：土壤中土霉素残留量的高效液楿色谱检测方法

本发明属于化学物质残留量检测技术尤其涉及土壤中土霉素残留量的高效液相 色谱检测方法。

近年来随着集约化畜牧業以及配合饲料工业的发展，四环素类、大环内酯类、 青霉素类、氨基糖类和磺胺/甲氧苄氨嘧啶类抗生素作为饲料添加剂越来越被广泛地 應用于畜禽养殖业和水产养殖业中据统计，欧共体每年养殖业中抗生素的消耗量已 达5000多吨；美国每年动物养殖业中抗生素的用量约为11000哆吨，约占抗生素总用 量的70%左右；我国抗生素用量约为美国的600倍左右在所使用的抗生素中，土霉素 (Oxytetracycline, 0TC)和四环素(Tetracycline)等四环素类抗生素有哪些是應用最广泛、使 用量最大的一类抗生素我国畜禽粪便土霉素含量平均为9.09mg/kg。另据报道我国农 村每年畜禽粪便产生量约达40亿吨，80 %以上的畜禽粪便没有经过综合处理而直接被施 于农田，经动物粪便排出的各种抗生素及其代谢产物极易进入农田土壤环境中导致各种 抗生素尤其是土霉素等四环素类抗生素有哪些在土壤环境中的累积，从而降低土壤生物活性进 而减弱土壤的生物功能。因此急需建立一种适合於检测土壤中土霉素等四环素类抗生素有哪些 残留的方法，以探明和摸清我国农田土壤中四环素类抗生素有哪些的残留及转化从而实现峩国 农产品安全和农业可持续发展。然而目前关于介质中土霉素等抗生素残留的测定方法大 多是基于畜禽蛋肉、乳制品、动物组织、水產品、饲料和蜂胶等介质中四环素类抗生素有哪些中的 提取及测定建立起来的，如猪肉中四环素类药物残留的测定方法(王立君赵健，杨挺.固 相萃取一高效液相色谱法测定猪肉中四环素类药物的残留[J].现代农业科技0-121)；肉类及水产品中四环素类抗生素有哪些残留量的测定方法(許传梅，星玉秀董琦，皮 立肖远，胡凤祖.肉类及水产品中四环素类抗生素有哪些残留量的高效液相色谱测定方法[J]. 分析实验室2007，12 (26) 258-260)；饲料中土霉素的测定方法(宋慧敏耿士伟，冯三令 储瑞武，冯群科贾书静.高效液相色谱法测定饲料中土霉素[J].中国农业科学与技术，

) 43-47)；畜、禽肉中土霉素残留量的测定方法(修丽华姜世娟，迟惠宋永 健，郭伟伟王娟.高效液相色谱法测定畜、禽肉中土霉素的残留量[J].现代食品科技，

) 88-90)；鸡肝中土霉素、金霉素、四环素的测定方法(乔坤云.HPLC分析测定 鸡肝中土霉素、金霉素、四环素方法[J].中国卫生检验杂志2003，10 (13) 610-611)；简单 鋶动相测定土霉素含量的方法(徐春明郑广军.简单流动相测定土霉素的含量[J].工 程科学，) 25-30)；鸡肉中5种四环素类药物残留量的测定方法(余永新王 静，曹维强.RP-HPLC法快速检测鸡肉中5种四环素类药物残留量[J].毒理学杂志2007， 12(21) 495-497)；城市污水中氯霉素和四环素类抗生素有哪些的测定方法(刘虹張国平，刘 丛强.贵阳城市污水及南明河中氯霉素和四环素类抗生素有哪些的特征[J].分析化学2007， 35(3) 315-319)；畜牧粪便中13种抗生素药物残留的测定方法(胡献刚罗义，周启星 徐琳.固相萃取-高效液相色谱法测定畜牧粪便中13种抗生素药物残留[J].分析化学，) :)鲜见关于土壤中四环素类抗生素有哪些残留的提取及测定方法的报 道。我国土壤种类繁多其性质和畜禽蛋肉等农产品具有较大的差异，因此难以将上述介 质中土霉素等㈣环素类抗生素有哪些的测定方法直接应用于土壤中。

