高含量的活性氧物种(ROS)可能导致细胞的氧化还原状态对氧化应激条件的变化这种情况会导致分子(脂质,DNA蛋白质)的氧化,并导致细胞死亡氧化应激也影响一些疒理状况如糖尿病,视网膜病神经退行性疾病和癌症的进展。因此重要的是定义工具不仅在单细胞水平,而且在整个生物体的情况下调查氧化应激的条件。在这里我们考虑的斑马鱼胚胎在体内系统中一个有用的执行这样的研究,并提出了一个协议来测量体内氧化应噭利用荧光探针活性氧和斑马鱼转基因荧光线,我们开发两种不同的方法来测量氧化应激在体内 :I)的“全胚胎ROS的检测方法”对氧化应噭的定性测量和ii)“单细胞ROS的检测方法“对氧化应激的定量测量在此,我们证明这些程序的有效性由氧化剂剂和生理或遗传方式增加氧囮应激的组织该协议是服从正向遗传筛选,这将有助于ROS的地址因果关系中的氧化应激相关的疾病如神经系统疾病和癌症的动物模型。
氧化应激被专门定义为一个条件结果从不平衡细胞的氧化还原状态。这通常发生在细胞内复杂的氧化还原反应确定细胞的氧化还原状态氧化还原反应包括的所有化学反应,包括在电子生物分子产生减少和分子( 即氧化还原反应)的氧化原子之间的转移这些反应是通过電子方式激活产物( 即亲氧化性物质),其特征在于一个极端的结构不稳定性和其与邻近的生物分子交换不平衡的电子的自发活化催化。这些不规则的反应结果放入DNA损伤蛋白羧化和脂质过氧化,最终导致细胞死亡1氧化应激水平的增加已经与衰老和不同的病理状态2的进展相关。氧化应激有据报道负责血管改变在糖尿病和心血管疾病3,4。它还在神经元变性阿尔茨海默病的关键作用和帕金森氏病5另外,氧囮应激已被证明是在管癌的进展和转移的事件6,7的一个关键因素此外,炎症和免疫反应可能引发进一步的支持氧化应激8
在活细胞中,亲氧物种是来自氧(ROS活性氧物种)或氮(RNS;活性氮)。活性氧包括羟基自由基超氧阴离子(OH)(O 2- )和过氧化氢 ??(H 2 O 2)。主要RNS是一氧化二氮(NO)可以通过自发的相互作用来产生betwee一系列继发反应物种的?ROS和RNS或游离金属离子9。例如超氧阴离子自由基与氮氧化物发生反应,形荿peroxynitrate(ONOO - )而H 2 O 2反应,以Fe 2 +产生的羟自由基 ROS和RNS,由于其与几种生物分子发生反应的能力被认为是生理氧化还原状态10维护一个危险的威胁。以保持氧化还原状态的细胞都配备了一系列解毒抗氧化剂分子和酶超氧化物歧化酶(SOD),过氧化氢 ??酶谷胱甘肽过氧化物酶和Peroxiredoxins基本上構成了抗氧化酶法,阿森纳从亲氧化物质提供细胞保护包括H 2 O 2,OH和过氧化亚硝酸盐- 11还抗氧化分子,如维生素C和E多酚和辅酶Q10(辅酶Q10)是臸关重要的淬火ROS和他们的危险去衍生参数12,13。然而过量生产的ROS和RNS,或者在抗氧化剂系统功能障碍为转移细胞的氧化还原状态的朝向氧化應激14。
除了他们的贬义活性氧可以在不同来源的细胞发挥不同的生理作用。正常细胞产生的ROS作为信号分子介导正常的生理活动如宿主防御和修复创面15-17。反应性物质是响应信号因子生长因子,和钙的水平18,19的胞内波动通常生产中的细胞通过细胞内的酶如氮氧化物(NADPH氧化酶)和XO(黄嘌呤氧化酶)。据报道活性氧可能差异调节的重要核因子如p53或细胞组分,如ATM激酶的DNA损伤反应20的主调节器的活性类似的ROS强烈調解日影响细胞信号?氧化和蛋白质酪氨酸磷酸酶酶(PTPs),其被建立为信号转导21的关键调节剂失活此外,基于蛋白质组学的方法证明RNS还負责特定的蛋白质修饰和分子信号的改变 RNS反应与半胱氨酸的巯基修饰成S-nitrothiols(SNO)和触发伴随着病理状态,如炎症和自身免疫性疾病22,23的分子途径。
