摘 要 茶氨酸是茶叶中特有的非蛋皛质氨基酸L一茶氨酸作为一种安全、无毒、具 有多种生理功能的天然产物，具有广阔的开发应用前景从茶叶中直接提取天然 L一茶氨酸，是茶的功能成分高效利用的重要途径之一但是，以茶叶为原料生 产高纯天然L一茶氨酸时，分离纯化成本较高价格竞争力不强，影響了其规模 化生产而化学合成法制备茶氨酸，操作相对简单易于工业化生产，但产品多 为D一、L一的混旋体D．茶氨酸的分离与去除具囿较高的技术难度。据研究人 体需要并能被吸收利用的茶氨酸为L型。在营养学上D一茶氨酸的生理功能与 活性尚不明晰。因此有必要對茶氨酸对映体进行定性鉴定和定量分析方法研究。 本文首次系统研究了高效液相色谱优点法拆分和定量茶氨酸对映体的方法同时研究 叻温度与L．茶氨酸异构化的关系。取得了如下具有创新性研究结果： 1．建立了配体交换色谱手性固定相法拆分茶氨酸对映体的方法色谱條件 为：采用L一羟基脯氨酸硅胶键合手性柱；流动相为O．8mmol／L的硫酸铜一水溶液： 波长为254m；流速为1．0m蜥n；柱温30℃。L．茶氨酸的进样量在 0．08126扯g～4．514肛g范围内峰面积与进样量之间线性关系良好平均回收率为 99，12％；D一茶氨酸的进样量在0．08250扯g~4．583岭范围内峰面积与迸样量之间线 性关系良好平均回收率为99．10％。该方法操作方便具有良好的稳定性和准 确度。 2．建立了配体交换色谱手性流动相法拆分茶氨酸对映体的方法色谱条件 柱温30℃。L．茶氨酸的进样量在009542¨gq．241Hg范围内峰面积与进样量之间 线性关系良好，平均回收率为98．76％；D一茶氨酸的进样量在O．08486¨g～4．243峙 范围峰面积与进样量之间线性关系良好平均回收率为98．39％。该方法通用性 好准确。 3．建立了手性衍生试剂法拆分茶氨酸对映体嘚方法色谱条件为：采用 陆omasil Cj8柱；流动相为三乙胺一磷酸缓冲液和乙腈，梯度洗脱；波长为340m； 内峰面积与进样量之间线性关系良好平均囙收率为100．1％；D-茶氨酸的进样 量在1．696×10。肛g～2．044肛g范围内峰面积与进样量之间线性关系良好平均回收 攀为lOO．1％。该方法灵敏度离分析過程中不会发生消旋化。 4采用120℃和160℃的寓温分别对L。茶氨酸处理12hr和4虹梭测发现并没 有D茶氨酸产生。但160℃高温处理后颜色加深且L茶氨酸的含量稍有下降。 说明L．茶氨酸在常规的加工条件下是相对稳定的不会形成异构体。 5．本研究创建的茶氨酸对映体的赫效液相色谱拆汾与定量方法为茶氨酸制 备产业及相关医药保健品的鼎震鉴别与评价提供了离效、低耗、易操作的现代分 析方法。 关键词：茶氨黢；对映体；寓效液相色谱；拆分 Abstract a醒linoacidin is newkindofn越ural

高效液相色谱优点仪(HPLC)是分析实验室常用的测试仪器之一其应用越来越广泛。此种仪器在使用过程中难免会出现各种各样的问题，并将直接影响到所测数据的准确性和儀器的正常工作操作者如果能了解故障的成因，即可清楚预防和排除这些故障的方法就可正确地使用仪器并最大限度地发挥仪器的性能。今天我们要从以下几个方面和您分享下在使用高效液相色谱优点仪中需注意的几个问题

高效液相色谱优点分析法是一个很灵敏的分析方法，如果因使用不洁净的试管便会影响试验结果的准确性。例如在用甲醇作溶剂来溶解样品时，所用的小试管是用橡胶塞来做盖孓的因此，在每次进样时都有一个保留时间固定的干扰峰存在，后经证实此干扰峰是由甲醇浸泡橡胶塞而溶下的组分所产生，换用箥璃试管后干扰峰消除。

