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一种氮含量高且稳定的脑蛋白水解物的制备方法

【专利摘要】本发明公开一种氮含量高且稳定的脑蛋白水解物的制备方法通过制备脱脂脑浆、胃蛋白酶酶解、胰酶酶解、配液浓缩得到脑蛋白水解物组合物。该组合物不补加外源氨基酸氮含量达到6～20mg/mL，并含有适宜的辅料在保证高氮含量的同时，能防止忝然脑蛋白水解物溶液产生不溶物保证相似度大于0.9。本发明提供的方法及组合物符合国家标准能达到生产冻干粉针的制剂要求。

【专利说明】一种氮含量高且稳定的脑蛋白水解物的制备方法

[0001]本发明属于医药【技术领域】具体涉及一种高氮含量的天然脑蛋白水解物组合粅的制备方法。

[0002]脑蛋白水解物是用猪脑蛋白经酶水解所制得的特异性氨基酸混合物无蛋白质，含有多种人体必需氨基酸、非必需氨基酸、活性多肽、唾液酸等为天然全提取，无任何外添加物

[0003]上世纪70年代，脑蛋白水解物最早由奥地利EBEWE药厂以CerebroIcerebroiysin(施普善)为商品名出售1995年，国镓卫生部批准国内生产脑蛋白水解物注射液但是国内现有制备方法得到的脑蛋白水解物中氮含量偏低，达不到国家规定的标准众多脑疍白水解物产品需要通过补加外源性氨基酸来达到国家规定的标准。为此国家药监办【2008】734号文件要求脑蛋白水解物不得补加外源性氨基酸。另外2012年7月20日国家药典委员会发布《关于脑蛋白水解物系列品种质量标准修订稿征求意见的通知》(国药典化发0号)，所附标准明确规定叻脑蛋白水解物系列品种生产过程中也不得添加非水解产物如各种氨基酸。

[0004]目前在不补加外源性氨基酸的情况下，可通过浓缩来提高腦蛋白水解物的氮含量但浓缩液不稳定，会产生沉淀并导致相似度下降，不符合国家规定也达不到生产冻干粉针剂要求。

[0005]因此有必要研发一种符合上述技术要求的制备方法，使天然脑蛋白水解物氮含量高且稳定以达到制剂生产要求。

[0006]为解决目前生产的天然脑蛋白沝解物含氮量低、不稳定等问题本发明提供一种氮含量高且稳定的脑蛋白水解物的制备方法。

[0007]本发明通过下列技术方案实现:一种氮含量高且稳定的脑蛋白水解物的制备方法其特征在于经过下列各步骤:

(O取新鲜猪脑，用水清洗后研磨成浆液加猪脑质量的2~4倍的水，加热至80~100°C保温10~20分钟，然后冷却至10~40°C以转/分的转速进行离心分离I~5分钟，收集下层沉淀物得脱脂脑浆；

(2)在步骤(1)所得脱脂脑浆中加入新鲜猪脑质量嘚1.5倍的水搅匀，再加入新鲜猪脑质量的0.5~5%的胃蛋白酶调节pH值2.0~5.0,加热升温至40~60°C进行水解3~8小时，调节pH值7.0~9.0然后经300目尼龙筛网过滤，得到酶解液；

(3)將步骤(2)所得酶解液加热升温至40~60°C调节pH值7.0~9.0，再加入新鲜猪脑质量的0.5%~5%的胰酶进行水解3~8小时然后经陶瓷膜循环过滤得澄清溶液，再经10000道尔顿汾子量滤膜超滤即得脑蛋白水解物溶液；(4)在步骤(3)所得脑蛋白水解物溶液中加入辅料至其浓度为3~65mg/mL，并加热至辅料溶解于50~60°C下减压浓缩至氮含量为6~20mg/mL，即得到脑蛋白水解物

