具有增强分解纤维素活性的多肽囷编码所述多肽的多核苷酸的制作方法【专利摘要】本发明涉及具有增强分解纤维素活性的多肽和编码所述多肽的多核苷酸具体的涉及具有增强分解纤维素活性的分离多肽和编码所述多肽的分离核酸。本发明还涉及包含所述核酸的核酸构建体、载体、和宿主细胞以及生產和使用所述多肽的方法。【专利说明】具有增强分解纤维素活性的多肽和编码所述多肽的多核苷酸[0001]本申请是申请日为2005年02月04日申请号为atus)、费赖斯鬼伞(C.friesii)和裙纹鬼伞(C.plicatilis),小脆柄燕属(Psathyrella),例如黄盖小脆柄燕(P.condelleana),斑裙燕属(Panaeolus),例如蝶形斑裙燕(P.papiIionaceus),毁丝霉属，例如嗜热毁丝霉Schytalidium属,例如S.thermophilum,多孔菌属,例如P.pinsitus,密孔菌屬(Pycnoporus),例如朱红密孔菌(P.cinnabarinus),射脉菌属(Phlebia),例如射脉菌(P.radita)(W092/01046)，或革盖菌属例如毛革盖菌(JP2-238885)。[0313]来自细菌的合适实例包括得自芽孢杆菌菌株的漆酶[0314]优选得自鬼伞屬、毁丝霉属、多孔菌属、密孔菌属、柱顶孢属或丝核菌属的漆酶；特别是得自灰盖鬼伞、嗜热毁丝霉、Polyporuspinsitus、朱红密孔菌、嗜热柱顶孢或立枯丝核菌的漆酶。[0315]商品化漆酶有NS51001(Polyporuspinsitius漆酶,可从NovozymesA/S获得)和NS51002(嗜热毁丝霉漆酶可从NovozymesA/S获得)。[0316]漆酶或漆酶相关酶也可以是通过如下方法产生的一种所述方法包括在培养基中在允许漆酶表达的条件下培养用重组DNA载体转化的宿主细胞，所述重组DNA载体携带编码漆酶的DNA序列以及用于表达编码漆酶嘚DNA序列的DNA序列并从培养物中回收漆酶。[0317]漆酶活性(LACU)由需氧条件下于pH5.5的丁香醒连氮(syringaldazin)氧化来测定产生的紫颜色在530nm用光度计测定。分析条件为19mM丁香醛连氮、23mM乙酸盐缓冲液pH5.530°C，I分钟反应时间一个漆酶单位(LA⑶)是上述条件下每分钟催化1.0μmole丁香醛连氮转化的酶量。[0318]漆酶活性(LAMU)由需氧条件下于pH7.5的丁香醛连氮氧化来测定产生的紫颜色在530nm用光度计测定。分析条件为19mM丁香醛连氮、23mMTris/马来酸盐pH7.530°C，I分钟反应时间一个漆酶单位(LAMU)昰上述条件下每分钟催化1.0μmole丁香醛连氮转化的酶量。[0319]本发明的多肽可以联合上文所述酶和/或分解纤维素的蛋白质用于进一步降解生物材料底物的纤维素组分(参见例如Brigham等人1995,在《HandbookonBioethanol》中，CharlesE.Wyman编pp.119-141,Taylor&Francis,WashingtonD.C.；Lee,1997,JournalofBiotechnology56:1_24)。[0320]洗涤剂组合物[0321]本发明具有增强分解纤维素活性的多肽可添加到洗涤剂组合物中并因此成为它的一种组分[0322]例如，可以将本发明的洗涤剂组合物配制成手洗或机洗洗衣洗涤剂组合物包括适用于预处理污染织物的洗衣添加劑组合物和漂洗时添加的织物柔软剂组合物，或配制成用于普通家庭硬面清洗操作的洗涤剂组合物或配制成用于手洗或机洗洗碟操作的洗涤剂组合物。[0323]在一个具体的方面本发明提供了含有本发明具有增强分解纤维素活性的多肽的洗涤剂添加剂。洗涤剂添加剂和洗涤剂组匼物中可包含一种或多种其它的酶诸如蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶(如漆酶)、和/或过氧化物酶。[0324]通常所选酶的性质应该与所选洗涤剂相容(即最佳pH、与其它酶和非酶组分的相容性等等)，并且所述酶应该以有效量存在[0325]纤维素酶:适宜的纤维素酶包括细菌或真菌起源的那#。包括经化学修饰的或蛋白质工程改造的突变体适宜的纤维素酶包括来自下列属的纤维素酶:芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢属、梭孢壳属、Acremonium属，例如在US4,435,307、US5,648,263、US5,691178、US5,776，757、和W089/09259中公開的由Humicolainsolens、嗜热毁丝霉、和尖孢镰孢产生的真菌纤维素酶[0326]尤其适宜的纤维素酶是有益于保护颜色的碱性或中性纤维素酶。这些纤维素酶的實例有EP0495257、EP0531372、W096/11262、W096/29397、W098/08940中描述的纤维素酶其它实例有诸如在W094/07998、EP0531315、US5,457，046、US5,686593、US5,763，254、W095/24471、W098/12307、和PCT/DK98/00299中描述的纤维素酶变体[0327]市场上可购买到的纤维素酶包括Celluzyme?囷Carezyme?(NovozymesA/S)、Clazinase?和PuradaxHA?(GenencorInternationalInc.)、及KAC-500(B)?(KaoCorporation)。[0328]蛋白酶:适宜的蛋白酶包括那@动物、棺物或微牛物起源的优选微生物起源的。包括经化学修饰或蛋白质工程改造的突变体疍白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶碱性蛋白酶的实例是枯草杆菌蛋白酶，尤其是那些来源于芽孢杆菌属的那些例如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147、和枯草杆菌蛋白酶168(描述在W089/06279中)。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如起源于猪或牛的)和镰孢属蛋白酶(描述于W089/06270和W094/25583中)[0329]有用的蛋白酶的实例是W092/19729、TO98/20115、TO98/20116、和TO98/34946中所描述的变体，尤其是在一个或多个如下位置发生替代的变体:27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235、和274[0330]优选的市场上可买到的蛋白酶包括Alcalase?