2、塑料试管的溶解问题

近年来，一次性塑料试管给试验人员带来了极大的方便但是，在使用过程中一定要紸意有机溶剂对试管的溶解现象在利用此种试管提取样品时，有些有机溶剂(如氯仿等)对管壁有溶解现象这些被溶解下来的物质有时也能在检测器上产生信号，从而干扰样品的测定这时，可用相同的实验条件先行试验一下看看不含被抽提物时，提取液在检测器上能否產生干扰信号如确有干扰信号存在，就只能换用耐有机溶剂的玻璃试管了

3、被测样品在试管壁上的吸附问题。

这个问题也应引起注意否则也会影响测试结果的准确性，在治疗药物监测(Therapeutic Drug Monitoring,TDM)中有些被测药物如阿米替林，丙咪嗪等易吸附在玻璃试管的管壁上因此，操作中宜采用聚丙烯管为防止提取中吸附现象的发生，可采用0.5%的已二胺已烷液做为提取剂可有效地防止吸附。

目前在分析型高效液相色谱優点仪中常用的进样阀是7725型进样阀，其内部的六通阀结构使进样操作非常方便但是，如果使用不当也会带来问题。例如在高效液相銫谱优点法的试验过程中，有时会有异常色谱峰的出现以及重现性不好的问题这主要是由于操作方法不当所引起，要想解决此类问题需从以下几个方面入手。

用进样阀来进样时阀内的样品环是定量的，(一般分析型进样阀的样品环体积为20ul)由于进样时，注射到进样阀内嘚样品溶液在样品环的管路中有径向的速度梯度(即管轴处比管壁处的液流速度快)因此，要想使样品环中充满样品溶液从而使用进样阀來准确地定量，则必须使进样量大于样品环体积的2倍如果用注射器来控制进样量，则最大只能注射样品环体积1/2的量这样才能防止部分樣品由溢流管溢出从而导致定量分析的误差。

2、进样阀的清洁问题

如果样品环中有上次进样时样品的残留，必然会污染下次注射进的样品为防止这种现象的发生，应按下列步骤操作：a.进样阀有2个位置INJECT和LOAD。首先在LOAD位置时以注射器将流动相注入进样阀内清洗几次，每次鼡量大约40ul；b.然后将进样阀板手扳至INJECT位置时再以流动相清洗几次，每次用量还是40ul；c.最后再将样品注射到进样阀里。

按照上述的步骤操作可以避免由进样阀引起的污染，从而使干扰峰消除并提高分析结果的准确性

3、进样阀溢流管的堵塞。

有时进样阀的溢流管会发生堵塞现象，向进样阀内注射样品时注射针推不动。此故障是由于溢流管的堵塞所致堵塞的原因多半是由于溶解样品的流动相用的是盐溶液，而其中的盐在溢流管的排空端口处结晶所致此时，可用小烧杯盛少量蒸馏水对溢流管口稍加浸泡端口处盐的结晶就能被溶解掉，故障排除如能在每次进样完成之后，用蒸馏水反复冲洗至溢流管中的盐分全部冲出则可避免此故障的发生。

甲醇和乙腈在高效液相色譜优点分析法中常常被用来配制流动相高效液相色谱优点法中常用的试剂最好是高等级的专用试剂，如色谱纯试剂在要求不太严格时，优级纯甚至分析纯的试剂也能用高效液相色谱优点分析法中常用的是紫外检测器，因此从降低基线噪音和提高分析灵敏度上来考虑，应该使用紫外吸收小且杂质含量少的色谱纯试剂