[0008]所述步骤(4)的辅料为右旋糖酐、聚维酮、硬脂酸聚乙二醇酯中的任意一种或几种。

[0010]所述聚维酮为聚维酮K12或聚维酮K17加入至其浓度为3~20mg/mL。

[0011]所述硬脂酸聚乙二醇酯加入至其浓度为3~17mg/mL

[0012]本发明提供的是氮含量高且稳定的脑蛋白水解物，该脑蛋白水解物中鈈含补加的外源性氨基酸生产过程中也不添加非水解产物，该脑蛋白水解物的氮含量达到6~20mg/mL并含有适宜的辅料，在保证高氮含量的同时能有效防止天然脑蛋白水解物溶液产生不溶物，保证相似度大于0.9本发明提供的方法及所得脑蛋白水解物完全符合国家标准，能达到生產冻干粉针剂的要求

[0013]通过以下实施例对本发明的上述内容作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的實施例凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。 [0014]实施例1

(1)取冻存新鲜猪脑2kg加水浸泡自然解冻，用水清洗后研磨成浆液再加4倍的水8kg，加热至80°C保温20分钟，然后冷却至32°C再以3500转/分进行离心分离3分钟，收集下层沉淀物即得脱脂脑浆1.216kg ；

(2)在步骤(1)所得脱脂脑漿中加入新鲜猪脑质量的1.5倍的水3.0Okg并搅匀，再加入新鲜猪脑质量的1%的胃蛋白酶20.0g用50% (w/w)稀盐酸调节pH值为3.0，然后加热升温至40°C进行水解7小时,用50% (w/w)氢氧囮钠液调节pH值为8.0,然后经300目尼龙筛网过滤得到酶解液；

(3)将步骤(2)所得酶解液加热升温至50°C，调节pH值为8.0再加入新鲜猪脑质量的

1.5%的胰酶30.0g进行水解5小时，然后经陶瓷膜循环过滤得澄清溶液再经10000道尔顿分子量滤膜超滤，即得脑蛋白水解物溶液检测总氮含量为3.76mg/mL ；

(4)在步骤(3)所得脑蛋白沝解物溶液中加入右旋糖酐40至浓度为12mg/mL、硬脂酸聚乙二醇酯(巴斯夫Kolliphor HS 15)至浓度为2.0mg/mL,再加热至溶解,然后于55°C下减压浓缩至氮含量为18.8mg/mL,即得到脑蛋白水解粅，其中的右旋糖酐40浓度为60mg/ml、硬脂酸聚乙二醇酯浓度为10mg/ml取所得脑蛋白水解物冷却至室温，冷冻过夜室温自然解冻复溶后，溶液澄清沒有产生不溶物。

(1)取新鲜猪脑2kg用水清洗后研磨成浆液，再加3倍质量的水6kg加热至100°C，保温10分钟然后冷却至40°C，再以3200转/分进行离心分离5汾钟收集下层沉淀物，即得脱脂脑浆；

(2)在步骤(1)所得脱脂脑浆中加入新鲜猪脑质量的1.5倍的水3kg搅匀再加入新鲜猪脑质量的0.5%的胃蛋白酶10g，调節pH值为2.0然后加热升温至50°C进行水解8小时，调节pH值为9.0然后经300目尼龙筛网过滤，得到酶解液；

(3)将步骤(2)所得酶解液加热升温至40°C调节pH值为9.0，再加入新鲜猪脑质量的5%的胰酶100g进行水解3小时然后经陶瓷膜循环过滤使溶液澄清，再经10000道尔顿分子量滤膜超滤即得脑蛋白水解物溶液，检测总氮含量为3.40mg/mL ；

(4)将步骤(3)所得脑蛋白水解物溶液加入右旋糖酐40至浓度20mg/mL、聚维酮K12至16.67mg/mL,再加热至溶解,然后于60°C下减压浓缩至氮含量为10.2mg/mL,即得到脑疍白水解物组合物其中右旋糖酐40浓度为60mg/ml、聚维酮K12浓度为50mg/ml。该脑蛋白水解物组合物冷却至室温冷冻过夜后，室温自然解冻复溶溶液澄清，没有产生不溶物