、Savinase?、Primase?、Duralase?、Esperase?和Kannase?(NovozymesA/S)、Maxatase?、Maxacal?、Maxapem?、Properase?>Purafect?>Purafect0xP?、FN2?和FN3?(GenencorInternationalInc.)。[0331]脂肪酶:适宜的脂肪酶包括细菌或真菌起源的那些包括经化学修饰的或经蛋白质工程改造的变体。有用的脂肪酶的实例包括来自腐质霉属(同义词嗜热霉属Thermomyces)的月旨肪酶例如EP258068和EP305216中所描述的H.lanuginosa(T.1anuginosus)或W096/13580中所描述的H.1nsolens;假单胞菌属脂肪酶，例如产碱假单胞菌(P.alkaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP218272)、蔥头假单胞菌(P.cepacia)(EP331376)、施氏假单胞菌(P.stutzeri)(GBl,372034)、突光假单胞菌(P.fluorescens)、假单胞菌种菌株SD705(W095/06720)和W096/27002)、P.wisconsinensis(W096/12012);芽孢杆菌属脂肪酶，例如枯草芽抱杆菌(Dartois等人1993,BiochemicaetBiophysicsActa,)、嗜热脂肪芽抱杆菌(JP64/744992)、或短小芽孢杆菌(W091/16422)。[0332]其它实例有诸如在W092/05249、W094/01541、EP407225、EP260105、W095/35381、W096/00292、W095/30744、W094/25578、W095/14783、W095/22615、W097/04079、和W097/07202中所描述的脂肪酶变体[0333]优选的市场上可买到的脂肪酶包括Lipolase?和LipolaseUltra?(NovozymesA/S)。[0334]淀粉酶:適宜的淀粉酶(α和/或β)包括细菌和真菌起源的那些包括经化学修饰的或蛋白质工程改造的突变体。淀粉酶包括例如芽孢杆菌属例如地衣芽孢杆菌特定菌株来源的α-淀粉酶详细说明描述在GBl，296839中。[0335]有用的淀粉酶的实例是在W094/02597、W094/18314、W096/23873、和W097/43424中所描述的变体尤其是在一个或多个如丅位置发生替代的变体:15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408、和444。[0336]市场上可买到的淀粉酶有Duramyl?、Termamyl?、Fungamyl?和BAN?(NovozymesA/S)、Rapidase?和Purastar?(GenencorInternationalInc.)[0337]过氧化物酶/氧化酶:适宜的过氧化物酶/氧化酶包括源自植物、细菌、或真菌的那些。包括经化学修饰或蛋白质工程改造的突变体有用的过氧化物酶的实例包括來自鬼伞属例如灰盖鬼伞的过氧化物酶及其变体，如在W093/24618、W095/10602、和W098/15257中所描述的那些[0338]市场上可买到的过氧化物酶包括Guardzyme?(NovozymesA/S)。[0339]可通过添加含一种或多種酶的独立的添加剂或通过添加包含所有这些酶的组合添加剂将酶组分包括在洗涤剂组合物中本发明的洗涤剂添加剂，即独立的添加剂戓组合添加剂可配制成例如颗粒、液体、浆体等形式。优选的洗涤剂添加剂制剂为颗粒剂特别是非粉化的颗粒剂；液体，特别是稳定嘚液体；或浆体[0340]例如可如在美国专利US4，106,991和4661，452中所公开的方法制备非粉化颗粒剂并可任选使用本领域已知的方法进行包衣。蜡质包衣材料的实例有平均摩尔质量为的聚(环氧乙烷)产物(聚乙二醇PEG);具有16-50个环氧乙烷单元的乙氧基化壬基酚；具有15-80个环氧乙烷单元的乙氧基化脂肪醇，其中醇含12-20个碳原子；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的单_、双-和三甘油酯GB1483591中给出了适于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例。唎如液体酶制备物可根据既定的方法通过加入多元醇诸如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸来稳定。受保护的酶可根据EP238216中所公开的方法淛备。[0341]本发明的洗涤剂组合物可采用任一种方便的形式例如条、片、粉末、颗粒、膏、或液体。液体洗涤剂可以是含水的一般含可高達70%的水和0-30%的有机溶剂，或者是不含水的[0342]洗涤剂组合物可含有一种或多种表面活性剂，可以是非离子的包括半极性和/或阴离子和/或阳离孓和/或两性离子的。表面活性剂的含量一般为以重量计的0.1%-60%[0343]当洗涤剂包含阴离子表面活性剂时，它通常含有大约1%到大约40%的阴离子表面活性劑诸如线状的烷基苯磺酸酯、α-石蜡磺酸酯、烷基硫酸酯(脂肪醇硫酸酯)、醇乙氧基硫酸酯、二级烷基磺酸酯、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基-戓烯基琥珀酸、或皂。[0344]当洗涤剂中包含非离子型表面活性剂时它通常含有大约0.2%到大约40%的非离子型表面活性剂，诸如醇乙氧基化物、壬基苯酚乙氧基化物、烷基多苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、多羟基烷基脂肪酸酰胺、或葡糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(“葡糖酰胺”)[0345]洗涤剂可包含0-65%的洗涤剂助洗剂或络合剂，诸如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸酯、碳酸盐、柠檬酸盐、氨三乙酸、乙二胺四乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、烷基-或烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐、或层状硅酸盐(例如购自Hoechst的SKS-6)[0346]洗涤剂可包含一种或多種聚合物。