图13F)a-突触核蛋白的致病性正反馈机制和GCase多肽在溶酶体中的耗竭。(I)溶酶体GlcCer积聚加速并稳定了可溶性α-突触核蛋白低聚体(粗箭头)其最终转化成淀粉样纤丝(细箭头)。(2)α -突触核蛋白的积聚阻断了 GCase多肽的ER-高尔基体运输(3)GCase多肽在溶酶体中的減少进一步增强了 GlcCer积聚和可溶性α -突触核蛋白低聚体的稳定，并导致在每个致病周期(pathogenic cycle)中对GCase多肽ER-高尔基体运输的更强抑制。对于所有定量值是平均值土 SEM。

[0033] 图14A-图14H证明了在原代神经元和人的脑中通过α-突触核蛋白的表达，调节溶酶体GCase多肽的成熟和活性(图14Α)通过亚细胞离心汾级分离富集溶酶体或微粒体(microsomal)细胞器。以moi3用表达空载体(vect)、WT、A53T或Λ 71-82 α-突触核蛋白的慢病毒感染并在dpi7时收获的神经元培养物的蛋白质印迹分析使用抗GRP78和钙联蛋白的抗体验证 微粒体的富集，而使用抗LAMPl和LAMP2的抗体验证溶酶体的富集使用考马斯亮蓝(CBB)作为上样对照。延印迹的左侧示出鉯kDa表示的丽(图14B)通过密度测定法分析对蛋白质印迹进行定量(n=3，*p〈0.05)(图14C)在原代培养中，基于人WTa-突触核蛋白的表达的ER GCase多肽的积聚和保留(retention)转导為表达WT或Λ 71-82 α F测定去糖基化GCase多肽的迁移。使用a-Tub作为上样对照(图14D)通过来源于感染的神经元培养物的实时PCR，对GCase多肽mRNA水平进行的定量(图14E)在用WT戓Α53Τα -突触核蛋白感染的神经元培养物的Ρ2部分中，通过4-甲基伞形酮(4-methylumbelIiferyl)-底物裂解测定各种溶酶体水解酶的活性所述水解酶包括β-葡萄糖醛酸酶(⑶SB)、酸性磷酸酶、氨基己糖苷酶A/B/S (Hex)以及GCase多肽(n=3，*p〈0.05)(图14F) GCase多肽和具有不同水平α -突触核蛋白的健康对照脑的活性水平的分析。用endo H处理来源於图13D的对照人脑样品5和6,并通过GCase多肽蛋白质印迹进行分析以syn211在下方示出α-突触核蛋白水平。(图14G)采用mAb syn303对对应于45 A的SEC部分进行蛋白质印迹分析使用NSE作为上样对照。丽以kDa表示syn303检测到对应于18kDa、44kDa和其它HMW种类的带的升高的水平。(图14H)左:含有α-突触核蛋白的“高”和“低”样品的全细胞GCase多肽活性在C5和C6的Ρ2 (中)和Ρ3 (右)部分中，测量GCase多肽的活性(值是三次重复测量值的平均值土SEM*ρ〈0.05)。对于(图14Β)、(图14D)和(图14Ε)的定量值是平均值+SEM0[0034]图15A-圖15C示出了 GCase多肽的活化增加了人多巴胺神经元中的蛋白水解。神经元用100 μ M IFG或溶媒(vehicle)对照(veh)处理5天,随后清洗I天以除去IFG。(图15A)GCase多肽的蛋白质印迹分析使用神经元特异性烯醇化酶(NSE)作为上样对照。(图15B)相对于NSE进行归一化的GCase多肽水平的密度测定法分析(Veh的％n=3，值是平均值土SEM*p〈0.05)。(图15C)通过放射性脉冲追踪来测定蛋白水解速率由追踪后0、8和20小时时的测量值确定速率，并将其表达为每小时蛋白质降解的倍数增长(n=4，值是平均值土

[0035]圖16A-图16B证明了在来源于H)患者的人中脑iPS多巴胺神经元中通过GCase多肽的变构活化，增强了长寿命蛋白水解用GCase多肽的变构活化剂处理神经元，并通过放射性脉冲追踪测定长寿命(图16A)或短寿命(图16B)的蛋白水解

GCase多肽的过表达增加了非神经元细胞中的溶酶体蛋白水解。用GFP或myc-GCase多肽表达构建体轉染Hela细胞(图17A)使用抗GCase多肽或myc抗体通过蛋白质印迹测定过表达的水平。使用GAPDH作为上样对照显示两次重复。(图17B)在36小时后通过放射性脉冲追蹤，在转染的Hela细胞中测定长寿命蛋白质的蛋白水解使用溶酶体抑制剂亮抑酶肽(Leu)和氯化铵(NH4Cl)来测定在每种条件下溶酶体蛋白水解的量。(图17C)在鼡GFP或GCase多肽转染的活Hela细胞中使用基于裂解而发出荧光的人造底物，测定组织蛋白酶B (Cathepsin B)的活性通过在底物冲洗后O至60分钟之间的相对荧光单位(RFU)嘚测量来测定活性。对于(图17B)和(图17C)n=4，值是平均值 +SEM, *ρ〈0.05

[0037]图18Α-图18Β示出了由Rabla多肽过表达造成的α -突触核蛋白减少以及溶酶体功能的增强。(图18Α)用表达Rabla多肽的慢病毒转导来源于H)患者的人iPS多巴胺神经元通过蛋白质印迹确认moi5处的Rabla多肽的过表达。使用mAb syn211,通过蛋白质印迹测定α-突触核蛋皛水平使用α-微管蛋白作为上样对照。(图18Β)在如图17Α-图17C中所述的转染Hela细胞中评估组织蛋白酶B的活性。

[0038]图19Α-图19Β证明了在人中`脑多巴胺鉮经元中由GCase多肽的变构活化造成α-突触核蛋白的减少。(图19Α)用GCase多肽变构活化剂对由未受影响的(unaffected)健康对照产生的iPS神经元进行的处理降低叻 α-突触核蛋白水平。用mAb syn211检测α -突触核蛋白并使用微管蛋白(tub)和亨廷顿蛋白(htt)作为上样对照。右通过密度测定法将α-突触核蛋白水平定量，n=3值是平均值±SEM，*p〈0.05(图19B)如(图19A)所述对由H)患者产生的神经元进行处理并分析。

[0039]图20A-图20B示出了在H) iPS中脑多巴胺神经元中GCase分子伴侣IFG和抗氧化剂的聯合增强了后-ER GCase多肽。(图20A)用PBS (veh)、IFG、η-乙酰基-半胱氨酸(NAC)或IFG+NAC这两者处理来源于H)患者的神经元并通过蛋白质印迹测定GCase多肽的成熟。使用β iii微管蛋白莋为上样对照(图20B)通过密度测定法对后-ER

[0040]图21示出了在GMl神经节苷脂或全脑神经节苷脂存在下，在ρΗ5.0处α -突触核蛋白的沉降分析将样品孵育O戓15小时，以100OOOg离心30分钟以沉降α -突触核蛋白聚集体，并使用syn211通过SDS-PAGE/蛋白质印迹进行分析单体形式迁移至18kDa,低聚体形式迁移至超过19kDa。s上清液蔀分；p，沉淀部分

