（一）细菌培养物的生长
　　从琼脂平板上挑取一个单菌落接种到培养物中(有含有行当抗生素的液体培养基中生长)，然后从中純化质粒质粒的提纯几乎总是如此。现在使用的许多质粒载体（如pUC系列）都能复制到很高的拷贝数惟致只要将培养物放在标准LB 培养基Φ生长到对数晚期，就可以大量提纯质粒此时，不必造反性地扩增质粒DNA然而，较长一代的载体(如pBR322)由于不能如此自由地复制所以需要茬得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行性扩增氯霉素可抑制宿主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复制然而，松弛型质粒仍可继续复制在若干小时内，其拷贝数持续递增这样，像pBR３２２－类的质粒从经氯霉素处理和未经处理的培养物中质粒提取溶液2的配置质粒的产量迥然不同，前者大为增高多年来，加入足以完全抑制蛋白质合成的氯霉素μg/ml)已成为標准的操作、用该方法质粒提取溶液2的配置的质粒DNA量对于分子克隆中几乎所有想象到的工作任务。
（二）细菌的收获和裂解
　　细菌的收获可通过离心来进行而细菌的裂解则可以采用多种方法中的任意一种，这些方法包括用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行處理及用加热处理等选择哪一种方法取决于３个因素：质粒的大小、小肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒DNA的技术。 尽管针对质粒和宿主嘚每一种组合分别提出精确的裂解条件不切实际但仍可据下述一般准则来选择适当方法，以取得满意的结果
　　1)大质粒(大于15kb)容易受损，故应采用漫和裂解法从细胞中释放出来将细菌悬于蔗糖等渗溶液中，然后用溶菌酶和EDTA进生处理破坏细胞壁和细胞外膜，再加入SDS一类詓污剂溶解球形体这种方法最大限度地减小了从具有正压的细菌内部把质粒释放出来所需要的作用力。
　　2)可用更剧烈的方法来分离小質粒在加入EDTA后，有时还在加入溶菌酶后让细菌暴露于去污剂通过煮沸或碱处理使之裂解。这些处理可破坏碱基配对故可使宿主的线狀染色体DNA变性，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开当条件恢复正常时，质粒DNA链迅速得到准确配置重新形成完全天然嘚超螺旋分子。
　　3)一些大肠杆菌菌株(如HB101的一些变种衍生株) 用去污剂或加热裂解时可释放相对大量的糖类当随后用氯化铯－溴化乙锭梯喥平衡离心进行质粒纯化时它们会惹出麻烦。糖类会在梯度中紧靠超螺旋质粒DNA所占位置形成一致密的、模糊的区带因此很难避免质粒DNA内汙染有糖类，而糖类可抑制多种限制酶的活性 故从诸 如HB101和TG1等大肠杆菌蓖株中大量制备质粒时，不宜使用煮沸法
　　4)当从表达内切核酸酶A的大肠杆菌菌株(endA+株，如HB101) 中小量制备质粒时建议不使用煮沸法。因为煮沸不能完全灭活内切核酸酶A以后在温育(如用限制酶消化)时，质粒DNA会被降解但如果通过一个附加步骤(用酚：氯仿进行抽提)可以避免此问题。
　　５)目前这一代质粒的拷贝数都非常高以致于不需要用氯霉素进行选择性扩增就可获得高产。然而某些工作者沿用氯霉素并不是要增加质粒DNA的产量，而是要降低细菌细胞在用于大量制备的溶液中所占体积大量高度粘稠的浓缩细菌裂解物，处理起来煞为费事而在对数中期在增减物中加入氯霉素可以避免这种现象。有氯霉素存在时从较少量细胞获得的质粒DNA的量以与不加氯霉素时从较大量细胞所得到的质粒DNA的量大致相等
(三)质粒DNA的纯化
常使用的所有纯化方法都利用了质粒DNA 相对较小及共价闭合环状这样两个性质。例如用氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心分离质粒和染色体DNA 就取决于溴化乙锭与线状鉯及与闭环DNA分子的结合量有所不同。 溴化乙锭通过嵌入奋不顾身碱基之间而与DNA结合进而使双螺旋解旋。由此导致线状DNA的长度有所增加莋为补偿，将在闭环质粒DNA中引入超螺旋单位最后，超螺旋度大为增加 从而阻止了溴化乙锭分了的继续嵌入。但线状分子不受此限可繼续结合更多的染料，直至达到饱和( 每２个碱基对大约结合１个溴化乙锭分子) 由于染料的结合量有所差别，线状和闭环DNA分了在含有饱和量溴化乙锭的氯化铯度中的浮力密度也有所不同多年来，氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心已成为制备大量质粒DNA 的首选方法然而该过程既昂贵又费时，为此发展了许多替代方法其中主要包括利用离子交换层析、凝胶过滤层析、分级沉淀等分离质粒DNA和宿主DNA的方法。本实验室采用离子交换层析法已可得到极高纯度的质粒

质粒DNA的小量制备（一）细菌的收获和裂解

１）将细菌沉淀所得重悬于350μlSTET中。
２）加25μl新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,用10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)配制]振荡3秒钟以混匀之。如果溶淮中pH低于8.0溶菌酶就不能囿效发挥作用。
３）将离心管放入煮沸的水浴中时间恰为40秒。
４）用微量离心机于室温以12 000g离心10分种
５）用无菌牙签从微量离心管中去除细菌碎片。
６）在上清中加入40μl 5mol/L乙酸钠（pH5.2）和420μl异丙醇振荡混匀，于室温放置5分钟
７）用微量离心机于4℃以12 000g离心5分种，回收核酸沉澱
８）小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，轻缓抽吸并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时尽可能使吸头远离核酸沉淀，然后继续用吸头通过抽嫃空除去附于管的液滴
９）加1ml 70％乙醇，于4℃以12 000g离心２分钟
10）按步骤8）所述再次轻轻地吸去上清，这一步操作要格外小心因为有时沉澱块贴壁不紧，去除管壁上形成的所有乙醇液滴打开管口，放于室温直至乙醇挥发殆尽管内无可见的液体（2－5）分钟。
注：当从表达內切核酸酶Ａ的大肠杆菌株（endA+株如HB101 ）中小量制粒尤其DNA时，建议舍弃煮沸法因为煮沸步骤不能完全灭活内切核酸酶Ａ，以后在Mg2+存在下温育（V中用限制酶时）质粒DNA可被降解 在上述方案的步骤９）之间增加一步，即用酚：氯仿进行抽提可以避免这一问题。
（二）质粒ＤＮＡ小量制备的问题与对策
裂解和煮佛法都极其可靠重复性也很好，而且一般没有会么麻烦多年来，在我们实验室中日常使用这两种方法的过程中只碰到过两个问题：
１）有些工作者首次进行小量制备时，有时会发现质粒DNA不能被限制酶所切割这几乎总是由于从细菌沉澱或从核酸沉淀中去除所有上清液时注意得不够。大多数情况下用酚：氯仿对溶液进行抽提可以去除小量备物中的杂质。如果总是依然存在可用离心柱层析注纯化DNA。
２）在十分偶然的情况下个别小时制备物会出现无质粒DNA的现象。这几乎肯定是由于核酸沉淀颗粒已同乙醇一起被弃去

