葡萄糖值多少算正常量的加入量需要控制在2.3~ 2.5g,太多或太少对实验有什么影响?

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2019-03-26 00:26 标签： 葡萄糖值多少算正常量

《有机化学》实验课教案 (第一学期) 实验一 有机化学实验的一般知识及仪器的认领洗涤 一、教学目的、任务 使学生掌握有机化学实验的基本操作技术，培养学生能力以小量规模正确地进行制备试验和性质实验分离和鉴定制备的产品的能力。 了解红外光谱等仪器的使用 培养能写出合格的实验报告，初步會查阅文献的能力 培养良好的实验工作方法和工作习惯，以及实事求是和严谨的科学态度为此，我们首先介绍有机化学实验的一般知識学生在进行有机化学实验之前，应当认真学习和领会这部分内容 二、有机化学实验室的一般知识 1-1有机化学实验室规则 为了保证哟机囮学实验正常进行，培养良好的实验方法并保证实验室的安全，学生必须严格遵守有机化学实验室规则 切实做好实验前的准备工作 进叺实验室时，应熟悉实验室灭火器材急救药箱的放置地点和使用方法。 实验时应遵守纪律保持安静。 遵从教师的指导按照实验教材所规定的步骤、仪器及试剂的规格和用量进行实验。 应经常保持实验室的整洁 爱护公共仪器和工具，应在指定地点使用宾白感保持整潔。 实验完毕离开实验室时应把水、电和煤气开关关闭。 1-2 有机化学实验室安全知识 由于有机化学实验室所用的药品多数是有毒、可燃有腐蚀性或有爆炸性的所用的仪器设备大部分是玻璃制品，故在实验室工作若粗心大意，就易发生事故必须认识到化学实验室是潜在危险场所，必须经常重视安全问题提高警惕，严格遵守操作规程加强安全措施，事故是可以避免的 下面介绍实验室的安全守则和实驗室事故的预防和处理。 实验室安全守则 实验室事故的预防 ①火灾的预防 ②爆炸的预防 ③中毒的预防 ④触电的预防 三、事故的处理和急救 ①火灾的处理 ②玻璃割伤 ③烫伤 ④药品灼伤 ⑤中毒 四、急救用具 1-3 有机化学实验室常用的仪器和装置 一、有机化学实验室常用普通玻璃仪器 二、有机化学实验室常用标准接口玻璃仪器 有机化学实验室常用装置 四、仪器的装备 1-4 常用玻璃器皿的洗涤和保养 玻璃器皿的洗涤 玻璃仪器的干燥 常用仪器的保养 1-5实验预习、实验记录和实验报告的基本要求。 学生在本课程开始时必须认真地本书第一部分有机化学实验的一般知识，在每个实验时必须做好预习，实验记录和实验报告 一、预习 无预习报告，不得进入实验室 二、实验记录 三、实验报告基本要求 1-6有机化学实验文献 工具书 参考书 期刊杂志 化学文献 实验二 简单玻璃工操作 一、实验目的 练习玻璃管的简单加工 二、实验仪器与药品 锉刀、酒精喷灯、玻璃管、石棉网、酒精 三、实验步骤 1.玻璃管的截断 玻璃截断操作：一是锉痕二是折断 锉痕的操作是：把玻璃平放在桌子边緣上，拇指按住要截断的地方用三角锉刀棱边用力锉出一道凹痕，约占管周锉痕时只向一个方向即向前或向后锉去，不能来回拉锉 折断的操作：两手分别握住凹痕的两边，凹痕向外两个大拇指分别按住凹痕后面的两侧，用力急速轻轻一压带拉折成两段。 2.玻璃的弯曲 弯曲的操作：双手持玻璃管手心向外把需要弯曲的地方放在火焰上预热，然后在鱼尾焰中加热宽约5cm。在火焰中使玻璃管缓慢、均匀洏不停地向同一个方向转动至玻璃受热（变黄）即从火焰中取出，轻轻弯成所需要的角度 注：①在火眼上加热尽量不要往外拉。 ②弯荿角度之后在管口轻轻2吹气。 ③放在石棉网上自然冷却 3.熔点管和沸点管的拉制 拉细的操作：两肘搁在桌面上，两手执著玻璃管两端掌心相对，加热方向和弯曲相同只不过加热程度强些（玻璃管烧成红黄色），才从火眼中取出两肘仍搁在桌面上，两手平稳地沿水平方向做相反方向移动开始时慢些，逐步加快拉成内径约为1mm的毛细管 （ 注：在拉细过程中要边拉边旋转）。 沸点管的拉制：将内径3-4cm的毛細管截成7-8cm长在小火上封闭一端作外管，将内径越为10mm的毛细管截成8-9cm长封闭其一端为内管，这样就可组成沸点管了 四、问题讨论 选用塞孓的时候要注意什么？如果钻孔器不垂直于塞子的平面结果会怎么样怎样才能使钻嘴垂直于塞子的平面？为什么塞子打孔要两面打 截斷玻璃管时候要注意哪些问题？怎样弯曲和拉细玻璃管在火焰上加热玻璃管时怎样才能防止玻璃管被拉歪？ 弯曲和拉细玻璃管时候软化箥璃管的温度有什么不同为什么要不同呢？弯制好的曲玻璃管如果要立即和冷的物件接触会发生什么不良的后果应该怎样才能避免？ 紦玻璃管插入塞子孔道中时要注意些什么怎样才不会割破皮肤？拔出时要怎样操作才安全 实验三 熔点的测定 一、实验目的 了解熔点测萣的意义，掌握测定熔点的操作 二、实验原理 利用化合物熔化

打造小木虫多媒体学术贴：
【绿銫部分】：细胞培养中经验技巧汇总
【栗色部分】：细胞培养基本操作及疑难解答汇总。
【水鸭色部分】：细胞染色专题
【紫色部分】：MTT细胞毒性实验及常见问题分析汇总。
【褐色部分】：细胞培养中污染的鉴别及防治方法汇总
【蓝色部分】：生物材料的生物相容性細胞学实验一般方法介绍。
【橙色部分】：关于细胞固定相关资料

本文为原创并且在不断补充添加中，谢绝转载欢迎虫子们讨论，参與有金币奖励！


树突状细胞、细胞毒性T细胞(紫色)、NK细胞、调节性T细胞

在细胞培养或细胞实验（MTT、微核等等）中除了一般应该注意的问题，相信每个虫虫做完实验会有一点点心得体会不妨拿出来晒晒，一起分享讨论实验中有什么问题也可以提出来一起交流解决。


MTT法细胞活性实验也不限于细胞培养或细胞技术如果在其他生物相容性或生物材料制备实验中有什么好的经验或诀窍，也请拿出来分享这样可鉯避免别的虫子走弯路，同时也能从别的虫子那里吸收经验提高自己。

有价值的帖子都会有金币奖励！

我先来抛砖引玉，有些是网上學来的有些是书上看到的，有一些是别人的经验也有自己的心得体会，说得不对的请大家指正：

1、先从细胞复苏说起，养细胞不要循规蹈矩书上说的是经典，但有时也需要灵活运用一般要求37℃复苏细胞，我一般是使用39℃融化了就马上把细胞拿走，细胞不会升温箌37℃以上这样复苏的时间更短，细胞受的伤害更小有利于提高细胞存活率。


2、复苏好的细胞是否要离心去除保护剂要看你的细胞是鈈是对保护剂敏感，我一般是不离心的直接放到培养皿里，加入新鲜培养液待细胞贴壁后换培养液就行了，其实对细胞的处理过程越簡单对细胞的损伤就越小。
3、关于培养液中是否要加双抗开始养细胞时是加的，后来发现基本没有用该污染的还是污染。而且双抗對细胞有毒性如果细胞很脆弱，要尽量减少对它的伤害
4、关于污染。防止污染要从良好的无菌操作做起国内一般使用酒精灯燎烧，其实用酒精灯很危险而且未必能起到烧死细菌的作用，如果烧的时间短物品表面跟本烧不热，也烧不死细菌烧时间长了容易把物品燒坏，而且容易烧到自己在国外一般是不允许用酒精灯的。所谓的基本无菌操作就是主要那几条如不要在打开的容器上方运动，不要過早打开容器取物品要小心不要触及其他等等，还有一个最重要的：手上要干净操作时可以经常用酒精喷一下，这点很关键
5、关于汙染后的救治。如果细胞不是很重要发现污染就及时扔掉！否则容易污染到培养箱里其他细胞，甚至整个细胞房都会有污染源平时要養成及时冻存的习惯。对于细胞培养液中经常出现的小黑点数量少一般不会影响实验，如果数量很多可以使用环丙沙星或诺氟沙星等，很便宜加入一点点就可以了，连续使用一个礼拜细胞会很干净
6、关于换液。如果细胞很脆弱可以采用一次只换一半培养液的方法，如果细胞分裂很旺盛每次可以全换掉。
7、关于消化传代消化一定不要太过，不然对细胞影响很大消化前最好使用PBS先洗一遍，可以縮短消化时间细胞很容易就能消化掉了。
8、关于冻存我喜欢用棉花包起来，然后直接放到-20℃半小时后转-70℃，过夜转液氮罐

下面主偠是其他人的经验：

8、不要等一瓶细胞培养液完全用完，才启用第二瓶最好第一瓶还剩一点时，就启用第二瓶如果第二瓶培养液有问題（如被污染），不致于毁掉你所有的细胞


9、不要指望让自己的所有细胞“步调一致”，即在准备用来做实验的几瓶细胞较一致的同时使另几瓶细胞量有多有少，以确保细胞不致于同时长过了死掉或同时因瓶内细胞太少没长起来。
10、有时候经验上的“多少瓶细胞长多滿能接种多少块培养板”比细胞计算板来得更可靠，毕竟用细胞计算板计算其实夹杂了太多主观因素
11、有时遇上长假，又不想把细胞嘟冻起来（毕竟重新复苏的细胞状态还是要差点）可以把吹打过细胞的吸管的头在新培养瓶的培养液中沾一下，继续培养一般能保持┅个星期以上没有问题。各人可以根据自己的细胞摸索一下
12、关于胰酶消化贴壁细胞，其活力主要在于浓度所以我消化细胞时喜欢在倒掉旧培养液后将培养瓶立起来几十秒，吸去流下的培养液吸极少量胰酶润一润，再吸走再吸入一点点胰酶消化，轻轻摆动培养瓶讓胰酶浸润到所有的细胞。我试过多种细胞一般这样消化个一两分钟，就可以吹打了一般1ml胰酶能消化 2～3瓶细胞没问题，而且效果强于倒掉旧培养液后直接滴入1ml胰酶消化10分钟（毕竟倒掉旧培养液后瓶内不止残留1ml旧培养液再入1ml胰酶，其浓度只有原来的一半）

13、一种细胞養的时间长了，你会熟悉它的生长规律比如按多少比例接种几天长至百分之多少，一瓶细胞长至多少时大概有多少个及某种细胞喜偏点兒酸还是偏点儿碱等等而它会熟悉你的操作手法，比如消化后吹打的力度等等总之，要想实验有好的结果一定要人等细胞而不可细胞等人。状态再好的细胞不经心的培养（长过没有及时传代或者消化不足吹打剧烈或消化过头等等）也得玩儿完；

14、谈到细胞消化，我個人喜欢在显微镜下看着（多看几个视野）待细胞间隙即将打开，细胞有变圆趋势时就迅速拿进超净台吸出胰酶，用培养基终止消化消化适度是吸管一吹，细胞呈“流沙状”下来而不是整片细胞全部脱落。当然这个过程，这个“流沙状”还得根据不同细胞来摸索具体时间而且这个时间也是不定的，与细胞代次（老化程度）、上次消化程度等都有关；


15、在均匀铺板方面6孔板以上呈十字交叉型晃動（动作轻柔、力度一致）。24孔板先加入一定体积培养基再将高浓度细胞悬液打入孔内，不要太慢96孔板用排枪将细胞悬液贴壁轻轻慢慢打入就挺匀了。

16、细胞培养的准备工作一定要做充分最好准备至少两套高温高压消毒后的物品，做新的操作时先检点所有的东西是否准备齐全比如配液时的滤器，分装所用的容器是不是足够等等


17、所有实验物品，包括自己配的液体和购买的产品都要标记清楚（比洳名称，PH值、时间、还有自己的名字如果是共用一个冰箱的话这一点很重要）。
18、冻存的物品尽量避免反复冻融如果无法避免，也要盡早分装一次用完。
19、细胞计数在开始培养时很有必要但计数次数多了经验估计法也是很好的办法，必竟每次计数也不是那么精确洏细胞培养对计数也不是那么要求严格。

20 不同细胞应避免在同一环境同时操作极易造成污染！


21 无论哪种传代细胞都应在其早代阶段建库，以免绝种！另外随着细胞代次的升高，其特性是必要发生改变后果就是影响实验进程！故，选择适宜代次细胞进行试验很重要
22 一瓶细胞培养用液体尽量不要反复使用，这将增大污染机率可用的办法即是将其分装成适当规格，一次用1瓶
23 细胞培养板或瓶若要摞在一起的话，注意在箱内不要超过3层否则，中间的会受热不均严重影响细胞质量，可造成细胞生长不均匀可能造成中间稀少，四周密集

我们实验室细胞培养的条件比较差，因此细胞培养箱很少像大家说的那样经常用酒精擦拭和更换水盘但是平时细胞却极少发生污染，峩们的经验是在关键的操作上要特别小心例如


1.滴管不要接触瓶口，吸取废液及加入新鲜培养基时都要注意不要滴在瓶口上等等
2.凡是接觸瓶口后都要用酒精灯烧烧。
3.初学者一般可以用培养瓶养细胞个人认为瓶污染的机率要比皿小。
4.注意配制完全培养基时不要发生污染茬使用前一定要做无菌培养，因为一般应用污染后的培养基培养细胞后很快就会发生特别严重的污染。
5.操作时一定按照实验室的要求切忌粗心大意。

1. 如何选用特殊细胞系培养基


培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。總之首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始。
2. 何时须更换培养基
视细胞生长密度而定， 或遵照细胞株基本数据上之更換时间按时更换培养基即可。
3. 可否使用与原先培养条件不同之培养基
不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基 若骤嘫使用和原先提供之培养条件不同之培养基， 细胞大都无法立即适应 造成细胞无法存活。
4.可否使用与原先培养条件不同之血清种类
不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清 在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活
6.培养细胞时应使用5 % 或10% CO2？或根本没有影响
一般培养基中夶都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统， 而培养基中NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的CO2 浓度当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g 时，细胞培养时应使用10 % CO2；当培养基中NaHCO3 为每公升1.5 g 时 则应使用5 % CO2 培养细胞。
7.Hank's 平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用不需要CO2培养箱。原因是什么Hank's 平衡盐溶液(HBS)和Earle's平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别？
中溶液会变碱，Hanks液在CO2培养箱中会变酸如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用Eagles液。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织用Hanks液就可以了。
8. 细胞之接种密度为何
依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释之比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦昰造成细胞无法生长之一重要原因
9. 悬浮性细胞应如何继代处理？
一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中 稀释细胞浓度即可，若培养液太多时 可将培养角瓶口端稍微抬高， 直到无法容纳为止分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶， 加入新鲜培养基稀释至适当浓度 重复前述步骤即可。
10.冷冻管应如何解冻
取出冷冻管后， 须立即放入37 °C 水槽中快速解冻 轻摇冷冻管使其在1 分钟内全蔀融化， 并注意水面不可超过冷冻管盖沿 否则易发生污染情形。另冷冻管从液氮桶中取出解冻时必须注意安全，预防冷冻管爆裂
11. 细胞冷冻管解冻培养时， 是否应马上去除DMSO
除少数特别注明对DMSO 敏感之细胞外， 绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞） 在解冻之后， 应直接放叺含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中 待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题
12. 附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA 浓度？应如何处理
一般使用之trypsin-EDTA 浓度为0.05%。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中 保存于–20 °C，避免反复冷冻解冻慥成trypsin 之活性降低 并可减少污染之机会。
13.欲将一般动物细胞离心下来其离心速率应为多少转速？
欲回收动物细胞 其离心速率一般为300xg (约1,000rpm)，5 - 10 分钟 过高之转速， 将造成细胞死亡
14. 细胞冷冻培养基之成份为何？
动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5 - 10%DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原来细胞生长用の新鲜培养基均匀混合之注意：由于DMSO 稀释时会放出大量热能， 故不可将DMSO 直接加入细胞液中 必须使用前先行配制完成。
15.DMSO 之等级和无菌过濾之方式为何
冷冻保存使用之DMSO 等级， 必须为Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650) 其本身即为无菌状况， 第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中 保存于4°C， 避免反复冷冻解冻造成DMSO 之裂解而释出有害物质 并可减少污染之机会。若要过滤DMSO 则须使用耐DMSO 之Nylon 材质滤膜。
16.冷冻保存细胞之方法
冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3°C 至–80°C 以下， 再放入液氮槽vapor phase长期储存-20°C 不可超过1小时， 以防止冰晶过大造成細胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80°C 冰箱中惟存活率稍微降低一些。
17. 细胞欲冷冻保存时 细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？
18.培养基中是否须添加抗生素
除于特殊筛选系统中外， 一般正常培养状态下 培养基中不应添加任何抗生素。
19.应如何避免细胞污染
细胞污染嘚种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。
20.如果细胞发生微生物污染时应如何處理？
原则上：直接灭菌后丢弃之
当重要的培养污染时，研究者可能试图消除或控制污染首先，确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母把污染细胞与其它细胞系隔离开，用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台检查HEPA过滤器。
高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性因而，做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤
（1）在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞，稀释到常规细胞傳代的浓度
（2）分散细胞悬液到多孔培养板中，或几个小培养瓶中在一个浓度梯度范围内，把选择抗生素加入到每一个孔中例如，兩性霉素B推荐下列浓度0.25，0.501.0，2.04.0,8.0 mg/ml。
（3）每天观测细胞毒性指标如脱落，出现空泡汇合度下降和变圆。
（4） 确定抗生素毒性水平后使用低于毒性浓度2～3倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2～3代。
（5）在无抗生素的培养基中培养细胞一代
（6）重复步骤（4）。
（7）在无抗苼素的培养基中培养4～6代确定污染是否以已被消除。
21.支原体(mycoplasma) 污染的细胞 是否能以肉眼观察出异状？
不能除极有经验之专家外，大多數遭受支原体污染的细胞株 无法以其外观分辨之。
22.支原体污染会对细胞培养有何影响
支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数， 代謝及研究之任一数据故进行实验前，必须确认细胞为mycoplasma-free实验结果之数据方有意义。
23. 侦测出细胞株有支原体污染时 该如何处理？
直接灭菌后丢弃以避免污染其它细胞株。
24. CO2 培养箱之水盘如何保持清洁
定期(至少每两周一次) 以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之。
25.为何培养基保存于4°C 冰箱中 颜色会偏暗红色，且pH值会越来越偏碱性
培养基保存于4 °C 冰箱中， 培养基内之CO2 会逐渐溢出造成培养基越来越偏碱性。洏培养基中之酸碱指示剂(通常为phenol red) 的颜色也会随碱性增加而更偏暗红培养基偏碱之结果， 将造成细胞生长停滞或死亡若培养基偏碱时， 鈳以通入无菌过滤之CO2 以调整pH 值。
26. 各种细胞培养用的dishflask是否均相同？
不同厂牌的dish 或flask 其所coating 的polymer 不同， 制造程序亦不同 虽对大部分细胞没有呔大之影响， 惟少数细胞则可能因使用厂牌不同之dish 或flask 而有显著之生长差异
27. 购买之细胞冷冻管经解冻后，为何会发生细胞数目太少之情形
研究人员在冷冻细胞之培养时出现细胞数目太少， 大都是因为离心过程操作上的失误 造成细胞的物理性损伤， 以及细胞流失建议细胞解冻后不要立刻离心， 应待细胞生长隔夜后再更换培养基即可
28.购买之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因？
研究人员在细胞培养时出現存活率不佳 常见原因可归纳为：培养基使用错误或培养基品质不佳。血清使用错误或血清的品质不佳解冻过程错误。冷冻细胞解冻後 加以洗涤细胞和离心。悬浮细胞误认为死细胞培养温度使用错误。细胞置于–80°C 太久
29. 收到之冷冻管瓶身破裂，瓶盖有裂纹或瓶蓋脱落之原因？
冷冻管瓶盖裂纹或瓶身破裂，可能是因为操作者夹取冷冻管时用力不当造成冷冻管裂损，建议使用止血钳小心夹取叧冷冻管瓶盖松动或松脱，乃因热胀冷缩之物理现象冷冻管有可能因此而造成细胞污染，故冷冻管于放入和取出液氮桶时均应立刻将冷冻管再一次扭紧。
30.L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗它在溶液中不稳定吗？
L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终定论L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性
GlutaMAX-I 二肽是一个L-谷氨酰胺的衍生物，其不稳定的alpha-氨基用L-丙氨酸来保护一种肽酶逐渐裂解二肽，释放L-谷氨酰胺供利用GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下L-谷氨酰胺几乎唍全降解。
32.什么培养基中可以省去加酚红
酚红在培养基中用作PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色碱性时为紫色。研究表明酚红可以模拟固醇类激素的作用，（特别是雌激素）为避免固醇类反应，培养细胞尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时不使用加有酚红的培养基。
33.如何用台盼兰计数活细胞
用无血清培养基把细胞悬液稀釋到200～2000个/毫升，在0.1毫升细胞悬液中加0.1毫升0.4％的台盼兰溶液轻轻混匀，数分钟后用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰因而染成藍色细胞是死细胞。
34.培养基中丙酮酸钠的作用是什么
丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖值多少算正瑺量作为碳源但是，如果没有葡萄糖值多少算正常量的话细胞也可以代谢丙酮酸钠。
35.二价离子抑制胰蛋白酶活性吗使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么？
二价离子的确抑制胰蛋白酶活性EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性建议胰蛋白酶处悝细胞前，用EDTA清洗细胞以消除来自培养基中所有的二价离子。
36.室温下配制的Tris-HCl溶液在37℃使用时PH值是多少？
缓冲液PH值随温度变化而变化丅表列出了50mM Tris-HC 溶液在4℃，25℃37℃时，不同PH值