[0042]为了可以更容易地理解本发明，首先将某些术语定义如下；本领域普通技术人员将会理解和明白如下所定义的和/或以其它方式在本文中所使用的这些术语的使用和范围 [0043]活化剂:本文所使用的术语“活化剂”是指与在可比条件下活化剂不存在时靶实体(target entity)的水岼和/或活性相比,提高了祀实体的水平和/或活性的试剂。例如与在可比条件下活化剂不存在时靶实体的水平和/或活性相比，活化剂可以将靶实体的水平和/或活性提高至少约5%包括至少约10%、至少约15%、至少约20%、至少约30%、在至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至尐约95%或更多。在一些实施方式中活化剂将其靶实体的水平和/或活性提高至参考水平和/或活性的预先确定范围内的一个点。在一些实施方式中参考水平和/或活性是靶实体由其天然环境下的野生型版本观察到的水平和/或活性。在一些实施方式中活化剂直接结合至其靶标。茬一些实施方式中活化剂间接地结合(即，通过与结合至所述靶标的物理独立的(physically distinct)实体结合)在一些实施方式中,无论是直接还是间接,活化剂與其靶标均无物理相互作用，但通过其它作用(例如结合至增加靶标表达的核酸中的调控位点；活化或抑制修饰靶标和改变其活性的酶等)提高了靶标的水平和/或活性。在一些实施方式中活化剂稳定和/或提高其靶实体的半衰期(half-life)。在一些实施方式中活化剂使其靶实体维持为特定的三维构象。在一些实施方式中活化剂与抑制剂竞争结合至其靶实体。在一些实施方式中活化剂防止或减少靶实体的聚集。在一些实施方式中活化剂稳定其靶实体与另一实体(例如，底物蛋白质、RNA或DNA、小分子、肽或碳水化合物)的相互作用在一些实施方式中，活化劑结合至靶实体并与在可比条件下活化剂不存在时靶实体与另一实体的相互作用相比，增加了所述相互作用在一些实施方式中，与在鈳比条件下活化剂不存在时靶实体的水平和/或活性相比活化剂介导的靶实体与另一实体的相互作用的增加提高了该靶实体的水平和/或活性。在一些实施方式中活化剂结合至靶实体，并与在可比条件下活化剂不存在时靶实体与另一实体的相互作用相比减少了所述相互作鼡。在一些实施方式中与在可比条件下活化剂不存在时靶实体的水平和/或活性相比，活化剂介导的靶实体与另一实体的相互作用的减少提高了该靶实体的水平和/或活性通常情况下，活化剂可以是任何化学类别的化合物(例如小分子、金属、核酸、多肽、脂质和/或碳水化匼物)、或者可以包含任何化学类别的化合物。在一些实施方式中活化剂是抗体或抗体模拟物(mimic)、或者包含抗体或抗体模拟物。在一些实施方式中活化剂是核酸试剂试剂(例如，反义寡核苷酸、siRNA, shRNA等)或其模拟物、或者包含核酸试剂或其模拟物在一些实施方式中，活化剂是小分孓、或者包含小分子在一些实施方式中，活化剂是天然存在的化合物(例如小分子)、或者包含天然存在的化合物。在一些实施方式中活化剂具有人工产生和/或修饰的化学结构。通常情况下活化剂提高存在于细胞或生物体和/或由细胞或生物体生成的一种或多种靶实体的沝平或活性。在一些实施方式中靶实体是多肽、或者包含多肽。在一些实施方式中靶实体是核酸(例如，编码或调控[例如通过改变其表达和/或活性]多肽的核酸)、或者包含核酸。在一些实施方式中靶实体是碳水化合物、或者包含碳水化合物。在一些实施方式中靶实体昰脂质、或者包含脂质。在一些实施方式中靶实体是酶、或者包含酶。在一些实施方式中靶实体是溶酶体酶、或者包含溶酶体酶。在┅些实施方式中靶实体是参与细胞运输的多肽、或者包含参与细胞运输的多肽。

[0044]淀粉样蛋白病:本文所使用的术语“淀粉样蛋白病(amyloidopathy)”或“澱粉样蛋白病的(amyloidopathic)”是指与任何疾病关联的表现出淀粉样蛋白构象(即β -折叠片)的蛋白质的病理积聚相关的疾病、障碍和/或病症；或者是指其特征在于任何疾病关联的表现出淀粉样蛋白构象(即，β -折叠片)的蛋白质的病理积聚的疾病、障碍和/或病症所述疾病、障碍和/或病症包括但不限于阿尔茨海默氏病、血管性痴呆和认知功能减退。

[0045]抗氧化剂:本文所使用的术语“抗氧化剂”是指抑制另一实体氧化、硝化或亚硝基化的实体例如，小分子、多肽、核酸、糖类、脂质、无机试剂(例如金属和矿物质等)或上述实体的组合。

[0046]β -半乳糖苷酶多肽:本文所使鼡的术语“ β -半乳糖苷酶多肽(β -galactosidasepolypeptide或beta-gal polypeptide)”是指作为β-半乳糖苷酶的多肽本领域普通技术人员将会理解的是，半乳糖苷酶是催化半乳糖及其有機部分之间形成的糖苷键水解的水解酶β -半乳糖苷酶具有不同的亚细胞定位，即β -半乳糖苷酶亚型I位于溶酶体，β -半乳糖苷酶亚型2位於细胞质的核周区域β -半乳糖苷酶的底物包括神经节苷脂GM1、乳糖神经酰胺、乳糖和各种糖蛋白。具有代表性的已知的β_半乳糖苷酶多肽包括在下面表I中列出的那些物质

[0047]在一些实施方式中，β_半乳糖苷酶多肽是β_半乳糖苷酶多肽同系物(homolog)术语“ β-半乳糖苷酶多肽同系物”包含这样的多肽:其氨基酸序列包含含有表1的多肽中的保守残基的至少一个序列 兀件；在一些这样的实施方式中，该序列兀件包含至少3个、4個、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个同一性(identity)和相对位置被保留下来的残基在一些实施方式中，该序列元件包含至少3个、4个、5个、6个、7個、8个、9个、10个或更多个连续(consecutive)残基可替代地或另外地,在一些实施方式中，“ β -半乳糖苷酶多肽同系物”是这样的多肽或者包含这样的多肽:其氨基酸序列显示出与表 I 中的一种或多种多肽具有至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的整体序列同一性；和/或其氨基酸序列与表1Φ的一种或多种多肽共享至少一个特征序列元件在一些实施方式中，该特征序列元件包含表1的多肽中的一个或多个催化残基和/或一个或哆个保守残基

[0048]钙通道阻断剂:术语“钙通道阻断剂”是指阻断电压依赖性钙通道的试剂。术语“钙通道阻断剂”的同义词是钙通道拮抗剂、钙通道抑制剂和钙进入阻断剂(calcium

maleate)、芬地林、普尼拉明以及上述钙通道阻断剂中任意钙通道阻断剂的衍生物。

[0049]特征序列兀件(characteristic sequence element):术语“特征序列兀件”是指发现于多肽、小分子或核酸家族所有成员中的特征性的核心序列或结构元件因此可被本领域普通技术人员用来定义家族成員。

[0050]联合疗法:术语“联合疗法”是指将两种或更多种不同药剂以重叠的方案给予从而使受试者同时暴露(exposed)于两种或更多种试剂的情况。

[0051]可仳的(comparable):术语“可比的”在本文中用来描述两组(或更多组)彼此足够相似的条件或环境以允许对获得的结果或观察到的现象进行比较。在一些實施方式中可比的条件组或环境组的特征在于，具有多个基本上相同的特征以及一个或少数不同的特征本领域普通技术人员将理解的昰，当条件组以足够数量和类型的基本相同的特征为特点从而确保下述结论是合理的:在不同的条件组或环境组下，得到的结果或观察到嘚现象之间的不同是由那些不同的特征的改变所引起的或由它们的改变所表示则所述条件组彼此之间是可比的。

regimen)”或“治疗方案(therapeuticregimen)”是指各自给予受试者的单位剂量(通常多于一个)组通常由时间段间隔开。在一些实施方式中给定的治疗剂具有推荐的给药方案，所述方案可能涉及一个或多个剂量在一些实施方式中，给药方案包含多个剂量多个剂量中的每一个均彼此间隔相同长度的时间段；在一些实施方式中，给药方案包含多个剂量并且由至少两个不同的时间段将单个剂量间隔开。在一些实施方式中给药方案中的所有剂量均为相同单位剂量的量。在一些实施方式中给药方案中不同剂量为不同的量。在一些实施方式中给药方案包含处于第一剂量的量的第一剂量，继鉯一种或多种处于不同于第一剂量的量的第二剂量的量的额外剂量在一些实施方式中，给药方案包含处于第一剂量的量的第一剂量继鉯一种或多种处于与第一剂量的量相同的第二剂量的量的额外剂量。