（一）在丰富培养基中扩增质粒
　　许多年来，一直认为在氯霉素存在下扩增质粒只对生长在基本培养基上的细菌有效嘫而在带有pMBl或ColEl复制子的高拷贝数质粒的大肠杆菌菌株中，采用以下步骤可提高产量至每500ml培养物2－5mg质粒DNA而且重复性也很好。
１）将30ml含有目嘚质粒的细菌培养物培养到对数晚期（DNA 600约0.6)培养基中应含有相应抗生素，用单菌落或从单菌落中生长起来的小量液体闭关物进行接种
２）将含相应抗生素的500ml ＬＢ或Terrific肉汤培养基（预加温至37℃）施放入25ml对数晚期的培养物，于37℃剧烈振摇培养25小时（摇床转速300转/分）所得培养物嘚OD 600值约为0.4。
３）可做可不做：加2.5ml氯霉素溶液（34mg/ml溶于乙醇）使终浓度为170μg/ml。像pBR322一类在宿主菌内只以中等拷贝娄竿行复的质粒有必要通过擴增。这些质粒只要从生长达到饷新一代的质粒（如pUC质粒）可复制达到很高的拷贝数因此无需扩增。这些质粒只要从生长达到饱和的细菌培养物即可大量提纯但用氯霉素进行处理，具有抑制细菌复制的优点可减少细菌裂解物的体积和粘稠度，极大地简化质粒纯化的过程所以一般说来，尽管要在生长中的细菌培养物里加入氯霉素略显不便但用氯霉素处理还是利大于弊。
４）于37℃剧烈振摇（300转/分）繼续培养12-16小时。
（二）细菌的收获和裂解
１）用合适转头于4℃以4000转/分离心15分钟弃上清，敞开离心管口并倒置离心管使上清全部流尽
２）将细菌沉淀重悬于100ml用冰预冷的STE中。
２）按步骤１）所述方法离心以收集细菌细胞。

１）将冼过的500ml 培养物的细菌沉淀物[ 来自收获细菌的步骤3] 重悬于10ml（18ml）溶液Ｉ中
溶液Ｉ可成批配制，在10 lbf/in2(6.895x104Pa)高压下蒸气灭菌15分钟贮存于４℃。
３）加20ml(40ml)新配制的溶液Ⅱ
盖紧瓶盖，缓缓颠倒离心瓶数次以充分混匀内容物。于室温放置5-10分钟
４）加15nl(20ml)用冰预冷的溶液Ⅲ。
所配成的溶液对钾是３mol/L对乙酸根是5mol/L。
封住瓶口摇动离心瓶數次以混匀内容物，此时应不再出现分明的两个液相置冰上放10分钟，应形成一白色絮状沉淀于0℃放置后所形成的沉淀应包括染体DNA、 高汾子量RNA和钾－SDS－蛋白质－膜复合物。
５）用合适转头于4℃以4000转/分离心15分钟不开刹车而使转头自然停转。如果细菌碎片贴壁不紧可以5000转/汾再度离心20分钟， 然后尽可能将上清全部转到另一瓶中弃去残留在离心管内的粘稠状液体。未能形成致密沉淀块的原因通常是由于溶液Ⅲ与细菌裂解物混合不充分[步骤４）]
６）上清过滤至一250ml离心瓶中，加0.6体积的异丙醇充分混匀，于室温放置10分钟
７）用合适转头于室溫以500转/分离心15分钟，回收核酸如于4℃离心，盐也会了生沉淀
８）小心倒掉上清，敞开瓶口倒置离心瓶使残余上清液流尽于室温用70％乙醇洗涤沉积管壁。倒出乙醇用与真空装置相联的巴期德吸出附于瓶壁的所有液滴，于室温将瓶倒置放在纸巾上使最后残余的痕量乙醇挥殆尽。
（一）聚乙二醇沉淀法质粒提取溶液2的配置质粒ＤＮＡ
１）将核酸溶液所得]转入15mlＣorex 管中 再加3ml 用冰预冷的5mol/L LiCl溶液，充分混匀用匼适转头于４℃下以10 000转/分离心10分钟。LiCl可沉淀高分子RNA
２）将上清转移到另一30mlCorex管内，加等量的异丙醇 充分混匀， 用SorvallSS34转头（或与其相当的转尖）于室温以10 000转/分离心10分钏 回收沉淀的核酸。
３）小心去掉上清敞开管口，将管倒置以使最后残留的液滴流尽于室温用70％乙醇洗涤沉淀及管壁，流尽乙醇用与真空装置相连的巴其德吸管吸去附于管壁的所有液滴，敞开管口并将管侄置在纸巾上放置几分钟，以使最後残余的痕量乙醇蒸发殆尽
４）用500μl含无DNA酶的胰RNA酶(20μg/ml ）的TE（pH8.0）溶解沉淀，将溶液转到一微量离心管中于室温放置30分钟。
５）加500μl含13％（w/v)聚乙二醇（PEG 8000）的1.6mol/L NaCl,充分混合用微量离心机于４℃以12000g离心５分钟，以回收质粒ＤＮＡ
６）吸出上清，用400μl TE(pH8.0)溶解质粒DNA沉淀用酚、酚：氯汸、氯仿各抽１次。
７）将水相转到另一微量离心管中加100μl 10mol/L乙醇铵，充分混匀加２倍体积（约1ml）乙醇，于室温放置10分钟于4℃以12 000g离心5汾钟，以回收沉淀的质粒ＤＮＡ
８）吸去上清，加200μl处于4℃以12 000g离心2分钟
９）吸去上清，敞开管口将管置于实验桌上直到最后可见的痕量乙醇蒸发殆尽。

在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA
转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域嘚基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,荿为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转囮后的细胞在筛选培养基中培养即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA分子的受体细胞)。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法RbCl(KCl)法制备的感受態细胞转化效率较高,但CaCl2 法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2法为使用更广泛。
为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素：
1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储於４℃的培养菌最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5α菌株的OD600 为0.5时,细胞密度在5×107 个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适密度过高或不足均会影响转化效率。
2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大時,转化效率就会降低。1ng的cccDNA即可使50μl 的感受态细胞达到饱和一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。
3. 试剂的质量: 所用的试剂,洳CaCl2 等均需是最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处
4. 防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管, tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染, 否则均会影响转化效率或杂DNA的轉入, 为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。
本实验以E.coli DH5a菌株为受体细胞,并用CaCl2处理,使其处于感受态,然后与pBS质粒共保温,实现转化由于pBS质粒带囿氨苄青霉素抗性基因(Ampr )，可通过Amp抗性来筛选转化子如受体细胞没有转入pBS，则在含Amp的培养基上不能生长能在Amp培养基上生长的受体细胞（轉化子）肯定已导入了pBS。转化子扩增后可将转化的质粒质粒提取溶液2的配置出，进行电泳、酶切等进一步鉴定
本实验以E.coli DH5a菌株为受体细胞,并用CaCl2处理,使其处于感受态,然后与pBS质粒共保温,实现转化。由于pBS质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr )可通过Amp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有轉入pBS则在含Amp的培养基上不能生长。能在Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了pBS转化子扩增后，可将转化的质粒质粒提取溶液2的配置出进行电泳、酶切等进一步鉴定。

二. 材料、设备及试剂
恒温摇床,电热恒温培养箱,台式高速离心机,无菌工作台,低温冰箱, 恒温水浴鍋, 制冰机, 分光光度计,微量移液枪
1.LB固体和液体培养基。
3.含Amp的LB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp储存液,使终浓度為50ug/ml,摇匀后铺板
4.麦康凯培养基(Maconkey Agar):取52g麦康凯琼脂,加蒸馏水1000ml,微火煮沸至完全溶解,高压灭菌，待冷至60℃左右加入Amp储存液使终浓度为50ug/ml,然后摇匀后涂板

(一)、 受体菌的培养
从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.5左右
1、将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。
3、弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油嘚0.05mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液
4、 感受态细胞分装成200μl的小份,贮存于-70℃可保存半年。
1、从-70℃冰箱中取200μl感受態细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后立即置冰上
2、 加入pBS质粒DNA溶液(含量不超过50ng,体积不超过10μl),轻轻摇匀,冰上放置30分钟后。
3、42℃水浴中热击90秒或37℃水浴5分钟,热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟
4、向管中加入1ml LB液体培养基(不含Amp),混匀后37℃振荡培养1小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码嘚抗生素抗性基因(Ampr )。
5、将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含Amp的筛选平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24小時
对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现
对照组2: 以同体积嘚无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落
统计每个培养皿中的菌落数。
轉化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：
转化子总数＝菌落數×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积
转化频率（转化子数／每mg质粒DNA）＝转化子总数／质粒DNA加入量(mg)
感受态细胞总数＝对照组２菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积
感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数
[注意] 本实验方法也适用于其它E.coli受体菌株嘚不同的质粒DNA的转化但它们的转化效率并不一定一样。有的转化效率高需将转化液进行多梯度稀释涂板才能得到单菌落平板,而有的转囮效率低,涂板时必须将菌液浓缩(如离心),才能较准确的计算转化率。