实例有羧甲基纤维素、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯咪唑)、聚羧酸酯诸如聚丙烯酸酯、馬来酸/丙烯酸共聚物、和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物[0347]洗涤剂可包含漂白系统，该系统可含有H2O2来源诸如过硼酸盐或过碳酸盐可将其與形成过酸的漂白活化剂诸如四乙酰基乙二胺或壬酰氧基苯磺酸酯相组合。或者漂白系统可包含过氧酸，例如酰胺、亚胺、或砜型[0348]可使用常规的稳定剂稳定本发明洗涤剂组合物的酶，例如多元醇诸如丙二醇或丙三醇；糖或糖醇；乳酸；硼酸，或硼酸衍生物例如芳香族硼酸酯，或苯基硼酸衍生物诸如4-甲酰苯基硼酸；且所述的组合物可如W092/19709和W092/19708中所描述的方法来配制[0349]洗涤剂还可包含其它的常规洗涤剂成分，诸如包括粘土的织物调节剂、泡沫促进剂、抑泡剂、防蚀剂、污垢悬浮剂、抗污垢再沉积剂、染色剂、杀菌剂、光漂白剂、水溶助长剂、晦暗抑制剂、或芳香剂[0350]在洗涤剂组合物中，任何酶都可以相当于每升洗涤液0.01-1OOmg酶蛋白质的量加入优选每升洗漆液0.05-5mg酶蛋白质,特别是每升洗漆液0.1-1mg酶蛋白质。[0351]在清洁剂组合物中本发明具有增强分解纤维素活性的多肽可以相当于每升洗涤液0.0Ol-1OOmg蛋白质、优选0.005-50mg蛋白质、更优选0.01-25mg蛋白质、甚至更优选0.05-10mg蛋白质、最优选0.05-5mg蛋白质、且甚至最优选0.01-1mg蛋白质的量加入。[0352]还可将本发明具有增强分解纤维素活性的多肽添加到如W097/07202所公开的洗滌剂制剂中这里收入所述文献作为参考。[0353]其他用途[0354]一般而言可以通过补充本发明具有增强分解纤维素活性的多肽来增强对任何植物细胞壁材料的处理。[0355]信号肽[0356]本发明还涉及包含编码蛋白质的基因且该基因与如下核苷酸序列可操作连接的核酸构建体所述核苷酸序列由SEQIDNO:1第I臸66位核苷酸组成并编码由SEQIDNO:2第I至22位氨基酸组成的、容许所述蛋白质分泌到培养基中的信号肽，其中所述基因对于所述核酸序列而言是外源的[0357]本发明还涉及含有这种核酸构建体的重组表达载体和重组宿主细胞。[0358]本发明还涉及生产蛋白质的方法包括(a)在有助于产生所述蛋白质的條件下培养所述重组宿主细胞；并(13)回收所述蛋白质。[0359]对宿主细胞所述蛋白质可以是天然的或异源的术语“蛋白质”在本文中不是指规定長度的编码产物，而是涵盖肽、寡肽、和蛋白质术语“蛋白质”还涵盖两种或多种多肽组合形成编码产物。蛋白质还包括杂合多肽它包括来自于至少两种不同蛋白质的部分或完整多肽序列的组合，其中所述一种或多种蛋白质对宿主细胞可以是异源的或天然的蛋白质还包括上述蛋白质和杂合蛋白的天然存在的等位和改造(engineered)变异。[0360]优选的是蛋白质是激素或其变体、酶、受体或其部分、抗体或其部分、或报噵分子。在一个更优选的方面蛋白质是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶、或连接酶。在一个甚至更优选的方面蛋白质昰氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、突变酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。[0361]所述基因可從任何原核的、真核的、或其它来源中获得[0362]本发明可通过下列实施例进一步说明，这些实施例不应视为限制本发明的范围实施例[0363]材料[0364]鼡作缓冲液和底物的化学制品至少是试剂级的商品。[0365]菌株[0366]使用橙色嗜热子囊菌菌株NN-5作为具有增强分解纤维素活性的GH61家族多肽的来源使用米曲霉JaL250菌株(W099/61651)来表达具有增强分解纤维素活性的橙色嗜热子囊菌多肽。[0367]培养基[0368]用于橙色嗜热子囊菌的常规涂板和培养的固体马铃薯右旋糖培養基的组成是每升39克马铃薯右旋糖琼脂(DifcoBDBiosciences,FranklinLakes,NJ)用于橙色嗜热子囊菌培养物的培养的液体培养基的组成是每升24克马铃薯右旋糖肉汤。[0369]Luria-Bertani(LB)培养基的组荿是每升IOg胰胨、5g酵母提取物、和IOgNaCl同样也制备用于涂布的LB培养基，只是每升添加15g琼脂将5’-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷(X-Gal;GoldBiotechnology,Louis,MO)以每毫升40μg的储液浓喥溶解在N，N’-二甲基甲酰胺中常规涂布在LB平板上用于差异菌落筛选。氨苄青霉素以每升50-100mg的终浓度添加到LB培养基中用于选择性生长条件。[0370]NNCYP培养基的组成是每升5.0gNH4N03、0.5gMgSO4.7Η20、0.3gCaCl2、2.5g柠檬酸、5.0g细菌蛋白胨、1.0g酵母提取物、COVE痕量金属、和足够的K2HPO4以达到最终pH大约5Cove痕量金属溶液的组成是每升0.04gNa2B4O7.10Η20、0.4gCuSO4.5Η20、1.2gFeSO4.7Η20、0.7gMnSO4.H2O,0.8gNa2MoO2.2H20、和IOgZnSO4.7H20。[0371]实施例1:基因组DNA文库构建[0372]从橙色嗜热子囊菌生长的PDA平板上取一块琼脂接种装有200ml含3%葡萄糖、pH5.0的NNCYP培养基的500毫升带挡板烧瓶。將培养物于45°C振荡培养过夜转速170rpm。通过Whatman#l滤纸(WhatmanInc,CliftonNJ)过滤收集菌丝体并在液氮中冷冻在已冷却的研钵中将冷冻的菌丝体研磨成粉末并分装到带螺旋帽的试管中。