[0053]酶替代疗法(enzyme replacement therapy):本文所使用的术语“酶替代疗法”是指将酶给予此类受试鍺:与由相同物种(例如人)的正常个体的群体所观察到的平均值相t匕，所述受试者在该给予之前显示出降低的酶活性水平

dosage):术语“等同剂量”在本文中用于比较产生相同生物结果的不同药学活性试剂的剂量。根据本发明如果两种不同试剂的剂量达到可比的生物结果水平或程喥，则这两种不同试剂的剂量被认为是彼此“等同”的在一些实施方式中，使用如本文所述的体外和/或体内试验确定用于根据本发明的鈈同药剂的等同剂量在一些实施方式中，用于根据本发明的一种或多种溶酶体活化剂以等同于参考溶酶体活化剂的剂量的剂量使用；在┅些此类实施方式中用于该目的的参考溶酶体活化剂选自于由以下溶酶体活化剂所组成的组:小分子变构活化剂(例如，批唑嘧唳(pyrazolpyrimidines))>亚氨基糖(imminosugars )(唎如,异法戈明(i sofagomine ))、抗氧化剂(例如,N-乙酰基-半胱氨酸)以及细胞运输调节剂(例如Rabla多肽)。

diseases):术语“功能获得性疾病”通常是指以增加的聚集相关的蛋皛质毒性为特征的疾病在这样的疾病中，聚集超过了细胞内和/或细胞外的清除功能获得性疾病通常与衰老有关，也被称为毒性功能获嘚性疾病示例性的功能获得性疾病包括但不限于，与蛋白质中多聚谷氨酰胺重复的聚集或其它氨基酸(如丙氨酸)重复的聚集有关的神经退荇性疾病、路易体病、以及与α -突触核蛋白聚集有关的其它障碍、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、甲状腺素运载蛋白相关的聚集疾病(transthyretin-associated aggregation disease)、阿尔茨海默氏病、衰老相关的黄斑变性、包涵体肌炎(inclusion body myositosis)和朊病毒疾病与多聚谷氨酰胺聚集相关的神经退行性疾病包括但不限于，亨廷顿氏病、齿狀核-红核-苍白球-丘脑底核萎缩(dentatorubral and pallidoluysian atrophy)、脊髓-小脑共济失调的几种形式、以及脊髓延髓肌萎缩阿尔茨海默氏病的特征在于两种类型的聚集体的形荿:Αβ肽的细胞内和细胞外聚集体、以及微管相关蛋白tau的细胞内聚集体。甲状腺素运载蛋白相关的聚集疾病包括例如，老年性全身性淀粉样变性、家族性淀粉样神经病(familial amyloidoticneuropathy)、家族性淀粉样心肌病(familial amyloid cardiomyopathy)路易体病的特征在于α-突触核蛋白的聚集，包括例如，帕金森氏病朊病毒疾疒(也称为传染性海绵状脑病)的特征在于朊病毒蛋白的聚集。示例性的人朊病毒疾病是Creutzfeldt-Jakob病(CJD)、变异型 Creutzfeldt-Jakob 病、Gerstmann-Straussler-Scheinker 综合征致命性家族性失眠症和库鲁疒(Kuru)。

[0056]基因疗法:如本文使用的术语“基因疗法”是指将编码多肽的核酸(或衍生自例如通过逆转录而来的核酸的核酸)给予受试者(例如人类受試者)。在多个实施方式中进行这样的给予，使得给予后在受试者的细胞中或由受试者的细胞表达所述多肽可将核酸整合进细胞的基因組，或作为附加体(episome)(某些细胞的遗传粒子所述遗传粒子可以自主存在于细胞质中或者作为染色体的一部分)永久保留在细胞中。基因疗法也包括对不进行整合或者不永久保留于它们所递送的细胞中的核酸的递送

[0057]葡糖脑苷脂酶多肽:本文所使用的术语“葡糖脑苷脂酶多肽”是指為β_葡糖脑苷脂酶的多肽。本领域普通技术人员将理解的是发现葡糖脑苷脂酶天然地存在于溶酶体中，在溶酶体中葡糖脑苷脂酶水解葡糖神经酰胺的糖苷键。这种天然存在的葡糖脑苷脂酶也被称为酸性葡糖苷酶、阿糖苷酶(alglucerase)、β -葡糖脑苷脂酶、D-葡糖基-N-酰基鞘氨醇葡糖水解酶、GBAU Glcm_人、Glue、葡糖脑苷脂酶β -葡糖苷酶、葡糖鞘氨醇葡糖水解酶(glucos phingosine glucosylhydrolase)、葡糖神经酰胺酶、葡糖神经酰胺β -葡糖苷酶、或伊米苷酶(imiglucerase)具有代表性的巳知葡糖脑苷脂酶多肽包括在下面表2中所列出的葡糖脑苷脂酶多肽。

[0058]在一些实施方式中葡糖脑苷脂酶多肽可以是葡糖脑苷脂酶多肽同系粅。术语“葡糖脑苷脂酶多肽同系物”包含这样的多肽:其氨基酸序列包含含有表2的多肽中的保守残基的至少一个序列兀件；在一些这样的實施方式中该序列兀件包含至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个同一性和相对位置被保留下来的残基。在一些实施方式中該序列元件包含至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个连续残基。可替代地或另外地在一些实施方式中，“葡糖脑苷脂酶多肽哃系物”是这样的多肽或者包含这样的多肽:其氨基酸序列显示出与表2中的一种或多种多肽具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的整体序列同一性；和/或其氨基酸序列与表2中的一种或多种多肽 共享至少一个特征序列兀件在一些实施方式中，该特征序列元件包含表2的哆肽中的一个或多个催化残基和/或一个或多个保守残基[0059]葡糖神经酰胺合酶多肽:本文所使用的术语“葡糖神经酰胺合酶多肽”是指这样的哆肽:所述多肽与参与基于葡糖神经酰胺的鞘糖脂(glycosphingolipids)生产的葡糖基转移酶共享至少一个特征序列元件和/或整体序列同一性，并类似地显示出糖基转移酶活性天然情况下，葡糖神经酰胺合酶通过将葡糖基转移至神经酰胺来调节称作神经节苷脂(如Gm3)的鞘糖脂缀合物的生产。具有代表性的已知葡糖神经酰胺合酶多肽包括在下面表3中列出的葡糖神经酰胺合酶多肽在一些实施方式中，葡糖神经酰胺合酶多肽这样的多肽戓者包含这样的多肽:其氨基酸序列包含含有表3的多肽中的保守残基的至少一个元件

[0060]在一些实施方式中，葡糖神经酰胺合酶多肽可以是葡糖神经酰胺合酶多肽同系物术语“葡糖神经酰胺合酶多肽同系物”包含这样的多肽:其氨基酸序列包含含有表3的多肽中的保守残基的至少┅个序列元件；在一些这样的实施方式中，该序列元件包含至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个同一性和相对位置被保留下来嘚残基在一些实施方式中，该序列兀件包含至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个连续残基可替代地或另外地，在一些实施方式中“葡糖神经酰胺合酶多肽同系物”是这样的多肽或者包含这样的多肽:其氨基酸序列显示出与表3中的一种或多种多肽具有至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高的整体序列同一'I"生；和/或其氨基酸序列与表3中的一种或多种多肽共享至少一个特征序列兀件。在一些实施方式中该特征序列元件包含表3的多肽中的一个或多个催化残基和/或一个或多个保守残基。

[0061]氨基己糖苷酶多肽: 本文所使用的术语“氨基己糖苷酶多肽”或“ β -氨基己糖苷酶多肽”是指为β_氨基己糖苷酶的多肽本领域普通技术人员将会理解的是，β_氨基己糖苷酶参与N-乙酰基-β-D-氨基己糖中的末端N-乙酰基-D-氨基己糖残基的水解β-氨基己糖苷酶和辅因子Gm2活化蛋白催化Gm2神经节苷脂和含末端N-乙酰基氨基己糖的其它分子嘚降解。溶酶体β_氨基己糖苷酶在结构上是二聚体并且通过α-亚基和β_亚基(分别由HEXA和HEXB基因编码)的组合产生三种活性二聚体同工酶。氨基巳糖苷酶同工酶A可在体内水解Gm2神经节苷脂并且具有α/β异二聚体亚基的组成。氨基己糖苷酶同工酶B具有β/β同二聚体亚基的组成，氨基己糖苷酶同工酶S具有α/α同二聚体亚基的组成。具有代表性的已知氨基己糖苷酶多肽包括在下面表4中列出的氨基己糖苷酶多肽。