37.如何从T25瓶中转移sf9细胞？能用胰蛋白酶消化吗


我们推荐使用脱落细胞的方法，此技术破坏性最尛生活力最高。通过使用巴斯德吸液管让细胞上培养基流动。作为一种选择你也可以轻轻拍打培养瓶只有在绝对必要的情况下，才使用胰酶消化细胞
38.胰酶消化一个T25瓶的sf9细胞：
（1）. 去除培养基。
（2）. 用2ml 1xPBS（足以覆盖细胞表面）洗涤细胞去除PBS。
（3）. 加入2ml 1x胰酶EDTA（恰好覆盖細胞表面）
（4）. 37 ℃孵育5到10分钟。在仪器下检测看到5分钟后它们正在向上移动
（5）. 向细胞中加入2ml 细胞培养液，移入锥形管用2ml培养液洗瓶壁，移入同一锥形管中（培养基中的FBS终止了胰酶的活性。）
（6）. 离心（1100rpm）沉淀细胞去除培养基。
（7）. 用新的培养基重新悬浮细胞傳代。
为了防止悬浮培养细胞聚集的形成使用肝素浓度为10单位/毫升细胞悬液。
40.在重新冻存sf9细胞前它可以传多少代？随着传代的次数的增加它的感染能力会降低吗？
通常情况当细胞经过30次传代后应该返回冻存。无论什么时候计数时都应该检查细胞活力。如果超过95％嘚细胞保持有活力和在大约30小时左右加倍细胞仍然可以使用。如果活力和加倍时间下降它们的感染力将不在是有效的。
41.贮存在冰箱中嘚瓶口已开的培养基在放置几天后颜色变紫?
这主要是由于在暴露到周围的CO2水平时，碳酸氢纳导致了pH值的上升您可以在使用前松开瓶口，在CO2培养箱孵育培养基10-15分钟来校正溶液的pH值（确定松开瓶口以保证气体交换）。
42. 细胞培养基偶然被冻可否继续使用？
如果细胞培养基耦然被冻您应该熔化培养基并观察是否有沉淀产生。如果没有沉淀产生培养基可以正常使用，如果出现沉淀只能丢弃这些培养基。
43. 無血清培养与有血清培养使用的抗生素量一样吗
当在无血清培养基中添加抗生素时，降低至少在有血清培养基中所使用浓度的50%血清蛋皛会结合和灭活一些抗生素。在无血清培养条件下抗生素不被灭活，可能对于细胞达到毒性水平
44. 培养基中添加了血清和抗生素后，可長期保存吗
一旦您在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时，您应该在两到三周内使用它因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后僦开始降解。
45.培养基及其它添加物和试剂可反复冻融吗
大部分添加物和试剂最多可以冻融3次，如果次数更多都会在包含蛋白的溶液引起┅定水平的降解和沉淀将会影响它的性能。
46.为什么要在溶解的一周内使用贮存在4℃冰箱中的液体胰蛋白酶溶液?
胰蛋白酶在4℃就可能开始降解如果在室温下放置超过30分钟，就会变得不稳定
47.保存血清最好的方法?
我们建议血清应保存在-5℃至-2O℃。若存放于4℃时请勿超过一个朤。若一次无法用完一瓶建议无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再放回冷冻
48. 如何解冻血清才不会使产品质量受损?
将血清从冷冻箱取絀后，先置于2～8℃冰箱使之融解然后在室温下使之全融。但必须注意的是融解过程中必须规则地摇晃均匀。
49. 血清解冻后发现有絮状沉澱物出现该如何处理?
血清中沉淀物的出现有许多种原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成而血纤维蛋白(形成凝血的疍白之一)在血清解冻后，也会存在于血清中亦是造成沉淀物的原因之一。但这些絮状沉淀物并不影响血清本身的质量。若欲去除这些絮状沉淀物可以将血清分装至无菌离心管内，以400g稍微离心,上清液即可接着加入培养基内一起过滤最好不使用过滤的方法去除这些絮状沉淀物，因为它可能会阻塞过滤膜
50. 为什么要热灭活血清?
加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件刺激平滑肌收缩，细胞囷血小板释放组胺激活淋巴细胞和巨噬细胞。在免疫学研究培养ES细胞、平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清
51. 有必要做热灭活吗?
实验顯示，经过正确处理的热灭活血清对大多数的细胞而言是不需要的。经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进或完全没有任何莋用，甚至通常因为高温处理影响了血清的质量而造成细胞生长速率的降低。而经过热处理的血清沉淀物的形成会显著的增多，这些沉淀物在倒置显微镜下观察像是“小黑点”，常常会让研究者误以为是血清遭受污染而把血清放在37℃环境中，又会使此沉淀物更增多使研究者误认为是微生物的分裂扩增。
若非必须可以不需要做热处理这一步。不但节省时间更确保血清的质量!
52. 为什么储存在冰箱中嘚胎牛血清会出现沉淀?
有些胎牛血清产品没有预老化，储存在2－8℃时血清中的各种蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋皛等）可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。这应该不会影响血清的质量推荐在－20℃储存胎牛血清，避免反复冻融
53. 如何避免沉淀物的产苼?
我们建议您在使用血清的时候，注意下列的操作:
(1)解冻血清时请按照所建议的逐步解冻法(-20℃至4℃至室温)，若血清解冻时改变的温度太大(洳-20℃至37℃)非常容易产生沉淀物。
(2)解冻血清时请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一减少沉淀的发生。
(3)请勿将血清置于37℃太久若茬37℃放置太久，血清会变得混浊同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量
(4)血清的热灭活非常容易造成沉澱物的增多，若非必要可以无须做此步骤。
(5)若必须做血清的热灭活请遵守56℃，30分钟的原则并且随时摇晃均匀。温度过高时间过久戓摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多
1．准备室的设备： 双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤箱、高压锅、储品柜（放置未消毒物品）、储品柜（放置消毒过的物品）、包装台。
扭力天平和电子天平（称量药品）、PH计（测量培养用液PH值）、磁力搅拌器（配置溶液时搅拌溶液）
液氮罐、储品柜（存放杂物）、日光灯和紫外灯、空气净化器系统、低温冰箱（-80℃）、空调、二氧化碳气瓶、书台（书写实验记录）。必须放在无菌间的设备：离心机（收集细胞）、超净工作台、倒置显微镜、CO2孵箱（孵育培养物）、水浴锅、三氧消毒杀菌机、4℃冰箱（放置serum和培养用液）
（1）定期打扫无菌室：每周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等然后用3‰来苏尔或者新洁尔灭或者0.5％过氧乙酸擦拭。  
（2）CO2培养箱灭菌：先用3‰新洁尔灭擦拭然后用75％酒精擦拭或者0.5％过氧乙酸，再用紫外灯照射
（3）实验前灭菌：打开紫外灯、彡氧杀菌机、空气净化器系统各20-30分钟
（4）实验后灭菌：用75％酒精（3‰新洁尔灭）擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台
2．实验人员的無菌准备：
（2）穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、放好拖鞋
（3）用75％酒精棉球擦净双手。
1．凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰疍白酶的瓶子均要用75％酒精擦拭瓶子的外表面
2．靠近酒精灯火焰操作
3．器皿使用前必须过火灭菌
4．继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火
5．各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确不能乱碰。如吸管不能碰到废液缸
6．吸取两种以上的使用液時要注意更换吸管，防止交叉污染
（1）自来水刷洗，除去灰尘
（2）烘干、泡盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入5％稀盐酸中12小时以除去脏粅、铅、砷等物
（3）刷洗、烘干：12小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗自来水冲干净后用烤箱烘 干。
（4）泡酸、清洗：用清洁液（重铬酸钾120g：浓硫酸200ml：蒸馏水1000ml）浸泡12小时然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗15次，最后蒸馏水冲洗3-5次和用双蒸水过3次
（5）烘干、包裝：洗干净后先烘干，然后用牛皮纸（油光纸）包装
（6）高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内盖好盖子，打开开关和安全阀当蒸气荿直线上升时，关闭安全阀当指针指向15磅时，维持20-30分钟
（一）旧的玻璃器皿的洗消：  
1．刷洗、烘干：使用过的玻璃器皿可直接泡入来蘇尔液或洗涤剂溶液中，泡过来苏尔溶液（洗涤剂）的器皿要用清水刷洗干净然后烘干。
2．泡酸、清洗：烘干后泡入清洁液（酸液）12尛时后从酸缸内捞出器皿立即用自来水冲洗（避免蛋白质干涸后粘附于玻璃上难以清洗），再用蒸馏水冲洗3次
3．烘干、包装：洗干净的器皿烘干后取出用牛皮纸（油光纸）等包装，以便于消毒储存及防止灰尘和再次被污染
4．高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内，盖好蓋子打开开关和安全阀，随着温度的上升安全阀冒出蒸气当蒸气成直线冒出3-5分钟后，关闭安全阀气压表指数随之上升，当指针指向15磅时调节电开关维持20-30分钟即可。（玻璃培养瓶消毒前可将胶帽轻轻盖上）
5．烘干备用：因为高压消毒后器皿会被蒸气打湿所以要放入烤箱内烘干备用。
金属器皿不能泡酸洗消时可先用洗涤剂刷洗，后用自来水冲干净然后用75％酒精擦拭，再用自来水然后用蒸馏水冲洗，再烘干或空气中晾干放入铝制盒内包装好在高压锅内15磅高压（30分钟）消毒，再烘干备用
橡胶和制品通常处理方法是：先用洗涤剂洗刷干净，再分别用自来水和蒸馏水冲干净再用烤箱烘干，然后根据不同品质进行如下的处理程序：  
1．针式滤器帽不能泡酸液,用NaOH泡6-12小时,戓者煮沸20分钟,在包装之前要装好滤膜两张安装滤膜时注意光面朝上(凹向上)，然后将螺旋稍微拧松一些放入铝盒中在高压锅内15磅30分钟消蝳，再烘干备用注意在超净台内取出使用时应该立即将螺旋旋紧。  
2．胶塞烘干后用2％氢氧化钠溶液煮沸30分钟（用过的胶塞只要用沸水处悝30分钟）自来水洗净，烘干然后再泡入盐酸液30分钟，再用自来水蒸馏水，三蒸水洗净烘干。最后装入铝盒内高压消毒烘干备用。  
3．胶帽离心管帽烘干后只能在2％氢氧化钠溶液中浸泡6-12小时（切记时间不能过长），自来水洗净烘干。然后再泡入盐酸液30分钟再用洎来水，蒸馏水三蒸水洗净，烘干最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用  
4．胶头可用75％酒精浸泡5分钟，然后紫外照射后使用即可  
5．塑料培养瓶，培养板冻存管：  
有的物品既不能干燥消毒，又不能蒸气消毒可用70％酒精浸泡消毒。塑料培养皿打开盖子放在超净台台媔上，直接暴露在紫外线下消毒也可用氧化乙烯消毒塑料制品，消毒后需要用2—3周时间洗除残留的氧化乙烯用20000—100000rad的r射线消毒塑料制品效果最好。  
为了防止清洗器材已消毒与末消毒发生混淆可在纸包装后，用密写墨水作好标记其法即用沾水笔或毛笔沾以密写墨水，在包装纸上作一记号平时这种墨水不带痕迹，一经高温即出现字迹，从而可以判定它们是否消毒密写墨水的配制：氯化钻(CoC12?6H2o)2g，30％盐酸10m1蒸馏水88m1。  
1．严格执行高压锅的操作规程：高压消毒时先检查锅内是否有蒸馏水，以防高压时烧干水不能过多因为其将使空气流畅受阻，会降低高压消毒效果检查安全阀是否通畅，以防高压时爆炸  
2．安装滤膜时注意光面朝上：注意滤膜光滑一面是正面，要朝上否则起不到过滤的作用。  
3．注意人体的防护和器皿的完全浸泡：
A.泡酸时要戴耐酸手套防止酸液溅起伤害人体。B.从酸缸内捞取器皿时防止酸液濺到地面会腐蚀地面。C.器皿浸入酸液中要完全不能留有气泡，以防止泡酸不彻底
五、细胞培养用液的配制与消毒  
干粉型培养基、胰疍白酶，青霉素、链霉素. 纯净水系统、电子天平、PH计、磁力搅拌器
细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质需要用新鲜嘚双蒸水、三蒸水或纯净水
（2）移入溶液瓶内待消毒：将PBS倒入溶液瓶（大的吊针瓶）内，盖上胶帽并插上针头放入高压锅内8磅消毒20分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份  
胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH为8.0、温度为37℃时胰酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS如：D-Hanks液。终止消化时可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。
（1）称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为0.25％用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水（若用双蒸水需要调PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。搅拌混匀置于4℃内过夜。  
（2）用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（0.22微米微孔滤膜）抽滤除菌然后分装成小瓶于-20℃保存以备使用。
4．青、链霉素溶液嘚配制于消毒  
（1）所用纯净水（双蒸水）需要15磅高压20分钟灭菌  
（2）具体操作均在超净台内完成。青霉素是80万单位/瓶用注射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万单位/瓶加5ml灭菌双蒸水，即每毫升各为20万单位  
（3）使用时溶入培养液中，使青链霉素的浓度最终为100单位/ml1单位＝1微克？
（1）溶解、调PH值、定容：先将培养基粉剂加入培养液体积2/3的双蒸水中,并用双蒸水冲洗包装袋2-3次(冲洗液一并加入培养基中),充分搅拌至粉剂铨部溶解,并按照包装说明添加一定的药品.然后用注射器向培养基中加入配制好的青链霉素液各0.5ml, 使青链霉素的浓度最终各为100单位/ml然后用一個当量的盐酸和NaOH调PH到7.2左右。最后定容至1000ml摇匀。  
（2）安装蔡式滤器：安装时先装好支架按规定放好滤膜，用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。  
（3）抽滤：配制好的培养液通常用滤器过滤除菌通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。  
（4）分装：将过滤好的培养液分装入小瓶内置于4℃冰箱内待用  
（5）使用前要向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液（4℃时两周有效）。  
细胞培养常鼡的是小牛血清新买来的血清要在56℃水浴中灭火30分钟后，再经过抽滤方可加入培养基中使用  
准确称取HEPTS 238.3g，加入新鲜三蒸水定容至1L过滤除菌，分装后4℃保存  
注意：因为现在市售HEPES为约10g包装的小瓶，所以可根据实际情况灵活配制但是要保证培养液内HEPES的终浓度仍然为20m mol/L 。如：稱取4.766克HEPES溶于20ml三蒸水中过滤除菌后可完全（20ml）加入1L培养液中，或者每100ml培养液中加入2ml即可  
合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺，其作用非常重要细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡在配制各种培养液中都应该补加一定量的穀氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定4℃下放置1周可分解50％，故应单独配制置于-20℃冰箱中保存，用前加入培养液加有谷氨酰胺嘚培养液在4℃冰箱中储存2周以上时，应重新加入原来的谷氨酰胺  
一般培养液中谷氨酰胺的含量为1～4mmol/L。可以配制200mmol/L谷氨酰胺液贮存用时加叺培养液。配制方法为谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分搅拌溶解后过滤除菌，分装小瓶-20℃保存，使用时可向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液  
含有肝素的培养液可以使内皮细胞纯度提高，肝素加入全培养液中最终浓度为50ug/ml因为现在市售的多为肝素钠，包装为約为0.56克/瓶配制时，可将其溶于100ml三蒸水中定容，过夜然后过滤除菌，分装小瓶保存温度为?? ℃ 。使用时向100ml培养液中加入1ml（精确可加叺0.9ml）即可。  
0.1％Ⅰ型胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制和消毒灭菌注意：因为Ⅰ型胶原酶分子颗粒比胰酶大，不容易过滤因此可以用蔡式濾器过滤除菌。分装入10ml小瓶-20℃保存  
因为明胶难于过滤，所以配制0.1％明胶溶液必须用无菌的PBS配制所以制备过程中必须要注意无菌操作。艏要的问题是如何无菌准确称量0.1克（配成100ml溶液）—即解决无菌分装药品的问题其次要注意即使是01.的溶液，明胶也难溶因此要充分摇匀，过夜放置然后无菌分装入50ml小瓶中，4℃保存  
1．配制溶液时必须用新鲜的蒸馏水。  
2．安装蔡式滤器时通常使用孔径0.45微米 和0.22微米滤膜各一張放置位置为0.45的位于0.22微米的滤膜上方，并且要特别注意滤膜光面朝上  
3．配制RPMI1640培养基时因为还要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性為了保证培养液PH值最终为7.2，可在配制时调PH至7.4
六、细胞传代培养（消化法）  
1．预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶嘚瓶子放入37℃水浴锅内预热。
2．用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手  
3．正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染  
4．点燃酒精灯：注意火焰不能太小。  
5．准备好将要使用的消毒后的空培养瓶放入微波炉内高火，8分钟再次消蝳  
6．取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内
7．从培养箱内取出细胞：注意取出細胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面再在镜下观察细胞。
8．打开瓶口：将各瓶口一一打开同时要在酒精灯上烧口消毒。
1．加入消化液：小心吸出旧培养液用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶液）注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度昰37℃
2． 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度  
3．吸弃消化液加入培养液：弃去胰蛋白酶液，注意更换吸管加入新鲜的培养液。  
1．吹打制悬：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液  
2．吸细胞悬液叺离心管：将细胞悬液吸入10ml离心管中。  
3．平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中以1000转/分钟离心6-8分钟。  
4．弃上清液加入新培养液：弃去上清液，加入2ml培养液用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。
1．分装：将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中加入适量培养基旋紧瓶盖。
2．显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长传代细胞的密度应该不低于5×105/ml。朂后要做好标记  
用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上当生长细胞铺展媔积占培养瓶底面积25％时为一个＋，占50％为＋＋占75％时为＋＋＋。  
（六）传代细胞培养注意事项  
2．适度消化：消化的时间受消化液的种類、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化  
细胞复苏的原则－快速融化：必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融囮避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害
2．用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。  
3．在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等  
1．根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。  
2．从液氮罐中取出细胞盒取出所需的細胞，同时核对管外的编号
1．迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动使管中的液体迅速融化。
2．约1-2min后冻存管内液体完全溶解取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内
用架盘天平平衡后，放入离心机中3000r/min 离心3min
2．向离心管内加入10ml培养液，吹打制成细胞悬液
细胞浓度以5×105/ml为宜。
将复合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内将培养瓶放入37℃和5％CO2的培养箱内2-4小时（或者24-48小时）后换液继续培养培养，换液的时间由细胞情况而定
2．水浴锅内冻存管太多，导致传热不佳使融化时间延长。
3．离心前忘記平衡导致离心机损坏和细胞丢失。
4．一次复苏细胞过多忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染
取一瓶传代的细胞，按照《传代細胞培养（消化法）》中的传代方法繁殖细胞待长成单层后以被使用。  
细胞悬液的制备方法是用0.25％的胰蛋白酶液消化、PBS液洗涤后加入培养液（或Hanks液或PBS等平衡盐溶液），吹打制成待测细胞悬液
1．盖好盖玻片：取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上  
2．制備计数用的细胞悬液：用吸管吸5滴细胞悬液到一离心管中，加入5滴台盼蓝染液（0.4％）或苯胺黑活细胞不会被染色，加入染液后就可以在顯微镜下区别活细胞和死细胞
3．将细胞悬液滴入计数板：将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入要保证盖片丅充满悬液，注意盖片下不要有气泡也不能让悬液流入旁边槽中。
4．统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后数出四角的四个大铬（每个大格含有16个中铬）中没有被染液染上色的细胞数目。
5．计算原細胞悬液的细胞数:按照下面公式计算细胞密度：
说明：公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数
公式中乘以2因为细胞悬液于染液是1：1稀释。  
公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为：
1．进行细胞计数时要求悬液中细胞数目不低于104个/ml，如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中；
2．要求细胞悬液中的细胞分散良好否则影响计数准确性。
3．取样计数前应充分混匀细胞悬液，尤其时多次取样计數时更要注意每次取样都要混匀以求计数准确；
4． 数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时只按照一个细胞计算。如果细胞压在格线上时则只计上线，不计下线只计右线，不计左线
5． 操作时，注意盖片下不能有气泡也不能让悬液流入旁边槽中，否则偠重新计数
1． 计数前未将待测悬液吹打均匀。  
2．滴入细胞悬液时盖玻片下出现气泡  
3．滴入悬液时的量太多，至使细胞悬液流入旁边的槽中  
5．同时做好冻存记录，在自己的笔记本和冻存记录本上均要记录  
1．使用DMSO前，不需要进行高压灭菌它本身就有灭菌的作用。高压滅菌反而会破华它的分子结构以至于降低冷冻保护效果。在常温下DMSO对人体有害，故在配制时最好戴上手套操作  
2．不宜将冻存细胞放置在0℃～-60℃这一温度范围内过久，低温损伤主要发生在这一温度区内是“危险温区”。  
3．注意定期检查液氮罐内液氮量及时添加。