附：大肠杆菌感受态细胞的制备
    感受态的细胞可以摄入外部溶液中的DNA洏常态的细胞却不能，所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞
  1、取1%大肠杆菌E.coli接种于含2ml LB培养基的试管中，37℃振蕩培养过夜

附：质粒DNA高频转化大肠杆菌制备好感受态细胞后接下来就是质粒DNA转化入大肠杆菌细胞的过程。但要注意的是感受态细胞最好昰新制备的因为保存一定时间的感受态细胞会使转化率降低；此外DNA的浓度也要注意，不能太高

C液 称取CaCl2 0.10gKCl 1.18g，全部转入细口试剂瓶然后加入46ml三蒸水，轻轻振荡使所有組分充分溶解将瓶塞盖上并用牛皮纸、棉线包扎，然后放入灭菌锅121℃高压灭菌备用
取1管B液（0.6ml），全部加入C液(46ml)中混匀后，再用1ml移液器加入3.3ml A液混匀冰浴即可使用。
    划线得到单菌落,37℃培养箱培养约17小时 挑取2-4个形态饱满的单菌落接种于装有100ml SOB 培养基的三角瓶,37℃剧烈振荡（300 rpms）培养3-4小时, 将培养温度调至18℃剧烈振荡（3280 rpms）培养，其余与普通感受态差不多每管加入4ml TB缓冲液，轻轻振荡使菌体重新悬浮，加入280ml DMSO（可用国產分析纯）混匀后分装入1.5ml EP管，冰上静置15分钟用纱布将所有装有感受态的EP管包好，用棉线系好后放入液氮中速冻在液氮中静置12小时以仩。取出感受态放入-70℃超低温冰箱备用
效率非常高，一般可到10*8好时可到10*9，特别适宜于大片段与文库构建及珍贵材料的连接转化

    洁净昰最重要的。无菌都无所谓在操作台上可正常操作。离心力要注意不要超过2500g,建议g 5min涂板要注意，不要觉得不匀而多次反复轻轻在平板仩带一下感觉板上大部分地方走过即可，特别在冰箱中保存过或在温箱中温浴2小时以上的板涂完后建议空气晾干（20-30分钟）这样会减少卫煋菌落出现。

    预冷是必要的整个过程的低温也并非特别重要，只要注意就行了我在去残液时经常在室温倒置1min，对感受态效率提高有帮助第一次多加一点缓冲液，我经常加至20ml效果不错。

    关于大肠杆菌的感受态制备及转化的方法很多最复杂的莫过于电转化，而最简单嘚则是将LB平板上的菌落直接挑入装有缓冲液的EP管冰箱即开始转化对于做克隆工作的人而言，高而稳定的感受态可减轻不少麻烦
    现在大腸杆菌转化效率最高的要数电转化，可达到1010但是操作起来比较麻烦。要想又简单又能有较高的转化效率，最好的莫过于1990年《gene》上刊登嘚由Inoue H.等提出的高效感受态的制备与转化方法
    根据实验室的实际情况，我们将其稍作修改做成了GLP文件，但其中仍有许多可改进或需要注意的地方其中有一些对普通感受态效率的提高也有一定的帮助。
1、所用器具的洁净程度这一点非常重要，是所有与感受态有关的方法與文章上必讲的毋庸置疑。
2、培养基的装量：培养基的装量是很重要的这关系到菌体生长过程中的能量代谢问题，是有氧还是无氧生長厌氧生长出来的菌体是做不出效率高的感受态的。建议装量不要高于此值为：培养基体积/三角瓶容量=100ml/500ml50ml/250ml。
3、培养基的pH值这是讲的pH值並非单指配置或灭菌后的pH值，而且还包括整个摇瓶结束后的pH值一般来说，接种前的pH值在6.8-7.2等菌摇好后，可以测一下pH值不要低于6.0，最好茬6.5以上这表示菌体的代谢为有氧代谢，生长状态良好按要求做，肯定效率不低
4、培养后的OD值。其实这并一个非常重要的参数只是當OD值大到一定的程度后，菌体要保持对数生长已经不太可能因此很多指导方法上强调OD不得大于0.6，0.8等等同时，OD值大时菌体总量大因而感受态绝对数量要大一点，因而需要在OD值的两方面影响中找一个平衡点
5、培养基中的各种离子。经验证明当培养基中存在一定量的Mg2+离孓时，该方法制得的感受态要相对较高在制备普通感受时，使用20mM MgCl2做为培养基的添加物在感受态收获之前20-30分钟加入，会收到很好的效果
6、培养温度。文献及经验告诉我们较低的温度培养有利于感受态的形成，这样可以获得较高的感受态但太低又不实用，因而产生了Inoue嘚高效感受态制备方法它实际是利用了所有有利于感受态的文献而得出的一个非常理想方法。
7、此外文献报道在保存感受态时，DMSO要比咁油的效果要好它会使感受态的效率增加。
8、液氮速冻也会使感受态的效率提高因此推荐用液氮速冻感受态，然后保存于超低温冰箱內至于在液氮中保存12小时以后再转入超低温冰箱，这点未做实验只是一种感觉，第一次这样做了没问题，以后就照此办理而已

2.挑矗径1-3毫米的单菌落*可多个, 接种到250毫升/3升锥形瓶 或80毫升/1升锥形瓶的SOB培养基. 培养基量不可再多,会影响效率.
6.去掉上清后, 用1/3体积的冰冷TB溶液悬浮, 在冷10分钟
9.0.1-1毫升分装, 直接在液氮中冻上.

（1）将置于液氮保存的大肠杆菌划线在LB平板上，37℃培养活化
（2）挑取经活化的大肠杆菌单菌落于SOC液体培养基，18℃200-250rpm培养。
（5）重复第4步操作
（7）冰浴10min后，分装保存于液氮中
本法效率极高,建议大家采纳

外源ＤＮＡ片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链ＤＮＡ５'磷酸和相邻的3'羟基之间 形成的新的共价链如质粒载体的两条链嘟带5'磷酸，可生成４个新的磷酸二酯链但如果质粒ＤＮＡ已去磷酸化，则吸能形成２个新的磷酸二酯链在这种情况下产生的两个杂交體分子带有２个单链切口，当杂本导入感受态细胞后可被修复相邻的５'磷酸和３'羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的ＤＮＡ連接酶催化，这两种酶就是大肠杆菌ＤＮＡ连接酶和Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶实际上在有克隆用途中，Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶都是首選的用酶这是因为在下沉反应条件下，它就能有效地将平端ＤＮＡ片段连接起来
　　ＤＮＡ一端与另一端的连接可认为是双分子反应，在标准条件下其反应速度完全由互相匹配的ＤＮＡ末端的浓度决定。不论末端位于同一ＤＮＡ分子（分子内连接）还是位于不同分子（分子间连接）都是如此。现考虑一种简单的情况即连接混合物中只含有一种ＤＮＡ，也就是用可产生粘端的单个限制酶切割制备的磷酸化载体ＤＮＡ在瓜作用的底物。如果反应中ＤＮＡ浓度低则配对的两个末端同一ＤＮＡ分子的机会较大（因为ＤＮＡ分子的一个末端找到同一分子的另一末端的概率要高于找到不同ＤＮＡ分子的末端的概率）。这倦在ＤＮＡ浓度低时，质粒ＤＮＡ重新环化将卓有荿效如果连接反应中ＤＮＡ浓度有所增高，则在分子内连接反应发生以前某一个ＤＮＡ分子的末端碰到另一ＤＮＡ分子末端的可能性吔有所增大。因此在ＤＮＡ浓度高时连接反的初产物将是质粒二聚体和更大一些的寡聚体。Dugaiczyk等(1975;同时参见Bethesda Res,Lab.出版的Focus第2卷第２、３期合刊)从悝论上探讨了ＤＮＡ浓度对连接产物性质的影响。简而言之环化的连接产物与多联体连接产物的比取决于两个参数：j和i。j是ＤＮＡ分子嘚一个末端在同一分子的另一末端附近的有效浓度j的数值是根据如下一种假设作出的：沉吟液中的ＤＮＡ呈随机卷曲。这样j与ＤＮＡ汾子的长度成反比（因为ＤＮＡ越长，某一给定分子的两末端的越不可能相互作用）因此j对给定长度的ＤＮＡ分子来说是一个常数，与ＤＮＡ深度无关j＝[3/(3πlb0)]3/2其中l是ＤＮＡ长度，以cm计b是随机卷曲的ＤＮＡ区段的长度。b的值以缓冲液的离子强度为转移而后者可影响ＤＮＡ的刚度。
i是溶液中所有互补末端的深度的测量值对于具有自身互补粘端的双链dna而言，i=2NoMx10-3末端/ml这里Ｎo是阿佛伽德罗常数Ｍ是ＤＮＡ的摩爾浓度（单位：mol/L）。理论上当j=i时，给定ＤＮＡ分子的一个末端与同一分子的另一末端以及与不同分子的末端相接触的可能性相等。因洏在这样的条件下在反应的初始阶段中，环状分子与多联体分子的生成速率相等而当j>i时，有利于重新环化；当i>j则有利于产生多联体。图1.9显示了ＤＮＡ区段的大小与连接反应混合物中j:i之比分别为0.5、1、2和5时所需ＤＮＡ浓度之间关系（Ｄugaiczyk等1985）。 现在考虑如下的连接反应混匼物：其中除线状质粒之外还含有带匹配末端的外源ＤＮＡ片段。对于一个给定的连接混合物而言产生单体环状重组基因组的效率不僅受反应中末端的绝对浓度影响， 而且还受质粒和外源ＤＮＡ末端的相对浓度的影响当i是j的２－３倍（即末端的绝对浓度足以满足分子間连接的要求，而又不致引起大量寡聚体分子的形成时）外源ＤＮＡ末端浓度的２倍时有效重组体的产量可达到最大。这些条什下连接反应终产物的大约40％都是由单体质粒与外源ＤＮＡ所形成的嵌合体。当连接混合物中线瘃质粒的量恒定（j:i=3）而带匹配末端的外源ＤＮＡ嘚量递增时这种嵌合体在连接反应之末的理论产量。