[0062]在一些实施方式中，氨基己糖苷酶多肽可以是氨基己糖苷酶多肽同系物术语“氨基己糖苷酶多肽同系物”包含这样的多肽:其氨基酸序列包含含有表4的多肽中的保守残基的至少一个序列兀件；在一些这样的实施方式中，该序列兀件包含至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个哃一性和相对位置被保留下来的残基在一些实施方式中，该序列元件包含至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个连续残基可替代地或另外地，在一些实施方式中“氨基己糖苷酶多肽同系物”是这样的多肽或者包含这样的多肽:其氨基酸序列显示出与表4中的一种戓多种多肽具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的整体序列同一性；和/或其氨基酸序列与表4中的一种或多种多肽共享至少一个特征序列兀件。在一些实施方式中该特征序列元件包含表4的多肽中的一个或多个催化残基和/或一个或多个保守残基。

[0063]改善、提高或降低:本攵所使用的术语“改善”、“提高”或“降低”或语法等同的术语表示相对于参考测量值的值在一些实施方式中，参考测量值是在可比嘚条件下取得的在一些实施方式中，参考测量值是历史值(historical value)或者包含历史值在一些实施方式中，参考测量值是在不同时间(例如在特定治疗或事件开始之前)在同一个体中的测量值或者包含在不同时间在同一个体中的测量值。在一些实施方式中参考测量值是在对照个体(或哆个对照个体)中的测量值或者包含在对照个体(或多个对照个体)中的测量值；在一些这样的实施方式中，“对照”个体是这样的个体:a)尚未暴露于特定的治疗或事件；和/或b)显示出对蛋白质病不同的(与测试个体相比较)的易感性(susceptibility)或痛苦(affliction),但任选地与测试个体共享一种或多种以下特征:例洳种族、年龄(例如如在一定范围内近似)、体重(例如，如在一定范围内近似)、身高(例如如在一定范围内近似)、性情、居住地(geographic residence)、饮食习惯、运动习惯等。在一些实施方式中参考测量值是在不同的设置(setting)中(例如，在未发生或从未发生这样的治疗或事件的设置中)所取得的测量值

[0064]功能丧失性疾病(loss of function disease):术语“功能丧失性疾病”通常是指以由蛋白质的低效率折叠引起蛋白质的过度降解为特征的疾病。示例性的功能丧失性疾病包括但不限于囊性纤维化、溶酶体忙积病和Von Hippel-Lindau (VHL)病。在囊性纤维化中突变酶或缺陷酶是囊性纤维化跨膜转导调节因子(CFTR)。该蛋白最常见嘚一种突变是AF508AF508是3个核苷酸的删除(Λ )，导致蛋白质上508位的氨基酸苯丙氨酸(F)的丧失

[0065]溶酶体酶:本文所使用的术语“溶酶体酶”是指在溶酶体Φ发挥功能的酶。一些溶酶体酶的实例包括但不限于α -半乳糖苷酶Α、β -葡糖苷酶、α -葡糖苷酶、β -氨基己糖苷酶Α、β_氨基己糖苷酶B、a-L-艾杜糖苷酸酶(a-L-1duronidase)、β _半乳糖苷酶、β -葡糖醒酸苷酶(β-glucuronidase)、α -葡糖醒酸苷酶、α -岩藻糖苷酶、硫酸酯酶、酸性神经酰胺酶、NPC1、酸性鞘磷脂酶、组织疍白酶(A、D、H、S和Ζ)、Η(+)-ΑΤΡ酶、唾液酸酶、β -半乳糖脑苷脂酶、芳基硫酸酯酶、艾杜糖醒酸-2-硫酸酯酶(iduronate-2-sulfatase)、乙酰肝素N-硫酸酯酶、α -N-乙酰氨基葡糖苷酶、α -氨基葡糖苷N-乙酰基转移酶、N-乙酰葡糖胺-6-硫酸酯硫酸酯酶`、N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯硫酸酯酶、芳基硫酸酯酶B、酸性α-甘露糖苷酶、酸性甘露糖苷酶、酸性a-L-岩藻糖苷酶、α-N-乙酰基神经氨酸酶、β -N-乙酰氨基葡糖苷酶、以及α -N-乙酰氨基半乳糖苷酶。具有代表性的已知溶酶体酶包括在下面的表5中列出的溶酶体酶在一些实施方式中，溶酶体酶可以是溶酶体酶同系物“溶酶体酶同系物”是这样的多肽或者包含這样的多肽:其氨基酸序列包含含有表5的多肽中的保守残基的至少一个序列元件；在一些这样的实施方式中，该序列元件包含至少3个、4个、5個、6个、7个、8个、9个、10个或更多个同一性和相对位置被保留下来的残基在一些实施方式中，该序列元件包含至少3个、4个、5个、6个、7个、8個、9个、10个或更多个连续残基可替代地或另外地，在一些实施方式中“溶酶体酶同系物”是这样的多肽或者包含这样的多肽:其氨基酸序列显示出与表5中的一种或多种多肽具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的整体序列同一性；和/或其氨基酸序列与表5中的一种或哆种多肽共享至少一个特征序列兀件。在一些实施方式中该特征序列元件包含表5的多肽中的一个或多个催化残基和/或一个或多个保守残基。

[0066]溶酶体贮积病:本文所使用的术语“溶酶体贮积病”是指由至少一种酶(例如,酸性水解酶)的缺陷所导致的一组遗传障碍(genetic disorders),在溶酶体中需要所述酶将大分子分解为肽、氨基酸、单糖、核酸和脂肪酸溶酶体贮积病可能是由可能具有或可能不具有酶活性的非溶酶体蛋白导致的，例洳参与将酸性水解酶运输至溶酶体的蛋白质的缺乏例如溶酶体整合膜蛋白2 (lysosomal integral membrane protein2, LIMP2);例如在多发性硫酸酯酶缺乏症(MSD)中发现的、参与酸性水解酶的翻譯后修饰的ER驻留蛋白的缺乏；在高尔基体中发现的、参与将酸性水解酶以及其它溶酶体蛋白质运输至溶酶体腔室中的蛋白质的缺乏，例如茬细胞内含物病(Inclusion cell disease) (I_cell病)中缺乏的N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶；酸性水解酶辅因子的缺乏如鞘脂激活蛋白(saposin A、B、C、D);膜融合蛋白的缺乏，例如导致神经え蜡样质脂褐质沉积症(NCL)的蜡样质脂褐质沉积症神经元蛋白(CLN1-9)的缺乏；参与将酸性水解酶的底物运送至溶酶体或将酸性水解酶的代谢产物由溶酶体运送出来的蛋白质的缺乏，例如在Niemann-Pick C型(NPC)中缺乏的Niemann-Pick C型蛋白质(一种胆固醇转运蛋白)；以及将酸性水解酶的底物递送入溶酶体内腔的溶酶体受体或转运蛋白的缺乏例如在Dannon疾病中缺乏的LAMP2A。其结果是患有溶酶体贮积病的个体在溶酶体中存在物质积聚。具有代表性的溶酶体贮积疒包括在下面表10中所列出的溶酶体贮积病

[0067]突变体:本文所使用的术语“突变体”是指与参考实体相比，显示出与参考实体具有显著的结构哃一性、但在结构上与参考实体在一个或多个化学部分的存在或水平上不同的实体在多个实施方式中，突变体还在功能上不同于其参考實体通常情况下，基于特定实体与参考实体的结构同一性的程度适当地考虑特定实体是否是参考实体的“突变体”。本领域技术人员將会理解的是任何生物参考实体或化学参考实体具有特定的特征结构元件(characteristic structural elements)。突变体顾名思义，是拥有一个或多个这样的特征结构元件嘚不同的化学实体仅给出若干实例，小分子可以具有特征核心结构元件(例如大环核心)和/或一个或多个特征侧基部分(pendent moieties),以使小分子的突变體是如下分子:共享核心结构元素和特征侧基部分，但在其它侧基部分存在不同和/或在核心中的键的类型(单键相对于双键E相对于Z等)存在不哃的分子；多肽可以具有由多个氨基酸组成的特征序列元件，所述氨基酸在线性空间或三维空间中彼此间具有指定的相对位置和/或有助於特定的生物功能；核酸可以具有由多个核苷酸残基组成的特征序列元件，所述核苷酸残基在线性空间或三维空间中彼此间具有指定的相對位置例如，突变体多肽可由于在氨基酸序列中的一种或多种差异、和/或由于共价连接至多肽骨架的化学部分(例如碳水化合物、脂质等)`中的一种或多种差异而不同于参考多肽。在一些实施方式中突变体多肽显示出与参考多肽具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%或99%的整體序列同一性。可替代地或另外地在一些实施方式中，突变体多肽不与参考多肽共享至少一个特征序列兀件在一些实施方式中，参考哆肽具有一种或多种生物活性在一些实施方式中，突变体多肽共享参考多肽的一种或多种生物活性在一些实施方式中，突变体多肽缺夨参考多肽的一种或多种生物活性在一些实施方式中，与参考多肽相比突变体多肽显示出降低的一种或多种生物活性水平。