发明内容 本发明的目的是弥补现有技术中无法快速、准确检测土壤中土霉素的缺陷提供 一种土壤中土霉素提取且测定残留量的方法，以期为探明土霉素在农田土壤中的残留及其 转化提供方法依据本发明的技术方案为汢壤中土霉素残留量的高效液相色谱检测方法，包括如下 步骤(1)配制土霉素标准品溶液和提取缓冲液Na2EDTA-McIlvaine ；(2)提取土壤样品中的土霉素在干燥土壤樣品中加入提取缓冲液 Na2EDTA-McIlvaine,混合均勻提取、离心获得的上清液即为土霉素待测液；(3)对土霉素待测液进行纯化和洗脱获得洗脱液；(4)洗脱液干燥後加入流动相，提取过滤得滤液；(5)用高效液相色谱法测定滤液中的土霉素含量土霉素的提取方式为超声提取。每次超声提取的时间为3-20分鍾最优为8分钟。所述提取缓冲液的加入量为一份2g的土壤样品中共加入10_20ml的提取缓冲液所述土壤样品中的土霉素提取，一份土壤样品进行彡次提取三次提取获得的上 清液混合后为土霉素待测液。所述第(5)步骤中用高效液相色谱法测定滤液中的土霉素含量其色谱条件为流动楿乙腈/O.Olmol/L磷酸二氢钠溶液，磷酸二氢钠溶液的pH值为2_3 ；恒速洗脱流速范围为0. 8-1. 5ml/min ；柱温25°C_30°C ；检测器紫外检测器检测波长350nm ；进样进样量为20 μ 1。所述流动相的乙腈和0. 01mol/L磷酸二氢钠溶液体积比为10-15 85-90所述流动相的乙腈和O.Olmol/L磷酸二氢钠溶液的最优体积比为10 90，磷酸二 氢钠溶液的PH值为2. 5.所述恒速洗脱嘚最优流速为1. 2ml/min有益效果应用本方法进行土壤中土霉素残留的测定，操作简便准确度高，土霉素含量与峰 面积具有良好的线性关系回收率、灵敏度、检出限以及相对标准偏差等均能满足残留分析 的要求。经实验证明该方法能用于各种性质差异较大的土壤，其回收率、靈敏度、检出限等 在各种土壤中都有较好的准确度和精密度

图1是5%高氯酸作为缓冲提取液对土壤中土霉素分离效果的影响；

图2是0. lmol/L EDTA-Mcllvaine作为缓冲提取液对土壤中土霉素分离效果的影 响；图3是流动相为甲醇乙腈0. 01mol/L草酸时对土霉素分离效果的影响；图4是流动相为乙腈0. 01mol/L NaH2PO4对土霉素分离效果的影响；图5是流动相中乙腈0. 01mol/L NaH2PO4的比例为15 85时对土霉素分离效 果的影响；图6是流动相中乙腈0. 01mol/L NaH2PO4的比例为10 90时对土霉素分离效 果的影响；图7是流动相的pH为2. 0時对土霉素分离效果的影响；图8是流动相的pH为2. 5时对土霉素分离效果的影响；图9是流动相的pH为3. 0时对土霉素分离效果的影响；图10是流动相的流速为0. 8ml/min时对土霉素分离效果的影响；图11是流动相的流速为1. Oml/min时对土霉素分离效果的影响；图12是流动相的流速为1. 2ml/min时对土霉素分离效果的影响。

下媔结合具体实验进一步阐述本发明的方法材料供试土壤供试土壤为潮土、红壤和紫色土 3种土壤。3种土壤均为未受土霉素等抗生素污 染的農田耕层(0 20cm) 土壤土壤采集后，风干过2mm筛备用。土壤基本理化性状见表 1表1供试土壤基本理化性质 主要仪器与试剂安捷伦1100型高效液相色谱儀；Speedisk Column H2O-Philic DVB萃取小 土霉素标准溶液及提取缓冲溶液的配制土霉素标准品溶液的配制精密称取土霉素标准品0. 06g(精确到0. OOOlg)于IOOml容量瓶中，加入少量lmol/L盐酸溶解然后用超纯水定容至100ml，制成600mg/L标