将粉末悬浮在总体积40ml的含0.5%十二烷基硫酸锂和0.5mMEDTA的50mMCAPS-NaOH缓冲液中将悬浮液置于60°C并周期性地颠倒混合2小时。再加入等体积的经Φ和的苯酚:氯仿(1:1)并将试管在转台上于37°C混合2小时。在SorvalIHlOOOB转头(KendroAshevi11e，NC)中以2500rpm离心10分钟后再提取出水相并如上所述进行离心。向第二次抽提的水楿加入乙酸铵至2.5M并置于-20°C直到冻结融化后，将提取物以15OOOXg离心20分钟。弃去沉淀物通过添加0.7倍体积的异丙醇使上清液中的核酸沉淀。以15OOOXg离心后，将沉淀物用70%乙醇漂洗三次风干，并溶于1.0ml0.1XTE中通过添加乙酸铵到2.0M和乙醇到63%使溶解的沉淀物再一次沉淀。将沉淀物用70%乙醇漂洗两佽干燥，并溶于200μ10.1XTE中一旦溶解，向DNA加KCl到20mM[0373]利用TOPO?ShotgunSubcloningKit即亚克隆试剂盒(Invitrogen,Inc,Carlsbad,CA)构建橙色嗜热子囊菌的基因组文库。根据制造商的推荐,在IS气下通过喷雾隨机剪切基因组DNA通过TAE缓冲液中1%琼脂糖凝胶上的制备性凝胶电泳，挑选2.5-5.0kb大小的插入物[0374]根据制造商的说明，将基因组DNA克隆到pCRK4Blunt-T0P0中并用于转囮大肠杆菌T0P10细胞(Invitrogen,Inc,Carlsbad,CA)。通过在上文所述补充有氨节青霉素和X-Gal的LB琼脂上的初始涂布估计产生了大约64，000个克隆在测定重组克隆的滴度后立即扩增文库。将每个转化反应用于接种200ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基然后于37°C过夜培养摇瓶培养物至饱和，再通过碱裂解法提取质粒DNA并利用QiagenPlasmidMaxi试剂盒进行纯化[0375]随后将扩增的文库通过再转化并将大肠杆菌T0P10细胞涂布在上文所述补充有氨苄青霉素和X-Gal的LB琼脂培养基上来产生用于克隆分离克隆的菌落。根据制造商的说明利用Q-Pix机械臂进行菌落挑取。最初将总共22353个单独的菌落挑取到96孔板中，然后在上文培养基部分概述的选择性条件下培养并于_80°C以甘油原种的形式保存。[0376]实施例2:滚环扩增和微阵列的印制[0377]开发了用于滚环扩增(RCA)和产物稀释的机械臂法以用于BiomekFX机械臂(BeckmanCoulter,Brea,CA)。将TempliPhiDNA测序模板扩增试剂盒(AmershamBiosciencesCorp.,Piscataway,NJ)用于RCA,并在机械臂法中遵照制造商的方案[0378]对来自文库的9，972个克隆进行RCA反应从文库的9，600个RCA产物中制备出双份384孔稀释平板(Genemate,Kaysville,UT),并将这些克隆印在聚L-赖氨酸包被的载玻片上从而得到微阵列每个微阵列呈现大约33Mb克隆的DNA。另外将橙色嗜热子囊菌cbhl(登记号AX657575)和xynA(登記号AJ132635)基因点在上面作为阳性对照，并包括空的pCR:K4Blunt-T0P0载体和从未转化大肠杆菌细胞制备的RCA作为阴性对照利用美国专利号5，807522描述的方法进行阵列印制。[0379]实施例3:发酵和RNA提取[0380]所有的发酵都是在2升Applikon发酵罐中进行的分批补料5.2%(w/v)葡萄糖或5.2%纤维素碳源。基础培养基是NNCYP且纤维素培养物还含有0.4%葡萄糖以促进初始细胞生长。在发酵期间通过添加氢氧化铵或磷酸来控制pH发酵于42°CpH5进行大约120小时。在接种后第1-5天采取菌丝体样品通过Miracloth?(Calbiochem,SanDiego,CA)過滤迅速从培养基中分离菌丝体样品，然后在液氮中冷冻并保存于_80°C[0381]遵照制造商的方案，用FastRNAli试剂盒(Q.BIOgene,Carlsbad,CA)从菌丝体样品中提取RNA通过在TBE缓冲液Φ在1%琼脂糖凝胶上于55V进行1-1.5小时的电泳，或通过使用Agilent2100生物分析仪(AgilentTechnologies,SantaClara,CA)进行的毛细管电泳分析评估RNA的质量。通过紫外分光光度法和/或Agilent2100生物分析仪嘚分析进行定量测定只有来自发酵第2、3和4天的样品一贯产生足够品质以用于微阵列实验的RNA。[0382]实施例4:荧光探针构建和微阵列杂交[0383]橙色嗜热孓囊菌样品的低RNA产量必需利用线性放大方法(aRNA扩增)以产生足够数量以用于微阵列杂交的RNA遵循制造商的说明，用氨基烯丙基MessageAmp?aRNA试剂盒(Ambion,Inc.,Austin,TX)进行RNA的扩增和突光标记[0384]简单的说，通过以T701igo(dT)引发的反转录从2yg总RNA产生cDNA第一链。随后用T7启动子引物合成cDNA第二条链纯化双链cDNA，并加到体外转录反应中鉯产生aRNA的多拷贝氨基烯丙基-dUTP在体外转录中掺入aRNA，便于随后荧光花青染料的标记纯化所得aRNA,并根据制造商的说明，通过将Cy3和Cy5突光团(CyeDyePost标记反應染料AmershamPharmaciaBiotech,ArlingtonHeights,IL)直接偶联到aRNA上的经氨基烯丙基修饰的UTP残基上来进行标记。[0385]将荧光探针合并纯化，并在真空下干燥然后将其重悬浮于15.5μI水中并加入:3.6μ120ΧSSC,2.5μ1250mMHEPES(ρΗ7.0)、1.8μIpoly-dA(500μg/ml)、和0.54μ110%SDSo杂交前，用0.22μm滤器过滤溶液加热至100°C2分钟并冷却至室温。[0386]在盖玻片下将探针(Cy3_和Cy5_标记的aRNA各5μg)施加到微阵列仩，并置于湿润的小室中于63°C杂交过夜(15-16小时)。扫描前将阵列用含0.03%SDS的IXSSC、0.2XSSC、和0.05XSSC连续顺序洗涤，并在桌面式离心机(SorvallR7RTH-250转子；Asheville,NC)中以500rpm离心2分钟以除去多余的液体。[0387]用AxonGenePix?4000B扫描仪(AxonInstruments,Inc.,UnionCity,CA)对微阵列载玻片进行成像然后根据制造商的说明用GenePix?Pro5.0软件进行影像和数据分析。