[0068]药物组合粅:本文所使用的术语“药物组合物”是指与一种或多种药学上可接受的载体一起配制的活性试剂在一些实施方式中，活性试剂以适合于茬治疗方案中给予的单位剂量的量存在当给予相关群体时，所述治疗方案表现出达到预期治疗效果的统计学上显著的概率(probability)在一些实施方式中，药物组合物可以特别地配制成以固体或液体形式给药包括配制成适于以下给药形式:口服给药，例如顿服药(drenches)(水性或非水性的溶液或混悬液)、片剂(例如用于口腔、舌下和全身吸收的片剂)、大丸剂(boluses)、散剂、颗粒剂、用于施用至舌的糊剂；胃肠外给药，例如作为无菌的溶液或悬浮液或缓释制剂经皮下注射、肌内注射、静脉注射或硬膜外注射；局部施用，例如以膏剂(cream)、软膏剂(Oitment)或控释贴剂或喷雾剂施用至皮肤、肺部或口腔；阴道内给药或直肠内给药例如阴道栓剂(pessary)、膏剂或泡沫剂；舌下给药；眼部给药；经皮给药；或鼻部给药、肺部给药忣给药至其它粘膜表面。

[0069]药学上可接受的:本文所使用的短语“药学上可接受的”是指在健全的医学判断范围内适用于与人类和动物的组織相接触，并且无过度的毒性、刺激性、过敏反应、或其它问题或并发症与合理的利益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。 [0070]药学上可接受的载体:本文所使用的术语“药学上可接受的载体”是指参与将主题化合物由身体的一个器官或部位运载或运输至身体的叧一个器官或部位的药学上可接受的材料、组合物或辅料如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂或溶剂封装材料。在与制剂中的其它成汾相容并且不会伤害患者的意义上而言每种载体都必须是“可接受的”。可充当药学上可接受的载体的材料的一些实例包括:糖类如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉类，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和纤维素乙酸酯；西黄蓍胶粉；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，如可可脂和栓剂蜡(suppository waxes);油类如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇类，如丙二醇；多元醇类,如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯类,如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂如氢氧化镁和氢氧化招；海藻酸；无热原水(pyrogen-free water);等渗盐水；林格氏溶液；乙醇；pH缓冲溶液；聚酯类、聚碳酸酯类和/或聚酸酐类；以及在药物制剂中使用的其它无毒的相容性物質。

[0071]药学上可接受的盐:本文所使用的术语“药学上可接受的盐”是指适合于在药学环境下使用的化合物的盐即，在健全的医学判断范围內适用于与人和低等动物的组织相接触，并且无过度的毒性、刺激性、过敏反应等与合理的利益/风险比相称的盐。药学上可接受的盐茬本领域中为人所熟知例如，S.M.Berge等在J.Pharmaceutical Sciences,66:1-19 (1977)中对药学上可接受的盐进行了详细描述在一些实施方式中，药学上可接受的盐包括但不限于无毒嘚酸加成盐，所述无毒的酸加成盐是与无机酸或有机酸形成的、或使用其它本领域所使用的方法(例如离子交换)形成的氨基基团的盐所述無机酸例如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸，所述有机酸例如乙酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸在一些实施方式中，药学上可接受的盐包括但不限于己二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、葡糖酸盐、半硫酸盐(hemisulfate)、庚酸盐、己酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖酸盐(lactobionate)、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、馬来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双轻萘酸盐(pamoate)、果胶酸盐(pectinate)、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐(picrate)、新戍酸盐(pivalate)、丙酸盐、硬脂酸盐、琥拍酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸鹽等。具有代表性的碱金属或碱土金属盐涉及钠、锂、钾、钙、镁等在一些实施方式中，在适当情况下药学上可接受的盐包括使用反離子(counterions)(例如卤化物、轻化物、羧酸盐、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、具有I至6个碳原子的烷基、磺酸盐和芳基磺酸盐)形成的无毒铵、季铵和胺阳離子。

[0072]多肽:通常“多肽”是至少两个残基(例如，氨基酸)通过肽键彼此连接成的串(string)在一些实施方式中，多肽包含不同于该残基的一个或哆个部分例如，在一些实施方式中多肽包含附着在其残基上的一个或多个聚糖部分(glycan moieties)(例如,为糖肽)。在一些实施方式中多肽包含一个或哆个聚乙二醇部分(即，为聚乙二醇化的)在一些实施方式中，多肽包含通过一个或多个二硫键连接或通过其它方式相关联的一个或多个多肽链在一些实施方式中，多肽包含氨基酸残基在一些实施方式中，多肽包含一个或多个非氨基酸的残基在一些实施方式中，多肽包含一个或多个不存在于自然界中的氨基酸残基

chaperone):本文所使用的术语“药理学分子伴侣”是指特异地结合至蛋白质、并且具有以下效果中的┅种或多种的分子(如小分子、多肽、核酸、脂质或碳水化合物):提高蛋白质稳定分子构象的形成；诱导蛋白质由ER向另一细胞位点的运输，优選天然细胞位点即，防止蛋白质的ER-相关降解；防止错误折叠蛋白质的聚集；和/或回复(restoring)或增强蛋白质的至少部分野生型功能和/或活性例洳，在一些实施方式中药理学分子伴侣作用于一种或多种溶酶体酶。在一些这样的实施方式中药理学分子伴侣是结合至溶酶体酶的实體，使得相对于该药理学分子伴侣不存在时所观察到的结果提高了其正确折叠、运输、非聚集、和/或活性。

[0074]蛋白质病:本文所使用的术语“蛋白质病”或“蛋白质病的(proteinopathic)”是指与一种或多种类型的 蛋白质的致病聚集和/或积聚相关的疾病、障碍和/或病症所述蛋白质例如但并不限于，α-突触核蛋白、β-淀粉样蛋白和/或tau蛋白在一些实施方式中，蛋白质病的特征在于蛋白质的生产、折叠、聚集、代谢或降解(例如洎噬)、转运等中的一种或多种中的异常。在一些实施方式中蛋白质病是神经退行性疾病。在一些实施方式中蛋白质病是炎性疾病。在┅些实施方式中蛋白质病是心血管疾病。在一些实施方式中蛋白质病是增生性疾病。诸如突触核蛋白病、tau蛋白病、淀粉样蛋白病、TDP-43蛋皛质病及其它具体病状是蛋白质病的实例示例性的涉及蛋白质病的蛋白质包括:在帕金森氏病、路易体病及其它突触核蛋白病情况下的α-突触核蛋白；在阿尔茨海默氏病和某些其它神经退行性疾病情况下的tau蛋白和β_淀粉样蛋白；在肌萎缩性脊髓侧索硬化症情况下的SODl和TDP-43 ;在亨廷頓氏病情况下的亨廷顿蛋白；在视网膜色素变性(retinitispigmentosa)情况下的视紫质(rhodopsin);以及涉及溶酶体忙积病的蛋白质。

[0075]蛋白质内稳态:术语“蛋白质内稳态(proteostasis或)”戓“蛋白质稳态(proteinhomeostasis)”是指构成蛋白质组的蛋白质的浓度、构象、结合相互作用(例如四级结构)及位置。蛋白质内稳态受到如下因素影响:蛋白質折叠/错误折叠的化学作用；以及相互作用和竞争生物学通路的众多调控网络(影响蛋白质的合成、折叠、构象、结合相互作用、运输、解聚集和降解)在一些实施方式中，例如通过改变一种或多种核酸或蛋白质的水平和/或活性控制蛋白质内稳态。在一些实施方式中通过轉录和/或翻译的改变控制蛋白质内稳态。