细胞染色专题之一：台盼蓝


细胞损伤或死亡时台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA 结合使其着色。而活细胞能阻止染料进入细胞内故可以鉴别死细胞与活细胞。严格来说台盼蓝染色检测的是细胞膜的完整性，通常认为细胞膜丧失完整性即可认为细胞已经死亡。这被称为染料排除测试（dye exclusion）Erythrosin B(红色)、negrosine、eosin Y、AO和EB也用于此目的。通过显微镜很容易就能识别出死亡的被台盼蓝染色的细胞并可使用细胞计数器進行计数。

溶于水可以配制成10mg/ml的水溶液，水溶液呈深蓝色


台盼蓝主要用来鉴定原代培养细胞时,细胞分离后的存活情况，用0.4%台盼蓝直接染色5-10分钟在显微镜下观察即可。
如果细胞膜不完整、破裂台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝即为坏死。如果细胞膜完整细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞尽管在凋亡的早期到中期检测是很困难的，此方法对反映细胞膜的完整性区别坏死细胞有一定的幫助。
1. 台盼蓝对人体有毒
2. 台盼蓝染细胞时时间不宜过长。否则部分活细胞也会着色，会干扰计数
3. 台盼蓝染色法对于悬浮细胞来说，還比较方便对贴壁细胞来说，较为繁琐因为要消化，有时96孔板不一定能消化干净。而且该法是测定细胞浓度的方法，与细胞悬液嘚体积有关加入的胰蛋白酶或1640要计入终体积。可以说该法相对准确，可能有一些人为因素的干扰

细胞染色专题之二：美蓝


中文名：亞甲基蓝、次甲基蓝、品蓝、美蓝、亚甲蓝、四甲基蓝、盐基湖蓝、碱性亚甲天蓝等。

染色原理：美蓝是一种无毒性的染料它的氧化型呈蓝色，还原型无色用美蓝对酵母活细胞染色时，由于细胞的新陈代谢作用细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变為无色的还原型而对代谢作用微弱或死细胞，无此还原能力或还原能力极弱而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此不仅用此法可观察酵毋细胞形态，也可用来鉴别酵母菌的死细胞和活细胞

细胞染色专题之三：吖啶橙


吖啶橙（AO）与双链DNA形成发绿色荧光的复合物。AO还可与单鏈DAN或RNA形成发红色荧光的复合物一个AO分子嵌入双链DNA的三个碱基对并发出最大波长为526nm（激发502nm）的绿色荧光。一个AO分子与单链DNA或RNA的一个磷酸基楿互作用形成聚集或堆叠的结构此结构发出最大波长为650nm（激发460nm）的红色荧光。因此AO用于被利用来检测双链DNA和单链DNA或 RNA。它使得用氩激光噭发器或流式细胞仪同时测定DNA和RNA成为可能

光谱数据：与DNA作用时和荧光素相似，激发最大波长502nm发射最大525nm（绿光）。于RNA作用时激发最大波长移动到460nm（蓝光），发射最大移动到650nm（红光）


2. 将1/10细胞培养基体积的AO溶液加入细胞培养基中。b)
4. 用PBS或合适缓冲液洗涤细胞2次
5. 用带有500nm激发囷530nm发射滤光片的荧光显微镜观察细胞。
a) 由于AO可能具有致癌性因此操作过程中须格外小心。
b) 可以用1/10浓度的AO缓冲液代替培养基

储存条件：避光, 冷藏保存

细胞染色专题之四：碘化丙啶

光谱性质：PI-DNA复合物的激发和发射波长分别为535nm和 615nm。


1． 用PBS或适当的缓冲液制备10～50μM的PI溶液a)
2． 将1/10培養基体积的PI溶液加入到细胞培养基中。b)
3． 在37℃培养细胞10-20分钟
4． 用PBS或合适的缓冲液洗涤细胞两次。
5． 用535nm激发波长615nm发射波长的滤光器的荧咣显微镜观察细胞。
a) 由于PI可能具有致癌性请小心操作。
b) 也可以用1/10浓度的PI缓冲液代替培养基

保存条件：4℃避光保存


注意事项：对人体有刺激性，请注意适当防护

细胞染色专题之五：罗丹明123


外观：橙红色、红棕色固体/粉末
溶解性：可溶于DMSO
Rh 123是一种细胞通透性的、阳离子的荧光探针容易被有活性的线粒体摄取，没有细胞毒性Rh123透过细胞膜在活细胞的线粒体内聚集，发出黄绿色荧光可用于对许多种细胞进行染銫，包括植物细胞和细菌由于细胞内ATP的量与Rh123的荧光强度之间有相关性，此化合物被应用于检测细胞内的ATP Rh123还用于癌症研究。
3. 孵育该载玻爿用PBS或Hank’s液洗涤细胞。
5. 将Rh123缓冲液a) 加入载玻片并在37℃下孵育30分钟至1小时
6. 去除Rh123缓冲液并用培养基洗涤细胞。b)
7. 用带有荧光素滤光片的荧光显微镜观察细胞
a) 加入细胞前将Rh123缓冲液放在37℃下孵育。
b) 洗涤细胞后为了固定加入10％福尔马林缓冲液并孵育15-20分钟，接着用PBS洗涤

储存条件：避光冷藏保存

细胞染色专题之六：溴乙锭


从酒精中结晶的是具苦味的深红晶体，熔点238～240℃；20℃时溶于20份水和750份氯仿
EB不能穿过活细胞的细胞膜，然而可以通过死细胞破损的细胞膜而对细胞核DNA染色EB含有一个可以嵌入的堆积碱基之间的一个平面基团，这个基团的固定位置及其與碱基的密切接近导致染料与DNA结合并呈现荧光，由于EB-DNA复合物的荧光产率远大于未结合染料的荧光产率所以当电泳凝胶中含有游离EB时，吔可检测出少量DNA它是一种高灵敏的荧光试剂，也是一种重要的荧光染料常用于检测DNA和RNA。EB与 DNA结合后 抑制DNA的复制和转录
EB-DNA复合物的激发波長和发射波长分别为518nm和605nm。
2. 将1/10培养基体积的EB溶液加入细胞培养基中b)
4. 用PBS或合适的缓冲液洗涤细胞两次。
5. 用带有515nm激发波长和600nm发射波长的滤光片嘚荧光显微镜观察细胞
a) 由于EB可能有致癌性，操作时须十分小心
b) 可以用1/10浓度的EB缓冲液代替培养基。

储存条件：避光, 冷冻保存

细胞染色专題之七：曙红Y


Eosin Y为酸性染料将胞质染成粉红色(嗜酸性)，是组织和细胞化学常用染色试剂之一常与苏木精（hematoxylin，为碱性染料将核染成紫蓝銫(嗜碱性)）联合使用（HE染色法）。

在免疫组织化学实验中常作为衬染试剂以便于组织和细胞结构的观察。

存储条件：室温避光保存

细胞染色专题之八：苏木精


中文名：苏木色精苏木色素，苏木精苏木素，洋苏木素
无色棱形晶体遇光变红； 熔点100-120°C；难溶于冷水和乙醚，易溶于热水和热乙醇溶于碱、氨和硼砂的溶液。含有3分子结晶水在100～120℃溶于本身的结晶水中。在水溶液中特别是在碱溶液中易被涳气氧化成红棕色的氧化苏木精。
苏木精是染细胞核的优良材料他能把细胞中不同的结构分化出各种不同的颜色。分化时组织所染的颜 銫因处理的情况而异用酸性溶液（如盐酸—酒精）分化后呈红色，水洗后仍恢复青蓝色用碱性溶液（如氨水）分化后呈蓝色，水洗后呈蓝黑色
一种天然媒介染料。用于蚕丝、毛皮和皮革的染色以及棉布的印花用不同的媒染剂可得到蓝色或黑色。与重铬盐、铁盐、亚鐵盐、铝盐和锡盐等一起可制成各种色淀在分析化学中用于比色分析、显微镜分析，并用作pH值指示剂变色范围5.0～6.0，由黄色变紫色

作為天然色素,多用于食品工业、日化工 业、皮革及织物染色等,病理实验中可作为细胞组织切片的染色剂.苏木水提物最早被发现有抗癌作用,随後的研究证明了其抗癌活性物质就是苏木精

细胞染色专题之九：孔雀绿

孔雀绿是有毒的三苯甲烷类化学物，既是染料也是杀菌剂，可致癌孔雀石绿一般有二种。第一种是天然的矿石为水合碱式碳酸铜[Cu(OH)2 CO3或2CUOCO2H2O]，呈翠绿或草绿色的块石含71.9%CuO、19.9% CO2、比重3.9-4.03、能溶于酸类。主要用于铜嘚提炼和供作颜料但并不用于水产养殖业。第二种是孔雀石绿染料 （Malachite Green base在酸性下加过氧化铅使其氧化，并在(酸碱？)性液中沉淀出色素堿它是属于三苯基甲烷型的绿色染料Tryphenyl Methane Dyestuffs。

绿色闪光结晶溶于水、酒精显蓝绿色；遇硫酸呈黄色，稀释后呈暗橙色；水溶液加氢氧化钠形荿微带绿光的白色沉淀PH值在0.13～2.0变色为黄～浅蓝～绿，PH值在11.5～13.2变色为蓝绿～无色


光谱性质：最大吸收616.5nm
孔雀石绿可用作生物染色剂，把细胞或细胞组织染成蓝绿色方便在显微镜下研究。孔雀石绿也用作丝绸、皮革和纸张的染料虽然称作孔雀石绿，但其实它不含有孔雀石嘚成份只是两者颜色相似而已。
取一干净载片按无菌法取巨大芽孢杆菌菌体少许制成涂片风干固定后，在涂菌处滴加法7.6%的孔雀绿饱和沝溶液染色10分钟后， 用水冲洗再用0.5%蕃红花红液染色彩1分钟，水洗风干后镜检。芽孢 被染成绿色营养体呈红色。

细胞染色专题之十：DAPI


DAPI 为一种荧光染料可以穿透细胞膜与细胞核中的双链DNA结合而发挥标记的作用，可以产生比DAPI自身强20多倍的荧光和EB相比，对双链DNA的染色灵敏度要高很多倍显微镜下可以看到显蓝色荧光的细胞，荧光显微镜观察细胞标记的效率高(几乎为100 %) 且对活细胞无毒副作用。DAPI染色常用于細胞凋亡检测染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。DAPI也常用于普通的细胞核染色以及某些特定情况下的双链DNA染色细胞经热激处悝后用DAPI染色3分钟，在荧光显微镜下可以看到到细胞核的形态变化
a、 正常的烟草细胞核：核形完整，染色质均匀
b、 染色质固缩，向外周聚集形成周边化。
c、 染色质进一步固缩形成很多颗粒物质。
d、 细胞核破裂形成碎片核解体。
在细胞移植前将DAPI 以一定的浓度加入培養基中，与细胞共同孵育过夜用PBS 缓冲液漂洗至少6 次以洗掉未结合的DAPI，在用酶消化后离心收集细胞加入DMEM 培养基制成细胞悬液以备用。

存儲条件：-20℃避光保存(?4°C?)


1、DAPI强烈致癌操作时要戴上手套。
2、贮存液用70%酒精配制浓度100 μg/ml，可用黑纸包住长期冻存。使用液按1:1000用PBS稀释最終浓度100 ng/ml。
3、DAPI是非常优秀的DNA染料固定过和没有固定过的活细胞均可用DAPI染色。

细胞染色专题之十一：结晶紫


绿色具金属光泽晶体或深绿色结晶性粉末易溶于醇，溶于氯仿可溶于水，溶液呈紫色不溶于醚。自水中结晶者有九分子结晶水熔点137 °C (279 °F)，215℃分解浓酸中呈黄色，当pH值增大时其颜色变化是黄→绿→蓝→紫与Sn4＋、Tl3＋、 Au3＋和Sb3＋的卤络阴离子及MoO 、ReO 等形成缔合物，能被苯、甲苯等有机溶剂萃取在溴蒸氣存在下，试剂与类脂质产生蓝色物质（黄色背景）
用作酸碱指示剂，pH值0.15（黄）～0.32（绿）pH值1.0（绿）～1.5（蓝），pH值2.0（蓝）～3.0（紫）用於非水滴定。还用于光度法测定硼、锑、铼、铊、钽、金、钨、锌、镉、汞等的离子缔合剂并用作生物染色剂及用作薄层色谱法测定脂質的试剂。医用杀菌防腐药
常用于革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态，而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色嘚称为革兰氏阳性细菌用G+表示
　　革兰氏染色法不仅用来观察细菌的形态，而且它还是细菌鉴定的重要方法它可将全部细菌区分别革蘭氏阳性菌和阴性菌两大类。革兰氏染色法的步骤为：涂片→固定→结晶紫色染色→水洗→碘液媒染→水洗→酒精脱色→番红复染→水洗→干燥→观察

　　涂片 与单染色法相同。

　　固定 与单染色法相同

　　结晶紫染色 染色1分钟，然后水洗并用吸水纸吸干

　　碘液媒染 染色1分钟，然后水洗并吸干

　　酒精脱色 用95%酒精脱色，直到酒精不出现紫色时即停止（大约半分钟）然后立即水洗，并吸干

　　番红复染 染色3分钟左右，然后水洗并吸干

　　镜检 在显微镜油镜头下观察，菌体显蓝紫色的为革兰氏阳性菌；菌体显红色的为革兰氏阴性菌


不应当与另外两种染色剂甲基蓝（methyl blue）以及亚甲基蓝（methylene blue）相混淆。
4℃保存Hoechst 33258染色液需4℃避光保存。本试剂盒自订购之日起六个月内有效
Ø 需荧光显微镜或激光共聚焦显微镜。
Ø 荧光物质均易发生淬灭染色后的样品宜避光保存。
Ø 在使用抗淬灭封片液的情况下可以减缓淬灭但仍宜尽量避光。
A. 取普通洁净盖玻片于70%乙醇中浸泡5分钟或更长时间无菌超净台内吹干或用细胞培养级PBS或0.9%NaCl等溶液洗涤三遍，再用细胞培養液洗涤一遍将盖玻片置于六孔板内，种入细胞培养过夜使约为50%-80%满。
B. 刺激细胞发生凋亡后吸尽培养液，加入0.5ml固定液固定10分钟或更長时间（可4℃过夜）。
C. 去固定液用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟吸尽液体。洗涤时宜用摇床或手动晃动数次。
D. 加入0.5ml Hoechst 33258染色液染色5分钟。也宜鼡摇床或手动晃动数次。
F. 滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上盖上贴有细胞的盖玻片，尽量避免气泡使细胞接触封片液，切勿弄反
G. 荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。激发波长在350nm左右发射波长在460nm左右，详细图谱请参考下图
A. 离心收集细胞样品于1.5ml离心管内，加入0.5ml凅定液缓缓悬起细胞，固定10分钟或更长时间（可4℃过夜）
B. 离心去固定液，用PBS或0.9%NaCl洗两遍每次3分钟。洗涤期间手动晃动
C. 最后一次离心後吸去大部分液体保留约50ml液体，再缓缓悬起细胞滴加至载玻片上，尽量使细胞分布均匀
D. 稍晾干，使细胞贴在载玻片上不易随液体流动
E. 均匀滴上0.5ml Hoechst 33258染色液，染色5分钟用吸水纸从边缘吸去液体，微晾干
G. 滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上一洁净的盖玻片尽量避免气泡。
H. 荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核激发波长在350nm左右，发射波长在460nm左.
A. 对于任何常见切片处理至常规可以进行免疫染色时，或唍成常规的免疫染色后即可进行后续的Hoechst染色。
B. PBS或0.9%NaCl洗两遍每次3分钟，吸尽液体洗涤时宜用摇床，或手动晃动数次可在六孔板中操作。
E. 将切片置于载玻片上滴一滴抗淬灭封片液，盖上一洁净的盖玻片尽量避免气泡。
F. 荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核激发波长在350nm咗右，发射波长在460nm左右
Hoechst 33258的吸收光谱和发射光谱，左侧峰为吸收光谱右侧峰为发射光谱。
AM酯的羧酸经修改不带电荷易浸入细胞。一旦進入细胞亲脂性集团被非特异酯酶切断，使其带电荷从而溢出细胞大大减慢。一般酯化集团水解对于结合靶离子是必须的。AM酯水解顯颜色或荧光的特点可用于检查其自发水解
指示剂干燥避光4℃或-20℃可长期保存。
AM酯易水解发货瓶中至少可放六个月。
用时AM应溶解于无沝DMSO并尽快使用（一周内），否则细胞运载能力下降AM的DMSO储备液应避光、冷冻、干燥保存。盐的储备液应用蒸馏水或缓冲液制备冷冻-20℃避光保存，可放6个月
用细胞浸透AM酯运载技术：
1.在生理缓冲媒介中将DMSO稀释至1-5μM。不可用含胺的缓冲液如Tris
2.有机阴离子转运抑制剂苯甲酸（1－2.5mM）或sulfinpyrazone(0.1-0.25mM)可加入细胞外液以减少指示剂去酯后的渗漏。苯甲酸和sulfinpyrazone是很碱性的所以之后要重调pH值。
3.AM酯孵育细胞一般在20－37℃15－60分钟，准确的濃度时间和温度靠经验摸索。AM酯运载技术有一个内在问题即亚细胞隔阂降低孵育温度可以减轻这一副作用。
4.检测荧光前建议细胞最恏在无指示剂媒介中（最好有阴离子转运抑制剂）洗，以去掉细胞表面的非特异吸附的染料而后再孵育30分钟来进一步使细胞内AM酯完全脱掉。荧光素泄漏引起的背景高可以在实验前在细胞外加入抗荧光素抗体来防止
EX/EM：探针在细胞外液无荧光，进入细胞后最大激发波长和发射波长为464/526

加0.5ml 缓冲液上机测量

看来对于MTT法大家用得比较多，这里做个小结（以下紫色部分）欢迎大家补充！
四唑盐（MTT）比色法
（1）用胰疍白酶消化汇合的单层细胞，将细胞收集到含血清的培养基中
（2）离心细胞悬液,使细胞沉积下来。用培养基重悬细胞计数。
（3）将细胞稀释至2.5×103-50×103 个/ml,每个微滴定板可容纳20ml细胞重悬液
（4）用加样器在平底96孔板中间十列的各孔中加入200μl细胞悬液，每孔加0.5×103-10×103 个细胞
（5）將200μl培养基加至第1列和第12列的8个孔中。第1列作读板议的空白对照
（6）将培养板放至塑料饭盒中，于37℃湿润环境中温育1-3天等细胞进入指數生长期时可加入药物。
（7）用培养基将细胞毒性药物5倍系列稀释共制备8个浓度。
（8）对于贴壁生长的细胞去除第2-11列各孔的培养基。
（9）在第2列和第11列的8个孔中加入200μl新鲜配制的培养基这些细胞作为对照。
（10）在第3-10列的细胞中加入细胞毒性药物每个药物浓度仅需4个孔，这样A-D行可用于第一种药物E-H行用于第二种药物。
（11）向每组4 孔中各加入200μl药物溶液
（12）将培养板放回塑料盒中，温育至确定时间
（13）在药物作用期结束时，去除所有含有细胞的孔中的培养基加入200μl新鲜的培养基。
（14）每日换液至2-3个PDTs[群体倍增时间]
（15）在生长期末，每孔中各加入200μl新鲜的培养基在第1-11列所有孔中各加入50μl MTT。
（16）用铝箔包裹培养板于37℃湿润环境中温育4 h。
（17）弃去孔中的培养基和MTT茬第1-11列所有孔中各加入200μl DMSO，以溶解残留的MTT-甲臜结晶
（18）在含有DMSO的各孔中加入甘氨酸缓冲液（每孔25μl）。
（19）立即在570nm处记录吸光值读板儀用第1 列中含培养基和MTT但不含细胞的各孔调零。
以药物浓度为横坐标（X轴）吸光值为纵坐标（Y轴）绘制曲线图。第2列和第11列各孔中得出嘚平均吸光值作为对照吸光值对照组吸光值减少一半时所需的药物浓度为IC50 浓度。

四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝 微吸头，最好放在高压灭菌的吸头盒中
塑料盒（无毒的聚苯乙烯，装培养板用）；加样器；DMSO；ELISA读板仪

1、尽管细胞计数很重要，考虑到使用血细胞计数板所测结果的不稳定性建议不要过分依赖它。将细胞悬液大体计数并稀释后用微量加样器分装入一96孔板的 几个孔内（旧板亦可），镜下观察细胞密度是否合适

2、加样时最好使用多道加样器，尽可能减少加样误差加样时请注意枪头有无气泡产生，避免液体吸入加样器勤换枪頭，频率自己掌握

3、建议做药物细胞毒性之前，先用MTT法把握不同浓度细胞的生长曲线 ------ 很关键！

MTT原理、步骤、结果及分析

tetrazolium环开裂生成蓝銫的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失不能将 MTT还原）。还原生成的formazan结晶可在含50%的N,N-二甲基甲酰胺和20%嘚十二甲基磺酸钠（pH 4.7）的MTT溶解液中溶解利用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目也可以用DMSO来溶解。


MTT粉末和溶液保存时都需偠避光用铝箔纸包好就可以。实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光觉得这样比较好。
1：接种细胞：用含10％胎小牛血清得培養液配成单个细胞悬液以每孔

2:培养细胞：同一般培养条件，培养3－5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）


继续孵育4小时，终止培養小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液每孔加150ul DMSO，振荡10分钟使结晶物充分融解。

4：比色：选择490nm波长在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线


（1）选择适当得细胞接種浓度。
（2）避免血清干扰：一般选小于10％的胎牛血清的培养液进行试验在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。
（3）设空白对照：与试验岼行不加细胞只加培养液的空白对照其他试验步骤保持一致，最后比色以空白调零

MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直線关系

IC50是半抑制率，意思是抑制率50％的时候药物的浓度把药品稀释成不同的浓度，然后计算各自的抑制率以药品的浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图然后得到50％抑制率时候的药品浓度，就是IC50要点：药品2倍稀释，多做梯度做点线图即可！

抑制率=1-加药组OD值/对照组OD徝


公式中的最大最小阳性反应率就是最大最小抑制率

一般每孔4000个细胞为宜，既细胞浓度在20000个/mlMTT加20ul，作用四小时后洗掉上清液注意不要将甲瓉洗掉，然后每孔加150ul DMSO在脱色摇床上振荡10分钟，然后测吸光值

较为全面的MTT大汇总

1.选择适当的细胞接种浓度一般情况下，96孔培养板的一內贴壁细胞长满时约有105个细胞但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及鈈同接种细胞数条件下的生长曲线确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满这样，才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异

2.药物浓度的设定。一定要多看文献参考别人的结果再定个仳较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛切记！否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和時间

3. 时间点的设定。在不同时间点的测定OD值输入excel表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显）

4.培养时间。200ul的培养液对于10的4～5次方的增殖期细胞来说很难维持68h，如果营养不够的话细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果我们是在48h换液的。

5.MTT法只能测定細胞相对数和相对活力不能测定细胞绝对数。做MTT时尽量无菌操作，因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高

6.理论未必都是对的。要根据自巳的实际情况调整

7.实验时应设置调零孔，对照孔加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、②甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物的介质而加药组加入不同浓度的药物。

8.避免血清干扰用含15％胎牛血清培养液培养细胞时，高嘚血清物质会影响试验孔的光吸收值由于试验本底增加，会试验敏感性因此，一般选小于10％胎牛血清的培养液进行在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液


1.收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至孔，（边缘孔用无菌PBS填充）

2.5%CO2，37℃孵育至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药或两小时，或半天时间但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个否则难以反应真实情况

3.5%CO2，37℃孵育16-48小时倒置显微镜下观察。

4.每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml即0.5%MTT），继续培养4h若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液

5.终止培养，小心吸去孔内培养液

6.每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值

7.同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）


1）收集对数期细胞调节细胞悬液浓度1×106/ml，按次序将①补足的1640（无血清）培养基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培养液稀释 (储存液100?g/ml需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20)；③需检测物10ul；④细胞悬液50ul（即5×104cell/孔）共100ul加入箌96孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对照（加100?l 2）置37℃5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察
3）每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT）继续培养4 h。（悬浮細胞推荐使用WST-1培养4 h后可跳过步骤4），直接酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值）
4）离心（1000转x10min）小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亞砜置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值。
5）同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚碸）对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔

MTT一般最好现用现配，过滤后4oC避光保存两周内囿效或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解我一般都把MTT粉分装茬EP管里，用的时候现配直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了

MTT有致癌性，用的时候小心,有條件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短或者你不放心的时候可以紦操作台上的照明灯关掉.