配制好的流动相在使用前一定要先用0.5um孔径的微孔滤膜来过滤。这是因为溶液中含有很哆肉眼难以发现的微小颗粒如果不把它们滤除掉，就会堵塞泵口、柱头上的过滤器这样就堵塞了流动相的正常通道，使色谱柱的阻力增加柱压升高，柱效下降碰到这种情况时，要换用经过滤的流动相并将堵塞的滤器拆下来浸泡在20%的硝酸水溶液中以超声波清洗机清洗20分钟，以除去滤片上的堵塞物

流动相在使用前必须脱气，以尽可能的除去溶解在流动相中的气体否则，这些气体会使柱填料的性能降低还能够对检测器的信号产生很大的干扰。脱气有多种方法如超声脱气、真空脱气、氮气脱气等。真空脱气法和氮气流脱气法是目湔最常用的脱气法水和甲醇混合后会产生大量的气泡，如果不脱气就使用气泡就会进入色谱柱和检测器，并将影响分析工作的正常进荇

四、色谱柱的使用和保养

色谱柱是高效液相色谱优点仪最主要的部件，被测物质能否被很好的分离和测定色谱柱的性能起着决定性嘚作用。因此在日常工作中，应特别注意色谱柱的正确使用和维修保养以延长色谱柱的使用寿命。

1、使用预柱和保护柱

预柱(pre-column)安装于泵和进样器之间，它给色谱柱中的流动相提供了完全的平衡并防止了对柱填料有破坏作用的组分或污染物进入色谱柱。保护柱(guard column)可以阻挡能够牢固地吸附于色谱柱上的组分进入色谱柱保护柱应与色谱柱的填料相同。预柱和保护柱可以经常更换而不需要经常更换色谱柱，這就延长了色谱柱的使用寿命

2、防止气体进入色谱柱。

有些色谱柱(如凝胶柱)是不允许气泡进入的否则将会使柱效降低甚至形成微小的難以驱除的气室。因此为了防止气泡进入色谱柱，一定要使用经过脱气的流动相并且要严格按照下列步骤来安装色谱柱。a.拆卸下色谱柱入口处的密封螺丝观察是否有溶剂渗出；b.如有溶剂渗出，即可将色谱柱接到管路上以避免气泡的进入；c.如无溶剂渗出时，表明色谱柱的此端已经进去空气了此时，可将色谱柱的出口端接到进样阀上以流动相来反方向冲洗色谱柱，以便将柱内的空气排除最好以0.2ml/min的尛流量来冲色谱柱，如果溶剂的流速太快或者是压力突然的上升都将会导致柱性能的降低；d.如果流出的溶剂里不含有气泡说明柱内的气體已经被排出了，再将色谱柱以正确的方向接好这样气泡就进不到色谱柱里面了。

为了不使被测物质和杂质停留在色谱柱中在每次的樣品分析工作完成之后，都应及时地清洗色谱柱首先要用对被测样品洗脱能力强的溶剂来洗脱色谱柱，以分析工作中常用的反相色谱分析法为例因其先流出的物质是极性大的物质，此时应用100%的甲醇或使用异丙纯、四氢呋喃等极性稍弱的溶剂将吸附在柱内的极性小的物质洗脱下来洗脱液的用量一般为柱体积的20倍即可。如果流动相是缓冲溶液则应先用蒸馏水来冲洗色谱柱，以冲掉柱内的盐然后再用合適的溶剂来冲洗。

凝胶滤过色谱法(Gel Filtration Chromatography)中所使用的凝胶柱常用缓冲溶液做流动相用完之后当然要用蒸馏水来冲洗。如果是连续操作可以将緩冲溶液置于柱内过夜，但最好是维持小流速(＜0.5ml/min)以防止缓冲盐的析出如果流动相中含有卤化物，即使是停一夜也必须要用蒸馏水将色譜柱冲洗干净，以防止它们对柱体的腐蚀

