WB封闭目的性试题要达到的考核目的是什么意思

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2018-12-05 07:35 标签： WB封闭目的

  • 取材要注意什么若取肠管做WB,实驗组和对照组如何定量取材注意什么

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如图给药24h时，120的浓度只有LC3-II出现条带p62和actin都没有，48h时60和120浓度出现这种情况，72h时30、60、120都出现了这种凊况。论坛的XDJM有没有人知道这是咋回事是不是应为LC3-II是在胞器的膜上，而p62和actin都是在胞质中所以离心的时候只有LC3-II能离下来？（ps用的悬浮細胞，高浓度的样在1000rpm离不到细胞我在加RIPA之前都是2000rpm离心，但是离下来也跟正常细胞不一样沉淀的颜色灰灰的，不知道是药的原因还是细胞都死了）趋势也说不清，好忧桑···

    不知道邀请谁试试他们

  • 政治敏感、违法虚假信息
各位园子里的朋友们帮我分析汾析我的WB结果吧，小弟不甚感激啊！ 一抗是山羊抗小鼠的多抗（来自Santa公司建议浓度1:100-1:1000，建议开始浓度1:200）；二抗是兔抗山羊（来自博士德公司建议浓度1:00）小弟我先说一下步骤：
（1）配胶：10%的，因为目的条带为80KD
（2）电泳：先浓缩胶80V 50分钟后改为120V跑到底
（3）转膜：300AM转膜1个半小时
（4）丽春红染色：可见maker70KD周围有条带但是其它地方还是很多的条带
（5）WB封闭目的：5%的BSA 室温WB封闭目的2个小时 一抗来源于山羊，说要用BSAWB封闭目的之前用牛奶WB封闭目的过，背景更差、杂带更多
（6）一抗孵育： 用WB封闭目的液稀释抗体后4°过夜 （1:200）
（8）二抗孵育：WB封闭目的液稀释二忼后室温摇1个小时（1:10000）
（10）压片：用的millipore的A、B发光液。暗室里加入发光液后要么整个膜都发光要么都不发光总是不能只是目的条带发光。

茬染了丽春红之后我们一起做实验同事都说很漂亮应该不是前面出现的问题，我一抗用的1:200二抗用的1:10000


现在的问题：（1）总是感觉目的条帶不明显，背景杂带多压片的时间长-背景杂带多，压片时间短点但是所有条带很不明显包括目的条带也不明显（2）感觉没有趋势：前兩个孔为正常组，后两个孔为手术组可是wb的结果没有差异（实际上是有差异的）（3）压片时在暗室里加入发光液后要么整个膜都发光要麼整个膜都不发光，总是不能只有目的条发光整个膜都发光进行压片后很多杂带，减少压片时间目的条带就很模糊、很淡了，感觉目嘚条带就是出现的很多条带中的一条没有特异性，自己感觉根本就没有特异的80kd目的条带（4）压一次片后再次加入发光液就不再发光了：哆次遇见（5）我试过一抗浓度1：100、1:500结果和上面的都差不多当1:800、1:1000时整个结果都淡了很多，目的条带非常淡但是还是有杂带。（6）我做了內参非常漂亮，压片时也只有目的条带发光下面为内参。希望高手能给小弟一些建议啊！实在找不到原因了！我有两个蛋白一抗都是買的Santa的做出来都差不多是这样的结果，很无语了！不知道这是什么原因啊！大家帮忙指点一下啊！！！谢谢啊！！！不胜感激！！！！！！

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