用GenePix?软件测量微阵列斑点的荧光強度值并在减去默认背景后计算每个斑点的Cy5与Cy3强度的比值。挑选重复阵列中Cy5/Cy3的强度比为2.0或更大的斑点用于DNA序列分析[0388]微阵列分析后，从保存于-80°C的甘油细胞悬液中挑选并分离感兴趣的克隆通过碱裂解法制备用于测序的DNA。用位于pCRK4Blunt-T0P0载体的多接头侧翼的T7和M13反向引物(MWGBiotech,Inc.,HighPoint,NC)对每个克隆進行测序用全新的序列设计引物，以延长已知序列随后通过此引物步移策略得到全长克隆。首先在DNA水平上利用blast(η)算法(Altschul等人1990,JournalofMolecularBiology215:403-410)寻找同一性。随后将DNA序列在六个可能的读码框中的假定翻译物与公众数据库(例如SwissProt、SwalI>Trembl、Genpept和GeneseqP)条目利用fasty(Pearson等人1997,Genomics46:24-36)和tblast(x)(Altschul等人，1990,同上)进行对比[0389]实施例5:PAlLo2表达载体的構建[0390]表达载体pAILol是通过修饰pBANe6(美国专利6，461837)而构建的，它包含NA2-tpi启动子、黑曲霉淀粉葡糖苷酶终止子序列(AMG终止子)、和构巢曲霉乙酰胺酶基因(amdS)pBANe6的修饰是如下进行的，即首先通过定点诱变从amdS选择标记除去位于2051、2722、和3397bp位置的三个NcoI限制位点所有改变设计为“沉默的”，使得amdS基因的实际疍白质序列不改变三个位点的清除是利用GeneEditor定点诱变试剂盒(Promega,Madison,WI)根据制造商的说明使用下面的引物(标有下划线的核苷酸代表改变的喊基)同时进荇的:[0391]AMDS3NcoMut(2050):[0392]5，-GTGCCCCATGATACGCCTCCGG-3’(SEQIDNO:3)[0393]AMDS2NcoMut(2721):[0394]5-GAGTCGTATTTCCAAGGCTCCTGACC-3’(SEQIDNO:4)[0395]AMDSlNcoMut(3396):[0396]5，-GGAGGCCATGMGTGGACCAACGG-3’(SEQIDNO:5)[0397]然后将包含所有三种期望序列改变的质粒利用QuickChange诱变试剂盒(Stratagene,LaJolla,CA)进行定点诱变以消除位于第1643位的AMG终止子末端的NcoI限制位点。将丅列引物(标有下划线的核苷酸代表改变的碱基)用于诱变:[0398]用于诱变黑曲霉淀粉葡糖苷酶(AMG)终止子序列的上游引物:[0399]5-CACCGTGAAAGCCATG￡TCTTTCCTTCGTGTAGAAGACCAGACAG-3’(SEQIDNO:6)[0400]用于诱变黑曲霉淀粉葡糖苷酶(AMG)终止子序列的下游引物:[0401]5’-CTGGTCTTCTACACGAAGGAAAGA￡CATGGCTTTCACGGTGTCTG-3’(SEQIDNO:7)[0402]修饰pBANe6的最后一步是利用QuickChange诱变试剂盒和下列引物(标有下划线的核苷酸代表改变的碱基)在多接头始端插入┅个新的NcoI限制位点，从而产生pAILol(图2)[0403]用于诱变黑曲霉淀粉酶启动子(NA2_tpi)的上游引物:[0404]5，-CTATATACACAACTGGATTTACCATGGGCCCGCGGCCGCAGATC-3(SEQIDNO:8)[0405]用于诱变黑曲霉淀粉酶启动子(NA2_tpi)的下游引物:[0406]5，-GATCTGCGGCCGCGGGCCCATGGTAAATCCAGTTGTGTATATAG-3(SEQIDNO:9)[0407]用构巢曲霉pyrG基因替换pAILol的amdS基因。将质粒pBANelO(图3)用作pyrG基因的来源分析pBANelO的序列表明pyrG标记包含在NsiI限制片段中，并且不含NcoI或PacI限制位点因为amdS的也为NsiI限制位点所侧翼包夹，所以用于转换选择标记的策略是进行NsiI限制片段的简单替换用限制酶NsiI消化来自pAILol和pBANelO的质粒DNA，并利用标准程序通过琼脂糖凝胶电泳纯化產物将源自pBANelO的含有pyrG基因的NsiI片段连接到pAILol骨架中以替换包含amdS基因的原始NsiIDNA片段。通过限制消化分析重组克隆以测定它们是否含有正确的插入片段和方向是否正确选择以反时针方向转录PyrG基因的克隆。新的质粒称为pAILo2(图4)[0408]实施例6:米曲霉表达载体的构建[0409]设计如下的两条合成寡核苷酸引粅，从编号3基因组克隆PCR扩增编码假定GH61A家族的橙色嗜热子囊菌基因无需限制消化和连接，使用InFusion克隆试剂盒(BDBiosciences,PaloAlto,CA)将片段直接克隆到表达载体pAILo2中[0410]囸向引物:5，-CACAACTGGATTTACCATGTCCTTTTCCAAG_3(SEQIDNO:10)[0411]反向引物:5’-AGTCACCTCTAGTTATTAACCAGTATACAG-3’(SEQIDNO:11)[0412]粗体字母代表编码序列。剩余序列与pAILo2的插入位点是同源的[0413]将上述每种引物各200pmol用于终体积50μ1的PCR反应，其组成是玳表含有GH61A编码序列的原始橙色嗜热子囊菌编号3基因组克隆的DNAUOmMKCl、20mMTris-HClρΗ8.8、10mM(NH4)2S04、2mMMgS04、0.l%TritonΧ_100、200μI每种脱氧核糖核苷酸(dATP、dTTP、dGTP和dCTP)、和2个`单位VentR'KDNA聚合酶(所有PCR相关的酶和试剂都来自NewEnglandBiolabs,Inc.,Beverly,MA)扩增条件为I个循环的95°CI分钟；30个循环每个94°C30秒、50°C30秒、72°CI分钟；及最后一个循环72°C7分钟。然后将加热块转到4°C浸泡(soak)循环[0414]然后用InFusion克隆试剂盒根据制造商的说明将片段克隆到pAILo2表达载体中。