由于细胞培养实验中只是部分地重现了众多的演技在体内的因素它是非常感兴趣的动物模型24,25进行氧化还原的研究。为了实现这一目标在斑马鱼一直被认为是合适的脊椎动物的动物模型来研究氧化应激动力学26。斑马鱼是给予几个优势在脊椎动物的开发研究细胞和基因活动的新模式系统elopment和疾病。可以生成和提供每周一次实验需要大型集群胚胎此外斑马鱼胚胎的非凡的光学清晰度,以及它们的小尺団使单细胞成像和动态跟踪在整个生物体27。在过去的十年中已经产生了相当多的斑马鱼突变体来模拟人类的病理状况,如癌症和遗传疾病28-31最重要的是,大量的转基因株系已经产生允许基因和生物操纵32的广泛的机会。例如转基因的组织特异性的斑马鱼线被经常用于體内研究。这些行表示一个选择的启动子的控制下的荧光蛋白质提供识别单个细胞在体内的功能,以及它们含有的解剖结构
几个毒理學研究已经采用t他斑马鱼来评估化学品对氧化还原平衡在体内的作用,提示这种脊椎动物的适用性作为动物模型药物发现和氧化应激33-35的領域。即使一些荧光探针已经过测试以监测氧化应激的斑马鱼幼虫36,37,有没有既定的分析检测和测量氧化应激在斑马鱼组织中的水平和活細胞在这里,我们描述了用于在体内量化氧化应激在活斑马鱼胚胎细胞的过程成像工具,流式细胞仪分选荧光探针和促氧化条件都結合在一起,生成一个简单的化验检测和氧化物质的定量分析在斑马鱼胚胎和组织
仪器和工作方案1。准备
成人鱼类2配套和选择斑马鱼的胚胎
4,全山ROS的检测方法
5,单细胞ROS的检测方法
通过应用这里介绍的方法我们可以很容易地测量和检测氧化应激(和ROS的水平)在斑马鱼胚胎組织。穿越成年斑马鱼后鸡蛋收集,并使其在28°C至发展到72小时受精后(HPF)为了诱导的氧化应激,我们提出了两种不同的方法:胚胎1)具有较强的促氧化试剂处理或2)组织损伤后促进活性氧的形成
过氧化氢 ??(H 2 O 2),作为通用的细胞ROS形成剂和鱼藤酮,作为特定的线粒體ROS驱动程序:在第一种方法中我们根据具体需要采用两种不同的试剂。鱼藤酮是的等等这些放松管制的氧化应激41的致病复合物I抑制剂。
在第二个方法中我们诱导的ROS的积累通过在尾鳍斑马鱼胚胎的产生伤39,另外氧化应激条件可以通过敲除与吗啉注射Nrf2的抗氧化响应途 ??径是对氧化应激38的细胞毒作用的主要细胞防御促进了斑马鱼的组织。
一旦氧化应激诱导在斑马鱼胚胎中的活性氧物种(ROS)的积累可以通過使用通用的或特定的线粒体ROS敏感探头它成为荧光激活时( 即氧化)来测量。
处理的胚胎可以通过使用整个安装ROS的检测方法或通过将单個细胞的ROS的检测方法概述于图1中进行分析方法之间的选择依赖于是否需要执行的氧化应激的定性或定量测定。这两种方法的有代表性的結果表示在图2中>和图3
图2示出了用于氧化应激的体内成像的整个装载ROS的检测方法的应用。尤其是这种方法已被应用到遵循由外源性促氧囮剂的治疗以及由多个生理条件,如伤口损伤或基因缺失产生的“低”氧化应激产生的两个“强”氧化应激
氧化性物质的生理水平是通過产生72个高倍视野尾鳍活斑马鱼胚胎的微损伤或宽的伤口引起的。它已被证实损伤后H 2 O 2的伤口39后积聚在伤口边缘20分钟。为了可视化的氧化應激在伤口边缘的积累胚胎培养与一个通用的ROS敏感探头,炸伤39后成像在20分钟通过比较完好尾翼与受伤的尾巴,能够分辨荧光探针的积累在伤口边缘( 图2A)非特异性弱荧光信号检测各地在这两个条件的尾鳍组织。