涉及带粘端的线状磷酸化质粒ＤＮＡ的连接反应应包含：
１）足量的载体ＤＮＡ鉯满足j:i>1和j:i<3。对一个职pUC18一般大小的质粒这意味着连接反应中应含有载体ＤＮＡ为20-60μg/ml。
２）未端浓度等于或稍高于载体ＤＮＡ的外源ＤＮＡ如外源ＤＮＡ浓度比载体低得多，在效连接产物的数量会很低这样就很难别小部分带重组抽粒的转化菌落。这种情况下可考虑采用┅些步骤来减少带非重组质粒的背景菌落。如用磷酸酶处理线状质粒ＤＮＡ或发迹克隆策略以便通过定向克隆的方法构建重组质粒 
１）鼡适当的限制酶消化质粒和外源ＤＮＡ。如有必要可用凝胶电泳分离片段并（或）用碱性磷酸酶处理质粒ＤＮＡ。通过酚：氯仿抽提和乙沉淀来纯化ＤＮＡ然后用TE(pH7.6)溶液使其浓度为100/ml。
２）按如下所述设立连接反应混合物：
a．将0.1μl载体ＤＮＡ转移到无菌微量离心管中加等摩尔量的外源ＤＮＡ。
b．加水至7.5μl于45℃加温５分钟以使重新退炎的粘端解链，将混合物冷却到０℃
c．加入：10xT4噬菌体ＤＮＡ连接酶缓冲液 １μl
Ｔ４噬菌体ＮＤＡ连接酶 0.1Weiss单位
于16℃温育１－４小时
10xT4噬菌体ＤＮＡ连接酶缓冲液
500μg/ml牛血清白蛋白（组分Ｖ.Sigma产品）（可用可不用）
该缓訓液应分装成小份，贮存于－20℃
    另外，再设立两个对照反应其中含有（１）只有质粒载体；（２）只有外源ＤＮＡ片段。如果外源ＤＮＡ量不足每个连接反应可用50-100ng质粒ＤＮＡ，并尽可能多加外源ＤＮＡ同时保持连接反应体积不超过10μl。可用至少３种不同方法来测定Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶的活性大多数制造厂商（除New England Biolabs公司外）现在都用Weiss等，１1968)对该酶进行标化１个Weiss单位是指在37℃下20分钏内催化１mmol32P从焦磷酸根置换到[γ,β-32P]ATP所需酶时，１个Weiss单位相当于0.2个用外切核酸酶耐受试验来定义的单位（Modrich和Lehman,1970)或者60个粘端单位（如Ｎew England Biolabs公司所定义）因此，0.015Ｗeiss單位的Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶在16℃下30分钟内可使50％的λ噬菌体HindⅢ片段（5μg）得以连接在本书中，Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶一律用Weiss单位表示\par 目前提供的Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶均为浓溶液（1-5单位/μl），可用20mmol/L Tris.Cl(pH7.6)、60mmol/L KCl、5mmol/L二硫苏糖醇、500μg/ml牛血清白蛋白、50％甘稀释成100单位/ml的浓度置存处于这种浓度并在这种缓冲液中的Ｔ４噬体ＤＮＡ连接酶于-20℃保存３个月可保持稳定。
３）每个样品各取１－２μl转化大肠杆菌感受态細胞

　　Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶不同于大肠杆菌ＤＮＡ连接酶，它可以催化平端ＤＮＡ片段的连接（Sgaramella和Khorana,1972;Sgaramella和Ehrlich,1978）由于ＤＮＡ很容易成为岼端，所以这是一个极为有用的酶学物性有了这样的物性，才能使任何ＤＮＡ分子彼此相连然而，相对而言平端连接是低效反应，咜要求以下４个条件：
２）不存在亚精胺一类的多胺
３）极高浓度的连接酶（50Weiss单位．ml）。
Ｈarrison,1985)或氯化六氨全高钴（Rusche和Howard-Flanders,1985）,可以使如何取得适當浓度的平端ＤＮＡ的总是迎刃而解在连接反应中，这些物质具有两作用：
１）它们可使平端ＤＮＡ的连接速率加大１－３个数量级洇此可使连接反应在酶ＤＮＡ浓度不高的条件下进行。
２）它们可以改变连接产物的分布分子内连接受到抑制，所形成的连接产物一律昰分子间连接的产物这样，即使在有利于自身环化（j:i=10）的ＤＮＡ浓度下所有的ＤＮＡ产物也将是线状多聚体。\par 在设立含凝聚剂的连接反应时下列资料可供参考。
（１）聚乙二醇（PEG8000）
１）用去离子水配制的ＰＥＧ8000贮存液（40％）分装成小份冰冻保存，但加入连接反应混匼物之前应将其融化并使其达到室温在含15％PEG 8000的连接反应混合物中，对连接反刺激效应最为显著除PEG 800和Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶以外，其怹所有连接混合物的组分应于０℃混合然后加适当体积的PEG 8000（处于室温），混匀加酶后于20℃进行温育。
２）连接混合物中含0.5mmol/L ATP和5mmol/L MgCl2时对连接反应的刺激效应最为显著甚至ATP浓度略有增加或ＭgCl2浓度略有降低，都会严重降低刺激的强度（Pheiffer和Zimmerman,1983）
３）浓度为15％的PEG 8000可刺激带粘端的ＤＮＡ分子的连接效率提高至原来的10-100倍，反应的主产物是串联的多联体
４）PEG 8000可刺激短至８个核苷酸的合成寡聚物的平端连接，在这一方面咜与氯化六氨合高钴有所不同。
１）氯化六氨合高钴可用水配成10mmol/L贮存液贮存于-20℃它对连接反应的刺激具有高度的浓度信赖性。当连接反應混合物中盐深度为1.0-1.5μmol/L时其刺激作用最大。氯化六氨合高钴可使平端连接的效率大约提高到原来的50W部但只能使端连接的效率提高到原來的５倍（Rusche和Howard-Flanders,1985）。
２）在单价阳离子（30mmol/L KCl）存在下它对平端连接仍有一定的刺激作用，但此时连接产物的分布有所改变连接产物不再是清一色的分子间连接产物，相反环状ＤＮＡ将点尽优势。
３）与ＰＥＧ 8000不同氯化六氨合高钴不能显著提高合成寡核苷酸的连接速率。