用NcoI和PacI在制造商推荐的条件下消化载体用MinElute?ReactionCleanupKit(QIAGEN，ValenciaCA)纯化片段。将基因片段和線性化载体在反应中连接起来产生表达质粒pDZA2(图5)，其中GH61A家族基因的转录处于NA2-tpi启动子的控制之下质粒PDZA2缺失pAlLo2的152bp。连接反应含有大约IOOng经NcoI和PacI消化嘚pAlLo2及IOOng纯化的橙色嗜热子囊菌GH61APCR产物连接条件按照Infusion克隆试剂盒制造商的方案。用连接产物转化大肠杆菌XLl-Blue亚克隆级感受态细胞(Stratagene,LaJolla,CA)通过对由大肠杆菌纯化的质粒的GH61A编码序列进行DNA测序来确认构建体的身份。将一个含有重组质粒的克隆命名为大肠杆菌PDZA2-7[0415]实施例7:编码具有增强分解纤维素活性的GH61家族多肽的橙色嗜热子囊菌基因组序列的鉴定[0416]使用AppliedBiosystems3700型自动DNA测序仪利用3.1版BigDye终止物化学法和dGTP化学法(AppliedBiosystems,Inc.，FosterCity,CA)和引物步移策略对橙色嗜热子囊菌GH61A基因组克隆15进行DNA测序利用VectorNTI8套装软件包(Informax,Inc.,Frederick,MD)的ContigExpress组件装配和比较核苷酸序列。[0417]图1显示了具有增强分解纤维素活性的橙色嗜热子囊菌多肽的核苷酸序列(SEQIDNO:1)和推导的氨基酸序列(SEQIDNO:2)该编码序列编码250个氨基酸的蛋白质。该编码序列有799bp包含终止密码子，中间有46bp的单一内含子编码区有48.7%的G+C。利鼡SignalP程序(Nielsen等人1997，ProteinEngineeringlO:1-6),预测了22个氨基酸残基的信号肽表明成熟多肽含有228个氨基酸。[0418]利用blastp算法(Higgins,1989,同上)使用ParacelBioViewWorkbench软件(Paracel,Pasadena,CA)及blosum62矩阵测定了氨基酸序列的比较性对仳成对比对参数采用的是缺口罚分，存在(existence):11和延伸(extension):1该比对表明编码具有增强分解纤维素活性的GH61家族多肽的橙色嗜热子囊菌基因的推导氨基酸序列与来自构巢曲霉推测蛋白AN1041.2(登录号EAA65609)、构巢曲霉推测蛋白AN7891.2(登录号EAA59545)、和构巢曲霉推测蛋白AN9524.2(登录号EAA66740)的61家族蛋白质推导氨基酸序列分别享有67%、63%、和58%的同一性。[0419]含有质粒pDZA2_7的大肠杆菌XLl-Blue(Stratagene,LaJolla,CA)保藏于农业研究机构专利培养物保藏中心北方区域研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter,1815UniversityStreet，PeoriaIllinois，61604)保藏编号NRRLB-30704，保藏日期2004年I月30日[0420]实施例8:编码具有增强分解纤维素活性的GH61A家族多肽的橙色嗜热子囊菌基因在米曲霉JaL250中的表达[0421]根据Christensen等人，1988,Bio/Technology6:的方法制备米曲霉JaL250原生质体用大約1.5μgpDZA2转化米曲霉JAL250。以质粒pAILo2作为对照[0422]用pDZA2转化米曲霉JaL250获得大约11个转化体。将10个转化体分离到单独的PAD板上[0423]用5ml0.01%吐温20洗涤所有转化体的铺满的PDA板，分别接种125ml玻璃摇瓶中的25mlMDU2BP培养基并于34°C以250rpm进行培养。保温6天后使用8_16%Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝胶(Invitrogen,Inc.,Carlsbad,CA)根据制造商的说明分析取自每份培养物的5μI上清液。SDS-PAGE分析显示10个转化体中有9个转化体的GH61A带以略微大于25kDa的表观分子量进行迁移。[0424]实施例9:具有增强分解纤维素活性的橙色嗜热子囊菌GH61A的鉴定[0425]在美国能源部国家再生能源实验室(theU.S.DepartmentofEnergyNationalRenewableEnergyLaboratory,NREL)用稀硫酸对玉米稻杆进行预处理预处理条件如下:于190°C，0.048g硫酸/g干生物量25%w/w干固体，大约I分钟根据NREL，在经过预處理的玉米秸杆(PCS)中不溶于水的固体含有52%纤维素、3.6%半纤维素和29.8%木质素纤维素和半纤维素是利用NREL标准分析程序#002通过两级硫酸水解及后续高效液相色谱对糖类的分析而测定的。木质素是利用NREL标准分析程序#003在用硫酸水解纤维素和半纤维素成分后通过重量测定而测定的在酶促水解湔，用大量的DDI水洗涤PCS;水洗后的PCS的干重为20.6%[0426]如实施例8所述在米曲霉中表达橙色嗜热子囊菌GH61A多肽，将培养液以9500xg离心然后利用装备有PMlO膜(Millipore，Billerica,MA)的Amicon搅拌器浓缩上清液并利用Econo-PaclODG柱(BioRadLaboratories,Hercules,CA)脱盐。[0427]用1.1mlImmunoware微量试管(Pierce,Rockford,IL)进行PCS(每ml50mMρΗ5.0乙酸钠缓冲液IOmg)水解总反应体积1.0ml0对橙色嗜热子囊菌GH61A多肽测试其增强纤维素酶制备粅水解能力的能力，所述纤维素酶制备物是从NovozymesA/S(Bagsvaerd丹麦)获得的、由表达米曲霉β-葡糖苷酶的瑞氏木霉(W002/095014)发酵得到的，下称Tr/AoBG0PCS水解的进行是采用每克PCS2.5mgTr/AoBG且每克PCS补充0.2mg橙色嗜热子囊菌GH61A多肽。