为了验证该活性氧敏感的探针在伤口边缘的特定堆积H 2 O 2水岼在伤口已经除由药理学途径。因为它已经证明在伤口裕量H 2 O 2的积累是向DUOX抑制剂VAS2870 39极为敏感,胚胎伤人之前预处理与此抑制剂活性氧敏感嘚探针的荧光进行比较,从VAS前处理的胚胎和相应的控制表示该信号是依赖于ROS的积累(
此外,我们通过将斑马鱼胚胎与鱼藤酮产生的斑马魚组织中高水平的氧化性物种鱼藤酮处理的胚胎和对照物与一个通用的ROS敏感的探针特异性检测活性氧物种。之后探针被洗去,将胚胎茬荧光立体显微镜下成像在胚胎( 图2C)的整个身体被检测到的氧化应激。高放大率图像显示解剖区域其中所述探针被成功代谢( 图2D)。明场图像(上图)区分解剖结构而荧光图像(下图)表明ROS阳性细胞。所表现出的荧光图像的结果主要是氧化应激的检测,这是由与處理的胚胎比较控制实现的定性报告。
单细胞-ROS的检测方法
图3报告代表FACS图和氧化应激通过将单个细胞的ROS的检测方法定量这种方法已经被鼡于测量氧化应激水平,斑马鱼细胞进行了亲氧化剂条件中所报协议并在图的说明详细介绍如上所述,氧化应激已通过培养解离成单细胞与ROS敏感的分子探针斑马鱼组织中进行了测量由于分离程序和FACS本身可能造成的细胞损伤,样品的分析要求只有“活细胞”被认为是对氧化应激的定量。因此分离的细胞可以通过选择细胞显示“活细胞”的物理参数( 图3A)的馏分,并通过排除死细胞( 图3B)进行分析因此,将样品定量供根据活性氧敏感的探针的荧光并用于示出诸如阳性的GFP( 图3C)的内源荧光的氧化应激水平。对ROS敏感探针的阴性对照样品Φ应包括为了评估诱导的处理和技术程序的氧化应激( 图3C;面板:控制- )流式细胞仪相对定量的情节展现在直方图显示不同的生物学重复( 图3D-E)的测量。
除了 ??在过氧化氢 ??处理的氧化应激水平的定量该方法已被应用到在nrf2a morphants与各自对照( 图3F)的生理条件,例如我们内定量的氧化应激水平
此外,由单细胞的ROS的检测方法与特定的活性氧敏感的探针例如我们结合线粒体ROS-敏感的探针,但也可以测量氧化应激Φ的特定线粒体靶向促氧化剂处理( 图3G)的上下文
图1。方法用于测量ROS水平在斑马鱼胚胎的原理图斑马鱼成人越过适当的繁殖坦克。受精卵然后收集到的菜肴并存储在28℃,以允许胚胎充分开发可以以不同的方式来实现诱导的氧化应激,或者通过药物治疗或通过遗传或粅理辱骂可选地,在壳体的基因突变分析有可能跳过这一孵化和向前移动。在这一点上也能够继续进行以下两种不同的方法。据“整个米'mount ROS检测“的方法(左)斑马鱼胚胎孵育立即用荧光活性氧敏感的探针(1),然后用荧光或共聚焦显微镜(2)分析在“单细胞ROS检测”的方法(右),斑马鱼的胚胎被解离成单细胞(1)中温育,用荧光活性氧敏感探测器(2)并通过FACS进行荧光检测和定量(3)进行分析洏“整装-ROS的检测”方法允许氧化应激检测在活胚胎主要为定性分析,“单细胞为基础的”法补助定性和氧化应激水平的定量测量
图2。整個安装ROS检测方法的代表性结果 甲)斑马鱼胚胎在72个高倍视野经受伤人如先前所描述的Niethammer 等人 ,2009年39代表共聚焦图像显示亲氧(ROS)的积累(箭头)在受伤的尾鳍伤口边缘。氧化性物质已被发现与一般的活性氧探头(CellROX;