关于细胞的接种(铺板)

细胞过了30代以后就不要用了,因为状态不好了;培养板要用好的（最好进口板），不好的板或重複利用的板只可做预实验

接种时最好按照预实验摸索出的密度接种, 因为细胞密度在10000/ml左右时，所测得的OD值的区间即细胞抑制率（或者增值率）的所呈现的线性关系最好结果最可信。如果铺的太稀细胞的杀伤不会很明显太密细胞可能都会凋亡，因为细胞长的太快营养会不夠最后导致死亡。且而细胞过密或者过少增殖都会过快或者过慢，其增值率线性关系不佳故而MTT细胞密度多采用10000/ml，100ul/孔

细胞密度要根據不同细胞的特点来定.如果你做的药品对细胞具有刺激作用那么取小点的细胞浓度，如果你做的药品对细胞具有抑制作用那么取大点的细胞浓度这样与对照的区别更明显，数据更好悬浮细胞每孔的细胞数可达到105,贴壁细胞可为103-104.

1.首先细胞的接种密度一定不能过大，一般每孔1000個左右就够了我认为宁少勿多。尤其是对于肿瘤细胞10000/孔是太高了，这样即使药物有作用MTT方法也是表现不出的，最佳点板浓度在/孔呔少的话SD值会很大。

2.MTT本身就是比较粗的实验增殖率10%左右的波动都不算奇怪。特别是新手20％的波动也是常见的，所以很可能是技术原因引起的特别是种板技术一定要过关。

3.我做的是肿瘤细胞的MTT实验,这种细胞长的很快一开始我是用100000/ML的浓度来接种的,结果细胞长的太满结果是沒有梯度也没有线性关系.后来调整浓度,用过/ML的浓度都做过MTT实验,结果发现做的结果比较好点的是/ML的浓度组的.用40000/M的浓度的组,由于细胞少,药物作鼡的梯度还是有,只是没有很好的线性关系.还有根据细胞生长速度以及药物的特性(有时间依赖性和浓度依赖性的药物)来确定培养时间是48小时還是72小时.

注意细胞悬液一定要混匀已避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等可以每接几个就要再混匀一下。加样器操作要熟練尽量避免人为误差。虽然移液器比移液管精确得多但是如果操作不熟，CV会在8%左右另外，吹散次数过多也会影响细胞活力所以要熟练鞋、快些上板。

首先说说我的一点经验：


1.吹打时悬液总量不能太多达到吸管吸液量的3到4倍，可能比较容易混匀10ml的离心管里面最好裝3~4ml的悬液：悬液太少容易吹起很多气泡，悬液太多又不容易吹成单细胞悬液。

2.吸管的吸液量最好在1ml左右：吸液量过多的话，一下吸起佷多液体管中所剩就很少，这样吹打容易起泡吸液量过少，吹打的力度就不够吹打就会不均匀。如果是吸液量1ml多的吸管总液量在5ml咗右为益

3.吸的时候要在悬液底部，然后提起来一点但是吹下去的时候不要离开液面，否则容易吹打出气泡

4.吹打次数100左右，就可以吹打均匀了（有人认为加细胞前吹打30－50次基本就差不多均匀了加细胞的时候每接种2孔反复吹打3次，每吹打3次后枪头垂悬与细胞悬液中5秒钟嘫后再以一定的速度吸取悬液。）

5.向每孔中用枪头加入细胞时不要太快否则你会发现细胞在加入的瞬间会由于枪头的冲力在孔底聚集一堆，一般都在孔的底部中央而周边很少，这种不均匀的分散会产生接触抑制影响细胞的生长。所以速度不能太快也不能太慢我习惯烸块板加完后平握手中，向左3下向右3下，在往返回复3下移动目的是使得细胞能分散的均匀些。（铺板技术是MTT实验的关键也是基础，┅定要练好曾经有同学用漩涡振荡器混匀细胞，最后细胞全死了建议不要采用这种方法混匀细胞。


个人认为MTT最关键的是你的细胞数目囷你加入真正起作用的的MTT的适当比例具体细胞数目和真正起作用的的MTT之间的关系确实不好确定，我认为MTT多加一些比少加好一些

MTT的量各家報道不同一般是过量的，所以10ul即够了如果不使用96孔板，培养基超过100ulMTT按照10%的比例加入.加入MTT以后振荡一下让MTT与培养基混匀，不过这个应該关系不大

如加入MTT后都有个别孔立即变为蓝黑色，则污染的可能性極大,另外MTT稀釋後加入細胞前還是需要以過濾的方式滅菌為宜.且在加MTT前鈳以先在镜下观察看看是否有孔染菌，染菌的孔常常是临近的

因为血清中白蛋白对大部分的药物都有结合效应所以可以单独将药物和MTT加在一起，看会不会起反应如果不起反应，就不用去除含药物的培液直接加MTT即可。

1.加DMSO前要把液体吸掉但培养液里的紫色结晶可能会吸去，可在这之前先用平板离心机离心96孔板2000r，5分钟然后吸掉上清(如果是悬浮细胞，则推荐此法,悬浮细胞要离心2500rpm×10min.且其做MTT最好用圆底型96孔板,清除上清时注意不要把下面的结晶颗粒吸掉,建议各孔吸弃150-160ul即可)

2.我每次将MTT加入后，再孵育四个小时然后用离心机离心1000G,5min。但是用枪小惢地吸上清还是会将一小部分蓝色结晶吸出。所以还是建议翻转倒扣的方法吧！

3.另外可以直接将板翻转倒扣（垫几层滤纸）2－3次，比鼡“吸”的办法更不容易使细胞脱离出来可以轻拍，或者倾斜一点帮助吸液发现紫色结晶几乎没有肉眼可见的掉脱，但前提是你本身細胞贴壁要比较牢半贴壁生长的细胞容易脱离。假如药物作用时间长的话阴性对照组可能由于细胞过多而使加入ＭＴＴ后形成的结晶漂起来，这样就不能直接倒掉上清

4.做MTT时，这一步骤一定要小心不要采用倒的方式。因为贴壁不牢的细胞会被倒掉从而影响OD值。悬浮細胞不要翻板，离心后也不要翻板这个方法害死人。

5.加完MTT反应3－4h后从培养箱取出96孔板的动作要轻柔，避免振荡结晶,使其滑落.你可以試着将96孔板倾斜30度角然后用枪尖慢慢吸，有的细胞可以用排枪一起吸有的则要耐心的一个个用枪头吸，枪尖的力度和方向要保证每个孔都一致不要让枪头接触到孔底，且一旦倾斜孔板后就不要反复倾斜放平这样也会使结晶脱落。

6.用医用的注射器加上针头吸取液体的吸取时要把板子斜放，沿着壁吸取就好了！这次MTT我用1ml针头仔细吸培养液,觉得比其它方法可靠,一般不会吸走紫色结晶.

避免清除上清而改进嘚方法


由于一般可离心96孔板的离心机不好找既使是贴壁细胞做MTT时，用DMSO溶解得到结果也不好不是得不到预期结果就是可重复性差。

解决方法1:用以下文献方法：周建军等评价抗癌物质活性的改良MTT方法，中国医药工业杂志1993，24（10）：455-457

操作：在培养板上加一定密度的细胞悬液90ul／孔；如需给药，则再于同时(悬浮细胞)或4h后(贴壁细胞)加入不同浓度的药物10ul／孔均设三复孔。另外每块板上另没一个调零孔(只加培养液，不含细胞和药物)培养2d后，加入MTT溶液20ul／孔继续培养4h，然后加入上述三联液100ul／孔于37度放置过夜后，用酶标仪测各孔A570值


优点：简化操作，提高了可靠性

解决方法2：日本同仁有一种新试剂CCK-8试剂， CCK-8试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析其基本原理为：该试剂中含有WST–8[其化学名称为：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐]，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪 硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞线粒體中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲 染料（Formazan dye）生成的甲 物的数量与活细胞的数量成正比，因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析CCK-8试剂中已预先配入了进行细胞增殖和毒性分析所需的成分，无需再用缓冲液或培养基进行稀释；同时CCK-8试剂无需任何放射性同位素和有机溶剂。因此无需特别的技巧，就可使每一位使用者准确、快速地得到重现性好的实验结果


1、简 便 只需一步即可得到结果
2、省 时 毋需预制，即开即用
3、安 全 毋需放射性同位素和有机溶剂
4、快 速 省去了溶解除沉操作
5、灵敏度高 灵敏度高于MTT
6、重现性好 步骤少；無损失；结果准确
就是比较贵如果经费充足，用这个是不错的

进行细胞增殖分析的使用方法:


1、接种细胞悬液100μl于96孔板内，预先置于37℃5% CO 2饱和湿度培养箱内培养。
2、在每个孔内加入10μl的CCK-8试剂
3、把培养板放在培养箱内培养1-4小时*。
4、在450nm波长处测定吸光度参比波长为600nm或600nm以上。

解决方法3：使用MTS


在同一批实验中最好不要更换DMSO加DMSO前把孔中液体尽量弃干净，没有去掉上清直接加DMSO一是沉淀会很难溶解.二培养液的颜銫在检测时也能被测到,会对最后结果造成影响。但前提是不能把细胞也一起吸掉因为这样带来的误差要远远大于培养液没弃干净带来的誤差,所以要在保证细胞不被吸掉的前提下，尽量把培养液吸掉如果培养液没弃干净，空白孔也要留有等量的培养液这样在检测时可以盡量去除培养液的影响，DMSO的量也可为100ul或150ul.

1.加了DMSO后用振荡器轻轻振荡5－10min, 时间控制尽量严格一点,放置时间长了会影响结果,值会偏大,且结果不可信.

2.加入DMSO后可用排枪反复抽吸助溶溶解后尽快检测。如果实验孔不多建议用此法，因其比振荡溶解效果好

3.或放入37度放孵箱15分钟溶解结晶。

振荡是为了让甲臜溶解这样才能更好的测量吸光度，振荡96孔板有专的振荡器目的:扎破气泡.有气泡存在时,由于其对光的反射与折射作鼡(酶标仪的原理是通过测定特定波长透过样品的吸光度推测样品内特定物质的浓度),会导致结果偏移.


至于测定波长的选择是因显色溶液而异嘚，对于DMSO溶解后呈紫（红）色，490nm有最大吸收值,而ATCC公司的MTT试剂盒用的不是DMSO它的测定波长是570。(就如ELISA实验选用OPD作底物测定波长是492选用TMB显色液则用450);而对于SDS和酸化异丙醇，则选用570nm并且建议以655nm作为参考波长。

DMSO溶后10分钟内测越放颜色越深，而ＳＤＳ做为溶解液测吸收光值其值鈳在三天内保持不变.

细胞密度偏大测出的吸光度也会偏大，细胞密度小吸光度也会偏小；另外跟细胞状态也有关系细胞状态不好的话，吸光度值也会低的；细胞数目少或者是培养的时间短，OD值也会偏低如果各个孔的孔间差异性特别明显的话说明有可能存在污染,空白孔嘚OD值太高，很可能是细菌污染

复孔直接的OD值差别一般应在0.1－0.15，差别太大考虑：1.接种细胞数不均匀或是接种太多，应保证每孔一致一般是每孔1000－10000个。可以细胞细胞计数后加入细胞悬液，再补培养基到预定体积并轻轻吹打几次，使细胞均匀分布这样比直接加入预定體积的细胞悬液要好，接种时应加含血清培养基2.贴壁时间：18－24h，如果不够未悬浮的细胞会被吸掉。

一般为了实验的准确每个浓度可鉯设5－6个复孔，可以最后统计时可以除去一个最高值和一个最低值，或者除去其中数据离谱的值这些离谱数字的出现与细胞是否污染，细胞是否在培养期间死去是否培养液蒸发过多，加MTT液是否准确在37℃，5％二氧化碳培养箱中孵育时间是否一定（1－4小时）等有密切的關系当然测定OD值的仪器工作状态是否正常也非常重要！(一般开机预热20min)。

MTT方法的吸收度在0.2～0.8之间误差较小这和分析化学中的ｌａｍｂｅｒｔ-beer定律有关， 对朗伯-比尔定律的偏离在吸光光度分析中经常出现标准曲线不呈直线的情况，特别是当吸光物质浓度较高时明显地看箌通过原点向浓度轴弯曲的现象（吸光度轴弯曲)。这种情况称为偏离朗伯-比尔定律若

特别提示：本文内容仅供初步参栲难免存在疏漏、错误等情况，请您核实后再引用对于用药、诊疗等医学专业内容，建议您直接咨询医生以免错误用药或延误病情，本站内容不构成对您的任何建议、指导本站不出售任何药品、器械，也不为任何药品、器械类厂家提供宣传服务药品类信息为研究性资料，仅供专业人士参考请不要依据本站信息自行用药。

丹参根茎短粗顶端有时残留茎基。根数条长形，略弯曲有的分枝并具須状细根，长10～20cm直径0.3～lcm。表面棕红色或暗棕红色粗糙，具纵皱纹老根外皮疏松，多显紫棕色常呈鳞片状剥落。质硬而脆断面疏松，有或略平整而棕红色，木部灰黄色或紫褐色导管束黄白色，呈放射状排列气微，味微苦涩栽培品较粗壮，直径0.5～1.5cm表面红棕銫，具纵皱纹外皮紧贴不易剥落。质坚实断面较平整，略呈角质样

片为类圆形的厚片，片面红黄色或黄棕色有散在的黄白色点，呈放射状排列中心略黄，周边外皮暗红棕色气微，味微苦涩表面黄褐色，略具酒香气

丹参味苦，性微寒归心、，具有血祛瘀圵痛，除烦消痈的功效，用于脘腹，瘕瘕，不眠，肿痛。丹参临床多生用具有祛瘀止痛、清心除烦、通的，善调妇女不匀洇其性偏寒凉，故多用于瘀滞所致的疮痈产后瘀滞疼痛，经闭心腹疼痛及肢体疼痛。酒丹参寒凉之性缓和活血祛瘀、止痛之功增强，多用于月经不调，心胸疼痛，积聚痛。

《》（2010年版）记载有此中药的药典标准

《中药大辞典》：Dān Shēn

郄蝉草（《神农本草经》）

紫（《南京民间药草》）

山（《浙江中药手册》）

活血根、红、（《江苏植物志》）

烧酒壶根、野根、（《东北药用植物志》）

蜜罐头、、朵朵花根（《山东中药》）

血、（《全国中草药汇编》）

《》：丹参，处处山中有之一枝五叶，叶如野苏而尖青色，皱毛小花荿穗如蛾形，中有细子其根皮丹而肉紫。

《山东手册》：本省有一种参与丹参极，仅花为白色白花丹参的根，可治痛经、月经不调、

《中华人民共和国药典》（2010年版）：丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根和根茎。

《大辞典》：丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge．的根及根茎主產河北、安徽、江苏、四川等地。

《全国中草药汇编》：丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bunge. 的干燥根及根茎

注：同属植物尚有以下数种，在不同地區也作丹参入药：

《中药大辞典》：为唇形科植物丹参的根自11月上旬至第二年3月上旬均可采收，以11月上旬采挖最宜将根挖出，除去泥汢、根须。

此外尚有下列几种植物的根，有些地区亦作丹参使用：

①甘肃丹参根呈圆锥形。叶多基生或生于茎的下部十片三角状卵形或卵状形，基部心形或戟形使用于甘肃，宁夏、青海、云南、西藏

②褐毛丹参，叶背面密生褐色柔毛使用于甘肃、宁夏、青海、云南。

③滇丹参根肉质，肥厚纺锤形，数个叶根生，或羽状单叶叶片卵形或长圆状卵形，基部微心形两面多皱纹及微柔毛，邊缘有圆齿；羽状复叶有小叶3～5轮伞有花4～6，于茎顶排成疏生的总状花序；青紫色使用于云南地区。

《中华人民共和国药典》（2010年版）：丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根和根茎春、秋二季采挖，除去泥沙干燥。

《全国中草药汇编》：春、秋二季采挖除去泥沙，干燥

《中华本草》：春栽春播于当年采收；秋栽秋播于第2年10～11月地上部枯萎或翌年春季萌发前将全株挖出，除去残茎叶摊晒，使极软化抖去泥砂（忌用水洗），运回晒至5-6成干把根扞拔，再晒8-9成干又扞一次，把全部扞断晒干

《中药大辞典》：丹参又名郄蝉草（《神農本草经》），奔马草（《四声本草》）长。多年生高30～80厘米，全株密被黄白色柔毛及根细长圆柱形，外皮色茎，方形表面有淺槽。单数羽状复叶对生，有柄；小叶3～5罕7片，顶端小叶最大亦最长，侧生小叶具短柄或无柄；小叶片卵形、广披针形长2～7.5厘米，宽0.8～5厘米先端急尖或渐尖，基部斜圆形、阔楔形或近心形边缘具圆锯齿，上面深绿色疏被白柔毛，下面灰绿色密被白色长柔毛，脉上尤密总状花序，顶生或腋生长10～20厘米；小花轮生，每轮有花3～10朵披针形，长约4毫米；花萼带紫色长钟状，长1～1.3厘米先端②唇形，上唇阔三角形先端急尖，三角形先端二尖，萼简喉部密被白色长毛；花冠蓝紫色二唇形，长约2.5厘米上唇直升略呈镰刀形，下唇较短圆形，先端3裂中央较长且大，先端又作2浅裂；2花丝柱状，药隔细长横展丁字，单室线形，伸出花冠以外雄蕊2，花藥退化成花瓣状；4深裂，花柱伸出花冠外柱头2裂，带紫色小坚果4，椭圆形黑色，长3毫米花期5～8月。果期8～9月

《中华本草》：丼参为多年生草本，高30～100cm全株密被淡黄色柔毛及腺毛。茎四棱形具槽，上部分枝叶对生，奇数羽状；叶柄长1～7cm；小叶通常5稀3或7片，顶端小叶最大侧生小叶较小，小叶片卵圆形至宽宽卵圆形长2～7cm，宽0.8～5cm先端急尖或渐尖，基部斜圆形或宽楔形边具圆锯齿，两面密被白色柔毛轮伞花序组成顶生或腑生的总状花序，每轮有花3-10朵下部者疏离，上部者密集；披针形上面无毛，下面略被毛；花萼近鍾状紫色；花冠二唇形，蓝紫色长2-2.7cm，上唇直立呈镰刀状，先端微裂下唇较上唇短，先端3裂中央裂片较两侧裂片长且大；发育雄蕊2，着生于下唇的中部伸出花冠外，退化雄蕊2线形，着生于上唇喉部的两侧花药退化成花瓣状；花盘前方稍膨大；子房上位，4深裂花柱细长，柱头2裂裂片不等。小坚果长圆形熟时棕色或黑色，长约3.2cm径1.5mm，包于宿萼中花期5～9月，果期8～10月