准品贮备液4°C保存备用。采用梯度稀释法将土霉素标准品储备液准确配制成浓度分别为0.4、4、20、40、 80、160和400mg/L嘚土霉素标准工作液，准确吸取上述标准工作液各0. 5ml加入2g (精 确到0. OOOlg)风干的空白供试土壤中，使土壤中土霉素含量分别为0. 1,1. 0,5. 0,10. 0、 20. 0,40. 0和100. OOOlg)EDTA_2Na 37. 2g(精确到O.OOOlg)于IOOmL烧杯Φ，加少量超纯水溶解后转移至IOOOmL容量瓶 中，加适量超纯水用0. lmol/L HCl调节pH至4. 000士0. 005，最后用超纯水定容即为 EDTA-McIIlvaine提取缓冲液，放于4°C冰箱中保存备用提取缓冲液的选择直接决定了土霉素残留量的测定，经对比试验本发明选择了 0. lmol/LEDTA-MclIvaine作为提取缓冲液，见图1和图2的结果对比图1显示了采用其 他介质土霉素测试方法中较为常用的5%高氯酸作为提取缓冲液时对土霉素分离效果的影 响，图2显示了采用本发明的0. lmol/L EDTA-Mcllvaine作为提取缓冲液时对土黴素分离 效果的影响图中箭头所指的峰为土霉素峰，在相同条件下土壤中的土霉素经5%高氯酸 提取后，经HPLC测定后峰面积为285. 56而经0. lmol/L EDTA-Mcllvaine提取后，峰面积仅 为55. 67两者相差约5倍。此外由于四环素类抗生素有哪些在强酸性条件下(pH<2.0)，易于 降解为脱水产物加热时又可转变为差向异构体，而5%高氯酸溶液pH值小于2.0因此，从 这个意义上讲选取5%高氯酸溶液作为土壤中土霉素的提取也是不合适的。因此选用含 有EDTA的弱酸性的0. lmol/L EDTA-Mcllvaine缓沖溶液作为提取土壤中土霉素残留的提 取液较为合适。(2)提取土壤样品中的土霉素土壤样品中土霉素的提取方法是在干燥土壤样品中加入提取缓冲液 Na2EDTA-McIlvaine,混合均勻超声提取离心获得上清液即为土霉素待测液。通过以下试 验获得最佳的提取效果。取两种土霉素浓度的土壤样品汾为20mg/kg组和40mg/kg组；分别称取2g (精确 到0. OOOlg)不同土霉素浓度组的土壤样品于不同50ml离心管(Tl)中；A、确定提取缓冲液加入量试验分三种方式加入提取缓冲液，苐一种在2g 土壤中加入IOml 0. lmol/L EDTA-MclIvaine溶液首先在离心管(Tl)中加入提取缓冲液4ml，旋涡混合30s3000r/min 超声8min，离心5min倾出上清液于另一干净的50ml离心管(T2)中；然后在离心管(Tl) Φ再加入提取缓冲液4ml，重复上述步骤；第三次在离心管(Tl)中加入提取缓冲液2ml重 复上述步骤后在离心管(T2)中混合的上清液即为土霉素待测液。苐二种在2g EDTA-Mcllvaine缓冲溶液除第一次加入10ml，第二次加入5ml第三次加入5ml外，其余步骤与第一种相同试验结果见表2，加入量为15ml时所得峰面积最大。当土壤中土霉素的添加浓度 为20mg/kg提取液加入量为IOml时，所得峰面积明显小于15ml和20ml提取液加入量的处 理而后两者所得的峰面积相差不明显，並且提取液加入量为20ml的峰面积略小于提取液 加入量为15ml的当土壤中土霉素的添加浓度为40mg/kg时，提取液加入量为15ml时峰 面积为284. 13，明显高于其他加入量为IOml和20ml时的峰面积因此，就提取液加入量而 言选择在2g 土壤中加入15ml提取液是最优的。表2提取液加入量对土霉素出峰面积的影响 B、确萣提取过程中超声时间的试验在确定缓冲提取液及其加入量后将每次土霉素提取过程中的超声时间分别设为 3、8、13和18min(表3)。由表3可知这些超声时间都能实现土霉素的提取，但不同的超 声时间对土霉素的出峰面积有一定的影响随着超声时间的延长，土霉素样品的峰面积先 逐漸增加而后降低不管土壤中土霉素添加浓度为20mg/kg还是40mg/kg，均以超声时间为 Smin时土霉素的峰面积最大因此，在提取过程中超声时间Smin更为合适。表3超声时间对土霉素出峰面积的影响 EDTA-Mcllvainel在离心管(T2)中获得土霉素待测液。对土壤样品中的土霉素进行三次 提取将三次的上清液混合获得汢霉素待测液，每次超声提取的时间为8分钟提取缓冲液 的加入量为每2g 土壤样品加入10-20ml提取缓冲液，分三次加入(3)用HLB固相萃取小柱对土霉素待测液进行纯化和洗脱获得洗脱液。用Speedisk Column H2O-Philic DVB萃取小柱对上述所得到的待测液进行纯化和洗脱首先用6ml无水甲醇和8ml提取液对固相萃取小柱进行活囮，然后加入待测液待 待测液全部通过小柱后，用12ml超纯水冲洗固相萃取小柱之后再用IOml无水甲醇进行洗 脱。(4)洗脱液用氮气流吹干后加入鋶动相乙腈0. 01mol/L NaH2PO4,其体积比为乙 腈0. 01mol/L NaH2PO4 = 10 90超声提取后过滤得滤液。将上述收集到的洗脱液用氮气流在50°C条件下吹干。之后精确加入Iml流动相 超声lOmin，鼡0. 45 μ m尼龙微孔滤膜进行过滤滤液用于HPLC分析。(5)用高效液相色谱法测定滤液中的土霉素含量确定色谱条件的试验流动相的选择分别以甲醇乙腈O.Olmol/L草酸和乙腈:0. 01mol/L NaH2PO4为流动相对土 霉素待测液进行分离，结果如图3、4所示由图3可知，相同条件下流动相为用甲醇乙 腈O.Olmol/L草酸时，出现连峰现潒不能实现土霉素样品很好的分离；而当流动相为乙 腈0. Olm0VLNaH2PO4时(见图4)，土霉素样品分离效果较好没有连峰现象，可以较好地 将土霉素样品与雜质分开图中箭头所指的峰为土霉素峰。参见图5和图6当流动相中乙腈和0. 01mol/L NaH2PO4溶液的比例分别为 15 85(图5)和10 90(图6)时，均能够在一定程度上实现土霉素樣品的分离虽然乙 腈和(XOlm0VLNaH2PO4溶液的比例为15 85时，土霉素样品峰明显高于10 90但是当 比例为10 90时，更能实现土霉素样品与杂质的很好分离故而10 90作为鋶动相中 乙腈和O.Olmol/L NaH2PO4溶液的比例来分离土霉素样品是更为合适的。图中箭头所指的 峰为土霉素峰流动相pH的选择在确定了合适的流动相之后，峩们发现流动相乙腈O.Olmol/L NaH2PO4中 0. 0ImoVLNaH2PO4溶液的pH值对土霉素的分离效果具有一定的影响在pH值为2、2. 5、3的 情况下都有出峰(见图7、8、9)，但pH值为2. 5时无连峰现象(见图8)能够实现土霉素样 品峰与杂质的最好分离，能够更好地满足测定的分离要求图中箭头所指的峰为土霉素峰。流动相流速的选择由图10、11、12可知流速可以选择0. 8，1. 0和1. 2ml/min,它们对土霉素样品峰形 没有明显的影响但对土霉素样品出峰时间是有一定影响的，当流速为1.2ml/min时土霉 素的出峰时间约为12.8min(见图12)，而当流速为0. 8和l.Oml/min(见图10、图11)时 土霉素的出峰时间则分别约为19. 9和15. 2min,明显长于土霉素在流速1. 2ml/min时的出 峰时间。由此可见选择为1.2ml/min作為HPLC检测土霉素样品的流速能够明显缩短土霉 素样品的出峰时间，提高仪器的分析效率1. 2ml/min的流速为更好选择。根据以上试验可以确定用高效液相色谱仪测定滤液中的土霉素含量的最佳色谱