2.5微米)已经取得了20分钟后伤口比例尺为20μm。B)示出在72 HPF斑马鱼胚胎中的伤口边缘代表共焦图象胚胎被预处理VAS2870(20μM)或DMSO中进行90分钟的伤口已经取得之前。 ROS已检测到具有通用ROS敏感探测器(CellROX; 2.5μM)伤后20分钟比例尺为20μm。
三)全身图像显示在斑马鱼胚胎鱼藤酮诱导的氧化应激氧化应激在图D所示的胚胎)的尾部区域强烈检测。鱼藤酮是线粒體ETC的强效抑制剂主要影响的skel等人的肌肉细胞在斑马鱼。比例尺180微米。
图3的单细胞的ROS检测方法的代表性结果 甲)代表性FACS图,显示斑马魚胚胎中的一个典型的样品解离为单细胞活细胞都符合FSC-H和SSC-H参数门控R1区。 SSC-H:539(电压)1.0(AmpGain),模式:线性;
FSC-H:E00(电压)2.1(AmpGain)B)的代表性FACS图,显示斑马鱼胚胎中的一个典型的样品解离为单细胞 FACS分析前,样品被温育用碘化丙锭(PI1微克/毫升),5分钟死细胞会根据使用PI荧光(FL2-H通道)选通R2上的区域。
FSC-H:E00(电压)2.1??(AmpGain),模式:线性SSC-H:539(电压),1.0(AmpGain)模式:李附近。电压通道:FL-2:613日志C)代表FACS图显示分离遭受促氧化处理(H 2 O 2)和相应的控制斑马鱼胚胎内皮细胞通过GFP通道可视化。
FACS图代表了UL和UR受到氧化应激(ROS)的所有单元格阴性细胞被绘制在丅部象限(LL和LR)。 TG(Kdrl:GFP)S843斑马鱼胚胎在48hpf培养与H 2 O 2(2 ??毫米)或H 2 O作为控制10分钟 FACS分析前,胚胎在协议中描述的处理受氧化应激细胞通过使鼡通用的ROS敏感荧光探针(;
2.5μMCellROX)进行检测。不育与活性氧敏感探头的样本已被列入作为阴性对照进行亲氧化剂治疗与各自对照样品相比较,细胞的数目在上象限(UL + UR)绘制更高流式细胞仪ACQUIS银行足球比赛的设置如下:电压通道:FL-1:582日志; FL-4:410日志D)的直方图表示细胞的UL + UR)在H 2 O
2处理的胚胎和相应的控制受到氧化应激的百分比(。测量都涉及到在C中所示的样品受氧化应激细胞通过使用通用的ROS敏感荧光探针(; 2.5μMCellROX)进行检測。结果是n = 2的不同生物学重复±标准差E)柱状图显示内皮细胞()在H 2 O
2处理的胚胎和相应的控制受到氧化应激(ROS +)的百分比的GFP +的平均值测量都涉及到在C中所示的样品。结果是n = 2的不同生物学重复±标准差F)的直方图显示在nrf2a morphants受到氧化应激(ROS +)nrf2a
MO)细胞的百分比(和相应的控制均值(CTRL MO)在24 HPF结果是n = 2的不同生物学重复±SD G)的直方图显示受线粒体氧化应激的处理的胚胎细胞的百分比(鱼藤酮的平均值;在72 HPF DMSO);相应的控制(按Ctrl 10微米)和。解离胚胎成单个细胞后线粒体氧化应激(线粒体ROS +)的测定使用线粒体特异的探针(MitoSOX;
5μM)。结果是n = 3的不同生物学重复±标准差的平均值。
对氧化应激的检测在本文中所描述的斑马鱼胚胎的过程包括两个不同的方法整个安装ROS检测方法主要是定性测定活性氧检测用,而单 ??细胞ROS的检测方法允许更具体的定量测量( 图1)这两种方法提供了一种快速简便的方法来评估对斑马鱼胚胎的体内活性氧检测。然而他们都提出了一些关键步骤。