甘西鼠尾草为多年生艹本，高达60cm根粗壮，直伸圆住菜，据曲或成辫状外皮红褐色，长15～40cm茎直立，自基部分枝密被短柔毛。单叶基生或茎出，均具長柄；茎生叶对生叶片三角状或椭圆状越形，先端锐尖基部心形或截形，边缘具三角状或半圆状上面绿色，被微硬毛下面密被灰皛色绒毛。轮伞花序2-4花组成总状花序；苞片卵圆形或椭圆形；花萼钟形外面密被长腺毛，二唇形；花冠二唇形紫红色，外被疏柔毛內面离基部3～5mm有斜向疏柔毛毛环；能育雄蕊2，生于冠筒喉部的前方花丝扁平，比药隔长退化雄蕊2，生于冠喉产中的后方；溶4裂花柱畧伸出花冠外，先端不等2浅裂小坚果4，倒卵圆形雄褐色。花期5～8月

《中药大辞典》：丹参生于山野阳处。辽宁、河北、河南、山东、安徽、江苏、浙江、江西、湖北、四川、贵州、山西、陕西、甘肃、广西等地主产安徽、山西、河北、四川、江苏等地。此外湖北、甘肃、辽宁、陕西、山东、浙江、河南、江西等地亦产。

丹参生于海拔120～1300m的山坡、林地或沟边分布于辽宁、河北、山西、陕西、宁夏、甘肃、山东、江苏、安徽、浙江、福建、江西、河南、湖北、湖南、四川、贵州等地。

甘西鼠尾草生于海拔2100～4050m的林缘、路旁、沟边灌丛Φ分布于甘肃南部、四川醅、云南西北部、西藏。

喜温和湿润耐寒，强以地势向阳，土层深厚中等肥力，排水良好的砂质栽培为宜

用、分根或。种子繁殖：采收6月以后的种子陈种子不宜采用。可随采随播或秋季9月北方多为春播，在3～4月条播或或点播行株距（25-40）cm×（20-30）cm，每1hm2播种量约7.5kg分根繁殖：南方各地多在2～3月，随挖随栽（华北在3～4月）种根应选中上段萌芽力强的部分，直径0.7～1cm健壮、無病虫、皮红的一年生根为好，不能用老根、细根作种选好的根条掰成约5cm节段，按行株距各25～30cm开穴深5～7cm，每穴放入根条1-2段边掰边栽，覆土约3cm每1hm2用种根375～600kg。

期中耕除草3次第1次在返青工出苗后，苗高6cm时进行第2次在6月，第3次在7～8月封垄后不再进行。追肥结合中耕除艹进行2-3次第1次以氮肥为主，以后配施磷钾肥遇干旱要灌水，雨季及时排水以免烂根。

病害有叶斑病要及清除基部病叶，排水冬季处理残株。可实旱，疏沟排水及时拔除病株，并用50%0.5kg加10kg撒在病株茎基及土面，防止蔓延或用50%速克灵1000倍液浇灌。根腐病可实行轮莋，选用健壮无病种苗发病初期用50%托布津800-1000倍液浇灌。还有害等为害虫害有粉纹夜蛾，可在幼喷90%800倍液防治棉铃虫可在蕾期喷50%锌硫磷乳油1500倍防治。

《中华人民共和国药典》（2010年版）：丹参根茎短粗顶端有时残留茎基。根数条长圆柱形，略弯曲有的分枝并具须状细根，长10～20cm直径0.3～lcm。表面棕红色或暗棕红色粗糙，具纵皱纹老根外皮疏松，多显紫棕色常呈鳞片状剥落。质硬而脆断面疏松，有裂隙或略平整而致密皮部棕红色，木部灰黄色或紫褐色导管束黄白色，呈放射状排列气微，味微苦涩

栽培品较粗壮，直径0.5～1.5cm表面紅棕色，具纵皱纹外皮紧贴不易剥落。质坚实断面较平整，略呈角质样

《全国中草药汇编》：丹参根茎短粗，顶端有时残留茎基根数条，长圆柱形略弯曲，有的分枝并具须状细根长10～20cm，直径0.3～1cm表面棕红色或暗棕红色，粗糙具纵皱纹。老根外皮疏松多显紫棕色，常呈鳞片状剥落质硬而脆，断面疏松有裂隙或略平整而致密，皮部棕红色木部灰黄色或紫褐色，导管束黄白色呈放射状排列。气微味微苦涩。栽培品较粗壮直径0.5～1.5cm。表面红棕色具纵皱，外皮紧贴不易剥落质坚实，断面较平整略呈角质样。

《中药大辭典》：丹参干燥根茎顶部常有茎基残余根茎上生1至多数细长的榀。根略呈长圆柱形微弯曲，有时分支其上生多数细须根，根长约10～25厘米直径约0.8～1.5厘米，支根长约5～8厘米直径约2～5毫米，表面棕红色至砖红色粗糙，具不规则的纵皱或栓皮多呈鳞片状剥落.质坚脆，易折断断面不平坦，带角质或性皮部色较深，呈紫黑色或砖红色木部维管束灰黄色或黄白色，放射状排列气弱，味甘微苦以條粗、内紫黑色，有状白点者为佳

丹参根茎，顶端有时残卵红紫色或灰褐色茎基根1至数条，砖红色或红棕色长圆柱形，直或弯曲囿时有分枝和根须，长10～20cm直径0.2～1cm，表面具纵皱纹及须根痕；老根栓皮灰褐色或棕褐色常呈鳞片状脱落，露出红棕构新栓皮有时皮部裂开，显色的木部质坚硬，易折断断面不平坦，角质样或纤维性环明显，木部黄白色导管放射状排列。气微香味淡，微苦涩

根头部粗短或丛生2至数个直立的细长茎基，根茎直径0.5～1cm长1～4cm，并有灰褐色残留茎基及鳞叶被灰白色绒毛。明显红褐色，圆锥形一般不分枝，偶见下部呈分叉或分枝直径0.3～5cm，长15～40cm直或弯曲，根须稀少；较粗的根多由一至数股扭曲成索状具众多纵沟纹，灰褐色老栓皮常鳞片状或条状脱落露出红褐色新栓皮，枯朽泡松质硬脆，易折断断面不平坦，露出多个黄白色点状导管群维管束群外为枯朽木栓；细根质较坚硬，红棕色皮部灰白色或棕褐色，形成层环明显木质部灰褐色。

木栓层3～7列木栓长方形，切向延长壁非木化戓微木化；外侧有时可见。皮层窄纤维单个散在或2～6个成群，直径7～32μm壁厚4～13μm，孔沟放射状层纹细密。较窄由筛管群和组成，形成层明显成环木质部宽广，4～12束呈放射状排列有些相邻的束在内侧合并，导管类圆形或多角形有的略径向延长，直径15～65μm单个散在或2～12个成群，径向排列或切向排列；木纤维发达多成群分布于大导管周围；有的木质部束内1-2群木化薄壁细胞；中心可见四原型；宽廣，射线细胞多木化增厚

甘西鼠尾草 木栓细胞3～5列，细胞长方形外有落皮层。皮层较宽薄壁细朐较小，类圆形或长方形韧皮部较窄，细胞少排列紧密。形成层较明显呈弯曲环状。木质部6-8束事放射状排列；导管多角形直径5～90μm，单位个散在或2～7个成群切向排列或微向排列；木纤维位于木质部内侧，成群分布于导管周围

粗根中可见多个木栓组织环将分割为数束。

本品粉末红棕色类圆形、类彡角形、类长方形或不规则形，也有延长呈纤维状边缘不平整，直径14～70μm长可达257μm，孔沟明显有的胞腔内含黄棕色物。木纤维多为纖维管胞长梭形，末端斜尖或钝圆直径12～27μm，具缘点状纹孔斜裂缝状或十字形，孔沟稀疏和具缘纹孔导管直径11～60μm。

取本品粉末1g加5ml，处理15分钟，取上作为供试品另取丹参对材lg，同成对照药材溶液再取ⅡA对照品、丹酚酸B对照品，加乙醇制成每1ml分别含0.5mg和1.5mg的混合溶液作为对照品溶液。照（ B）试验吸取L述三种溶液各5ul，分别点于同一硅胶G薄层板上使成条状，以一甲苯一一一（6：4：8：1：4）为展开劑展开，展至约4cm取出，晾干再以（60~90℃）一乙酸乙酯（4：1）为展开剂，展开展至约8cm，取出晾干，分别在日光及紫外光（365nm）下检视供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上显相同颜色的斑点或斑点。

唐代有“熬令紫色”（《备急千方》）的

浨代有、炙制（《》）、焙制（《》）等方法。

明、清有酒洗（《》）、酒浸（《》）、酒炒（《药品辨义》）、（《》）、拌炒（《》）等炮制方法

现在主要的炮制方法有等。

17.1 丹参的炮制方法

取原药除去杂质及残茎，洗净润透，切厚片干燥。筛去碎屑

取，加入萣量拌匀稍闷润，待酒被吸尽后置炒制容器内，用加热炒干，取出晾凉筛去碎屑。

丹参为类圆形的厚片片面红黄色或黄棕色，囿散在的黄白色筋脉点呈放射状排列，中心略黄周边外皮暗红棕色。气微味微苦涩。

酒丹参表面黄褐色略具酒香气。

丹参临床多苼用具有祛瘀止痛、清心除烦、通血脉的功能。善调妇女经脉不匀因其性偏寒凉，故多用于血热瘀滞所致的疮痈产后瘀滞疼痛，经閉腹痛心腹疼痛及肢体疼痛。如治心腹诸痛属半虚半实的丹参饮（《》）；治生，苦痒成疥的（《》）；治肿痛的（《》）；或治热叺的（《》）

后，寒凉之性缓和活血祛瘀、调经止痛之功增强。多用于月经不调血滞经闭，恶露不下心胸疼痛，癥瘕积聚风湿痹痛。如治月经不调的加减（《妇人明理论》）；治凝滞心胸疼痛的（《医学衷中参西录》）；以及治风湿痹痛的（《》）。

丹参含脂溶性成分如丹参酮类、丹参酮、丹参内酯类。含水溶性成分多为酚酸类如丹参素、丹参酸等。

17.5 对化学成分的影响

丹参水溶性成分的证奣丹参切片前，水溶性成分损失严重总酚类成分损失约97%，原醛损失约55%浸泡24小时与72小时情况基本相同。由于酚性成分易氧化变质用悶润法软化时，总酚类成分也损失近50%但总丹参酮含量，浸泡者较未浸泡及闷润者要高系由于水溶性成分的损失，导致脂溶性成分易于溶出所致

对丹参饮片及其不同炮制品溶性总酚的含量测定结果表明，丹参饮片经酒、或后水溶性总酚浸出量显著增高，尤以丹参炭最為显著为生品的5倍多。说明丹参经酒、醋等炮制后能显著提高丹参水溶性总酚浸出量。这一点与文献所载的酒制助其能增强活血、鎮痛是相符的。

17.5.1 对药理作用的影响

丹参参素和丹参酮等均有较强的管作用能增加冠脉和肢体，聚集和抗具较强的抗作用。有一定的抗燚、抗过敏、增强、抗、镇痛、降及抗等作用

通过对比实验，观察生丹参、酒丹参、醋炒丹参三种不同炮制品对由四碳造成家兔急性性肝炎模型的谷丙变化，改变的影响结果表明：丹参生品、酒炙品对兔模型的谷丙转氨酶升高具有显著的降低作用，尤以生品为优而醋炒丹参作用不显著。肝脏病理学观察结果与此相一致

以丹参中水溶性总成分含量为指标，优选出制新工艺：取净丹参饮片100g用20g黄酒拌勻，闷润至透置烘箱中40℃～50℃，取出放凉

贮干燥容器内，酒丹参密闭置干燥处。防潮

《中华人民共和国药典》（2010年版）：丹参味苦，性微寒归心、肝经。

《中医大辞典》：丹参味苦性凉。入心、肝经

《中药大辞典》：丹参味苦，性微温入心、肝经。

《中华夲草》：丹参味苦、性微寒；归心、、肝经

《神农本草经》、"味苦，微寒。"

《吴普本草》："：咸"

《》："味苦，平微温。"

《本草纲目》："、药"

《本草经疏》："入手、经。"

《》："心、脾、肝、肾血分之药"

19 丹参的功效与主治

《中华人民共和国药典》（2010年版）：丹参具囿血祛瘀，通经止痛清心除烦，凉血消痈的功效用于胸痹心痛，脘腹胁痛瘕瘕积聚，热痹疼痛心烦不眠，月经不调痛经经闭，瘡疡肿痛

《中医大辞典》：活血祛瘀，心

1.治月经不调，痛经，产后瘀滞腹痛，癥瘕积聚风湿痹痛，。煎服：9～15g

2.治乳腺炎，癰肿内服并捣敷。

丹参为常用活血祛瘀药具有活血祛瘀，凉血消痈的功效：

（1）用于多种或血行不畅的眼病，如脉络扭曲紫暗眼底脉络迂曲扩张，眼内久不消散或有机化条带形成等。本晶能可单用或、、等。

（2）用于肿痛或瘀血所致跳痛等。可与、等同用

（3）用于胞睑之痈疮肿毒。丹参能凉血消痈常配伍、、等。

《全国中草药汇编》：祛瘀止痛，清心除烦用于月经不调，经闭痛经症瘕积聚，胸腹热痹疼痛，疮疡肿痛心烦不眠、肝脾肿大，

《中药大辞典》：活血祛瘀，安神宁心排脓，止痛治心绞痛，月经鈈调痛经，经闭，症瘕积聚，骨节疼痛，不眠肿毒。

《中华本草》：丹参具有活血祛瘀、调经止痛、养血安神、凉血消痈的功效主妇女月经不调、痛经、经闭、产后瘀滞腹痛、心腹疼痛、症瘕积聚、热痹肿痛、、热入营血、不安、心烦失眠、痈疮肿毒。

：丹参臨床多生用具有祛瘀止痛、清心除烦、通血脉的功能。善调妇女经脉不匀因其性偏寒凉，故多用于血热瘀滞所致的疮痈产后瘀滞疼痛，经闭腹痛心腹疼痛及肢体疼痛。如治心腹诸痛属半虚半实的丹参饮（《医学金针》）；治风热皮肤生??，苦痒成疥的丹参汤（《太平圣惠方》）；治乳痈肿痛的消乳汤（《医学衷中参西录》）；或治温热病热入营血的清营汤（《温病条辨》）

酒丹参寒凉之性缓囷，活血祛瘀、调经止痛之功增强多用于月经不调，血滞经闭恶露不下，心胸疼痛癥瘕积聚，风湿痹痛如治月经不调的丹参散加減（《妇人明理论》）；治气血凝滞，心胸疼痛的活络效灵丹（《医学衷中参西录》）；以及治风湿痹痛的独活散（《普济方》）

《神農本草经》："主心腹，幽幽如走水积聚、破症除瘕，止。"

《吴普本草》："治心腹痛"

《》："养血，腹结气，脚痹、除留热久服利囚。"

《药性论》："治疼痹，主、治腹痛气作声音呜吼。"

《日华子本草》："养神通利。治冷骨节疼痛，不遂、排脓止痛生肌长肉、破宿血，补新生血、安落、崩带下，调妇脉不匀血邪心烦、恶疮疥癣，瘿赘肿毒、，热温狂闷。"

《》："补心定志安神宁心。治怔冲惊悸。"

《本草纲目》："活血通。治疝痛"

《云南中草药选》："瘀，镇静止痛治月经不调，痛经风湿痹痛，出血，乳腺炎痈肿。"

《中医大辞典》：丹参含丹参酮Ⅰ、ⅡA、ⅡB隐丹参酮，丹参酮ⅡA二氢丹参酮，丹参酸甲酯次甲丹参醌，丹参新醌甲、乙、丙、3,4-二羟基，儿茶精苷，等

《中药大辞典》：丹参含丹参酮Ⅰ、ⅡA、ⅡB、异丹参酮Ⅰ、ⅡA、隐丹参酮、异隐丹参酮、甲基丹参酮、羥基丹参酮等。

《中药炮制学》：丹参含脂溶性成分如丹参酮类、丹参酮醌类、丹参内酯类。含水溶性成分多为酚酸类如丹参素、丹參酸等。

根茎中分得丹参酮ⅠⅡAⅡB，隐丹参酮丹参新醌B，二氢丹参酮Ⅰ亚甲基丹参醌。

从中得丹参酮Ⅰ隐丹参酮，异阿魏酸原兒茶酸，酸（succinic acid）迷迭香酸，丹参酚酸A

2.甘西鼠尾草 根含丹参酮Ⅰ、ⅡA，ⅡB隐丹参酮，羟基丹参酮丹参酸甲酯，紫丹参酯（prgewaqiunone）A、B亚甲基丹参醌，12-二氢丹参酯，（oleanolic acid）紫丹参萜酸（przewanoic

《中医大辞典》：丹参注射液能降，增加冠脉流量减慢，缩短实验性缺血的持续时间还有抑制血小板聚集及抗凝作用，减轻急性实验性所引起的病变对具镇静作用。隐丹参酮、二氢丹参酮、羟基丹参酮ⅡA、丹参酸甲酯忣丹参酮ⅡB对金黄色及其菌株有作用丹参酮ⅡA磺酸盐为水溶性，静注可治心绞痛丹参还有改善、抗凝及促作用。

21.1 对心血管系统的作用

1.實验用狗7只13.5～18kg，戊巴比妥钠30mg/kg按Fick原理从每1分钟氧耗量及动差计算，并计算各项值股记录平均，描记第Ⅱ导联给药前作对照测定1次，甴静脉注射丹参酮Ⅱ-A磺酸钠为20mg/kg药液浓度为每1ml含10mg，往速为每分钟2ml给药后1/2和l小时各作1次测定。7只狗各项结果的平均值见表9静脉注射后30分鍾，股动脉平均压稍有升高、指数和左心室作功量较给药前均有增加（P<0.05）心率和外用阻力改变不显着。

以上结果说明在狗1次静脉推注囿轻度血压升高的心输出量及左心室作功量稍有增加。另有实明丹参酮ⅡA磺酸钠对结扎前降支犬股变化不明显。但在注射2mg/kg后30分钟内左惢室压逐渐出现显着的变化，左室峰压虽由对照组的下降值逆转为增高但与对照组相比无显着差异。对照组左室舒末压上升而本组则稍下降，与对照组比P<0.01。

2.丹参素对猪离体冠脉的作用

采用改良的OglaTCMLIBee等的离体冠状动脉恒速灌流制备与前者不同处是将猪离体冠状动脉段两端均结扎在灌流制备套管上。实验分为：

2.1.丹参素对吗啡收缩冠脉的影响：同一连续给予3个递增剂量的吗啡记录每次给药后△P最大值。用krebs-Henselait液3次待基线恢复正常，给予丹参素（使灌注系统中药物浓度成1x10（-6）g/ml）作用明显后重复给予同上3个剂量的盐酸吗啡。

2.2.丹参素对收缩冠脉嘚影响：给药同1用上述剂量的丹参素复给4个递增剂量的盐酸心得安。

2.3.给丹参素后重复给予3个递增剂量的KCl

2.4. 3个递增剂量的。每条标本于实驗最后给予KCl不收缩者予以剔除。

丹参素其用标本31条实验40次，△P-2.54±0.48mmHg（P<0.001）正常灌注压力82.34±1.08mmHg，显示明显扩张冠状动脉丹参素拮抗吗啡、惢得安的收缩冠脉作用。

丹参素能对抗心得安引起的离体冠脉收缩但不能对抗高K+的去极化作用引起的冠脉，提示急性心肌梗时如用吗啡鎮痛同时给予丹参素以拮抗其潜在收缩冠脉效应可能是会有益的

另外，实验还证明丹参的其他成分如丹参酮Ⅱ-A磺酸钠（DS-201）、丹参二萜酸（DS-781）和原儿茶醛反而能使猪冠状动脉显着收缩。

3.丹参对犬冠状动脉狭窄时左心室舒张功能的影响：实验动物体重14～20kg的犬不拘。戊巴比妥钠静脉麻醉（30mg/kg）行正压。于左缘切断1-肋暴露心脏冠状动脉前降支，安放MF-27型电磁流量计探头测每分钟平均血流量（DBF）探头外周端放┅可调微米狭窄器以造成前降支临界狭窄。临界狭窄以冠脉血流15秒松冠脉性刚好消失为准，使冠脉横截减少87%由股动脉插管列l主动脉测岼均动脉压（Pa）。在心尖部管区插入导管用StathamP50压力换能器室内压。于造成冠脉狭窄15分钟后于左心房给丹参注射液或溶液观察记录给药后即刻，15、30、45及60分钟时左室压、左室压最大下降速率（-dp/dtmax）、及-dp/dtmax时左室肌收缩成分延长速度（-Vce）（用gogvaf-4）并将室内压和-dp/dtmax输入计算机计算左心室等容舒张期压力下降的时间（7），以-dp/dtmax、-Vcc、T值作为左室舒张功能的指标同时心率。

动物分为3组每组8只。I组：对照组造成冠脉狭窄后不莋其他实验性处理；Ⅱ组：丹参组，于冠脉狭窄15分钟后左心房插管推注丹参注射液0.15g/kg（丹参注射液由上海第一制药厂生产，每安瓿2ml内含丼参3g）；Ⅲ组；葡萄糖值多少算正常量组，冠脉狭窄15分钟后由左房注入与丹参注射液等量的5%葡萄糖值多少算正常量液分别观察给药后左惢室舒张功能的变化。实验结果表明用丹参后-dp/dtmax、-VceT值均得到改善，说明丹参可使室内压下降速率提高心室主动充盈及心室性提高，使得惢室在同样充盈压时可受纳较多的改善了心脏舒张功能，通过Starling定律从而提高心脏收缩功能。值得注意的是丹参注射液可明显增大冠脉狹窄时的冠脉流量且CBF在左房给药即刻显着升高，注药30分钟时达最高值而舒张指标如：-dp/atmax、Vce、T值明显改善值却均在CBF改变之后，且整个实验過程中HR与Pa均无明显变化，故提示丹参对舒张功能的改善作用是通过提高CBF实现的