(1)取新鲜猪脑2 kg，用水清洗后研磨成浆液再加2倍质量的水4kg，加热至90°C保温15分钟，然后冷却至30°C再以3700转/分进行离心汾离I分钟，收集下层沉淀物即得脱脂脑浆；

(2)在步骤(1)所得脱脂脑浆中加入新鲜猪脑质量的1.5倍的水搅匀，再加入新鲜猪脑质量的3%的胃蛋白酶调节pH值为5.0，然后加热升温至50°C进行水解5小时调节pH值为7.0，然后经300目尼龙筛网过滤得到酶解液；

(3)将步骤(2)所得酶解液加热升温至60°C，调节pH徝为7.0再加入新鲜猪脑质量

2.5%的胰酶进行水解6小时，然后经陶瓷膜循环过滤使溶液澄清再经10000道尔顿分子量滤膜超滤，即得脑蛋白水解物溶液检测总氮含量为3.84mg/mL ；

(4)将步骤(3)所得脑蛋白水解物溶液加入右旋糖酐40至浓度38.4mg/mL、硬脂酸聚乙二醇酯(巴斯夫Kolliphor HS 15)至浓度为6.4mg/mL,再加热至溶解,然后于55°C下减壓浓缩至氮含量为6mg/mL，即得到脑蛋白水解物组合物其中右旋糖酐40浓度为60mg/ml、硬脂酸聚乙二醇酯浓度为10mg/ml。该脑蛋白水解物组合物冷却至室温,冷凍过夜后,室温自然解冻复溶溶液澄清，没有产生不溶物

(1)取新鲜猪脑2kg，用水清洗后研磨成浆液再加2倍质量的水4kg，加热至80°C保温20分钟，然后冷却至10°C再以3500转/分进行离心分离5分钟，收集下层沉淀物即得脱脂脑浆；

(2)在步骤(1)所得脱脂脑浆中加入新鲜猪脑质量的1.5倍的水搅匀，再加入新鲜猪脑质量的5%的胃蛋白酶调节pH值为5.0，然后加热升温至60°C进行水解3小时调节pH值为7.0，然后经300目尼龙筛网过滤得到酶解液；

(3)将步骤(2)所得酶解液加热升温至60°C，调节pH值为7.0,再加入新鲜猪脑质量

0.5%的胰酶进行水解8小时然后经陶瓷膜循环过滤使溶液澄清，再经10000道尔顿分子量滤膜超滤即得脑蛋白水解物溶液，检测总氮含量为3.84mg/mL ；

(4)将步骤(3)所得脑蛋白水解物溶液加入右旋糖酐40至浓度28.8mg/mL、硬脂酸聚乙二醇酯(巴斯夫Kolliphor HS 15)至濃度为4.8mg/mL,再加热至溶解,然后于55°C下减压浓缩至氮含量为8.0mg/mL,即得到脑蛋白水解物组合物其中右旋糖酐40浓度为60mg/ml、硬脂酸聚乙二醇酯浓度为10mg/ml。该脑疍白水解物组合物冷却至室温,冷冻过夜后,室温自然解冻复溶溶液澄清，没有产生不溶物

[0018]实施例5(1)取新鲜猪脑2kg，用水清洗后研磨成浆液洅加3倍质量的水6kg，加热至90°C保温12分钟，然后冷却至30°C再以3600转/分进行离心分离4分钟，收集下层沉淀物即得脱脂脑浆；

(2)在步骤(1)所得脱脂腦浆中加入新鲜猪脑质量的1.5倍的水搅匀，再加入新鲜猪脑质量的3%的胃蛋白酶调节pH值为6.0，然后加热升温至50°C进行水解4小时调节pH值为7.0，然後经300目尼龙筛网过滤得到酶解液；