第一种方法为整装ROS的检测有很大的优势轻松地检测氧化应激的活胚胎( 图2)的所有组织。然而存在必须加以考虑和可能影响测定的结果的三个重要关键方面:探针1)的渗透性胚胎组织,2)所述探针的毒性和3)个?探头的灵敏度要低活性氧的浓度。
第一方面特别涉及到在体内的应用的方法42活性氧敏感的探针的“细胞渗透性”属性是为实现该测定的一个重要特征。理想情况下所有的水溶性化学品是最佳的分娩活斑马鱼胚胎;然而大多数的试剂氧化应激的检测是不溶于水。因此通常建议使用探针可溶於DMSO(二甲亚砜)。
有关于胚胎链接到ROS探针的浓度可能的毒性作用副作用是由组织损伤( 即坏死)或探针的加速新陈代谢通常表示。斑马魚胚胎与hydroethidine探头事业胚胎死亡的漫长孵化期(天)而高剂量的5 - (和6) - 羧基-2',7'-二氯二乙酸酯结果在正在特定的积累在肠道(未发表数据)的熒光为了克服这个问题与探针孵育期间监测胚胎是很重要的。几种浓度和孵育时间用相同的探针的测试将是有益的为好最佳培养时间尣许传递的分子探针无表面组织损伤和氧化。利用化学探针(0.5-10微米)的孵育时间通常可以固定在10-30分钟的范围内并应不超过1小时。这种情況可以是相当棘手的设置特别是当氧化物质的量是接近生理水平,或当它被限制在内部的胚胎组织事实上,当全生物体孵育具有活性氧检测用化学探针最表面的组织( 即皮肤,眼睛和心脏)是其中探针主要被氧化并变成荧光以后,探针被逐渐传递到内脏器官肝脏戓已经ssels。作为一个结果一个合适的时间为斑马鱼胚胎的活性氧检测用探针的孵育是至关重要的,以检测氧化应激的所有组织中
最后,使用这种方法时必须考虑探头由组织表达的氧化应激水平的灵敏度是重要的。大部分市售的探针不精细特征为他们的灵敏度这意味着,对于特定应用的最佳探头必须根据经验来确定所有的ROS敏感的探测器通常检测高水平的氧化应激,但大部分都不是氧化应激水平43的最小變化敏感
为了限制这一缺点,并允许更详细和精确的分析建议应用基于单细胞的检测氧化应激的第二方法。
在S英格尔细胞ROS的检测方法提出了一些关键步骤它们主要由1)胚胎细胞解离的效率,并通过2)相关联以测定活性氧敏感的探针的类型确定。
胚胎的离解成单个细胞是改编自斑马鱼细胞分析先前的协议使用流式细胞仪44,并提出了强烈地影响整个程序的结果的两个重要方面第一方面涉及用于分离胚的方法,而第二个是与分离的细胞的恢复
胚胎的离解成单细胞,主要由离解的试剂的浓度( 即胶原酶P和胰蛋白酶)来控制然而,必須考虑到组织离解的效率依赖于胚胎培养和它们的发育阶段的数目在早期发育阶段的斑马鱼胚胎(24 HPF-48 HPF)是因为增长45渐进组织更明智的解离試剂比幼虫(96 HPF-120高倍视野)。因此与斑马鱼胚胎在超过72个高倍视野不同发育阶段的工作时所需的解离过程中的调整。过度的孵化与试剂导致细胞死亡而试剂的浓度降低只能部分离解的胚胎。因为它正确地分解组织很重要但同样重要的是收集和保存单个细胞。一个重要的栲虑是在该细胞组织分裂后回收的温度它以在离心过程中保持细胞在冰上或在4℃下以限制的氧化应激继发于组织或处理程序的机械破坏昰非常重要的。
关于相关联的探针的第二个关键步骤是联系在一起的分析在感兴趣的特定组织检测小区波波尔最简单的方法通报BULLETIN在斑马魚是由转基因株系的广泛已建立在最近几十年46,47提供。但是所选择的转基因系的荧光必须与活性氧检测用探针兼容关键的是要避免背景组織荧光和低,但由探头发射的特定荧光信号之间的串扰
考虑这两种方法提供一种简单和成本有效的测定法来测量氧化应激在体内 ,有可能这个协议适用于几个条件:
氧化应激在不同的遗传( 如病理)测量条件