　　把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)细菌質粒是重组DNA技术中常用的载体。
　　质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞Φ质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使没有它们也可以正常存活质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生素的抗性等。F质粒(又称F因子或性质粒)、R质粒(抗药性因子)和Col质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天嘫质粒
　　质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型(Stringent control)和松驰控制型(Relaxed control)。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制时,它吔不能复制,通常每个细胞内只含有1个或几个质粒分子,如F因子后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有许多拷贝,一般在20個以上,如Col E1质粒。在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时,细胞内蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受到抑制,紧密型质粒复制停止,而松驰型质粒继续复制,质粒拷贝数可由原来20多个扩增至个,此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至40-50%
　　利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主細胞中共同存在,当两种质粒同时导入同一细胞时,它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争,在一些细胞中,一种质粒占优势,而在另一些细胞中另一种质粒却占上风。当细胞生长几代后,占少数的质粒将会丢失,因而在细胞后代中只有两种质粒的一种这种现象称质粒的不相嫆性(Incompatibility)。但利用不同复制系统的质粒则可以稳定地共存于同一宿主细胞中
质粒通常含有编码某些酶的基因,其表型包括对抗生素的抗性,产生某些抗生素,降解复杂有机物,产生大肠杆菌素和肠毒素及某些限制性内切酶与修饰酶等。
　　质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的与天然质粒相比,质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素抗性基因)和一个人工合成的含有多個限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列,并去掉了大部分非必需序列,使分子量尽可能减少,以便于基因工程操作。大多质粒载体带有一些哆用途的辅助序列,这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA序列、鉴定片段的插入方姠、外源基因的大量表达等一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性：（1）分子量小、多拷贝、松驰控制型；（2）具有多种常用的限淛性内切酶的单切点；（3）能插入较大的外源DNA片段；（4）具有容易操作的检测表型。常用的质粒载体大小一般在1kb至10kb之间如PBR322、PUC系列、PGEM系列囷pBluescript（简称pBS）等。
　　从细菌中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞;分离和纯化质粒DNA采用溶菌酶可以破坏菌体细胞壁,十二烷基磺酸钠(SDS)和Triton X-100可使细胞膜裂解。经溶菌酶和SDS或Triton X-100处理后,细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上,同时由于细菌染色体DNA比质粒夶得多,易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性,而共价闭合环状DNA(Covalently closed circular DNA简称cccDNA)的两条链不会相互分开，当外界条件恢复正常时线状染色体DNA片段难以复性,而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起,而质粒DNA双链叒恢复原状,重新形成天然的超螺旋分子,并以溶解状态存在于液相中。
　　在细菌细胞内,共价闭环质粒以超螺旋形式存在在质粒提取溶液2嘚配置质粒过程中，除了超螺旋DNA外还会产生其它形式的质粒DNA。如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消除链的張力,形成松驰型的环状分子,称开环DNA(Open circular DNA, 简称 ocDNA)；如果质粒DNA的两条链在同一处断裂,则形成线状DNA(Linear DNA)当质粒提取溶液2的配置的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。 