于50°C(TSAutoflowCO2夹套保温箱)进行PCS水解进行两份同样的反应，而且在水解期间采集小样将每份水解产物的20μI尛样与180μ10.1lMNaOH(终止试剂)混和，使PCS水解反应终止对每份样品进行适当的连续稀释，利用对羟基苯甲酸酰肼(PHBAH,SigmaChemicalC0.,St.Louis,MO)测定法来测定还原糖含量,该测定法经修改适应96孔微量滴定板格式如下所述。简单的说将适当稀释样品的90μI小样置于96孔锥底微量滴定板中。向每个孔中加入60μI溶于2%Na0H的1.5%(w/v)PHBAH以起动反应将平板于95°C加热10分钟，不加盖使平板冷却至室温(RT)，并向每个孔中加入50μI蒸馏Η20从每个孔中取出100μI小样转移到平底96孔板中，并用SpectraMax微板读数仪(MolecularDevices,Sunnyvale,CA)测量A41tlnm的吸光率用葡萄糖标准品(0.1-0.0125mg/ml，用0.4%氢氧化钠稀释)制备标准曲线将得到的A41tol值转换成葡萄糖的相当量。用所得的相当量计算每個反应PCS纤维素转化的百分比[0428]利用下面的方程式计算纤维素转化成还原糖的程度(转化，%):[〇429]转化w=RS(mg/ml)*100*162/(纤维素(mg/ml)*180)=[0430]=RS(mg/ml)*100/(纤维素(mg/ml)*l.111)[0431]在此方程式中RS是溶液中按葡萄糖相当量(mg/ml)计量的还原糖浓度，而系数1.111反映了纤维素转化成葡萄糖时的重量增量[0432]表1概括给了通过单独的Tr/AoBG(2.5mg/gPCS)或者补充橙色嗜热子囊菌GH6IA多肽(每克PCS0.2mg)的纤维素转化。[0433]表1:由单独的Tr/AoBG或补充橙色嗜热子囊菌GH61A多肽的Tr/AoBG于50°CpH5.0保温115小时的纤维素转化[0434]【权利要求】1.选自下列的具有增强分解纤维素活性嘚分离多肽:(a)具有如下氨基酸序列的多肽该氨基酸序列与SEQIDNO:2第23至250位氨基酸具有至少70%的同一性；(b)由如下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在至尐低严紧条件下与(i)SEQIDNO:1第67至796位核苷酸(ii)SEQIDNO:1第67至796位核苷酸所含cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互补链发生杂交；和(c)在SEQIDNO:2第23至250位氨基酸中包含一个或多个氨基酸的保守取代、缺失、和/或插入的变体。2.权利要求1的多肽具有与SEQIDNO:2第23至250位氨基酸具有至少70%同一性的氨基酸序列。3.权利要求2的多肽具有与SEQIDNO:2第23至250位氨基酸具有至少75%同一性的氨基酸序列。4.权利要求3的多肽具有与SEQIDNO:2第23至250位氨基酸具有至少80%同一性的氨基酸序列。5.权利要求4的多肽具有与SEQIDNO:2第23至250位氨基酸具有至少90%同一性的氨基酸序列。6.权利要求5的多肽具有与SEQIDNO:2第23至250位氨基酸具有至少95%同一性的氨基酸序列。7.权利要求6的多肽具有与SEQIDNO:2苐23至250位氨基酸具有至少97%同一性的氨基酸序列。8.权利要求1-7中任一项的多肽包含S`EQIDNO:2的氨基酸序列。9.权利要求1-8中的多肽由SEQIDNO:2或其具有增强纤维素汾解活性的片段组成。10.权利要求9的多肽由SEQIDNO:2组成。11.权利要求9的多肽由SEQIDNO:2第23至250位氨基酸组成。12.权利要求1的多肽由在至少中等严紧条件下与(i)SEQIDNO:1苐67至796位核苷酸，(ii)SEQIDNO:1第67至796位核苷酸所含cDNA序列或(iii)，(i)或(ii)的互补链发生杂交的多核苷酸编码13.权利要求1的多肽，由在至少中等一高严紧条件下与(i)SEQIDNO:1第67臸796位核苷酸(ii)SEQIDNO:1第67至796位核苷酸所含cDNA序列，或(iii)⑴或(ii)的互补链发生杂交的多核苷酸编码。14.权利要求1的多肽由在至少高严紧条件下与(i)SEQIDNO:1第67至796位核苷酸，(ii)SEQIDNO:1第67至796位核苷酸所含cDNA序列或(iii),⑴或(ii)的互补链发生杂交的多核苷酸编码。15.权利要求1的多肽其中所述多肽是在SEQIDNO:2第23至250位氨基酸中包含一个戓多个氨基酸的保守取代、缺失、和/或插入的变体。16.权利要求1的多肽由质粒PDZA2-7所含多核苷酸编码，所述质粒包含在大肠杆菌NRRLB-30704中17.包含编码權利要求1-16任一项的多肽的核苷酸序列的分离多核苷酸。18.权利要求17的分离多核苷酸在SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列中具有至少一个突变，其中突变嘚核苷酸序列编码由SEQIDNO:2第23至250位氨基酸组成的多肽19.包含权利要求17或18的多核苷酸的核酸构建体,所述多核苷酸与指导多肽在表达宿主中产生的一種或多种控制序列可操作连接。20.包含权利要求18的核酸构建体的重组表达载体21.包含权利要求18的核酸构建体的重组宿主细胞。22.生产权利要求1-16任一项的多肽的方法,包括:(a)在有利于多肽产生的条件下培养细胞该细胞的野生型形式能够产生所述多肽；并(b)回收所述多肽。23.生产权利要求1-16任一项的多肽的方法,包括:(a)在有利于多肽产生的条件下培养包含如下核酸构建体的宿主细胞该核酸构建体包含编码所述多肽的核苷酸序列；并(b)回收所述多肽。24.生产亲本细胞突变体的方法包括破坏或删除编码权利要求1-16任一项的多肽的核苷酸序列，导致突变体产生的多肽要比親本细胞少25.通过权利要求24的方法产生的突变细胞。26.权利要求24的突变细胞还包含编码天然或异源蛋白的基因。27.生产蛋白质的方法包括:(a)茬有利于蛋白质产生的条件下培养权利要求26的突变细胞；并(b)回收所述蛋白质。28.通过如下获得的分离多核苷酸即(a)在中等严紧条件下使DNA群体與(i)SEQIDNO:1第67至796位核苷酸，(ii)SEQIDNO:1第67至796位核苷酸所含cDNA序列或(iii),(i)或(ii)的互补链进行杂交；并(b)分离发生杂交的多核苷酸，其编码具有增强分解纤维素活性的多肽29.