有同源臂引物pcr引物是什么意思
来源:蜘蛛抓取(WebSpider)
时间:2019-03-02 00:32
标签:
同源引物
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准备用Gibson Assembly Mix把一个片段插入一个质粒,所以在这个操作前先用PCR把有同源臂引物pcr臂扩入这个质粒。质粒全长6000bp多PCR中,使用Q5-HF 25微升推荐的体系。正向引物TM59.2. 反向引物TM54.2程序如下:98度30秒, 98度30秒50-58度梯度7分,72度30秒72度10分,6度无限长hold
最后扩增出来的条带图如下:全部积在槽子里。不知道怎么回事求指点。
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程序错了吧怎么会退火时间7分钟,而延伸时间才30秒反了吧,你这酶不可能30秒能延伸6000bp吧
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没用过Gibson Assembly Mix这个试剂盒我一般是把载体单酶切或双酶切,然后和两端带有有同源臂引物pcr序列的PCR产物进行Gibson cloning如果你是用PCR方法扩增质粒的话,注意你的引物看看有没有问题。还有就是你用质粒做模板的话,只需要加几ng的质粒就够了不需要太多。
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对也罢错也罢;正也罢,逆也罢;通途也好崎岖无妨……但问,吾心坚否若坚,纵使歧路以铁心,贯穿而过亦为大道!不坚,便是坦途也难登临绝顶,观险峰
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感谢参与应助指数 +1
退火和延伸的时间是不是弄反了?延伸的时间1kb 1min退火时间为30s.
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一是退火延伸时间反了,二是如果你片段比较短鈳以把重组臂扩在片段上,短的片段总比长的质粒好扩
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对我打错了。延伸时间7分钟退火30秒。
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首先你的片段6000所用的酶或Mix可以不可以支持这么长片段的PCR反应,其次伱的程序设置错误,退货温度7分钟延伸时间30秒,设反了吧
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质粒提取浓度是300多ng每微升加了0.25微升。
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感谢参与应助指数 +1
98度30秒,50-58度梯度7分72度30秒---这是退火时间和延伸时间反了吧?
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