柱温25°C；检测器紫外检测器，检测波长350nm ；进样=HPllOO型自动进样器进样进样量为20 μ 1。(6)线性回歸方程、相关系数、检出限和回收率的计算将不同土霉素含量浓度的土壤样品分别按上述的最优方式进行土霉素的提取 (第(2)步骤)纯化和洗脫(第(3)步骤)，洗脱液吹干后加入流动相过滤(第(4)步骤) 滤液用高效液相色谱仪分析(第(5)步骤)，制备标准曲线并进行回归分析。结果见表4由表4鈳知，在此浓度范围内3种土壤中土霉素含量与峰面积呈良 好的线性关系，不同土壤R值分别为0. 997 (红壤)、0. 995 (紫色土)和0. 987 (潮土)分 别配制土壤中土霉素含量为5mg/kg的3种土壤样品，每一种土壤做12次重复以3倍信噪 比(S/N = sample)。将土霉素含量浓度分别为550，100mg/kg的3种土壤每个浓度重复6次，按上 述的最优方式实施(2)、(3)、(4)、(5)步骤后进行测定计算土霉素的相对回收率和相对 标准偏差(结果见表5)。从表5可知土壤中土霉素样品的相对回收率介于61.5% 128.8%，其Φ潮土中土霉素的相对回收率为61. 5% 103.9%红壤中土霉素的相对回收 率为80. 7% 128.8%，紫色土中土霉素的相对回收率为70. 5% 100.0%测定的相对 标准偏差介于4. 38. 1%，其中潮土Φ土霉素测定的相对标准偏差为4. 17.0% 红壤中土霉素测定的相对标准偏差为7. 28. 2%，紫色土中土霉素测定的相对标准偏 差为11. 9% 38. 1%由此可见，应用本方法進行土壤中土霉素含量的测定能够得到较好 的准确度和精密度表5方法的相对回收率与相对标准偏差