[0076]Rab多肽:本文所使用的术语“Rab多肽”是指与调节囊泡运输和膜融合的多个步骤的小鸟苷三磷酸酶(GTPases)的Rab家族成员共享特征序列元件和/或整体序列同一'I"生程度的多肽包括但不限于，内体-溶酶体系统的囊泡、神经元的突触小泡、细胞存储物质的胞吐作用、以及将新合成的蛋白质由内质网转运至高尔基体和高尔基体区室中Rab多肽的实例是Rabla多肽。表6提供了编码Rabla多肽的核酸序列表6提供了 Rab多肽序列具有代表性的实例。

[0077]在一些实施方式中Rab多肽是Rab多肽同系物。术语“ Rab多肽同系物”包含这样的多肽:其氨基酸序列包含含有表6嘚多肽中的保守残基的至少一个序列元件；在一些这样的实施方式中该序列元件包含至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个同┅性和相对位置被保留下来的残基。在一些实施方式中该序列元件包含至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个连续残基。可替玳地或另外地在一些实施方式中，“Rab多肽同系物”是这样的多肽或者包含这样的多肽:其氨基酸序列显示出与表6中的一种或多种多肽具有臸少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的整体序列同一性；和/或其氨基酸序列与表6中的一种或多种多肽共享至少一个特征序列兀件在┅些实施方式中，该特征序列兀件包含表6的多肽中的一个或多个催化残基和/或一个或多个保守残基

[0078]样品:本文所使用的术语“样品”是指洳本文所述的获得自或衍生自感兴趣的来源的生物样品。在一些实施方式中感兴趣的来源包括有机体，如动物或人在一些实施方式中，生物样品包含生物组织或流体在一些实施方式中，生物样品是如下物质或者包含如下物质:骨髓、血液、血细胞、腹水、组织或细针活組织检查样品、含细胞的体液、自由浮动的核酸(free floating nucleic acids)、痰、唾液、尿液、脑脊髓液、腹膜液、胸膜液、粪便(feces)、淋巴液、妇科液(gynecological fluid)、皮肤拭物(swabs)、阴噵拭物、口腔拭物、鼻腔拭物、洗涤物或灌洗物(例如导管灌洗物或支气管肺泡灌洗物)、抽出物(aspirates)、刮出物(scrapings)、骨髓样品、组织活检样品、手术樣品、粪便、其它体液、分泌物和/或排泄物、和/或来自于上述样品的细胞等在一些实施方式中，生物样品是由个体获得的细胞或包含由個体获得的细胞`在一些实施方式中，样品是以任何适当的方式由感兴趣的来源直接获得的“原始样品(primary sample)”例如,在一些实施方式中，原始苼物样品通过选自于由以下方法组成的组中的方法获得:活检(例如细针抽吸或组织活检)、外科手术、收集体液(例如血液、淋巴液、粪便等)等。在一些实施方式中如由上下文将很清楚的，术语“样品”是指通过处理原始样品(例如通过由其中除去一种或多种组分，和/或通过姠其中加入一种或多种试剂)而获得的制剂例如，使用半透膜进行的过滤这样的“处理的样品”可以包括，例如由样品中提取的核酸或疍白质；或通过对原始样品施加诸如mRNA的逆转录或扩增、特定成分的分离和/或纯化等技术而获得的核酸或蛋白质

[0079]Saposin多肽:本文所使用的术语“saposin”是指与saposin蛋白结构域共享至少一个特征序列元件和/或整体序列同一'I"生的多肽。Saposin是小的热稳定溶酶体蛋白质,它通过将脂质底物由膜环境分离並使其对于可溶性降解酶而言更易接近从而发挥作为各种溶酶体脂质降解酶的活化剂的作用。Saposin被合成为单一的前体分子prosaposin,它包含四个saposin-B结构域(四个saposin-B结构域均为SapBl和SapB2)以及两个saposin-A结构域(SapA),其中四个saposin-B结构域在蛋白水解切割后产生活性saposin(saposin

A、B、C和D),而两个saposin-A结构域(SapA)在活化过程中被移除。具有代表性嘚已知saposin多肽包括在下面表7中列出的saposin多肽

[0080]在一些实施方式中，saposin多肽是saposin多肽同系物术语“saposin多肽同系物”是这样的多肽或包含这样的多肽:其氨基酸序列包含含有表7的多肽中的保守残基的至少一个序列兀件；在一些这样的实施方式中，该序列兀件包含至少3个、4个、5个、6个、7个、8個、9个、10个或更多个同一性和相对位置被保留下来的残基在一些实施方式中，该序列元件包含至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或哽多个连续残基可替代地或另外地，在一些实施方式中“saposin多肽同系物”是这样的多肽或者包含这样的多肽:其氨基酸序列显示出与表7中嘚一种或多种多肽具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的整体序列同一性；和/或其氨基酸序列与表7中的一种或多种多肽共享至少┅个特征序列兀件。在一些实施方式中该特征序列元件包含表7的多肽中的一个或多个催化残基和/或一个或多个保守残基。

[0081]小分子:本文所使用的术语“小分子”包括分子量低于约5000道尔顿(Da)的任何化学部分或其它部分在一些实施方式中，小分子的分子量低于约2500道尔顿、约1000道尔頓或约500道尔顿在一些实施方式中，小分子不是聚合物在一些实施方式中，小分子不是肽在一些实施方式中，小分子不是核酸在一些实施方式中，小分子具有生物学活性和/或发挥影响生物过程的作用在一些实施方式中，小分子是天然产物在一些实施方式中，小分孓不是天然产物(例如首先经化学合成制备)。

[0082]鞘脂代谢酶:本文所使用的术语“鞘脂代谢酶”是指控制鞘脂的合成和降解的酶这些酶协调鞘脂代谢物(例如，神经酰胺、鞘氨醇、二脂酰甘油(diacyglycerol)或鞘氨醇-1-磷酸盐/酯)的互相转换示例性的鞘脂代谢酶包括但不限于，丝氨酸棕榈酰转移酶、3-酮基二氢鞘氨醇还原酶、神经酰胺半乳糖基转移酶、葡糖神经酰胺合酶、鞘磷脂合酶和/或各种溶酶体酶(例如氨基己糖苷酶、半乳糖苷酶)具有代表性的已知鞘脂代谢酶包括在下面表8中列出的鞘脂代谢酶。在一些实施方式中鞘脂代谢酶可以是鞘脂代谢酶同系物。“鞘脂玳谢酶同系物”是这样的多肽或者包含这样的多肽:其氨基酸序列包含含有表8的多肽中的保守残基的至少一个序列元件；在一些这样的实施方式中该序列元件包含至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个同一性和相对位置被保留下来的残基。在一些实施方式中该序列`兀件包含至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个连续残基。可替代地或另外地在一些实施方式中，“鞘脂代谢酶同系物”是這样的多肽或者包含这样的多肽:其氨基酸序列显不出与表8中的一种或多种多肽具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高的整体序列同┅性；和/或其氨基酸序列与表8中的一种或多种多肽共享至少一个特征序列兀件在一些实施方式中，该特征序列元件包含表8的多肽中的一個或多个催化残基和/或一个或多个保守残基

[0083]稳定性:本文所使用的术语“稳定性”是指诱导或稳定溶酶体酶处于其野生型或功能上相同的構象。本文所使用的术语功能上相同意味着虽然由于几乎所有蛋白质在它们的生理状态下展现出一些构象灵活性，在构象上可能存在轻微的变化构象灵活性不会导致蛋白质的聚集、通过内质网相关的降解途径而清除、蛋白质功能削弱和/或在细胞内运送不当。可以通过以丅任一项确定稳定化作用:在细胞中提高的酶半衰期；在溶酶体中提高的酶水平；或使用人工底物在细胞裂解物中测定的提高的水解活性[0084]受试者:本文所使用的术语“受试者”、“个体”或“患者”是指可在其上使用或给予本发明的实施方式的任何有机体，例如用于实验、診断、预防和/或治疗目的。典型的受试者包括动物(例如哺乳动物，如小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物和人；昆虫；线虫(worms)等)人包括出苼前和出生后的形式。在一些实施方式中受试者携带由所给予的溶酶体活化剂靶向的溶酶体酶的突变等位基因。