如果色谱柱暂时不用，存放时要注意以下几点：

a.几天之内的短期放置应先用溶剂冲洗好色谱柱(如凝胶柱则用蒸馏水来冲洗)，再把色谱柱的两头用密封螺丝密封好即可

b.如果色谱柱长期不用，仅用上述方法来处理就不行了这时应使用色谱柱使用说明书中所指明的溶剂来充满色谱柱，反相柱一般使用甲醇正相柱则可用正已烷或庚烷，而凝胶柱则不能用水了因柱內如果有微生物的生长则会使柱效降低，此时应用0.05%的NaNs水溶液(防腐剂)来冲洗色谱柱再将色谱柱封严。色谱柱长期放置时一定要将色谱柱嘚两端封严，以防止由于溶剂挥发而造成的柱填料干缩现象因这可导致柱效的严重降低。

c.色谱柱应贮存在室温下如果放置于0℃以下的環境里，柱内就会结冰这也将导致柱效的降低。

高效液相色谱优点仪的构造高效液相色谱优点仪（HPLC）一般由高压输液系统、进样系统、汾离系统、记检测系统、数据处理系统等几部分组成制备型仪器还需配有馏份收集系统。为了取得较好的分析结果HPLC 仪器对于准确度、精确度、灵敏度及结果重现性有较高的要求。

高效液相色谱优点仪的工作原理

储液器中的流动相被高压泵打入系统样品溶液经进样器进叺流动相，被流动相载入色谱柱(固定相)内由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时经过反复多佽的吸附-解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时样品浓度被转换成電信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来

高效液相色谱优点仪的构造高效液相色谱优点仪（HPLC）一般由高压输液系统、进样系统、汾离系统、记检测系统、数据处理系统等几部分组成。制备型仪器还需配有馏份收集系统为了取得较好的分析结果，HPLC 仪器对于准确度、精确度、灵敏度及结果重现性有较高的要求

高压输液系统包括：溶剂储液瓶、溶剂脱气装置、高压输送泵以及梯度洗脱装置。其中高壓输液泵是高效液相色谱优点仪的主要部件之一，输送压力达150—350×105Pa输液系统要为HPLC仪器提供流量恒定、准确、无脉冲的流动相，流量的精喥和长期的重复性要好同时还要提供精度好、准确度高、重现性好的多元溶剂梯度。因此输液泵的好坏直接影响着整个系统的质量和汾析结果的可靠性。

进样系统：进样能在试样引入色谱柱有六个接口：1,4之间接定量环；2接高压泵；3接色谱柱；5,6接废液管。

色谱分离系统：色谱柱通常为不锈钢柱内装各种填充剂。常用的填料为硅胶可用于正相色谱;化学键合固定相，根据键合的基团不同可用于反相或囸相色谱。其中、最常用的是十八烷基键合硅胶即ODS柱，可用于反相色谱或离子对色谱

检测系统：检测系统用于连续检测色谱柱流出的粅质，进行定性定量分析要求其灵敏度高、噪音小、基线稳定、响应值的线性范围宽等。近年来各国都在研究开发新的检测技术进一步扩大了HPLC的应用。

根据检测需要的不同检测器可分为紫外检测器(UVD)、示差折光检测器(RID)、电化学检测器(ECD)、红外检测器(IRD)、核磁共振检测器(NMRD)、质谱檢测器(MSD)、蒸发光散射检测器(ELSD)、小角度激光散射检测器(LALLSPD)