氧化剂和抗氧化基因可以通过注射吗啉(丧失功能的)或mRNA(功能獲得性的)的易于调制在斑马鱼胚胎基因敲减及microin最近报道的实验皑皑的mRNA在斑马鱼胚胎jection建立了抗氧化Nrf2a和Nrf2b基因在发育过程中保护细胞免受氧囮应激不同的角色。基因表达调节的方法评估哺乳动物和斑马鱼在神经细胞38,48缺氧反应和氧化应激之间的进化上保守的轴此外,一个很好嘚机会来研究氧化应激是由几个斑马鱼突变系提供例如,在斑马鱼ducttrip(DTP)突变体代表了一个有趣的例子为氧化应激有关的病理状态的表征在DTP突变携带不足为S-腺苷水解酶(ahcy)基因及其表征表明Ahcy失去活性通过影响ROS水平49导致肝脏变性。等价地斑马鱼突变体Nrf2的fh318,背着一个损失-的函数的转录因子Nrf2基因的n个突变一直被视为具有相当大的兴趣,以调查这起抗氧化基因在低等脊椎动物50的保护作用
氧化还原状态的测量,通过药物化合物引发
斑马鱼胚胎小的药物治疗可以抑制或激活氧化应激最近,我们证明诱导的氧化应激可通过辅酶Q10治疗51收回斑马鱼胚胎的他汀类药物治疗另外,在斑马鱼动物模型为人类RYR1相关肌病的氧化应激的分析突出作为肌肉疾病52一个潜在的治疗方法的抗氧化剂药物嘚NAC(N-乙酰半胱氨酸)的作用
小分子和毒品来表征其氧化性能的大规模筛选
斑马鱼是一种行之有效的动物模EL的大型化工审查。在斑马鱼中發现的抗氧化剂作为多巴胺能神经元存活,这是严重的影响在哺乳动物的神经变性疾病如帕金森氏病53调制器执行的小分子的最近的一个囮学筛选此方法可用于筛选新的亲或抗氧化剂分子在体内 。
这两个“整装”和“单细胞”活性氧检测方法的突出依赖于氧化应激的体内測量通过使用简单的实验技术和基本设备来执行的能力斑马鱼作为与活性氧检测用探针结合的动物模型中的应用程序允许氧化应激不仅單纯的启示,而且其在生物体和定量在单一组织中的水平的情况下检测重要的是,这些分析可以与市售的工具来执行的不需要去实现具体的专业知识。此外这两种方法都不是费时的程序,并且可以用适当的时间被应用于大样本集所有这些共同的实际优势使得具有特殊意义这些方法来提高体内氧化应激的分析。
然而这些测定也表现出一定的局限性一般来说,大多数的ROS敏感的探头现在市售不被看重的氧化应激水平在活细胞的细定性和定量分析采用基于荧光的检测54,尤其是当但最近关于他们的特殊性有关人士提出, -常用hydroethidine和MitoSOX探针被设計用于检测超氧化物(O 2)类似地报道一些先进的专用的H 2对二氯二乙酸酯(DCFH-DA)的疑惑> O 2传感55,56。此外这些氧化还原活性的荧光探针的特点是局部的非特异性激活( 即组织的自发荧光)和不氧化后是可逆的。一旦荧光探针活性氧氧化不能返回其非荧光还原态因此ROS的波动与时间汾辨率的检测是通过应用这种化学探针43的限制。
有相当的限制这个字段是由缺乏探针专用RNS检测的表示最近,基于蛋白质组学的方法证明叻RNS诱导蛋白修饰被认为是亚硝基活性应力的生物标志物并且可以通过免疫测定法通过使用特异性抗体的蛋白质氧化/硝化( 例如 ,抗-SNO-半胱氨酸反-3 -进行评价硝基酪氨酸)22,23。然而所有这些测定是仅间接氧化STRE的测量由RNS SS触发,在大多数情况下他们需要的细胞提取,这意味着它們并不适用于活细胞或活斑马鱼胚胎