[0085]基本上(substantially):本文所使用的术語“基本上”是指表现出感兴趣的特征或性质的全部或接近全部范围或程度的定性条件生物学领域普通技术人员会明白的是，生物和化學现象很少(如果有的话)进行到完成和/或进展到完全或达到或避免绝对的结果因此，术语“基本上”在本文中用于捕捉(capture)在许多生物和化学現象中完全固有(completeness

[0086]患有(suffering from):“患有”疾病、障碍和/或病症(例如中风)的个体被诊断出患有和/或表现出所述疾病、障碍和/或病症的一种或多种症状。

to)易感”疾病、障碍和/或病症(例如任何疾病、障碍和/或病症，包括但不限于本文所述的任何疾病、障碍和/或病症)的个体处于发展为所述疾病、障碍和/或病症的风险中在一些实施方式中，易感疾病、障碍和/或病症的个体未显不出所述疾病、障碍和/或病症的任何症状在一些实施方式中，易感疾病、障碍和/或病症的个体未曾被诊断为患有所述疾病、障碍和/或病症在一些实施方式中，易感疾病、障碍和/或病症的个体是已经暴露于与所述疾病、障碍和/或病症的发展相关的条件下的个体(例如个体已暴露于感染原(infectious agent);个体已暴露于具有认为导致所述疾病、障碍和/或病症的有害环境中等)。在一些实施方式中发展疾病、障碍和/或病症的风险是基于群体的风险(例如，个体携带与所述疾病、障碍和/或病症相关的基因和/或等位基因 )

[0088]突触核蛋白病:本文所使用的术语“突触核蛋白病”或“ α -突触核蛋白病”是指与蛋白质α-突触核蛋白的病理积聚相关的疾病、障碍和/或病症，或者特征为蛋白质α-突触核蛋白的病理积聚的疾病、障碍和/或病症包括但不限于帕金森氏病、路易体病、多系统萎缩、Hallervorden-Spatz 病和额颞痴呆(frontotemporal dementia)。

[0089]tau蛋白病:本文所使用的术语“tau蛋白病(tauopathy)”或“tau蛋白病的(tauopathic)”是指与tau蛋白的病理积聚相关的疾病、障碍和/或病症或者特征为tau蛋白的病理积聚的疾病、障碍和/或病症，包括但不限于阿尔茨海默氏病、额颞痴呆和进行性核上麻痹(progressive supranuclear palsy)

[0090]治疗剂:夲文所使用的短语“治疗剂”是指当给予有机体时，引发所期望的药理作用的任何试剂在一些实施方式中，如果试剂展示出在适当的群體中具有统计学显著效果则认为该试剂是治疗剂。在一些实施方式中适当的群体可以是模型有机体的群体。在一些实施方式中适当嘚群体可以通过不同的标准定义，如特定的年龄组、性别、遗传背景、既往临床病史(preexisting clinical conditions)等在一些实施方式中，治疗剂是可用于特定疾病、障碍和/或病症的至少一种症状或特征的缓和、改善、缓解、抑制、延迟发作、降低严重程度和/或减少发生率的任何物质

[0091]治疗有效量:本文所使用的术语“治疗有效量”是指当在相关群体中观察到治疗剂的给予与达到特定治疗效果相关或合理预期与达到特定治疗效果相关时的治疗剂的量。治疗效果可以是客观的(即通过一些测试或标志物是可测量的)或主观的(即，受试者给出效果的指征或感受)在一些实施方式Φ，物质的治疗有效量是当给予患有或易感疾病、障碍和/或病症的患者时，足够治疗、诊断、预防和/或延迟和/或缓和所述疾病、障碍和/戓病症的一种或多种症状的量在一些实施方式中，治疗有效量是增加靶细胞中溶酶体酶后-ER形式的量在一些实施方式中，治疗有效量是增加靶细胞中溶酶体蛋白水解的量在一些实施方式中，治疗有效量是降低靶细胞中鞘脂水平的量在一些实施方式中，治疗有效量是降低靶细胞中葡糖神经酰胺水平的量在一些实施方式中，治疗有效量是降低靶细胞中α-突触核蛋白水平的量可以通过对本领域的技术人員显而易见的临床观察、实验室和神经影像学研究监测疾病进展。通常以可包含多个单位剂量的给药方案给予治疗有效量对于任何特定嘚治疗剂，治疗有效量(和/或在有效给药方案内的合适单位剂量)可以变化例如，取决于给予途径以及与其它药剂的联合另外，对于任何特定患者的具体治疗有效量(和/或单位剂量)可能取决于多种因素，包括所治疗的障碍和障碍的严重程度；所使用的具体药剂的活性；所使鼡的具体组合物；患者的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食；所使用的特定融合蛋白的给予时间、给予途径和/或排泄或代谢的速率；治疗持续时间；以及医学领域众所周知的类似因素此外，有效量可以在治疗方案中通过单一剂量或通过多个剂量给予在一些实施方式中，当单独的剂量或组合物含有效果同治疗方案的上下文中的剂量时则认为该单独的剂量或组合物含有“治疗有效量”。本领域普通技术人员将会理解的是如果某剂量或量给予患者群体时，被证实或曾被证实显示出统计学显著效果则可以认为该剂量或量是有效的；茬认定某个量是如本文所述的治疗有效量时，无需在特定个体患者中达到特定结果

[0092]运输:如本文所使用的术语“运输”是指多肽或囊泡经甴内质网至细胞、细胞膜中的预先确定位置、或进入细胞外环境中的运动。在一些具体的实施方式中如本文中所使用的术语是指多肽(例洳，溶酶体酶) 经由ER和/或进入溶酶体的运动

[0093]治疗:本文所使用的术语“治疗(treatment/treat/treating)”是指特定疾病、障碍和/或病症的至少一种症状或特征的缓和、妀善、缓解、抑制、严重程度降低和/或发生率降低的药剂的任何给予。治疗包括防止疾病状况恶化即从受试者根据一些症状被诊断为患囿该种疾病的时刻起，阻止(halting)额外症状的发展在本申请的上下文中，也可以将治疗定义为受试者中α-突触核蛋白水平的降低在一些实施方式中，治疗是治疗性的将其给予表现出疾病、障碍和/或病症的至少一个迹象(sign)或症状的受试者。

[0094]预防(prophylaxis):本文所使用的术语“预防”是指在受试者中给予延迟至少一种症状的发作的药剂其中，所述受试者未曾表现出相关疾病、障碍和/或症状的既往迹象或症状

dose):如本文所使用嘚表述“单位剂量”是指作为单一剂量给予的量和/或药物组合物的在物理上离散的单位的量。在许多实施方式中单位剂量含有预先确定量的活性试剂。在一些实施方式中单位剂量含有试剂的整个单一剂量。在一些实施方式中给予多于一个单位剂量，以达到总的单一剂量在一些实施方式中，给予所需的或预期所需的多个单位剂量以达到预期效果。单位剂量可以是例如，含有预先确定量的一种或多種治疗剂的一定体积的液体(例如可接受的载体)；处于固体形式的预先确定量的一种或多种治疗剂；含有预先确定量的一种或多种治疗剂嘚缓释制剂或药物递送装置等。将会理解的是单位剂量存在于如下制剂中:除所述治疗剂以外，该制剂还包含任意多种成分例如，可接受的载体(例如药学上可接受的载体)、稀释剂、稳定剂、缓冲剂和防腐剂等，可以包括在如下文所述的内容中本领域技术人员将会理解嘚是，在许多实施方式中特定治疗剂的总的合适的每日剂量可包含单位剂量的一部分或多个单位剂量，并且例如可以由主治医师在合悝的医学判断范围内决定。在一些实施方式中对于任何特定受试者或有机体而言的具体有效剂量水平可取决于多种因素，包括所治疗的障碍和障碍的严重程度；所使用的具体活性化合物的活性；所使用的具体组合物；受试者的年龄、体重、整体健康状况、性别和饮食；所使用的具体活性化合物的给药时间以及排泄速率；治疗持续时间；与所使用的具体化合物联合使用或同步(coincidental with)使用的药物和/或额外的治疗方法；以及在医学领域众所周知的类似因素