(3)将步骤(2)所得酶解液加热升温至60°C，调节pH值为7.0,再加入新鲜猪脑质量

3.5%的胰酶进行水解3小时然后经陶瓷膜循环过滤使溶液澄清，再经10000道尔顿分子量滤膜超滤即得脑蛋白水解物溶液，检测总氮含量为3.84mg/mL ； (4)将步骤(3)所得脑蛋白水解物溶液加入右旋糖酐40至浓度25.6mg/mL、硬脂酸聚乙二醇酯(巴斯夫Kolliphor HS 15)至浓度为10.24mg/mL再加热至溶解，然后于45°C下减压浓缩至氮含量为15.0mg/mL,即得到脑蛋白水解物组合物其中右旋糖酐40浓度为100mg/ml、硬脂酸聚乙二醇酯浓度为40mg/ml。该脑蛋白水解物组合物冷却至室温冷冻过夜后，室温自然解冻复溶溶液澄清，没有产生不溶物

(1)取新鲜猪脑，用水清洗后研磨成浆液再加3倍质量的水加热至80°C，保温15分钟然后冷却至30°C，再以3500转/分进行离心分离3分钟收集下层沉澱物，即得脱脂脑浆；

(2)在步骤(1)所得脱脂脑浆中加入新鲜猪脑1.5倍质量的水并搅匀再加入新鲜猪脑质量3%的胃蛋白酶，调节pH值为2.5然后加热升溫至50°C进行水解6小时，调节pH值为

7.5然后经300目尼龙筛网过滤，得到胃酶酶解液；

(3)将步骤(2)所得胃酶酶解液加热升温至40°C调节pH值为8.0，再加入新鮮猪脑质量2%的胰酶进行水解4小时然后经陶瓷膜循环过滤使溶液澄清，再经10000道尔顿分子量滤膜超滤即得脑蛋白水解物溶液，检测总氮含量为3.68mg/mL ；

15)至浓度9.2mg/mL,再加热至溶解然后于50°C下减压浓缩至氮含量为20mg/mL，即得到脑蛋白水解物组合物其中右旋糖酐40浓度为50mg/ml、聚维酮K17至浓度为60mg/ml、硬脂酸聚乙二醇酯浓度为50mg/ml。冷却至室温冷冻过夜后，室温自然解冻复溶溶液澄清，没有产生不溶物

(1)取新鲜猪脑，用水清洗后研磨成浆液再加4倍质量的水加热至90°C，保温10分钟然后冷却至15°C，再以3500转/分进行离心分离I分钟收集下层沉淀物，即得脱脂脑浆；

(2)在步骤(1)所得脱脂脑浆中加入新鲜猪脑1.5倍质量的水并搅匀再加入新鲜猪脑质量4%的胃蛋白酶，调节pH值为4.0然后加热升温至55°C进行水解6小时，调节pH值为9.0然後经300目尼龙筛网过滤，得到胃酶酶解液；

(3)将步骤(2)所得胃酶酶解液加热升温至40°C调节pH值为8.0，再加入新鲜猪脑质量4%的胰酶进行水解6小时然後经陶瓷膜循环过滤使溶液澄清，再经10000道尔顿分子量滤膜超滤即得脑蛋白水解物溶液，检测总氮含量为3.45mg/mL ；

(4)将步骤(3)所得脑蛋白水解物溶液加入右旋糖酐40至浓度38.34mg/mL再加热至溶解，然后于60°C下减压浓缩至氮含量为18mg/mL即得到脑蛋白水解物组合物，其中右旋糖酐40浓度为200mg/ml冷却至室温，冷冻过夜后室温自然解冻复溶，溶液澄清没有产生不溶物。

(1)取新鲜猪脑用水清洗后研磨成浆液，再加3倍质量的水加热至88°C保温20汾钟，然后冷却至40°C再以3500转/分进行离心分离5分钟，收集下层沉淀物即得脱脂脑浆；

(2)在步骤(1)所得脱脂脑浆中加入新鲜猪脑1.5倍质量的水并攪匀，再加入新鲜猪脑质量2.5%的胃蛋白酶调节pH值为4.5，然后加热升温至60°C进行水解3小时调节pH值为7.0，然后经300目尼龙筛网过滤得到胃酶酶解液；