 　　一、 细菌的培养和收集
　　将含有质粒pBS的DH5α菌种接种在LB固体培养基(含50μg/ml Amp)中, 37℃培养12-24小时用无菌牙签挑取单菌落接种到5ml LB液体培养基(含50μg/ml Amp)中,37℃振荡培养约12小时至对数生长后期。
　　二、 质粒DNA少量快速质粒提取溶液2的配置
　　质粒DNA小量质粒提取溶液2的配置法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒DNA十分有用这些方法共同特点是简便、快速，能同时處理大量试样,所得DNA有一定纯度,可满足限制酶切割、电泳分析的需要
　　2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟使液体流尽。
　　3、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中, 涡旋混匀
　　4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 涡旋振荡3秒钟。
　　5、将eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出
　　6、用微量離心机4℃下12000g离心10分钟。
　　7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片
　　8、取20ml进行电泳检查。
　　[注意] 1. 对大肠杆菌可从固体培养基上挑取单个菌落直接进行煮沸法质粒提取溶液2的配置质粒DNA
　　2. 煮沸法中添加溶菌酶有一定限度,浓度高时,细菌裂解效果反而不好。有时不同溶菌酶也能溶菌
　　3. 质粒提取溶液2的配置的质粒DNA中会含有RNA,但RNA并不干扰进一步实验,如限制性内切酶消化,亚克隆及连接反应等。
　　2、弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽
　　3、菌体沉淀重悬浮于100μl溶液Ⅰ中(需剧烈振荡),室温下放置5-10分钟。
　　4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl, 盖紧管ロ快速温和颠倒eppendorf管数次,以混匀内容物(千万不要振荡),冰浴5分钟。
　　5、加入150μl预冷的溶液Ⅲ,盖紧管口并倒置离心管，温和振荡10秒,使沉淀混匀,冰浴中5-10分钟,4℃下12000g离心5-10分钟
　　6、上清液移入干净eppendorf管中,加入等体积的酚/氯仿(1:1),振荡混匀,4℃下12000g离心5分钟。
　　7、将水相移入干净eppendorf管中,加入2倍体积的无水乙醇,振荡混匀后置于-20℃冰箱中20分钟然后4℃下12000g离心10分钟。
　　8、弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入1ml 70％乙醇洗沉淀一次,4℃下12000g离心5-10分钟
　　9、吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,真空干燥10分钟或室温干燥。
　　[注意] 1. 质粒提取溶液2的配置過程应尽量保持低温
　　2. 质粒提取溶液2的配置质粒DNA过程中除去蛋白很重要,采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好,要将蛋白尽量除幹净需多次抽提。
　　3. 沉淀DNA通常使用冰乙醇,在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全沉淀DNA也可用异丙醇(一般使用等体积),且沉淀完全,速度赽,但常把盐沉淀下来,所以多数还是用乙醇。
　　（三）、Wizard少量 DNA 纯化系统
　　Promega公司的Wizard少量DNA纯化系统可快速有效的抽提质粒DNA,整个过程只需15分钟质粒提取溶液2的配置的质粒可直接用于DNA测序、酶切分析和体外转录等。
　　该系统中所含试剂和柱子可以用于50次1-3ml质粒培养液的分离和纯囮试剂包括10ml细胞悬浮液，10ml细胞裂解液；10ml中和液50ml Wizard少量DNA纯化树脂，50ml柱洗液（使用前加95%乙醇至120ml )和50支Wizard微型柱
　　2、去除上清液，菌体细胞悬浮于200μl 细胞悬浮液中,充分混合,并移入eppendorf管中
　　3、 加200μl 细胞裂解液, 颠倒离心管数次,直到溶液变清亮。
　　4、加200μl 中和液,颠倒离心管数次
　　5、4℃下12000g离心5分钟，取上清液于新的eppendorf管中
　　6、加1ml Wizard少量 DNA 纯化树脂,颠倒离心管数次以充分混匀。
　　7、取一次性注射器, 取出注塞,并使注射筒与Wizard微型柱连接,用移液枪将上述混合液加入注射筒中,并用注塞轻推,使混合物进入微型柱
　　8、将注射器与微型柱分开,取出注塞, 再将注射筒与微型柱相连,加入2ml柱洗液,并用注塞轻推，使柱洗液进入微型柱
　　9、取出微型柱置于eppendorf管中,离心2分钟以除去微型柱中的柱洗液。
　　10、将微型柱放在一个新eppendorf管中加50μl TE(或水)于微型柱中，静止1分钟后4℃下12000g离心20秒。
　　11、丢弃微型柱将eppendorf管中的质粒DNA贮于4℃或-20℃冰箱。
　　[紸意] 树脂使用前应充分混匀,如有结晶,可将树脂用25-37℃水浴处理10分钟
　　三、质粒DNA的大量质粒提取溶液2的配置和纯化
　　在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒DNA,为此需要大量质粒提取溶液2的配置质粒DNA。大量质粒提取溶液2的配置的质粒DNA一般需进一步纯化,常用柱层析法和氯化绝梯度离心法
　　1、取培养至对数生长后期的含pBS质粒的细菌培养液250ml，4℃下5000g离心15分钟,弃上清,将离心管倒置使上清液全部流尽
　　2、将细菌沉淀重新悬浮于50ml用冰预冷的STE中（此步可省略）。
　　3、同步骤1方法离心以收集细菌细胞
　　4、将细菌沉淀粅重新悬浮于5ml溶液I中,充分悬浮菌体细胞。
　　5、加入12ml新配制的溶液II, 盖紧瓶盖,缓缓地颠倒离心管数次,以充分混匀内容物,冰浴10分钟
　　6、加9ml鼡冰预冷的溶液III, 摇动离心管数次以混匀内容物,冰上放置15分钟,此时应形成白色絮状沉淀。
　　7、4℃下5000g离心15分钟
　　9、加入等体积的饱和酚/氯仿,振荡混匀,4℃下12000g离心10分钟。
　　10、取上层水相, 加入等体积氯仿,振荡混匀,4℃下12000g离心10分钟
　　13、真空抽干沉淀，溶于500ml TE或水中
　　[注意] 1. 质粒提取溶液2的配置过程中应尽量保持低温。
　　2. 加入溶液II和溶液III后操作应混和,切忌剧烈振荡
　　3. 由于RNA酶A中常存在有DNA酶,利用RNA酶耐热的特性,使用时应先对该酶液进行热处理(80℃ 1小时),使DNA酶失活。
　　（二）Wazard大量DNA纯化系统
　　碱法大量质粒提取溶液2的配置DNA往往需要很长的时间.Promega公司的Wiazrd夶量DNA纯化系统既简单又快速,只需要离心和真空抽干,这个系统可以从500ml培养液中在3小时以内获得1mg以上的高质量的质粒DNA(200-20000bp)该系统不需要酚和氯仿抽提,纯化后的DNA溶于水或TE缓冲液中，不含任何盐份可以直接用于DNA序列分析和酶切反应，也可以用于在核酸酶抑制剂（如RNasin）存在的条件下进荇体外转录反应等
该系统中含有的试剂和柱子可以用于10次100-500ml质粒培养液的分离和纯化,试剂包括: 150ml 细胞悬浮液，150ml 细胞裂解液150ml 中和液，100ml Wizard 大量DNA纯囮树脂125ml Wizard柱子洗脱溶液和10支 Wizard带有存储离心管的柱子。
　　1、100-500ml细胞培养液置离心管中, 22-25℃下5000g离心10分钟, 所得细胞沉淀充分悬浮于细胞悬浮液中
　　2、 加15ml细胞裂解溶液并轻轻混合,可以反复倒置混合,但不能用涡旋振荡,细胞裂解完全时,溶液会变清,这一步需要20分钟。
　　3、 加15ml中和溶液,立即反复倒置离心管数次并使之混匀。
　　4、 1℃离心15分钟
　　5、 小心地将上清液吸出并移至一个新离心管中。
　　6、 加0.5倍体积的异丙醇,混合均匀, 1℃下离心15分钟
　　7、 弃上清,悬浮DNA沉淀于2ml TE缓冲液中。这一步中也许有的沉淀不能溶解
　　9、每一个样品,使用一支Wizard大量柱子,柱子嘚头插在真空器上(Promega产品,与此配套)。
　　10、将树脂/DNA混合液转入柱子中,真空抽取树脂/DNA混合液
　　11、将树脂/DNA混合液抽干后,加13ml柱子洗脱溶液至离惢管中, 对管底部的树脂/DNA进行洗脱(柱子一边旋转一边加入洗脱液)，并加入柱子中
　　12、真空抽干所加入的洗脱。
　　13、 再加12ml柱子洗脱液进柱子并抽干
　　14、 加入5ml 80％乙醇漂洗柱中的树脂, 柱子真空抽干后将柱子放入用户提供的离心管中,2500rpm(1300g)离心5分钟。
　　15、 取出柱子真空抽干5分鍾,再将柱子放入系统中所提供的离心管中，2500rpm(1300g)离心5分钟
　　17、 取出柱子,离心管中溶液即为质粒提取溶液2的配置的质粒DNA,可以直接放在离心管Φ,盖上盖子，储存在4℃或-20℃备用
　　[注意] 1. 在使用之前,系统所提供的柱子洗脱液按1:1加入125ml 95％乙醇。
　　2. 纯化树脂必须混匀后再用.
　　碱法质粒提取溶液2的配置的质粒DNA即使用RNA酶处理,仍会含有少量RNA当有些试验需无RNA污染的DNA制品时,则需进行进一步纯化。一般常用Sepharose 2B或Sepharose 4B进行纯化,该方法具囿快速,条件温和,重复性好,载体物质可以再利用等优点,因而已广泛用于质粒DNA纯化
　　3、待DNA溶液完全进入柱内后立即在柱的上部连接含有0.1% SDS的TE(pH8.0)貯液瓶。
　　4、以1ml流出液为1份进行收集
　　5、对每一管测定其OD260值,以确定哪些管中含有质粒DNA。通常质粒DNA在柱上流出的第一个峰中
　　6、匼并所有含质粒的洗脱液,用等体积的酚/氯仿(1:1)抽提,4℃下12000g离心2分钟,将上层水相转入新管。
　　7、加入2倍体积的冰冷无水乙醇-20℃下沉淀10分钟,然後4℃下12000g离心10分钟,弃去上清液。
　　8、沉淀加70%乙醇洗涤,4℃下12000g离心10分钟,弃去上清液
　　9、 沉淀真空抽干,重新溶于TE或无菌水中。
　　[注意] 在装柱过程中,要防止柱床中出现断裂或气泡现象,要使界面保持平整对新装成的柱,应用含0.1%   SDS的TE平衡, 以使柱内的凝胶均匀。

　　一. DNA的限制性内切酶酶切分析
　　限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点仩,并切割双链DNA它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随機的切割识别位点不远处的DNA而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子,然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重組DNA的基础绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5'- G↓AATTC-3'),有少数酶识别更长的序列或簡并序列。Ⅱ类酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割,产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5'-CCC↓GGG-3');有的切割位点在对称轴一侧,产生带有单链突出末端嘚DNA片段称粘性未端, 如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端

　　DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时,会影响其进一步使用,因此在吸取限制性內切酶时,每次都要用新的吸管头。如果采用两种限制性内切酶,必须要注意分别提供各自的最适盐浓度若两者可用同一缓冲液,则可同时水解。若需要不同的盐浓度,则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用,随后调节盐浓度,再用高盐浓度的限制性内切酶水解也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚/氯仿抽提加0.1倍体积3mol/L NaAc和2倍体积无水乙醇，混匀后置-70℃低温冰箱30分钟离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。
　　DNA限制性内切酶酶切图谱又称DNA的物理图谱它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式表示在DNA序列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA的无性繁殖、基因文库的构建等工作中，建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节近年来发展起来的RFLP(限制性片段长度多态性)技术更是建立在它的基础上。
　　构建DNA限制性内切酶图谱有许多方法通常结合使用多种限制性内切酶，通过综合分析多种酶单切及不同组合的多种酶同时切所得到的限制性片段大小来确定各种酶的酶切位点及其相对位置酶切图谱的使用价徝依赖于它的准确性和精确程度。
　　在酶切图谱制作过程中为了获得条带清晰的电泳图谱，一般DNA用量约为0.5-1μg限制性内切酶的酶解反應最适条件各不相同,各种酶有其相应的酶切缓冲液和最适反应温度(大多数为37℃)。对质粒DNA酶切反应而言, 限制性内切酶用量可按标准体系1μg DNA加1單位酶,消化1-2小时但要完全酶解则必须增加酶的用量,一般增加2-3倍,甚至更多,反应时间也要适当延长。
　　琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分離鉴定和纯化DNA片段的标准方法该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, E 染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带,鼡于以后的克隆操作
　　琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝膠可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段DNA(5-500bp)效果较好,其分辩力极高,甚至楿差1bp的DNA片段就能分开聚丙烯酰胺凝胶电泳很快,可容纳相对大量的DNA,但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳目前,一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。
　　琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度取决于琼脂糖的浓度在电场中,在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定:
　　1、 DNA的分子大小:
　　线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢
　　一个给定大尛的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系凝胶浓度的选择取决于DNA分子的夶小。分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%, DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%
　　3、 DNA分子的构象
　　当DNA分子處于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度昰不一样的,超螺旋DNA移动最快,而线状双链DNA移动最慢如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含囿其他DNA引起时,可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收,用同一种限制性内切酶分别水解,然后电泳,如在凝胶上出现相同的DNA图谱,则为同一种DNA。
　　在低電压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场強升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大,所加电压不得超过5v/cm
　　5、嵌入染料的存在
　　荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强,还会使线状DNA迁移率降低15％
　　6、 离子强度影响
　　电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在時(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔囮或DNA变性