一个有效的替代传统的探头是由基因编码的氧化还原敏感的荧光蛋白表示。这个小组的主要成分是:roGFP从绿色荧光蛋白,rxYFP和cpYFP无论是从黄色荧光蛋白和超探头,一个特定的H 2 O 2敏感的荧光探针57衍生而得所有由荧光蛋白质创建这些工程化的氧化还原探针允许基于荧光的比例量化,使更高的时间分辨率(从几秒到几分钟)比化学探针58体内应用这些生物传感器中,也可以作为證明通过表达超斑马鱼的转基因系内源性H 2 O 2水平39,59的实时检测我mplementing的斑马鱼基因编码的传感器提供了一个最佳的系统调查氧化应激,但需要建竝的转基因动物线和适当的成像工具对氧化应激检测在斑马鱼这里介绍的过程比遗传方法不太精确,但是是快并提供了主要测定法用於体内检测高浓度的助氧化的物种的。个体的活性氧和/或氮物种的精确测量是目前该研究领域的限制在未来,即将纳米级氧化还原传感器可以帮助解决这个问题纳米颗粒和纳米管为基础的氧化还原传感器的成功应用,在几个体外研究过测试但不能作为体内试验到现在為止60。
从体感皮层2.准备急性脑片
从5层锥体神经元3.膜片钳记录
一个神经元的电响应性能4.半自动表征
通过模拟突触和模拟体内般的背景活动5.注射电导
在前面的章节中我们已经描述了如何使鼡该软件工具箱LCG表征L5锥体细胞的电生理特性和重新体内样突触活性的切片准备。使用命令行界面和半自动化协议的有利于实验这可能对所产生的数据的输出和质量有很大的影响的再现性和效率。另外由于数据被保存在一个一致的方式,很容易扩展分析以一个特定的目標。 图1示出了一个实验其中使用六个不同的协议的小区的基本电性能已经表征的典型结果。
测量动作电位的形状和阈值( 图1A):一个简短和去极化电流的强脉冲注入到测量平均动作电位形状穗门槛计算为的动作电位24第三衍生物的第一峰值。电压-电流曲线( 图1B)的测量:亞阈值电流脉冲被注入细胞允许被动响应性能如输入电阻和亚阈值的离子电流的表征测定。
测量的最小电流足以引发持续焙烧( 图1C)電流的注入斜坡允许细胞作为I型或II型振荡器25的表征。频率电流(FI)曲线( 图1D)的测定:注入的电流是瞬时点火频率的函数并且每次更新尛区尖峰,使用在5中描述的闭环协议使用这种技术,可以在不到30秒而获得的FI曲线的可靠估计在MEMBRAN测量e时代常数( 图1E):短超极化电流脉沖被传递到测量膜的被动松弛性能。此脉冲然后被装配到双指数来计算膜的时间常数(44毫秒在这种情况下)
适应系数和响应于去极化电鋶( 图1F):当前两个超阈值被注入到测量(第一个和最后间穗间隔之间的比例)的适配系数。一系列象描述的那些协议的自动化应用允许表征每个记录单元中的其关键电生理特性方面并且构成为旨在比较不同神经元类型和它们的作用的任何努力的基本步骤,无论是在健康囷疾病
虽然LCG包含实施专业化协议的几个剧本,大部分功率和工具箱的灵活性居住在能力S按配置文件的装置来描述的实验在秒。 5描述洳何执行动态钳位到模拟背景活动注入神经元。这里的配置文件和实体的概念被引入配置文件是简单地包含所有的基本构造块(称为实體 )所必需的执行给定的实验的名称和互连的文本文件;为此,通过连接实体设计新颖的范例是一个相对容易的任务因为是共享和重用实驗范式。在图2中所示的实验中五个实体被使用:
H5Recorder:记录所连接的实体的压缩文件。该HDF5文件格式已经被选择因为它支持大多数编程语言洳Python和MATLAB。
RealNeuron:提供了一个抽象层以实时重新的技术方面盘带和注射它包含关于数据采集板中的信息,并在网上进行主电极的补偿当动作电位是通过阈值交叉检测,实时神经元也输出在一个事件的形式的尖峰:这可以用于例如监视在实验过程中的燃烧率或人工突触连接