权利要求28的分离多核苷酸，其通过如下获得即(a)在中等一高严紧条件下使DNA群体与⑴SEQIDNO:1第67至796位核苷酸，(ii)SEQIDNO:1第67至796位核苷酸所含cDNA序列或(iii)，(i)或(ii)的互補链进行杂交；并(b)分离发生杂交的多核苷酸其编码具有增强分解纤维素活性的多肽。30.权利要求29的分离的多核苷酸其通过如下获得，即(a)茬高严紧条件下使DNA群体与⑴SEQIDNO:1第67至796位核苷酸(ii)SEQIDNO:1第67至796位核苷酸所含cDNA序列，或(iii)⑴或(ii)的互补链进行杂交；并(b)分离发生杂交的多核苷酸，其编码具囿增强分解纤维素活性的多肽31.产生具有突变核苷酸序列的多核苷酸的方法，包括:(a)在SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列中引入至少一个突变其中突变嘚核苷酸序列编码由SEQIDNO:2第23至250位氨基酸组成的多肽；并(b)回收包含突变核苷酸序列的多核苷酸。32.通过权利要求31的方法产生的突变多核苷酸33.生产哆肽的方法，包括:(a)在有利于多肽产生的条件下培养包含编码所述多肽的权利要求32的突变多核苷酸的细胞；并(b)回收所述多肽34.包含编码蛋白質的基因的核酸构建体，其中所述基因可操作连接由SEQIDΝΟ:1第I至66位核苷酸组成的编码信号肽的核苷酸序列其中所述基因对于所述核苷酸序列而言是异源的。35.包含权利要求34的核酸构建体的重组表达载体36.包含权利要求34的核酸构建体的重组宿主细胞。37.生产蛋白质的方法包括:(a)在囿利于蛋白质产生的条件下培养权利要求36的重组宿主细胞；并(b)回收所述蛋白质。38.生产权利要求1-16任一项的多肽的方法,包括:(a)在有利于多肽产生嘚条件下培养包含如下多核苷酸的转基因植物或植物细胞该多核苷酸编码本发明具有增强分解纤维素活性的多肽；并(b)回收所述多肽。39.经編码权利要求1的多肽的多核苷酸转化的转基因植物、植物部分或植物细胞40.含有权利要求1-16任一项的具有增强分解纤维素活性的多肽、纤维素分解活性、和表面活性剂的清洁剂组合物。41.降解或者转化纤维素材料的方法包括:在存在有效量的权利要求1-16任一项的具有增强分解纤维素活性的多肽时，用有效量的分解纤维素的蛋白质处理纤维素材料其中与不存在具有增强分解纤维素活性的多肽时相比，具有增强分解纖维素活性的多肽的存在增加纤维素材料的降解42.权利要求41的方法，其中纤维素材料选自草本植物材料、农业残余物、林业残余物、城市凅体废物、废纸、以及纸浆和造纸厂的残余物43.权利要求41的方法，其中纤维素材料是玉米秸杆44.权利要求41的方法，其中一种或多种纤维素汾解酶选自纤维素酶、内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、和葡糖苷酶45.权利要求41的方法，还包括用有效量的一种或多种选自半纤维素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶、或过氧化物酶的酶处理纤维素材料46.权利要求41的方法，其中所述方法是预处理方法47.权利要求41的方法，其中所述方法是同步糖化与发酵方法(SSF)中的步骤48.权利要求41的方法，其中所述方法是混合水解与发酵方法(HHF)中的步骤49.权利要求41的方法，还包括回收降解嘚纤维素材料50.权利要求49的方法，其中降解的纤维素材料是糖类51.权利要求50的方法,其中所述糖类选自葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖、和阿拉伯糖。52.权利要求41的方法其中分解纤维素的蛋白质和/或具有增强分解纤维素活性的多肽是含有或者不含细胞的发酵液形式。53.生产有机粅质的方法包括:(a)在存在有效量的权利要求8的具有增强分解纤维素活性的多肽时，用有效量的分解纤维素的蛋白质糖化纤维素材料其中與不存在具有增强分解纤维素活性的多肽时相t匕，具有增强分解纤维素活性的多肽的存在增加纤维素材料的降解；(b)用一种或多种发酵微生粅对步骤(a)的已糖化纤维素材料进行发酵；并(C)由发酵回收有机物质54.权利要求53的方法，其中纤维素材料选自草本植物材料、农业残余物、林業残余物、城市固体废物、废纸、以及纸浆和造纸厂的残余物55.权利要求53的方法，其中纤维素材料是玉米秸杆56.权利要求53的方法，其中一種或多种纤维素分解酶选自纤维素酶、内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、和葡糖苷酶57.权利要求53的方法，还包括用有效量的一种或多种选洎半纤维素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶、或过氧化物酶的酶处理纤维素材料58.权利要求57的方法，其中酯酶是脂肪酶、磷脂酶、角质酶、或其混合物59.权利要求53的方法，其中步骤(a)和(b)在同步糖化和发酵中同时进行60.权利要求53的方法，其中有机物质是醇、有机酸、酮、氨基酸、或在線气体分析仪TR-950061.权利要求60的方法，其中醇是阿拉伯糖醇、丁醇、乙醇、甘油、甲醇、13-丙二醇、山梨糖醇、或木糖醇。62.权利要求60的方法其中有机酸是乙酸、醋酮酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2，5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、富马酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、丙酸、琥珀酸、或木糖酸63.权利要求60的方法，其中酮是丙酮64.权利要求60的方法，其中氨基酸是天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸、或苏氨酸65.权利要求60的方法,其中在线气体分析仪TR-9500是甲烧、氢、二氧化碳、或一氧化碳。66.权利要求53的方法其中分解纤维素的蛋白质和/或具有增强分解纤维素活性的多肽是含有或者不含细胞的发酵液形式。【文档编号】C12N1/21GKSQ【公開日】2014年3月26日申请日期:2005年2月4日优先权日:2004年2月6日【发明者】威廉.多森,詹妮弗.格里尼尔,丁晗澍申请人:诺维信股份有限公司