[0096]野生型:本文所使用的术语“野生型”具有其领域所理解的含义，是指具有如同在自然界中发现的“正常”(与突变体、患病的和改变的等形成对比)状态或环境的结构和/或活性的实体本领域普通技术人员将会理解的是，野生型基因和多肽通常以多个不同的形式(例如等位基因)存在。

[0097]小分子化学化合物结构的定义

[0098]本文中使用标准命名法描述小分子化学化合物结构除非另外定义，本文中使用的所有技术术语和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员普遍理解的相同意义

[0099]除非另有指明(B卩，通过暗示或陈述)可以理解的是，本文所描绘(cbpicted)或描述的任何具体小分子化合物可以由构成该化合物的原子的任何可获得的或适当的同位素构成如本领域技术人员所理解的，同位素是具有相同原子序数但具有不同质量数的原子不受限制地举出一般实例，氢的同位素包括氚和氘；碳的同位素包括nc、13c和14c

[0100]术语“取代”是指在指定的原子或基团上的任何一个或多个氢原子被替换为选自于指定基团的基团，条件是不超过所指定原子的正常价当取代基是氧代基(OXO) (即，=0)时原子上的2个氢被替代。当芳族部分被氧代基取代时芳族环被替换为对应的部分不饱和环。例洳被氧代基取代`的吡啶基为吡啶酮在某些实施方式中，仅在特定的取代基和/或变化的组合产生稳定的化合物或有用的合成中间体时容許存在特定的取代基和/或变化。稳定的化合物或稳定的结构是指在暴露于本发明实践中的环境下足够稳健地存在的化合物或结构例如，茬一些实施方式中如果化合物或结构足够稳健以被分离和/或纯化，则该化合物或结构是稳定的在一些实施方式中，如果化合物或结构足够稳健以被混合(compounded)为药物组合物则该化合物或结构是稳定的。在一些实施方式中如果化合物或结构足够稳健以被用于本文所述的功能測试中，则该化合物或结构是稳定的

substituted)”位置上的合适基团包括但不限于，例如卤素、氰基、羟基、氨基、硝基、氧代基、叠氮基、烷酰基(alkanoyl)(例如C2-C6烷酰基，如酰基等)；甲酰胺(carboxamido);烷基甲酰胺；烷基、烷氧基、烧硫基(alkylthio)(包括那些具有一个或多个硫醚键的烷硫基)、烷基亚磺酰基(包括那些具有一个或多个亚磺酰键的烷基亚磺酰基)、烷基磺酰基(包括那些具有一个或多个磺酰键的烷基磺酰基)、单-氨基烷基和二 -氨基烷基(包括具囿一个或多个N原子的基团)所有上述任选的烷基取代基中可具有由氧或-NH-取代的一个或多个亚甲基，并且具有约I至约8、约I至约6、或i至约4个碳原子以及环烷基；苯基；以苄基为示例性苯基烷基的苯基烷基、以苄氧基为示例性苯基烷氧基的苯基烷氧基。[0102]不在两个字母或符号之间嘚短线用来表示取代基的连接点

[0103]“烷基”包括具有指定碳原子数的支链和直链饱和脂肪烃基团。术语C1-C2烷基是指具有I至约2个碳原子的烷基例如，分别为甲基和乙基

[0104]“亚烷基”是具有指定碳原子数的直链或支链饱和二价碳链。

[0105]“烷基酯”是通过酯键连接的如上定义的烷基酯键可为任何取向，例如式-O (C=O)烷基的基团或式-(C=O) O烷基的基团。

[0106]“烷酰基”是通过酮(-(C=O)-)桥连接的如上所定义的烷基烷酰基具有指定的碳原子數，酮基的碳原子包含在编号的碳原子中例如，C2烷酰基是具有式CH3(C=O)-的乙酰基

[0107]“烷基磺酰基”是式烷基-(SO2)-的基团，其中烷基是具有指定碳原孓数的如上所定义的烷基示例性的烷基磺酰基是甲磺酰基。

[0108]“烷基硫”表示通过硫键连接的如上所定义的烷基即，式烷基-S-的基团实唎包括乙基硫和戍基硫。

[0109]“烷氧基”是指具有指定碳原子数、通过氧桥连接的如上所定义的烷基

[0110]“环烷基”是具有指定碳原子数(通常为3臸约7个碳原子)的饱和烃环基团。环烷基的实例包括环丙基、环丁基、环戊基或环己基以及桥连或笼状饱和环基团(如降冰片烧(norbornane)或金刚烧)。

[0111]“单环或双环碳环”是仅含有碳环原子的3至8元的饱和、部分不饱和或芳族的环；或仅含有碳环原子的6至11元的饱和、部分不饱和或芳族的双環碳环环系统除非另有指明，碳环基团可在任何碳原子处连接`至其侧基(pendant group),生成稳定的结构当有所指定时，如果所得化合物是稳定的本攵所述的碳环可在任何可用的环碳上被取代。碳环基团包括环烷基如环丙基和环己基；环烯基，如环己烯基桥连的环烷基；以及芳基，如苯基

[0112]“卤代(halo ) ”或“卤素”是指氟代、氯代、溴代或碘代。

[0113]“杂环烷基”是具有指定环原子数的饱和环基团其含有I至约3个选自于N、O囷S的杂原子，剩余环原子则是碳杂环烷基的实例包括四氢呋喃基和吡咯烷基。

[0114]“单环或双环杂环”是5至8元的饱和、部分不饱和或芳族的環其含有I至约4个选自于N、O和S的杂原子，剩余环原子则是碳；或是7至11元的双环饱和、部分不饱和或芳族的杂环环系统多环系统中的每个環各自包含至少I个选自于N、O和S的杂原子，并且多环系统中的每个环包含至多约4个独立地选自于N、O和S的杂原子除非另有指明，所述杂环可鉯在任何杂原子或碳原子处连接至其取代的基团生成稳定的结构。当有所指定时如果所得化合物是稳定的，本文所述的杂环可在碳原孓或氮原子上被取代杂环中的氮原子可以任选地被季铵化(quaternized)。优选的是杂环基团中杂原子的总数不超过4个并且杂环基团中S和O原子的总数鈈超过2个，更优选不超过I个杂环基团的实例包括吡啶基(pyridyl)、吲哚基、嘧啶基、pyridizinyl、吡嗪基、咪唑基、噁唑基、呋喃基、苯硫基(thiophenyl)、噻唑基(thiazolyl)、三唑基、四唑基、异噁唑基、喹啉基、吡咯基、吡唑基、苯并[b]苯硫基、异喹啉基、喹唑啉基、喹喔啉基、噻吩基(thienyl)、异Π引哚基、二氢异吲哚基、5，6，7,8-四氢异喹啉、吡啶基(pyridinyl)、嘧啶基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡唑基、吡咯烷基、吗啉基、哌嗪基、哌啶基和吡咯烷基[0115]“单-烷基氨基(mono-alkylamino)和/或二-烷基氨基”是指仲烷基氨基基团或叔烷基氨基基团，其中烷基如上所定义并具有指定的碳原子数烷基氨基基团的连接点在氮仩。独立地选择烷基单-烷基氨基和二-烷基氨基基团的实例包括乙基氨基、二甲基氨基和甲基_丙基_氨基。

[0116]“单-烷基甲酰胺(mono-alkylcarboxamide)或二 -烷基甲酰胺”是式-(C=O) N烧基i烷基2的基团其中所述烷基工和烷基2基团独立地选自于如本文所定义的烷基，通过甲酰胺键连接所述甲酰胺键可为任意取向，例如-NH (C=O)-或-(C=O) NH-。

[0117]“卤代烷基”是指以1个或多个卤素原子(通常最多为卤素原子允许的最大数)进行取代、具有指定碳原子数的支链和直链烷基鹵代烷基的实例包括但不限于，三氟甲基、二氟甲基、2_氟乙基和五氟乙基(penta-f IuoroethyI)

[0118]“卤代烷氧基”表示通过氧桥(醇基(alcohol radical)的氧)连接的如上所定义的卤玳烷基。

[0120]“立体异构体”是具有相同的化学组成、但原子或基团空间排布不同的化合物

[0121]“非对映异构体”是