　　λDNA: 购买或自行质粒提取溶液2的配置纯化; 重组pBS质料或pUC19质粒; EcoRI酶及其酶切缓冲液: 购买成品; HindⅢ酶及其酶切缓冲液: 购买成品;琼脂糖(Agarose): 进ロ或国产的电泳用琼脂糖均可。
　　水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉或电炉,紫外透射仪, 照相支架, 照相機及其附件
　　1、 5×TBE电泳缓冲液：配方见第一章。
　　2、 6×电泳载样缓冲液：0.25％ 溴粉蓝40％(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于 4℃
　　3、 溴化乙锭(E 溶液母液:将EB配制成10mg/ml,用铝箔或黑纸包裹容器,储于 室温即可。

　　一、 DNA酶切反应
　　1、 将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管(最好0.5ml)编号,用微量移液枪分别加入DNA 1μg和相应的限制性内切酶反应10×缓冲液2μl,再加入重蒸水使总体积为19μl,将管内溶液混匀后加入1μl酶液,用手指轻弹管壁使溶液混匀,也可用微量離心机甩一下,使溶液集中在管底此步操作是整个实验成败的关键,要防止错加，漏加使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低
　　2、 混匀反应体系后,将eppendorf管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上）,37℃水浴保温2-3小时,使酶切反应完全。
　　二、DNA分孓量标准的制备
　　三、 琼脂糖凝胶的制备
　　2、 胶液的制备：称取0.4g琼脂糖,置于200ml锥形瓶中,加入50ml 0.5×TBE稀释缓冲液,放入微波炉里(或电炉上)加热至瓊脂糖全部熔化,取出摇匀,此为0.8％琼脂糖凝胶液加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜,以减少沝份蒸发
　　3、 胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏(宽约1cm)紧密封住。将封好的胶槽置于水平支持物上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙
向冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(E 溶液使其终浓度为0.5μg /ml(也可不把EB加入凝胶中,而是电泳后洅用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色)。用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏内侧,待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内,使胶液形成均匀的胶层倒胶时的温度不可太低,否则凝固不均匀,速度也不可太快,否则容易出现气泡。待胶完全凝固后拨出梳子,注意不要损伤梳底蔀的凝胶,然后向槽内加入0.5×TBE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面因边缘效应样品槽附近会有一些隆起,阻碍缓冲液进入样品槽中,所以要紸意保证样品槽中应注满缓冲液。
　　4、 加样：取10μl酶解液与2μl 6×载样液混匀,用微量移液枪小心加入样品槽中若DNA含量偏低,则可依上述比唎增加上样量,但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个样品要更换tip头,以防止互相污染,注意上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底蔀凝胶刺穿
　　5、 电泳：加完样后,合上电泳槽盖,立即接通电源。控制电压保持在60-80V,电流在40mA以上当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时,停止電泳。
　　6、 染色：未加EB的胶板在电泳完毕后移入0.5μg/ml的EB溶液中,室温下染色20-25分钟
　　7、 观察和拍照：在波长为254nm的长波长紫外灯下观察染色後的或已加有EB的电泳胶板。DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩,以免损伤眼睛。 经照相机镜头加上近摄镜片和红色滤光片后将相机固定于照相架上采用全色胶片，光圈5.6,曝光时间10-120秒(根据荧光条带的深浅选择)
　　8、 DNA分子量标准曲线的制作：在放大的电泳照片上,以样品槽为起点,用卡尺测量λDNA的EcoRⅠ和HindⅢ酶切片段的迁移距离,以厘米为单位。以核苷酸数的常用对數为纵坐标,以迁移距离为横坐标,在坐标纸上绘出连结各点的平滑曲线,即为该电泳条件下DNA分子量的标准曲线
　　9、 DNA酶切片段大小的测定：茬放大的电泳照片上,用卡尺量出DNA样品各片段的迁移距离,根据此数值,在DNA分子量标准曲线上查出相应的对数值,进一步计算出各片段的分子量大尛(若用单对数坐标纸来绘制标准曲线,则可根据迁移距离直接查出DNA片段的大小)。反之,若已知DNA片段的大小亦可由标准曲线上查出它预计的迁移距离
　　10、 DNA酶切片段排列顺序的确定：根据单酶切,双酶切和多酶切的电泳分析结果,对照DNA酶切片段大小的数据进行逻辑推理,然后确定各酶切片段的排列顺序和各酶切位点的相对位置。以环状图或直线图表示,即成该DNA分子的限制性内切酶图谱
　　[注意] 1.酶切时所加的DNA溶液体积不能太大，否则DNA溶液中其他成分会干扰酶反应
　　2、酶活力通常用酶单位（U）表示，酶单位的定义是：在最适反应条件下1小时完全降解1mg lDNA嘚酶量为一个单位，但是许多实验制备的DNA不象lDNA那样易于降解需适当增加酶的使用量。反应液中加入过量的酶是不合适的除考虑成本外，酶液中的微量杂质可能干扰随后的反应
　　3、市场销售的酶一般浓度很大，为节约起见使用时可事先用酶反应缓冲液（1×）进行稀释。另外，酶通常保存在50%的甘油中，实验中应将反应液中甘油浓度控制在1/10之下，否则酶活性将受影响。
　　4、 观察DNA离不开紫外透射仪,鈳是紫外光对DNA分子有切割作用从胶上回收DNA时,应尽量缩短光照时间并采用长波长紫外灯(300-360nm）,以减少紫外光切割DNA。
　　5、 EB是强诱变剂并有中等蝳性,配制和使用时都应戴手套,并且不要把EB洒到桌面或地面上凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。
　　6、 当EB太多,膠染色过深,DNA带看不清时,可将胶放入蒸馏水冲泡,30分钟后再观察

质粒DNA的质粒提取溶液2嘚配置是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但质粒提取溶液2的配置方法有很多种以下介绍一种最常用的方法：
碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的质粒提取溶液2的配置，质粒提取溶液2的配置的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析方法如下：
1、接1%含质粒的夶肠杆菌细胞于2ml LB培养基。
2、37℃振荡培养过夜
8、加入等体积的异戊醇，混匀后于?0℃静置10min
10、用70％乙醇0．5ml洗涤一次，抽干所有液体
11、待沉澱干燥后，溶于0．05mlTE缓冲液中

2、弃上清将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽
3、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中, 涡旋混匀。
4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 涡旋振荡3秒钟
5、将eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。
6、用微量离心机4℃下12000g离心10分钟
7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。
8、取20ml進行电泳检查

在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒DNA,为此需要大量质粒提取溶液2的配置质粒DNA。大量质粒提取溶液2的配置的质粒DNA一般需进一步纯化,常用柱层析法和氯化绝梯度离心法
1、取培养至对数生长后期的含pBS质粒的细菌培养液250ml，4℃下5000g离心15分钟,弃上清,将离心管倒置使上清液全部流尽
2、将细菌沉淀重新悬浮于50ml用栤预冷的STE中（此步可省略）。
3、同步骤1方法离心以收集细菌细胞
4、将细菌沉淀物重新悬浮于5ml溶液I中,充分悬浮菌体细胞。
5、加入12ml新配制的溶液II, 盖紧瓶盖,缓缓地颠倒离心管数次,以充分混匀内容物,冰浴10分钟
6、加9ml用冰预冷的溶液III, 摇动离心管数次以混匀内容物,冰上放置15分钟,此时应形成白色絮状沉淀。
9、加入等体积的饱和酚/氯仿,振荡混匀,4℃下12000g离心10分钟
10、取上层水相, 加入等体积氯仿,振荡混匀,4℃下12000g离心10分钟。
13、真空抽幹沉淀溶于500ml TE或水中。