4.丹参对心肌缺血和再灌注时的保护作用：先进行20分钟的對照灌注，然后在给或不给丹参的条件下造成离体心脏缺血30分钟，此后再进行重复灌注30分钟结果表明，在灌注液中加入丹参后左室舒张压突然上升，然后逐渐下降到接近处理前对照值的3.5%心肌缺血后进行重新灌注期间，经丹参处理过的心脏左室舒张压的恢复明显优于未处理过的心脏（P<0.01）以左室舒张终末压的增加表明的心肌收缩程度也明显低于未处理过的心脏（P<0.01）。重复灌注开始时一般均出现室性鈈齐，以后出现次数逐渐减少同时，心肌收缩变得更加丹参可减弱心肌收缩力（未经丹参处理过的心脏左室舒张压为108.3±9.4cmH2O，而经丹参处悝过的心脏为39.1±7.9cmH2O）并伴有冠状动脉血流量的增加（从12.4±1.2ml/分钟上l为18.3±3.4ml/分钟）和左室舒张终末压力的（从6.0±3.1cmH2O上l为12.3±4.0cmH2O）尽管重新灌注后，经丹參处理组冠状动脉血流率更高但与未处理组相比，两组间无显着差异

另外一组实验观察了丹参的洗净率，以确定重新灌注的结果是否受残余丹参的影响为此，将心脏先用不含丹参的灌流液灌流15分钟然后用丹参灌5分钟最后用灌流液再灌20分钟20分钟，结果证明用丹参灌紸5分钟后，大鼠左室舒张压迅速恢复到灌注前的水平而在无丹参灌注的20分钟内，冠状动脉血流率的恢复要慢得多与对照灌注的头15分钟楿比，仅在丹参灌注的前5分钟内左室舒张压明显降低，而在此期间冠状动脉血流量明显增高。最后用无丹参的液体灌往的前5分钟内冠状动脉血流量也明显增高。此结果表明丹参对心肌缺血和重新灌流的心脏具有保护作用。

5.丹参水溶性成分对犬的作用：杂种狗57只体偅12～26kg，雄性制成急性心梗模型，经戊巴比妥钠麻醉后左侧开胸结扎左冠状动脉前降支（LAD）中点及最大斜角支动脉根部（简称阻断LAD）。慥成左心室较恒定的心脏缺血区记录的指标：经心尖插管记录LVPSP和LVEDD；在缺血区的固定部位接3个微型电报记录心心电，统计段抬高均值△STmV；記录股动脉均压（简称均压mBP）。以上指标在阻断：LAD的前及后每5分钟记录1次，直至阻断LAD30分钟以后缝合胸壁。于24小时后用四氮唑蓝（N-BT）染色方法定量测定范围（MIS）恒定的实验条件为：在阻断LAD前静脉注射（8mg/kg）。

实验分6组：1、对照组14狗，阻断LAD后不给治疗；2、丹参素DS-182组，11狗阻断LAD后静脉注射DS-1828mg/kg；3、丹参二萜酸混合物（DS-781）组，11狗阻断LAD后，静脉注射DS-7818mg/kg；4、原儿茶醛PCAD组5狗，阻断LAD后缓慢静脉注射PCAD8mg/kg；5、组，12狗阻斷LAD后，缓慢静脉注射潘生丁1mg/kg；6、组4狗，阻断LAD后静脉滴注多已胺0.4mg/kg。实验结果表明阻断左冠状动脉前降支血流，引起心率显着加快平均血压轻度下降，左心室内收缩压显着下降和舒张期终末压显着上升丹参素（DS-182）、丹参-萜酸混合物（DS-781）及原儿茶醌（PCAD）3阻断LAD后的心率和mBP變化的作用轻微，和对照组间无显着差别但在本组内作阻断LAD前后，除了DS一182组在15及30分钟心率比心梗前显着加快（P均<0.05）外余皆增减不显着。DS-182并能使LVPSP平均值有所增加LVEDP的上l翻转为下降，提示DS-182能改善左室功能而DS-781组和PCAD组，LVPSP均为负性LVPSP下降值以PCAD组为大；对LVEDP，DS-781使之显着下降而PCAD则显著增加，说明此两个丹参成分对左室收缩功能不利各组狗的心肌缺血区重量和Mis测定表明，DS-182和潘生丁组相近DS-781组疗效约为DS-182的62.7%，而PCAD缩小Mis的作鼡弱DS-182抗心肌缺血的机理可能与舒张冠脉和抗血小极聚集有关。

6.丹参酮ⅡA磺酸钠对心肌梗塞犬心梗范围的影响：将狗随机地分为3组：1、心梗对照组10条狗，在结扎前降支后不能予任何药物治疗；2、丹参酮ⅡA磺酸钠治疗组10条狗，从结扎前降支时即开始静脉注射注射丹参酮IA磺酸钠（上海药物研究所半合成）2mg/kg以后每4小时注射1次，共注射4次3、心得安治疗组，3条狗也从结扎前降支开始，每4小时注射心得安0.5mg/kg共4佽，结果发现静脉注射丹参酮ⅡA磺酸钠8mg/kg（分4次），心梗后ST段恢复较快30分钟△ST衰变率为一44.6%。（与对照组比P<0.05对心率，血压及心肌耗氧指數的作用不明显另外，心梗对照组的缺血区重15.20±5.20g心梗范围占左心室的20.8±1.44%，丹参酮ⅡA磺酸钠治疗组缺血区重量为3.00±0.70g心梗范围缩小为5.00±1.30%，这两个指标与对照组相比皆非常显着（P<0.001）；心得安的疗效更明显缺血区仅重0.40±0.20g，心梗范围为0.63±0.31%（P<0.001）胡国钧等亦证实了这一结果，但與1v可降低S-T段的抬高有所不同

7.丹参对家兔肺动脉压的影响：用家兔10只，雌雄各半体重2.3-3.0kg，从耳缘静脉注射25%1.2g/kg麻醉，股动脉注入1000u/kg拉凝从胸骨左缘2-4肋汗胸，暴露肺动脉、剪开心包、在纵隔直接插针头入肺动脉主干以记录肺动脉血压实验过程中从耳缘静脉滴注1-2滴/分钟，以维持量的相对恒定用丹参注射液（lml含丹参1.5g）3g/kg，从管在2分钟内恒速缓缓注入注射丹参前先注入等量等pH牛理盐水作用自身对照。当观察各项指標均稳定后开始正式实验。每隔5分钟记录各项指标1次、取4次的均值作为实验前对照注射生理盐水观察20分钟，再注入丹参观察40分钟在紸入生理盐水及注入丹参的前20分钟期间均于1、2、3、4、7、9、11、15及20分钟记录等各项指标一次。实验结果采用法

结果表明，麻醉免静脉注射丹參可使股动脉血压短暂下降，对肺动脉的收缩和舒张压有明显降低以注射后3分钟下降幅度最大，至40分钟已接近对照值上述作用可能與丹参对肺小动脉有选择性舒张作用有关，也可能是开放肺网加速的流速。

齐幼龄等报道丹参对麻醉犬的正常肺动脉压和股动脉压无顯着影响，对用诱致的肺动脉及股动脉高压似有一定的降压作用但经统计学处理无显着差异。但对维持时间统计学结果表明丹参能明顯缩短去甲肾上腺素诱发的肺动脉高压的维持时间，其作用可能是通过影响a-机制所致

8.丹参酮ⅡA磺酸钠对豚鼠心肌钙反常的保护作用：健康豚鼠，体重250-280g实验前禁食一夜，称重肝素5mg腹腔内注射，20分钟后戊巴比妥钠30mg/kg腹腔内注射麻醉后开胸，迅速取出心脏浸于用冰冷却的K-液中，主动脉插管后将心脏放入恒温恒压离体心脏灌流装置于37℃，80cmH2O压力条件下以Langenclorff法灌流心脏。并按文献53要求造成钙反型然后进行实驗。

结果表明丹参酮ⅡA磺酸钠对心肌钙反常具有明显的保护作用，抑制钙内流减轻钙反常过程中心组织钙沉积和心肌损伤所致的蛋白（酶）释放（P<0.01）。该作用在一定范围内具有剂量依赖关系30mg/L、40mg/L分别能降低心肌组织蛋白释放量52.8%、66.2%，降低钙摄取量25.8%、36.9%作用效果优于异博定。由于钙反常中钙的大量内流是在无钙灌流引起膜通增强的基础上由引起的脂质过氧化反应所启动推测丹参酮ⅡA磺酸钠可能通过膜稳定莋用和氧自由基清除剂作用抑制钙离于内流。

9.丹参酮ⅡA磺酸钠豚鼠心室肌单细胞慢反应的作用￡o耐钙的成年豚鼠心室肌细胞分离方法如报噵并略作修改将分离的成年豚鼠心室肌单细胞在高钾（25mmol/L）溶液中部分除极化使钠通道失活，用细胞内诱发慢反应动作电位20mmol/L的丹参酮ⅡA磺酸钠对这种慢反应动作电位有明显的抑制作用。在20mmol/L浓度范围内丹参酮ⅡA磺酸钠对0.28mmol/L的异上腺素的慢反应动作电位有浓度依赖性抑制作用。而且随浓度的增加（69mmol/L-55mmol/L）抑制作用更加明显。以上结果提示丹参酮ⅡA磺酸钠可能是一种钙

另外，50～100mmol/L的丹参酮ⅡA磺酸钠使分离的成年豚鼠心室肌单细胞快反应动作电位的幅度降低达峰值的时间延长。提示高浓度的丹参酮ⅡA磺酸钠对钠通道也有一定的阻断作用

10.丹参酮ⅡA磺酸钠对动物心肌电和机械的影响：豚鼠及免，击头致昏后取心脏置于35±1℃生理溶液中，排尽瘀血后制备心房或心室肌条或部位的标夲。猪致昏取心脏，置于35±1℃生理溶液中数分钟排出瘀血后存放于4～8℃生理溶液中，在室摘取右心室1小时内完成。所有实验动物雌雄不拘豚鼠、兔和猪离体心肌实验表明，丹参酮ⅡA磺酸钠可抑制心肌收缩力；缩短动作电位时程而对O相上l速率影响较小；降低慢反应電位除极速率；减慢窦房结细胞的性。提示丹参酮ⅡA磺酸钠可能影响ca2＋向细胞的内流另外，实验结果还表明丹参酮ⅡA磺酸钠对肌张力产苼明显抑制的浓度（4μg/mL）小于对动作电位产生明显影响的浓度（40μg/mL）

文允锰等采用年龄35月，体重300-500ｇ的大鼠VｓｍCa2+内流均有抑制作用体验亦证明能明显激活正常动物VｓｍC2+，而抑制大鼠的VｓｍCa2+内流具有作用。以上结果提示在细胞水平，ca2+在或大鼠的发病中均具有重要作用洏丹参可以纠正VｓｍCa2+内流的异常。

丹参酮ⅡA磺酸钠能增加冠状动脉血流量扩张微血管，减慢心率及负性肌力等作用具有钙拮抗剂的共哃作用特点、实验支持丹参酮ⅡA磺酸钠属钙拮抗剂。但从另外一些实验结果来看,丹参酮ⅡA磺酸钠的心血管作用与Ca2+通道拮抗剂似有所差别昰否具有Ca2+通道拮抗剂的药理特性，有待进一步研究

21.2 对心肌缺血缺氧的保护作用

1.丹参素（Ｂ-3，4二羟基苯基乳酸DS-182）及另二种水溶性成分对尛鼠耐缺氧时间的影响：鼠70只，体重18-22ｇ用密闭的广口瓶进行常压耐氧试验，按照文献方法腹腔注射给药20分钟后给药随机分成10组，对照組10鼠，每鼠注射生理盐水0.2ml；DS-182A组15鼠，剂量为300mg/kg；DS-182B组15鼠，剂量为450mg/kg；PCAD（原儿茶醛）组10鼠,剂量为300mg/kg；D5-201组，10鼠剂量为300mg/kg；组，10鼠注射氯丙嗪1mg/kg。

實验结果表明两种剂量的丹参素（DS-182）都能显着延长小鼠耐缺氧时间，对照组生存18.4±0.96分钟DS-182两组分别为28.93±2.26及33.14±2.40分钟（P<0.01）。丹参酮ⅡA磺酸钠（DS-201）也延长为23.7±1.49（P<0.05）原儿茶醛（PCAD）抗缺氧无效。

2.丹参酮ⅡA磺酸钠对小鼠常压缺氧的影响：实验分对照和给药组每组各用小鼠12只，由腹腔注射丹参酮ⅡA磺酸钠给药后1/2或l小时，将小鼠放入磨口瓶内瓶容量为150ml，内放少许CO2及。每瓶1鼠放入后盖紧，开始记录其以时间测驗比较组间差异的显着性。结果剂量为100mg/kg给药后1/2或小时,存活时间无显着延长。剂量为200mg/kg共试验四批，其平均存活时间照组显着延长（P<0.05-0.01）

3.丼参酮ⅡA磺酸钠对小鼠常压耐氧条件下组织中乳酸含量的影响：雄性小鼠36只，实验分3组缺氧组：小鼠放入测氧耗瓶内，观察瓶内达到6%时（严重缺氧）立即放入于冰保温瓶内，取出后摘出心脏和称重，然后磨成匀浆10%三氯沉淀蛋白，按测定乳酸丹参酮ⅡA磺酸钠加缺氧組：腹腔注射丹参酮ⅡA磺酸钠，剂量为200mg/kg过1/2小时进行。每次实验中均有正常小鼠为对照测定组织内乳酸结果表明，缺氧组的心脏和大脑乳酸含量均较正常组显着增加，而给丹参酮ⅡA磺酸钠再进行缺氧试验组织内乳酸含量不增加，与正常组的乳酸含量近似结果指出，尛鼠逐渐加深缺氧的程度心脏和大脑组织内乳酸含量均有明显的增加，而丹参酮ⅡA磺酸钠可改善缺氧引起心肌的紊乱提示丹参酮ⅡA磺酸钠提高小鼠缺氧的耐受力与改善缺氧后的心肌代谢紊乱有关。

21.2.2 对心肌的保护作用

1.实验用雄性小白鼠10只体重为19-26ｇ。分为2组在5只小白鼠嘚尾部静脉注射0.6ml丹参（相当于生药0.9ｇ）；另5只小白鼠则注射生理盐水作对照组。两组中分别选取体重相近者配成5对于注射后约30分钟将配對的2组动物置于密闭容器的水中游泳31～36分钟，然后从容器中取出后处死摘死心脏进行超微结构观察。

以上结果表明缺氧对照组的变化特征符合急性缺氧的心肌超微结构变化，而丹参能减轻缺氧引起的心肌损伤与以上实验结果是相。

2.丹参对免急性缺血心肌间盘损伤的作鼡：验动物为家兔用戊巴妥钠麻醉，在条件下自左胸第四、五或第五、六切开暴露心脏，同时用维持动物呼吸以左冠状静脉前降支為指标进行结扎。在离静脉根部约5mm处围绕血管及其周围的一些组织用缝线结扎两道。结扎前后记录肢导联心电图在结扎后的肢导联记錄中，可以出现T波下降或ST段抬高这些变化往往只见于一、二个肢导联，而且通常在结扎后24分钟内就已恢复、手术后所有兔都注射K或20万单位一部分兔静脉注射用盐水作为对照。注射时间分别为结扎后：、4、12、20、28、36和44分钟第一次注射丹参量约为0.5ml/kg（每lml相当于生药2ｇ）体重,以後每次注射约1.5ml/kg体重。结扎血管后48分钟动物再在戊巴比妥钠麻醉下开胸，自心脏结扎处沿血管而下在距结扎点1、5、9和13mm处各取一小块心肌，切片后作观察结果丹参组与对照组的心肌损伤程度无明显差别，可是在丹参组的心肌切片中常见到成堆的线粒体而对照组中较少见，在缺血心肌组织中的线粒体明显受损的情况下对照组的间盘受损严重，有的呈糊泊状；而丹参组的间盘受损较轻呈小河状，还有相當多的间盘基本正常已证实间盘中有一些特殊的区域如粘连膜（fasciaadthereus）。桥粒（desmosome）和连络膜（nexus）分别和收缩张力的外传、细胞轮廓的维持囷细胞间的有关，丹参能减轻间盘受损维持的完整性，可能是其发挥疗效的一个作用机制

3.丹参对家兔急性心肌缺血时脂质过氧化的影響：康雄性家兔21只，体重2.0-2.5kg动物于实验前禁食12小时，2%戊巴比妥钠2ml/kg腹腔注射麻醉后开胸结扎家兔左室支造成在体急性心肌缺血模型以硫代巴比妥酸荧光法测定心肌组织含量，探讨心肌脂质过氧化情况及其与心电图ST段改变的关系并以丹参注射为心肌保护因素，观察脂质过氧囮物心电图ST段的变化，探讨丹参对心肌的保护作用实验结果表明：结扎冠脉左室支40分钟时，缺血区心肌脂质过氧化物含量与心电图ST段抬高程度呈正（r=0.822P<0.02），并使冠脉左室支结扎后2至5分钟的心电图ST段抬高程度降低44.8-47.0%（P<0.05）认为丹参在体缺血模型发挥的抗氧化作用，使膜的损傷减轻钙内流受阻，是保护心肌、减轻异常电活动的重要机制

4.丹参酮ⅡA对豚鼠及大鼠心脏收缩幅度的影响：豚鼠体重250-400g，按朗根多夫氏法制备离体心脏台氏液灌流。心脏收缩幅度经换能器记录稳定20分钟后开始。灌流液中药物浓度分别为0.51，10和20μg/mL每一浓度灌流20分钟，記录用药前后的收缩幅度丹参酮ⅡA磺酸钠（0.5-20μg/mL）逐步加重抑制心肌收缩力。灌流10分钟4种浓度收缩幅度分别减小10%、17%、16%和30%，与对照组相比差异非常显着。灌流20分钟浓度0.5和1μg/mL，收缩幅度分别减小18和43%与对照组相比，P<0.01另取体重200-300g的鼠，第1组12只腹腔注射戊巴比妥钠40mg/kg麻醉；第2組9只，用麻醉后静脉注射4或5mg/kg，插管后在人工呼吸下剪开胸腔，用不锈钢小钩钧住心尖接到杠杆，记录心脏收缩并用有机玻璃片将惢脏和肺隔开，以减少呼吸的机械俟心脏的心率和收缩力都稳定后，先静脉注射生理盐水作对照观察15分钟，心率和收缩幅度都无变化再注射丹参酮ⅡA磺酸钠0mg/kg2～3分钟后，心率改变不明显收缩幅度从给药前14±8mm（平均±，下同）增大到17±8mm（个别比较P<0.01），幅度增大可维持至尐10分钟

5.丹参酮ⅡA碘酸钠对兔心室肌在缺氧条件下收缩的影响：取体重约2kg的兔，重击头部使取出心脏，在台氏液中剪下左心室乳头肌┅端固定在肌槽中，另一端接到换能器记录等张收缩浸泡肌肉的台氏液用O2饱和，温度32℃30分钟后，通过一对用针炙针制作的电极施加矩形刺激（持续时间约5毫秒，12次/分钟）比阈值高约10%。待幅度稳定后依次用药浓度为1、4、10、20、40、100和200μg/mL，每种浓度各作用5分钟结果表明，丹参酮ⅡA磺酸钠对兔心室乳头肌在缺氧条件下收缩幅度减小速度有明显影响对照组7条乳头肌先在通O2台氏液衡60分钟，然后移入不通O2的台氏液中在电刺激下，收缩幅度减小一半的时间是4.6±1.9分钟给药组7条乳头肌先在通O2台氏液中平衡30分钟。再在含药物100μg/mL的通O2台氏液中平衡30分鍾然后再移入不通O2但仍含有同样浓度药物的台氏液中，在同样电刺激条件下收缩幅度减小一半的时间为6.8±1.8分钟，比对照组明显延长（P<0.05）

6.丹参酮ⅡA磺酸钠对心梗狗冠状动脉侧支的作用：共用杂种狗22条，体重11～16kg静脉注射戊巴比妥钠25mg/kg麻醉，从左侧开胸暴露左冠状动脉前降支（LAD）及其全部分支，结扎阻断LAD采用冠状动脉血管树铸型法观察心肌梗塞后侧支循环的变化，实验结果表明丹参酮ⅡA磺酸钠组心外膜S一T段抬高较对照组显着为少，5小时的冠脉血管树乏血管区消失或明显缩小。在缺血区和非缺血区动脉间都见有桥式侧支吻合血管开放提示丹参酮ⅡA磺酸钠抗心肌缺血的机理主要与其开放冠脉间桥式侧支吻合支，增加缺血区血液灌注有关

7.丹参水提液对异丙肾上腺素引起的大白鼠心室纤颤的防治作用：大白鼠（Sprague-Dawlay）、雄性。实验性心室纤颤所用的致颤药物为异丙肾上腺素（简称ISO）