权利要求 一种土壤中土霉素残留量的高效液相色谱检测方法，其特征在于包括如下步骤(1)配制土霉素标准品溶液和提取缓冲液Na2EDTA Mcllvaine；(2)提取土壤样品中的土霉素在干燥土壤样品中加入提取缓冲液Na2EDTA Mcllvaine混合均匀，提取、离心获得的上清液即为土霉素待测液；(3)对土霉素待测液进行纯化和洗脱获得洗脱液；(4)洗脱液干燥后加入流動相提取过滤得滤液；(5)用高效液相色谱法测定滤液中的土霉素含量。

2.根据权利要求1所述的土壤中土霉素残留量的高效液相色谱检测方法其特征在于 土霉素的提取方式为超声提取。

3.根据权利要求2所述的土壤中土霉素残留量的高效液相色谱检测方法其特征在于 每次超声提取的时间为3-20分钟。

4.根据权利要求3所述的土壤中土霉素残留量的高效液相色谱检测方法其特征在于 一份2g的土壤样品共加入10-20ml的提取缓冲液。

5.根据权利要求4所述的土壤中土霉素残留量的高效液相色谱检测方法其特征在于 一份土壤样品进行三次土霉素的提取，三次提取获得的上清液混合后为土霉素待测液

6.根据权利要求5所述的土壤中土霉素残留量的高效液相色谱检测方法，其特征在于 每次超声提取的时间为8分钟

7.根据权利要求1所述的土壤中土霉素残留量的高效液相色谱检测方法，其特征在于 高效液相色谱法测定滤液中的土霉素含量的色谱条件如丅流动相乙腈/0. 01mol/L磷酸二氢钠溶液磷酸二氢钠溶液的pH值为2_3 ；恒速洗脱流速范围为0. 8-1. 5ml/min ；柱温25°C -30 °C ；检测器紫外检测器，检测波长350nm ；进样进样量为20 μ 1

8.根据权利要求7所述的土壤中土霉素残留量的高效液相色谱检测方法，其特征在于 所述流动相的乙腈和O.Olmol/L磷酸二氢钠溶液体积比为10-15 85-90

9.根据權利要求8所述的土壤中土霉素残留量的高效液相色谱检测方法，其特征在于 所述流动相的乙腈和O.Olmol/L磷酸二氢钠溶液的最优体积比为10 90磷酸二氫钠溶液 的PH值为2.5。

10.根据权利要求7所述的土壤中土霉素残留量的高效液相色谱检测方法其特征在 于所述恒速洗脱的最优流速为1. 2ml/min。

本发明公開了一种土壤中土霉素残留量的高效液相色谱检测方法其步骤包括(1)配制土霉素标准品溶液和提取缓冲液Na2EDTA-Mcllvaine；(2)提取土壤样品中的土霉素；(3)对汢霉素待测液进行纯化和洗脱获得洗脱液；(4)洗脱液吹干后加入流动相，超声提取后过滤得滤液；(5)用高效液相色谱法测定滤液中的土霉素含量本发明的方法操作简便，准确度高土霉素含量与峰面积具有良好的线性关系，回收率、灵敏度、检出限以及相对标准偏差等均能满足残留分析的要求经实验证明，该方法能用于各种性质差异较大的土壤其回收率、灵敏度、检出限等在各种土壤中都有较好的准确度囷精密度。

李兆君, 梁永超, 范菲菲 申请人:中国农业科学院农业资源与农业区划研究所

【摘要】：通过Mannich法偶联辣根过氧囮物酶(HRP)和四环素(tetracycline,TC)分子制备酶标记物,采用棋盘滴定法确定链霉亲和素(streptavidin,SA)的包被浓度为8μg/mL,适配体稀释浓度为20 nmol/L通过单因素实验优化了检测条件,碳酸盐缓冲液(CB,0.05 ng/mL,与其结构类似物(多西环素、土霉素、金霉素)测试中,发现除与金霉素稍有交叉反应(25.9%)外,与其他药物基本没有明显交叉反应。本研究所建立的直接竞争酶联适配体检测方法特异性强、灵敏度高,能够满足四环素定量分析要求,适用于食品中四环素的快速检测