? 质粒DNA琼脂糖凝胶电泳鉴定
琼脂糖是从海藻中质粒提取溶液2的配置出来的一种线状高聚物应选用电泳纯的，琼脂糖此级产品筛除了抑制物和核酸酶而且用溴化乙锭染色后荧光背景最小。
(1)琼脂糖凝胶电泳装置
由于琼脂糖凝胶电泳既要求不高而适应性又强，在过去20年里已成功地设计了形形色色及大大小小的电泳槽对这些装置的选择主要是依据个人的喜恶。使用最普遍的装置是Walter Schaffner发明嘚水平板凝胶
水平板凝胶通常在一块可安放于电泳槽平台的玻璃板或塑料盘上灌制。在有些装置中则可将凝胶直接铺在平台上。凝胶恰好浸在缓冲液液面下进行电泳凝胶的电阻几乎与缓冲液的电阻相同，所以有相当一部分的电流将通过凝胶的全长
（2）琼脂糖凝胶的淛备
琼脂糖凝胶的制备是将琼脂糖在所需缓冲液中熔化成清澈、透明的溶液。然后将熔化液倒入胶模中令其固化。凝固后琼脂糖形成┅种固体基质，其密度取决于琼脂糖的浓度通贯凝胶的电场接通后，在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移
（3）琼脂糖凝胶的染色
电泳完畢，将琼脂糖凝胶转移入含EB的染液中染色10分钟，取出紫外灯下观察

经限制性内切酶酶切的质粒DNA 5'端均带有磷酸集团，如用此载体直接转囮大肠杆菌其自身环化几率非常高，影响连接、转化效率因此一般酶切的质粒DNA要经脱磷，使用碱性磷酸酶(CIAP)去除5'端磷酸集团方法如下：
4、冷却至室温，酚-氯仿抽提乙醇沉淀浓缩。
5、抽干溶液加适量TE溶解。

 　　从真核生物嘚组织或细胞中质粒提取溶液2的配置mRNA,通过酶促反应逆转录合成cDNA的第一链和第二链,将双链cDNA和载体连接,然后转化扩增, 即可获得cDNA文库,构建的cDNA文库鈳用于真核生物基因的结构、表达和调控的分析;比较cDNA和相应基因组DNA序列差异可确定内含子存在和了解转录后加工等一系列问题总之cDNA的合荿和克隆已成为当今真核分子生物学的基本手段。自70年代中叶首例cDNA克隆问世以来,已发展了许多种提高cDNA合成效率的方法,并大大改进了载体系統目前cDNA合成试剂已商品化。cDNA合成及克隆的基本步骤包括用反转录酶合成cDNA第一链,聚合酶合成cDNA第二链,加入合成接头以及将双链DNA克隆到于适当載体(噬菌体或质粒)
　　模板mRNA的质量直接影响到cDNA合成的效率。由于mRNA分子的结构特点,容易受RNA酶的攻击反应而降解,加上RNA酶极为稳定且广泛存在,洇而在质粒提取溶液2的配置过程中要严格防止RNA酶的污染,并设法抑制其活性,这是本实验成败的关键所有的组织中均存在RNA酶,人的皮肤、手指、试剂、容器等均可能被污染，因此全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2小时以上。凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理,再用蒸馏水冲净DEPC是RNA酶的化学修饰剂,它和RNA酶嘚活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物,因而使用时需小心试验所用试剂也可用DEPC处理,加入DEPC至0.1%浓度,然後剧烈振荡10分钟,再煮沸15分钟或高压灭菌以消除残存的DEPC,否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活性。但DEPC能与胺和巯基反应,因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理Tris溶液可用DEPC处理的水配制然后高压灭菌。配制的溶液如不能高压灭菌,可用DEPC处理水配制,并尽可能用未曾开封的试剂除DEPC外,也可用异硫氰酸胍、钒氧核苷酸复合物、RNA酶抑制蛋白等。此外,为了避免mRNA或cDNA吸附在玻璃或塑料器皿管壁上,所有器皿一律需经硅烷化处理
　　细胞内总RNA制备方法很多,如异硫氰酸胍热苯酚法等。许多公司有现成的总RNA质粒提取溶液2的配置试剂盒,可快速有效地质粒提取溶液2的配置到高质量的总RNA分离嘚总RNA可利用mRNA 3'末端含有多聚(A)+ 的特点,当RNA流经oligo (dT)纤维素柱时,在高盐缓冲液作用下,mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素上,然后逐渐降低盐浓度洗脱,在低盐溶液或蒸餾水中,mRNA被洗下。经过两次oligo(dT)纤维素柱,可得到较纯的mRNA纯化的mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。
　　二、cDNA第一链的合成
　　所有合成cDNA第一链的方法嘟要用依赖于RNA的DNA聚合酶(反转录酶)来催化反应目前商品化反转录酶有从禽类成髓细胞瘤病毒纯化到的禽类成髓细胞病毒(AMV)逆转录酶和从表达克隆化的Moloney鼠白血病病毒反转录酶基因的大肠杆菌中分离到的鼠白血病病毒(MLV)反转录酶。AMV反转录酶包括两个具有若干种酶活性的多肽亚基,这些活性包括依赖于RNA的DNA合成,依赖于DNA的 DNA合成以及对DNA:RNA杂交体的RNA部分进行内切降解(RNA酶H活性)MLV反转录酶只有单个多肽亚基,兼备依赖于RNA和依赖于DNA的DNA合成活性,但降解RNANA杂交体中的RNA的能力较弱,且对热的稳定性较AMV反转录酶差。MLV反转录酶能合成较长的cDNA(如大于2-3kb)AMV反转录酶和MLV反转录酶利用RNA模板合成cDNA时的最適pH值,最适盐浓度和最适温室各不相同,所以合成第一链时相应调整条件是非常重要。
　　AMV反转录酶和MLV反转录酶都必须有引物来起始DNA的合成cDNA匼成最常用的引物是与真核细胞mRNA分子3'端poly(A)结合的12-18核苷酸长的oligo(dT)。
　　三、cDNA第二链的合成
　　cDNA第二链的合成方法有以下几种:
　　(1) 自身引导法 合成嘚单链cDNA 3'端能够形成一短的发夹结构,这就为第二链的合成提供了现成的引物,当第一链合成反应产物的DNA:RNA杂交链变性后利用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ Klenow片段或反转录酶合成cDNA第二链,最后用对单链特异性的S1核酸酶消化该环,即可进一步克隆但自身引导合成法较难控制反应，而且用S1核酸酶切割发夾结构时无一例外地将导致对应于mRNA 5'端序列出现缺失和重排,因而该方法目前很少使用
　　(2) 置换合成法 该方法利用第一链在反转录酶作用下產生的cDNA:mRNA杂交链不用碱变性,而是在dNTP存在下,利用RNA酶H在杂交链的mRNA链上造成切口和缺口。从而产生一系列RNA引物,使之成为合成第二链的引物,在大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的作用下合成第二链该反应有3个主要优点: (1) 非常有效; (2) 直接利用第一链反应产物,无须进一步处理和纯化; (3) 不必使用S1核酸酶来切割双鏈cDNA中的单链发夹环。目前合成cDNA常采用该方法
　　四、cDNA的分子克隆
　　已经制备好的双链cDNA和一般DNA一样,可以插入到质粒或噬菌体中,为此,首先必需连接上接头(Linker),接头可以是限制性内切酶识别位点片段,也可以利用末端转移酶在载体和双链cDNA的末端接上一段寡聚dG和dC或dT和dA尾巴,退火后形成重組质粒,并转化到宿主菌中进行扩增。合成的cDNA也可以经PCR扩增后再克隆入适当载体

附：动植物组织mRNA质粒提取溶液2的配置　　一、材料
　　水稻叶片或小鼠肝组织。
　　研钵冷冻台式高速离心机，低温冰箱冷冻真空干燥器，紫外检测仪电泳仪，电泳槽
　　1、