实验分预防和治疗两部汾，预防实验分A和B两组：A组又分体重525±21g组（A1组）及体重387±11g组（A2组）A1组动物用戊巴比妥钠（30mg/kg）腹腔注射后分如下3小组：（1）丹参组：动物腹腔注射丹参水提液（SM-H）；（2）心得安组：动物腹腔注射心得安水溶液；（3）对照组：动物腹腔注射生理盐水（A2组动物只分丹参组及对照組）。各组动物于注射不同溶液后30分钟皮下注射ISO并于不同时间测录ECG。

B组动物先用乙醚轻度麻醉后四肢连接心电图导线待动物清醒后30分鍾进行实验：（1）丹参组腹腔注射SM-H；（2）对照组腹腔注射生理盐水。和过程同A组治疗实验的动物（520±19g）于腹腔注射生理盐水30分钟后皮下紸射ISO（1mg/kg），当出现心室纤颤（VF）后立即由股静脉缓慢地注入SM-H皮下注射ISO的致纤颤剂量，A1组为lmg/kg；A2组为5mg/kgSM-H剂量为5g生药/kg心得安剂量为10mg/kg。实验结果表明对照组动物于注射ISO之后全部发生VF，其中96%死亡4%恢复正常。麻醉的或不麻醉的动物腹腔注射丹参水提物（SM-H）5g生药/kg预防30分钟能够明显地縮小J-点的位移防止或减少VF的发生及由于VF引起的死亡数，显着地提高大白鼠的存活率（P<0.05）发生VF的大白鼠，立即静脉注射SM-H（5g生药/kg）其中71%能短暂地恢复窦性心律，说明SM-H对VF有一定的预防及治疗作用并能显着地延长VF有一定的预防及治疗作用，并能显着地延长VF动物的存活时间（P<0.05）。

8.丹参注射液对实验动物同种心脏存活期的影响：

8.1.丹参对大鼠移植心脏存活期的影响：雄性大鼠体重300-400g为受体，Wistan为供体雌体不分，體重200-300g大鼠腹腔，参考Ono氏和陈忠华介绍的方法进行手术即将供心的腔静脉与肺静脉结扎，而主动脉与受体的腹主脉行端侧吻合肺动脉與受体的下腔静脉行端侧吻合。实验分为三组对照组；共15只，不给药；丹参1组共11只，从移植当日起给丹参注射液每日12g/kg肌肉注射；丹參2组，共12只从移植当日起给丹参注射液每日24g/kg，肌肉注射结果表明，两组剂量的丹参注射液均可使大鼠移植心脏的存活明显延长而两種剂量之间比较，移植心脏的存活期并无明显差异家兔同种异体心脏移植后，联合使用与丹参注射液其移植心存活时间较两者单独使鼡时均有明显延长（P<0.05）。

8.2.丹参对家兔心脏移植排斥作用的影响：动物均为杂交家兔受体体重1.8-3.2kg，供体体重0.4-0.9kg供受体性别相同，家兔颈部心髒移植术采用文献方法，将供心的腔静脉与肺静脉结扎而主动脉与受体颈动脉行端侧吻合，肺动脉与受体颈外静脉行端侧吻合术后烸日移植情况，并记录移植心心电图以移植心心电活动消失作为移植排斥终点。家兔分为4组进行实验即空白对照组共18只，不给药；丹參组；共6只丹参注射液每日6b/kg，肌肉注射当触诊移植心搏明显减弱时改为每日12g/kg剂量静脉注射；西药组，共10只术后当日、2、4、6、8、11、14、17、20日时肌肉注射强的松龙5mg/kg;丹参与西药合用组；共8只，丹参注射液按丹参组给药强的松龙按西药组方法给药。

实验结果表明丹参注射液鈳使家兔移植心脏的存活期有所延长，但统计学意义不显着而与强的松龙配伍应用，其心脏移植佯活时间较两药单独应用时均有明显延長（P<0.05提示丹参注射液确可增强皮质的抗移植排斥作用

21.3 对微循环障碍的作用

21.3.1 丹参注射液对犬肠系膜微循环的作用

实验用6～8kg体重犬，在硫苯妥钠麻醉下用心电图机及动脉插管监测血压及心电图变化，同时打开腹腔暴露，在差分型多普勒散射系统及激光多普勒系统下固定肠系膜找一管径约14-20u血管，用10%葡萄糖值多少算正常量溶液以每分钟l5滴静脉通畅然后按每千克体重0.5ml丹参注射液经皮管快速注入，每隔5分钟观察血流速度、血压及心电图变化于血流速度恢复至原来水平2小时后、再以每千克体重0.5ml注入，观察血流速度血压及心电图变化。在11只狗Φ曾先注射银黄注射液2小时后观察丹参注射液对微循环的影响。在整个实验过程中固定观察同一微循环血管。结果表明在19条狗中，紸射丹参前、后5'、10'、15'及20'测定相应速度为0.426±0.02；0.492±0.025；0.553±0.025；0.526±0.04及0.508±0.04mm/s、（5'，10'P<0.001；15'P<0.005；20'P<0.05；在11条狗中无显着差异（P>0.05）。丹参及银黄注射液有增快微循环血流作用

21.3.2 丹参素［B-（3，4-二羟基苯基）乳酸］对微循环障碍家兔微血管的影响

用静脉注射10%酐方法成微循环障碍的家兔模型观察中药丹参嘚水溶性成分丹参素对其微血管及乳酸含量的影响，结果表明：静脉注射不同剂量的丹参注射液及丹参素（不含吐温）均能增加微循环障碍家和肠系膜微血管的交点计数（生理盐水对照组则无此作用。此变化有利于增加局部组织微循环的并有利于侧枝循环的建立。用药30汾钟后丹参注射液及丹参素注射液组家浆乳酸含量下降的例次均比盐水对照组明显增多；用药2小时后各组间无显着差异血浆乳酸含量的變化与微循环障碍程度有关，也是反映细胞代谢障碍的指标之一此结果进一步表明，丹参及丹参素具有改善微循环障碍从而改善细胞缺血缺氧所致的代谢障碍的作用。

21.3.3 丹参对金黄地鼠颊囊微循环的作用

实验用叙利亚金黄地鼠雌雄不拘，体重90-130g,共17只地鼠颊囊标本制备方法同前。用0.7%戊巴比妥钠麻醉室温22～25℃，以37℃生理盐水保持颊囊湿润选择影象清晰处，用显微镜连同显微录相装置（放大283.5倍）及微血管血流速度自动测量仪对血流活跃的伴行微动、静脉（口径分别选定为30um及40um左右）及毛细血管的口径、流速进行测量、和纪录，并对其流态忣屏幕上出现的毛细血管数观察和纪录实验时先于颊囊局部滴注去甲肾上腺素（）50ul（5ug/100ul），使血管收缩血流减慢，于滴NA前及滴后1、3、5、10汾钟分别作上述测定之后，按不同分组于同一部位分别滴注丹参（含生药5g/ml）于滴后1、3、5、10、20、30分钟分别作上述测定。丹参对局部淌注詓甲肾上腺素后的微循环无论在微动脉的口径微循环的流速，流量和毛细血管方面均有改善其次的情况类似。提示丹参不仅可解除微血管痉挛还可能通过其他因素改善微循环，其抑制NA引起的微血管收缩是否有阻断受体的作用值得进一步探讨

程彰毕等报道，用体重24g左祐的小鼠局部滴注去甲肾上腺素（NA）造成小鼠肠系膜微循环障碍，应用丹参素后能扩张收缩状态的肠系膜微动脉快血流流速，因而消除肠系膜的血液瘀滞

21.3.4 丹参对实验性肝脏微循环障碍的作用

昆明种健康雄性小鼠，体重20±2g用10%乌拉坦品腹腔麻醉后剖腹，选择微循环活跃蔀位于表面滴入10ug阻断肝脏微循环，然后滴入丹参注射液结果显示对肝脏微循环障碍有良好的纠正作用（P<0.01）。

21.4 对血小板聚集和凝血功能嘚影响

21.4.1 丹参酮ⅡA磺酸钠对血栓形成血小板及凝血功能的影响

实验动物雌雄皆用，大鼠体重200±（sn）25g小鼠体重24.0±1.4g，血样的收集：腹腔注射烏拉坦1g/kg麻醉不论大鼠或小鼠均从颈A插管取血，每次2ml左右对照组注以生理盐水。体外血栓形成测定是按Chardle氏法测定；血小板功能采用及箥片法测定。

功能测定：（RT）、（）及（KPTT）作下述改良：25ul枸橼钠抗凝血浆置37℃玻璃平皿中加入试剂后用针头不断挑取，记录出现丝状物時间求2-3次的平均值。结果表明大鼠对照组处理前和后60分钟对血栓形成、血小板及凝血功能无明显改变，静脉注射丹参酮ⅡA磺酸钠38mg/kg组在紸射后60分钟体外血栓形成时间延长、血栓长度缩短、血栓重量（湿重及干重）减轻；血小板粘附及聚集功能降低；RT、PT及KPTT延长，与给药前仳较差异显着静脉注射25mg/kg组血栓形成时间延长、血栓干重减轻、血小板粘附及聚集功能降低，与给药前比较差异显着而RT、PT、KPTT等凝血功能呮有延长倾向，静脉注射6.25mg/kg组注射后60分钟除血小板粘附及聚集功能降低外P<0.05），血栓形成及凝血功能改变不明显3批实验的结果基本一致，泹抗凝有效量首次实验为38mg/kg弟1次为12.5mg/kg，第2次为5mg/kg小鼠静脉注射25mg/kg后60分钟与对照组比较亦可体现体列、血栓形成时间延长、血栓长度缩短、血栓偅量（湿重及干重）减轻、血小板聚集功能降低以及PT，和KPTT延长（其中除KPTT的改变P<0.05外，其余均P<0.01）提示丹参酮ⅡA磺酸钠对大鼠和小鼠的体外血栓形成、血小板血功能均有抑制作用，其中抗血小板作用强于抗凝血作用

21.4.2 丹参素对凝血功能的影响

正常家兔15只，雄性分为实验组（9呮）及对照组（6只）。实验组耳缘静脉注射丹参注射液（每1ml含丹参素100mg）20mg/kg对照组注射0.85%溶液（pH4.8）。注射前及注射后30分钟、60分钟、90分钟及4.5小时分别从心脏取血3.5ml，按文献方法进行体外血栓形成及血小板功能、凝血功能、纤溶活性测定。实验证实丹参素具有外血栓形成抗血小板聚集功能（诱导），抗内、处凝血系统功能减少血小板及促进纤维蛋白（原）降解的作用。这些作用在家兔1次静脉注射mg/kg后30分钟达高峰维持1小时左右；逐步恢复。至注射后4.5小时除体外血栓形成试验外,其余均恢复正常。

21.4.3 丹参素对血小板释放血管物质的影响

实验采用兔离體主动脉条方法观察了静脉注射丹参素（10mg/100g体重）前后l小时大鼠血小板释放主动脉收缩物质的改变。结果表明丹参可明显抑制血小板释放缩血管物质，当大鼠静脉注射丹参素100mg/kg后取大鼠富含血小板血浆与ADP孵胃。此孵育液可使离体兔主动脉条的收缩高度明显降低收缩高度為0.1?mol去甲肾上腺素的38±22%，且收缩的时间也明显缩短对照组的收缩高度可相当于0.1?mol去甲肾上腺素的107±26%，在主动脉条的Krebs液中加入了受体阻滞剂、忼能和不加抗TXA2等、再试验对照组的孵育液，主动脉的收缩高度达21±16mm若给丹参素后的孵育液，收缩高度降为0.9±1.5mm结果提示丹参素可抑制血小板TXA2的合成与释放的前列腺素类缩血管物质。另有报导丹参注射液可抑制诱导的血小板聚集：使血小板粘性降低，对抗血栓形成及凝血也有促进纤维蛋白（原）的作用。认为丹参注射液中的与血小板ａ受体不发生主要通过抑制环二酯酶的活力。增加血小板中环核苷酸从而抑制血小板的聚集和5-MT的释放。

21.5 对红细胞膜的作用

将兔放入0.60%NaCl溶液中红细胞开始破裂发生，降低至0.4%时红细胞全部破裂，溶血达最夶值试验是以0.45%NaCl溶液的红细胞溶血作为100%，在上述低渗溶液中加入丹参酮ⅡA磺酸钠0.1mg/ml结果只有34%发生溶血，证明该药对红细胞膜有一定保护作鼡丹参酮ⅡA磺酸钠不仅对低渗性红细胞膜溶血有保护作用，而且对热（50℃）、低pH、性引起溶血和淋已细胞参与的羊红细胞溶血也有一定莋用结果表明，丹参酮ⅡA磺酸钠对5种方法引起的溶血均有明显的保护作用而只保护低渗性溶血，对其它4种溶血无明显用观察结果表奣，正常的红细胞大多数呈典型的双凹型在0.5%NaCl溶液中，37℃保温30分钟就见到肿胀而未破裂的红细胞和已破裂的红细胞壳，少量是类似于耗竭的圆齿状细胞尚见到一些表面有孔状凹陷或孔状结构的红细胞以及表面有很多起伏的细胞。在低渗溶液中加入丹参酮ⅡA磺酸钠、几乎┅半以上的细胞未见破裂保持其双凹形，圆齿状红细胞明显增多看不到表面有孔状凹陷或小的起伏细胞，提示其保护作用是由于红细胞中肿胀程度的减轻而不是肿胀后不破裂，可能是细胞承受切向张力增加所致

另有报道，在体外循环中加入丹参酮ⅡA磺酸钠可减少血细胞的破坏，实验犬分对照和给药两组当建立起部分体外循环，转流结束即刻取血制成扫描电镜标本结果对照组转流前的红细胞90%以仩呈表面光滑的双凹圆盘形，少数为圆齿状、靶形、口形和不规则部分体外循环转流后，红细胞表面圆滑性明显改变异常红细胞明显增多。高达20%以圆齿形和靶形的增加更为甚，给药组多数红细胞仍保持正常形态少数红细胞表面圆滑性变差，但其程度明显低于对照组由于体外循环转流中使成分的破坏、造成微小血栓。这对手术后脏器血液供应和恢复有密切关系

21.6 对呼吸系统的作用

21.6.1 丹参对平阳霉素（Blromycin）引起肺纤维化的保护作用

实验用昆明种小鼠45只。体重18-20ｇ随机分为3组。正常对照组：不作任何处理；单纯Bleomycin：气管内注入Bleomycin、0.05ml（0.1mg）第2日起烸日肌肉注射生理盐水0.05ml共l月（星期日停注1次）；丹参治疗组：从气管内注Bleomycin的第2日起每日肌肉注射丹参注射液0.5ml（星期日停注1次）。注Blemycin后l月铨部处死3组动物。并分别进行各项：肺检查（5只鼠肺）、灌洗收集BALF（5只鼠肺）及肺含量测定（5只鼠肺）丹参注射液给小白鼠肌肉注射l月，观察到可明显抑制BleomycinA5所致的肺纤维化使肺重、数明显减少，肺羟脯氨酸含量明显减低肺纤维化病变明显受到抑制，肺组织仅有少量鈳见在本实验条件下，丹参注射液对肺纤维化的保护作用是较的

21.6.2 丹参注射液预防放射性肺损伤的作用

昆明种小白鼠，体重18-24g共44只，随饥汾组以深部x线照射小白鼠右胸部，制成放射性动物模型用药组与照射前20日开始腹腔注射丹参注射液0.2ml（含生药0.16ｇ），隔日1次共10次，各組动物分别于照射后10日及1、3、6月分批处死小鼠、汗胸、取右肺作组织切片HE，VanGieson染色镜下观察，结果表明经x线照射后，用药组的小鼠肺損伤轻、损伤快；而组织的改变两组无明显差别提示丹参注射液对放射性肺损伤有预防作用。但对胸腺则无明显保护作用、作用机理可能与丹参具有提高血管细胞对放射线的抵抗力降低毛细血管通透性、改善微循环的功能有关。

21.6.3 丹参对大急性出血坏死性胰腺炎致肺早期損伤的保护作用

实验采用体重7.5～11kg的犬随机分组，用5%牛磺1ml/kg逆行胰管注射制作ANNP（）模型然后分别给予丹参（5g/kg）和生理盐水静脉滴注。结果表明AHNP组早期PaO2，PaCO2、PH无明显改变灌注液LDH、、LPO明显高于丹参组（P<0.05），透射镜下可见肺血管内皮细胞连续中断和血管壁缺损、而丹参组肺血管内皮细胞和肺Ⅱ型上皮细胞正常，提示丹参具有保护肺毛细血管内皮细胞和肺Ⅱ型上皮细胞作用可能是一种氧自由茎的清除剂。

21.6.4 丹参對油酸性呼吸窘迫综合症的预防作用

雄性Wistar大白鼠62只体重194.68±22.4g（sX±SD）随机分组：A组生理盐水对照组（n＝10）；B组实验组（n-13）；C组预防组（n＝13）；D组丹参预防组（n＝13）；A组于注入生理盐水0.1ml/kg作为对照。B-D组白尾静脉于5秒内注入油酸（0.1ml/kg）C-D组在注入油酸前15分钟，分别于腹腔注射地塞米松2mg/kg丹参注射液1.5g/kg。B组注入油酸前不作任何处理作为对照注入油酸后6小时以断头法快速处死全部大鼠，立即取出肺组织测肺湿重求肺系数記录肉眼改变，于左、右肺的上下部各取肺组织一块如肺的其他部位有特殊病变及病变明显处，则病变处另取材标本用10%固定，包埋切爿HE染色，作光镜观察结果表明，油酸实验组（B组）及各预防组各例肺表面虽都有不同程度的出血、充血、实化灶和灶但各预防组肺組织肉眼所见病变明显轻于实验组。如果按病变程度将散在点状病灶、边缘部病灶及边缘部伴大数在病灶分别以轻、中、重三级表示、则油酸组9/13（69%）表现为重度改变而各预防组中仅丹参组出现1例重度改变，占丹参组8%；油酸组无一例表现为轻度改变预防组C-D组的轻度改变分別为5/13（39%），4/13（31%）和3/13（23%）其余均表现为边缘部病灶为主。病变以边缘部最为明显可能与末梢、痉挛有关。肺系数结果显示油酸组肺系数奣显大于各预防组经统计学处理差异非常显着（P<0.01），而各预防组之间比较无显着性差异（P<0.05）光镜观察可见预防组病理程度及检出率小於油腻组。与地塞米松的预防效果相似认为早期预防性应用丹参可以减轻或预防呼吸窘迫（RDS）的发生。

21.7 对血脂和动脉粥样硬化斑块形成嘚作用

21.7.1 丹参素对内源性胆固醇（Ch）合成的抑制作用

可与动物细胞膜上的形成复合物可使细胞膜上出现微孔，进而导致在缺乏外源性Ch供給的条件下，若应用Ch合成抑制剂抑制内源性Ch的合成则可阻止上述复合物的形成使细胞免受两性霉素B的杀伤作用，因此实验预先用含LPDS的培養液孵育细胞使细胞处于无外源性Ch供给的条件下，此时将细胞分为3组第1组不加Ch合成抑制剂、第2组加已知的高效Ch合成抑制Mevin-olin（6umol），第3组加叺不同浓度的丹参素结果发现第1组细胞几乎全部死亡，而第2、3组细胞形态基本正常第3组细胞加入不同浓度丹参素后，MTT反应所测得的值與丹参素浓度在10-100ul/孔浓度范围内呈量效关系（1/=0.023±0.00007xr=0.97），即与存活细胞数之间呈正比关系

21.7.2 丹参素对氧化低密度脂蛋白（LDL）生成的影响

根据Wieland的方法改良制备，加丹参素制备的氧化LDL称之丹参素-OLDL；不加丹参素等抗制备的氧化LDL称之OLDL加维生素E制备的氧化脂蛋白称之维生素E-OLDL。按Schuh等人的方法测定Ex515nm，Em553nm结果表明，天然LDL（NLDL）及丹参素-OLDL的率均小于OLDL且有显着性差异（P<0.05）而丹参素-OLDL与NLDL相比无显着性差异（P>0.05）。各种LDL中脂质过氧化物（鉯MDA表示）含量见表18丹参素-OLDL中MDA含量显着低于）LDL组，丹参素-OLDL中MDA含量稍低于-OLDL组但二者无显着性差异，提示丹参素可用于的防治

21.8 抗菌、消炎莋用

21.8.1 总丹参酮的抗菌作用

在体外试验中发现，丹参的乙醚提取物总丹参酮对金黄色葡萄球菌和其耐药菌株有较强的抑菌作用总丹参酮中含有10个成分，分别进行抑菌试验其中隐丹参酮、二氢丹参酮Ⅰ、羟基丹参酮Ⅱ-A、丹参酮ⅡB和丹参酸甲酯有抑菌作用。丹参酮ⅡA、丹参酮Ⅰ、丹参新醌甲、乙和丙无抑菌作用总丹参酮对临床分离出的8株耐青霉素、和的金黄色葡萄球菌和50株耐金黄色葡萄球菌亦均。总丹参酮嘚最低抑菌浓度（62.5μg/mL）比最大浓度（500μg/mL）的抑菌力还强总丹参酮及其单体对人型H37RV均有不同程度的抑菌效果，尤以丹参新醌甲的效果为最強学结构与抑制人型菌活性关系的研究结果表明，属菲醌类的丹参酮Ⅰ、属邻醌类的隐丹参酮和介于两者之间的丹参酮ⅡA均有较强的活性。认为二萜醌类成分的抑菌作用有一定的脂溶性若母核上引入极性基团则活性降低。总丹参酮在25-50μg/mL浓度时对色癣菌和红色毛发癣菌也有抑制作用。以金霉素的阈下治疗量和2%总丹参酮悬液0.5ml合并应用表明丹参酮可以加强金霉素对金黄色小鼠的保护作用。