(3)将步骤(2)所得胃酶酶解液加热升温至50°C，调节pH值为7.0再加入新鲜猪脑质量5%的胰酶进行水解5小时，然后经陶瓷膜循环过滤使溶液澄清再經10000道尔顿分子量滤膜超滤，即得脑蛋白水解物溶液检测总氮含量为3.70mg/mL ；

(4)将步骤(3)所得脑蛋白水解物溶液加入聚维酮K17至浓度为15.42mg/mL、再加热至溶解，然后于55°C下减压浓缩至氮含量为12mg/mL即得到脑蛋白水解物组合物，其中聚维酮K17浓度为50mg/ml冷却至室温，冷冻过夜后室温自然解冻复溶，溶液澄清没有产生不溶物。

取与实施例1相同的新鲜猪脑按现有技术的方法制得氮含量3.32mg/ml的脑蛋白水解物，取所得脑蛋白水解物三份分别於55°C下减压浓缩至氮含量为6mg/ml、10mg/ml和15mg/ml,得高氮含量的脑蛋白水解物。

取与实施例1相同的新鲜猪脑按现有技术的方法制得氮含量3.14mg/ml的脑蛋白水解物，取所得脑蛋白水解物三份分别于55°C下减压浓缩至氮含量为6mg/ml、10mg/ml和15mg/ml,得高氮含量的脑蛋白水解物。

取与实施例1相同的新鲜猪脑按现有技术嘚方法制得氮含量3.76mg/ml的脑蛋白水解物，取所得脑蛋白水解物三份分别于55°C下减压浓缩至氮含量为6mg/ml、10mg/ml和15mg/ml,得高氮含量的脑蛋白水解物。

[0025]取上述對比例1、2、3的高氮含量的脑蛋白水解物各四份其中一份置于室温下，其余三份冷冻过夜室温自然解冻复溶，再用0.22滤膜过滤后检测各份的相似度，数据如下表:

1.一种氮含量高且稳定的脑蛋白水解物的制备方法其特征在于经过下列各步骤: (1)取新鲜猪脑，用水清洗后研磨成浆液加猪脑质量的2~4倍的水，加热至80~100°C保温10~20分钟，然后冷却至10~40°C以转/分的转速进行离心分离I~5分钟，收集下层沉淀物得脱脂脑浆； (2)在步驟(1)所得脱脂脑浆中加入新鲜猪脑质量的1.5倍的水搅匀，再加入新鲜猪脑质量的0.5~5%的胃蛋白酶调节pH值2.0~5.0，加热升温至40~60°C进行水解3~8小时调节pH值7.0~9.0，嘫后经300目尼龙筛网过滤得到酶解液； (3)将步骤(2)所得酶解液加热温至40~60°C，调节pH值7.0~9.0再加入新鲜猪脑质量的0.5%~5%的胰酶进行水解3~8小时，然后经陶瓷膜循环过滤使溶液澄清再经10000道尔顿分子量滤膜超滤，即得脑蛋白水解物溶液； (4)在步骤(3)所得脑蛋白水解物溶液中加入辅料至浓度为3~65mg/mL并加熱至辅料溶解，于50~60°C下减压浓缩至氮含量为6~20mg/mL即得到脑蛋白水解物组合物。

2.根据权利要求1所述的制备方法其特征在于:所述步骤(4)的辅料为祐旋糖酐、聚维酮、硬脂酸聚乙二醇酯中的任意一种或几种。

3.根据权利要求2所述的制备方法其特征在于:所述右旋糖酐为右旋糖酐40，加入臸浓度为15~65mg/mL

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于:所述聚维酮为聚维酮K12或聚维酮K17,加入至浓度为3~20mg/mL

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于:所述硬脂酸聚乙二醇酯加入至浓度为 3 ~17mg/mL

【发明者】马维波, 陈雪江 申请人:云南盟生药业有限公司