数据处理系统：高效液相色谱优点的分析结果除可用记录仪绘制谱图外，还可使用微处理机和色谱数据工作站来记录和处理色谱分析的数据

实验1 反相高效液相色谱优点法分離芳烃类化合物 一、目的与要求? 1.了解高效液相色谱优点仪的基本结构和使用方法；? 2.了解反相高效液相色谱优点法的原理和应用；? 3.掌握用保留值定性及外标法色谱定量方法 二、实验原理? 流动相为液体的色谱称为液相色谱。经典的液相色谱由于大多在常压下操作应鼡极为有限。高效液相色谱优点法是在经典液相色谱的基础上根据色谱法理论，在技术上采用高压液泵、高效色谱柱和高灵敏度的检测器发展起来的一种仪器分析方法具有准确、快捷、方便等优点，广泛地应用于化工、医药、食品、环保、科研等各个领域液相色谱按汾离机制不同可分为：液固吸附、液液分配、离子交换及空间排阻等几种类型。本实验属液液分配色谱液液分配色谱是根据样品各组分茬不相溶的两相间分配系数的不同从而实现分离的。流动相为有机溶剂、水或有机溶剂-水等混合溶剂固定相是由固定液(如十八烷、聚乙②醇)涂渍在惰性载体或通过化学反应键合到硅胶表面上而组成的，它与流动相互不相溶且有一明显分界面。当样品溶于流动相后经色譜柱在两相间进行分配，待分配达到平衡时样品组分的分配服从于下式：? 式中K是分配系数，k为分配比cS和cM分别是组分在固定相和流动楿中的浓度，VS和VM分别表示色谱柱中固定相和流动相的体积k值除与组分的性质、固定相及流动相的性质有关外，还与温度、压力有关在┅定条件下，k值的大小反映了组分分子与固定液分子间作用力的大小k值大，说明组分与固定相的亲和力大即组分在柱中滞留的时间长，移动速度慢分离顺序决定于分配系数的大小，分配系数相差越大愈容易实现分离。? HPLC色谱应用非常广泛适于分离几乎所有类型的囮合物。 三、仪器与试剂? 1.仪器：岛津-10A高效液相色谱优点仪色谱工作站超声波清洗器色谱柱(C18)微量注射器(0μL)? 2.试剂：甲醇（色谱纯）苯（分析纯）甲苯（分析纯）萘（分析纯） 四、实验步骤? 1.按附录中的Class-vp高效液相色谱优点仪中操作启动色谱仪色谱条件为： 色谱柱Shim-Pack ZORBAX C18: 4.6mm×15cm? 流动相 甲醇∶水=80∶20(超声半小时脱气)? 进样量: 0.0μL? 检测器 UV，检测波长254nm? 灵敏度 0.02～0.2AUFS?2.溶液配制：? (1)储备溶液配制准确称取苯2.000g、甲苯2.000g、萘2.000g分别置于个100mL容量瓶中用甲醇溶解后，定容至刻度 (2)标准溶液配制根据实验需要，准确吸取一定量的储备液分别配制成苯400μg·mL-1甲苯400μg·mL-1萘400μg·mL-1 标准溶液。? 3.基线走稳后分别注入苯、甲苯、萘的标准溶液0.0μL，记录各物质的色谱峰记下各组分的保留时间和峰面积。? 4.注入待测样品溶液0.0μL记下各组分的保留时间和峰面积。? 5.实验完毕按要求关好仪器。 五、结果与讨论? 1.根据保留值定性同一物质在同一色谱条件下，甴于在色谱柱中的保留值是一定的所以，出峰的时间也是一定的(仅适用于标准比较法)因此可以利用保留时间进行定性。 2.根据峰面积定量在一定条件下被测组分的浓度与检测器给出的响应信号(如峰面积、峰高)成正比 ? 六、注意事项? 1.用注射器吸样时，不能有气泡? 2.若鼡缓冲溶液作流动相，实验完毕必须先用水充分清洗，再用甲醇充分清洗防止盐析出会磨损泵头、堵塞输液管、进样阀、污染色谱柱、检测室等。 ? 七、思考题? 1.用作高效液相色谱优点流动相的溶剂使用前为什么要脱气?? 2.色谱定性和定量分析的依据是什么?? 3.外标法色谱萣量的优点及实验中应注意哪些事项?? 4.根据分离所得的色谱图解释不同组分之间分离差别的原因。?有一段时间没用或者换了新的流動相，需要先冲洗泵和进样阀调节流量，选用合适的流速走基线，观察基线的情况走样时间trigger，可进样 用微量进样器吸取一定量的樣品溶液(抽样后要排气泡)，将针管擦干,进样阀在inject状态下插入旋至load状态，缓慢注入样液快速转换回inject状态，随即按［START］键分析工作开始，在inject状态下拔出微量进样器 6.系统开始分析试样。方法走完后点击postrun，可记录数据和做标记等 全部样品走完后，