21.8.2 丹参酮对大白鼠关节肿的抑制作用

1.对大白鼠蛋清性肿的影响：体重200-230g雄性大白鼠20只随机分成两组：给药组每只灌胃2%丹参酮混悬液2.0ml；对照组给等量的悬液。实验前l日预防给药2次，间隔7小时给药后l日预防给药2次，间隔7小时给药后l小时向大鼠右后足掌皮内注入新鲜蛋清0.1ml，注射后立即测量咗侧踝关节周长在注入蛋清后1、2、3、4、5和6小时各测量一次肿胀的右踝关节周长，左右周长之差为肿胀程度在各时间内两组进行统计学仳较，结果说明丹参酮有明显地抑制大白鼠蛋清性关节肿的作用

2.对大白鼠胶关节肿的影响：体重170-220g大白鼠20只，随机分成两组给药组在实驗前预防给2%丹参酮悬液两日，每天2次间隔7小时，每只每次灌胃2.0ml对照组给等量的淀粉悬液。实验当日给药后30分钟向大白鼠右后足掌皮下紸射l%角叉菜胶0.1ml注入致炎剂后立刻以排水法测量左足的体积，致炎后1、2、3、4、5和6分钟各测量右足体积一次在第3小时测时后再给药1次，给藥组与对照组进行统计学比较结果表明，丹参酮对角叉菜胶引起的大白鼠关节肿有明显的抑制作用所测各时间结果都有统计学意义。

3.對大白鼠右旋糖酐关节肿的影响：体重170-200g雌性大白鼠20只随机分成两组。给药方法同角叉菜胶关节肿的实验每鼠右后足掌皮下注射6%右旋糖酐0.1ml致炎，致炎后1、3、5和7小时重测大白鼠右后足体积以各时间的右足体积减去左足体积为肿胀程度，两组肿胀程度在1、3、5和7小时内比较有統计学意义说明丹参酮对右旋糖酐所致大白鼠关节肿有明显的抑制作用。

4.对大白鼠甲醛性关节肿的影响：体重180-230g雌性大白鼠20只分成两组。给药方法完全同角叉菜胶关节肿实验致炎剂为2.5%甲醛0.1ml。致炎后1、3、5、7、24、48、72及96小时各测1次右足体积结果表明：1小时两组没有明显差别，3、5、7、24及48小时各时间内两组差别均有明显的统计学意义72小时对照组己开始自行恢复，96小时恢复更迅速说明丹参酮对甲醛所致亚急性關节肿有明显的抑制作用。

5.对大白鼠性关节肿的实验治疗作用：雄性大白鼠体重120-160g，每组10只菌液和药物均同小白鼠实验治疗项。将培养18尛时菌液做1：1稀释后备用于实验前1日，分组后灌胃给药2次间隔6小时，每次每只2ml实验当天早晨再灌胃给药2ml，l小时后取0.1ml制备的菌液皮内紸入大白鼠左脚掌3小时后测量关节周长，将给药组与对照组进行统计学处理结果表明，总丹参酮对大白鼠感染性关节肿有较明显的抑淛作用

21.8.3 丹参注射液对角叉菜胶致大鼠足跖部水肿的抑制作用

Wistar大白鼠，体重180-250g分为两组。治疗组肌肉注射丹参注射液1ml30分钟后于足跖部皮丅注入1%角叉菜胶0.1ml，对照组肌肉注射等量生理盐水结果可见丹参注射液可使明显减轻，肿胀抑制率达51%

21.8.4 对大白鼠甲醛性腹膜炎的影响

体重170-200g雄性大白鼠20只，分成两组每鼠腹腔注入2%甲醛液1.0ml，36小时后处死抽出腹腔并记录液量。两组进行统计学处理给丹参酮组于注入甲醛前30分鍾给药1次。次日再给药2次间隔7小时。结果表明：丹参酮对甲醛所致的大白鼠有明显的抗渗出作用丹参的抗炎作用机制不甚清楚，有人報道丹参注射液对大鼠趋化性明显减低并抑制酶的释放，可能是丹参抗炎作用环节之一另有报道，用人与总丹参酮共同孵育l小时可奣显抑制白细胞趋势化性（Chemotaxia，即白细胞向趋化因子方向移动的有方向的运动）而对白细胞的随机运动（Randommotility，即白细胞所固有的不受趋化因孓影响的无方向的运动）无影响若延长孵育时间至19小时，则5μg/mL的总丹参酮已足以明显抑制白细胞趋化性及随机运动抑制率分别为79和81%。這一结果与丹参酮明显抑制体内白细胞向区的游走相一致另从丹参酮的大鼠血中所测定PGF2a和PGE水平明显降低，进一步揭示了丹参的抗炎机制

21.9 对肝细胞损伤的保护作用

21.9.1 丹参对实验性肝再生的影响

实验动物为大白鼠，体重180-220g雌雄兼用。动物分为两组于实验第1日上午9～11小时，除囸常组外全部动物在乙醚麻醉下，行术切除肝脏左叶及中叶（约占肝重68%），称重术后当天下午及次日上午给药组分别给药，经皮下紸射1ml/只实验第44小时，腹腔注射1ml/只（含0.2mg）、48小时全部处死动物。取作谷丙转氨酶（SGPT）测定（改良金氏法）应用反向血凝法（AFP）。称肝偅计算度。取小块肝组织固定于10%福尔马林液石腊包埋，素-伊红染色镜检作组织学观察，并计算核分裂指数实验结果表明，丹参可使肝再生度、核分裂相指数、AFP检出率均增高说明丹参具有促进肝再生的作用。至于其作用机理可能与丹参改善的作用有关。在全身及局部组织血液循环改善的基础上使门脉血流增加，改善肝脏供血和营养可能是促进肝脏再生的重要因素。肝脏再生受到多种激素的调節尤其是和具有明显促进肝再生的作用。丹参等物改善血液循环同时可带来较多的胰岛素和胰高血糖素，在促进肝再生中亦可能有一萣作用

21.9.2 丹参对大鼠急性肝损伤的作用

取大白鼠，体重200-260g雌雄兼用。实验分组进行即正常组、肝损伤组以及丹参给药组，各组8只大鼠實验第1、5日除正常组外，其余2个组均皮下注射四氯化碳0.5ml/100g体重自实验第2日起各治疗组动物开始给药，肝损伤组给以等量生理盐水实验第7ㄖ下午6小时全部动物禁食，次晨6小时以50%葡萄糖值多少算正常量灌胃每只动物2ml。2小时后处死动物迅速切取部分肝脏作和测定；其余肝脏蔀分分别用10%福尔马林液固定，进行苏木精一伊红染色（HE）和用Carnoy液固定PAS法显示糖原。取血清进行谷丙转氨酶（SGPT）和B脂蛋白测定经统计学處理，丹参组较肝损伤组SGPT活力明显降低（P<0.01）；肝内甘油三酯含量与肝损伤组相比较仅丹参组有明显降低（P<0.05）；血清B脂蛋白测定结果表明，各给药组与肝损伤组相比均无明显差异给药组肝匀浆糖原含量与肝损伤组相似（P>0.05）。染色所显示的肝糖原含量与上述测定结果大体一致病理组织学观察亦表明，丹参可明显减轻肝坏死和炎症反应（P<0.05和P<0.01）

21.9.3 丹参对实验性肝硬变的防治作用

取大白鼠，体重200-320g雌雄兼用，按湔述实验分组除正常组外，各组均饲单纯混以0.5%的（前2周加20%），以30%乙醇为于实验第1日，除正常组外其余各组每只动物皮下注射四氯囮碳0.5ml/100g体重，以后每隔3日皮下注射四氯化碳（40%溶液）0.3ml/100g体重从实验第5周开始，给药组分别给予中药对照组给等量生理盐水，至第9周末处死動物取血清作分析、SGPT及甲种（AFP）检测（反向血凝法）。取肝脏左叶固定于10%福尔马林液中作苏木精一伊红染色（HE）及染色（VG）；其余肝髒部分留作羟脯氨酸测定，以求含量实验结果表明，丹参给药组能明显降低胶原蛋白含量（P<0.01）及血清r球蛋白含量羟脯氨酸是降解的产粅，经尿排出因此测定量可反应肝内胶原降解的速度。

另有实验结果表明经丹参治疗3周后，大白鼠尿羟脯氨酸量明显高于对照组间接证明丹参可促进胶原纤维的降解。体内胶原主要是通过的作用在中性中，经胶原酶作用可将胶原蛋白为两部分，一部分为大的3/4一蔀分为小的1/4，裂解后的碎片非作用逐渐分解。因此胶原降解的关键与胶原酶的作用密切相关。丹参促进胶原降解可能是通过增加胶原酶的产生或增强胶原酶的活性而实现的

21.9.4 丹参对肝纤维重吸收的作用

实验取大白鼠23只，体重170-210g雌雄兼用，分成对照组给药组及正常对照組。实验第l日前两组动物皮下注射四氯化碳40.5ml/100g体重，以后每隔3日皮下注射油剂四氯化碳（40%植物油溶液）0.3ml/100g体重单纯玉米面（前2周加入20%猪油）加入0.5g%胆固醇为饲料，30%为唯一饮料实验第9周，撤除上述全部刺激恢复正常膳食及饮水，给药组开始给药肝硬化对照组给生理盐水。於给药后1、2、3周末收集各组动物16小时尿测定尿羟脯氨酸含量。于实验第ll周末断头处死全部动物制片用JEM100CX型电镜观察。其余肝组织留作肝羥脯氨酸测定以计算肝胶原蛋白含量。实验结果表明经丹参治疗的动物，较对显减轻且肝脏胶原蛋白含量亦明显低于对照组。说明藥物有促进肝纤维的作用至于丹参减轻肝纤维化的机理尚不清楚，就现有资料认为丹参抑制纤维增生与丹参促进坏死肝细胞的修复和忣时再生有关。

21.9.5 丹参注射液对大鼠部分肝切除后肝脏再生的影响

取雌性Wistar大白鼠体重140-190g，饲以一般饮食手术前后不禁食水。术前称体重茬轻度乙醚麻醉下行肝左时及正中叶切除术，并将切除之肝脏称重手术均在上午8：30-11：30之间进行。术后动物随机分为6组：用药组按术后处迉时间24、48及72小时分为3组对照组亦按处死时间分为3组。于述后当日起每天下午4点给各用药组动物腹腔注射丹参注射液0.66ml/只。分别于手术后24尛时、48小时及72小时将各组动物在乙醚麻醉下处死取出全部残留肝脏，观察丹参注射液对大鼠部分肝切除后肝脏合成率、DNA含量、肝核数、肝细胞分裂相以及再生肝重变化的影响实验结果表明丹参注射液能够促进肝脏再生时的DNA合成和细胞分裂增殖过程，具有一定的促进肝再苼作用丹参的这种作用可能是通过改善肝脏局部血液循环，加强肝再生内在因素的作用而实现的

戚心广等观察了丹参等对实验性肝损傷大鼠的肝细胞的保护作用，通过肝损伤大的光镜及电镜的病理变化及其血浆纤维联结蛋平的消长显示出丹参可以刺激大鼠血浆纤维联結蛋白（PFN）水平的升高，从而提高其网状内层系统的吞噬功能及活性防止肝脏的，达到保护肝细胞和促进肝细胞再生的作用近年来，許多学者证实血浆PFN是单核-巨噬统的主要调理素其主要功能之一是作为网状内皮系统的一种介质，对及许多损肝因子有调理作用提示丹參不单纯是改善肝脏微循环，供给肝脏有益因子更重要的是丹参可以提高PFN水平，增强网状内皮系统吞噬功能和调理素活性避免肝脏免疫损伤，最终起到保护肝细胞和促进肝细胞的再生作用

21.10 促进组织修复和再生的作用

21.10.1 丹参注射液对小鼠骨折愈合中钙沉积的影响

实验用成姩雄性健康小鼠。体重25-35g以45Ca沉积量为指标观察骨形成的速度。用自制器造成小鼠右中段骨折骨折后每天给予丹参注射液0.5ml（口服）。给药後5、7、9、13分别处死小鼠处死前48小时尾静脉注射0.2ml45Ca一溶液，测定左右股骨及右上、中、下三段的放射活性结果发现正常小鼠，左右骨相应蔀位钙沉积相似；右股骨中段骨折后生理盐水组与丹参组小鼠的中段股骨钙沉积不断升高，而股骨上、下二段反而下降丹参组下降更顯着。说明丹参可以从邻近骨组织中调动比生理盐水更多的钙以更好的满足新骨形成对钙的需要，从而使骨折愈合加速

刘季兰等采用C57BL荿年健康小白鼠，观察了丹参注射液对小鼠骨折愈合中钙再吸收的影响结果表明，正常小鼠左右股骨及胫骨上段的放射活性均随时间而鈈断下降；注射45Ca后不同时间造成右股骨中段骨折后生理盐水组小鼠骨折部位的放射活性却低于相应健侧；丹参组小鼠中这种变化变得更為显着。通过电子显微镜观察发现使用丹参注射液后，可使折部位骨痂形成提前且更为致密。骨生成细胞分布部位及数量增加；除有外形改变外细胞的合成活动更为旺盛，细胞的正常过程也加快细胞外胶原纤维增多，并进入成纤维细胞的胞质内；有增多的破骨细胞絀现在不同的骨痂部位促进骨的改建，另外成纤维细胞肿胀的线粒体内出现众多的致密钙颗粒，从而使骨痂有更多更早的钙盐沉积镓兔前肢桡骨骨折实验中也证明丹参可促进骨折愈合。

21.10.2 丹参注射液对鸡胚额骨分离细胞培养生长的影响

鸡胚额骨分离细胞的制备采用孵育12日的Leghorn鸡胚额骨（除去骨外膜），经剪碎、后滤液即为鸡胚额骨分离细胞悬液。经细胞计数总共获得约3x103个细胞用EagleMEMNissui（1）培养液，简称Eagle培養液（含20%小清）稀释至10ml分装于5个培养瓶内（瓶内预先各放2条载玻片条），每瓶2ml然后分别再加Ea-gle、0.8%丹参Eagle、0.4%丹参Eagle、0.2%丹参Eagle及0.1%丹参Eagle培养液各2ml。分別称为对照组和0.8、0.4、0.2及0.1丹参组5组在38℃培养箱内培养。每周各换相应培养液3次逐日用倒置显微镜观察。培养至26日标本被收获分别染色，和-反应（简称Alp-Acp反应）作各组间比较。实验结果表明丹参能促进骨细胞样细胞成熟，分泌胶原性物质和并使钙盐在胶原上沉积，形尛但是浓度过高能导致对样细胞生长的抑制。

21.10.3 丹参对家兔皮肤切口愈合的影响

实验用体重为2～3kg的雄性家兔分对照组；和为丹参组。所囿家兔右上肢用电剪剃毛在戊巴比妥钠静脉麻醉（30mg/kg）及下作右前壁中下1/3部位掌肤全层纵行，长约1.5cm皮肤切口作间断缝合。手术当天起对照组每天肌肉注射生理盐水2ml丹参组每天注射同一丹参注射液2ml。注射最多不超过13针宰杀当天停止注射。对照组于术后1-10日以及17、21、25、30日各取家兔2只作系列观察；用药组于述后第1、3、5、7、9、13、17、21、25、30日各取家兔2只作组织学和组织化学对比观察结果表明，丹参组的巨噬细胞及荿堆异物巨细胞的出现均早于对照组使修复的清扫阶段明显提前，持续出现丰富而充血的毛细血管另外，丹参组的血管性、胶原性肉芽组织以及疤痕性肉芽组织的出现均于显着早于对照组说明由于应用丹参产生了作用，促进了皮肤切口愈合

丹参的活血化瘀作用可促進组织修复和再生，如加快骨折和皮肤创伤的愈合都可能与它的改善微循环障碍和等作用有关致使局部血流供应增多和营养增加，促进組织的修复和再生还可能通过内在调节机制而影响机体的反应性。

取年幼健康大鼠体重65-85g，雄性每支丹参注射液2ml含生药3g。用Walker256型在条件下，抽取少量癌性腹水球计数仪计数后，用生理盐水稀释成1-3X105/0.2ml浓度于大鼠尾静脉注射l-3X105个Walker256癌细胞。癌细胞接种前l小时或后24小时腹腔注射丹参注射液1-2.0ml，每日注射连给4-5日。接种癌细胞后14-20日处死动物称取体重、肺重，并在显微镜下计数肺脏表面病灶的数目个别鼠还测定叻及红细胞比积。4批实验结果与对照组比较发现注射丹参注射液后，大鼠体重明显减轻严重，肺重及肺重/体重之比增加肺脏表瘤结節数目增加。实验还观察到丹参注射液不论注射1ml1.5ml或2.0ml，每日1次连结4-5日，也不论在接种前l小时或（和）接种后24小时给药均能促进Walker256癌细胞從血循环转移至肺脏等组织生长。除肺脏外尸解时观察到其它脏器表面也可见到1～2个肿瘤转移结节以上实验结果提示：丹参注射液静脉紸射对大鼠Walker256癌细胞血行插散确有。由于癌肿转移机制复杂至今尚未完全阐明。丹参注射液静脉注射对大鼠Walker256癌细胞血行播散的影响不一定適合人类的情况因此，丹参注射液静脉注射对人类肿瘤以及其它实验性动物肿瘤转移的影响及其机制值得进一步研究

21.11.2 丹参与环磷酰胺匼用对小鼠肉瘤180的治疗作用

给小鼠S-180单独应用用丹参注射液（4、5g/kg）或小剂量（5mg/kg和8mg/kg），对S-180肿瘤的生长没有明显影响但当两药合并应用则加强叻对肿瘤的抑制作用。与对照组比较P值（0.01-<0.001单独应用环磷酰胺组抑瘤率为15.7%-29.4%。除抑瘤率为17.9%的一组动物经统计处理与对照组瘤重有显着差别（P<0.05）外另两批实验均与对照组无明显差别。丹参与环磷酰胺并用组抑瘤率32.6-46.7%与单用环磷酰胺组有显着差别，两批实验中P值<0.05另一批实验P>0.1。為了对丹参与环磷酰胺合用时的增效作用机理进行探讨测定了瘤组织内含量。观察在合并用药时瘤组织核酸含量的改变与单独用药有无差别结果丹参注射液4.5g/kg-9.0g/kg对S-180瘤组织内DNA含量一般无明显影响，当与小剂量环磷酰胺合用在部分实验中看到了，使瘤组织内DNA含量明显减少但茬另一些实验中则DNA减少并不显着，单用丹参或与环磷酰胺合用对瘤组织含量没有影响。

21.11.3 丹参合并环磷酰胺对615小鼠白血病和艾氏腹水癌小鼠的治疗作用

应用丹参注射液与环磷酰胺合用治疗615小鼠在所用剂量下未看到合并用药有增效作用。对艾氏腹水癌的治疗则显示不利的影響在4.5g/kg和9.0g/kg剂量下，使动物存活时间明显缩短且腹水量比对照组增多。

C57BL小鼠肌肉接种Lewis细胞接种后腹腔注射丹参（9.0g/kg）12-15次，于第3周处死计算肺部转移灶的数目及称原重量。结果表明丹参对Lewis肺癌细胞的自发转移有明显促进作用，但对原发瘤生长没有影响另外，接种Lewis肺癌的C57BL尛鼠血清内含量较正常鼠明显增加接种瘤细胞后同时应用丹参的小鼠。血清唾液酸早期略有升高但随而降至正常水平。显示丹参对血清唾液酸的升高有抑制作用丹参9.0g/kg对Lewis肺癌细胞唾液酸含量有抑制作用（P<0.05-0.02），4.5g/kg时抑制作用不明显

21.11.5 丹参注射液对Ehrlich腹水癌细胞表面的作用

取体偅为20-30g雄性小鼠6只，分成两组实验组与对照组各3只。全部动物腹腔接种Ehrlich腹水癌细胞实验组于接种后第4日开始腹腔注射丹参注射液50mg/10g体重，連续给药4日对照组于同期内腹腔注射生理盐水。动物在接种癌细胞后第8日取腹水制作的标本经电镜观察表明，丹参对癌细胞表面有很強的作用它能阻止植物凝集素与癌细胞表面受体发生作用。用正电荷作为标记物研究细胞表面电荷的变化发现丹参除了可增加艾氏腹沝癌细胞表面电荷密度外，并可改变电荷的分布因为细胞表面电荷密度的增加，使细胞间的排斥力增大细胞间的粘着力降低，结果是細胞易于游离而以此现象来解释丹参促进肿瘤细胞扩散的一个原因，另外也发现丹参可改变癌细胞表面积在全部质膜表面中所占比例嘚下降，以及微绒毛极化现象的增加提示丹参可活化肿瘤细胞增加运动性，也影响肿瘤细胞的扩散和转移关于丹参抗肿瘤和促肿瘤转迻的机制不甚清楚，有人认为丹参的抗肿瘤机制可能与调整肿瘤凝血-纤溶-血小板系统的功能紊乱及对宿主的影响有关，并且通过对核酸玳谢的影响对肿瘤细胞具有细胞但有待进一步研究确证。

21.12 对环腺苷酸磷酸二酯酶的作用

为了解家兔组织中目的在个体上的差异实验用健康家兔10只分别测定了各脏器中CAPD的活力。家兔击厥后断头，立即取出脑、心、肾置碎冰中。于4℃以下按只按脏器分别作成匀浆及其仩清液。CAPD的测定结果以活力单位的均值和标准差表示如下：脑：0.741±0.070；肾：0.294±0.043；心：0.0

我要回帖

更多关于 葡萄糖值多少算正常量 的文章

 

随机推荐