泊松:产生脉冲序列以下的指数分布的特定速率。这个过程的种子可以是固定的使得试验能够始终如一地被再现。
SynapticConnection:接收尖峰从发电机和一個给定的延迟之后它们转发到适当的突触
Exp2Synapse:双指数突触模型。它包含了逆转潜力和上升和衰减时间常数
如前面提到的,每个实体被连接到一个或多个其他吨?撰写实验。在二段中描述的兴奋性突触后电流的仿真的例子。 5.2和5.3可以抑制模拟电流,并重新在体内样活性
在圖2中示出了如何通过动态夹紧结构的装置,可以通过模拟电流感应到一个神经元通过人工突触研究以受控方式突触融合 图2A(顶)示出单獨的突触后电位(顶)连同每次注射ected电流。红(蓝)的痕迹表示兴奋性(抑制)事件需要注意的是注入的电流是关联到虚拟突触的活化茬电导变化的膜电压和的函数。
通过提供泊松脉冲序列在较高频率的突触 在体内式的背景活动可以模拟( 图2B和2D)。即使在当大电流注入(黑色迹线在图2B的底部)时电极活性补偿保证了尖峰形状不受影响( 图2C),即使单电极用于同时注入电流和尖峰记录膜的电压重复多個试验具有相同的电导波形允许23的工作延伸到更真实的框架,从而能够分离不同synapti的贡献?电流的可靠性和精度峰值时。
图3显示了混合网络通过从两个未连接锥体细胞同时记录和使用虚拟GABA能interneuron模拟disynaptic抑制的形式获得的一个简单的例子,一个普遍的机制在大脑皮层涉及马丁诺蒂細胞的活化。26 27图3A示出的实验装置的示意图:一对真实的,未连接的锥体细胞(黑色和红色三角形)是通过一个模拟的GABA能interneuron人工连接建模為一个漏水整合和-火神经元。该突触前锥体细胞连接到interneuron显示根据Tsodyks-马克拉姆模型28同突触短期便利实现而突触连接interneuron和突触后锥体细胞突触是┅个双指数突触上升和衰减钛我常数1和10毫秒,分别
两个连接的权值进行调整以具有在约2的突触后膜电位毫伏。 图3B和3C示出了突触前锥体神經元到90赫兹递送细胞内脉冲序列的响应的偏转并在模拟相应EPSP的interneuron:突触连接的参数,以具有人工神经发出冲动突触前突发3后调整- 4尖峰在高頻率如报道实验26,29图3D示出了在disynaptic抑制的效果真正的突触后锥体细胞:10次试验重叠,其中所述神经元被刺激与冷冻体内样背景类似于图2中描述的一种活性注意的增加可靠性响应于三个抑制IPSPs,反映在抑制性细胞的活化后的小尖峰抖动通过低于电压痕迹红色虚线所指示的。
图1的電子代码协议对于典型锥体细胞的修补L5锥体神经元输出数字电表征量词将自动执行,并没有进一步的编辑是必需的动作电位的阈值(虛线-50.5毫伏)(A)计算。红线是平均动作电位形状被动应对(上)到超极化电流(底部)(B)测量。(C)响应增加去极化电流测量rheobase电流(123帕)(D)发射频率作为注入的电流的函数,使用闭环方法测定每个灰度点位于一对(电流注入,所述峰峰间隔的倒数)的小区的基夲活性性能的红色曲线是线性拟合到数据点和虚线表示在面板(℃)测定的rheobase。(E)测量的膜的时间常数(43.8毫秒)(F)的识别发现该小区昰一个普通的扣球神经元,并且有最小的适应
图2.娱乐的接近体内的使用动态钳活动。(A)模拟兴奋性(红秒5.1)和抑制(蓝色,秒5.2)突触,灰色的痕迹是相同的实验等的实现(B )
仲>顶,从L5锥体神经元受到兴奋性(抑制)突触后电流的轰击在7000(3000)Hz的速率记录电压痕迹囿一个固定的随机种子多个实现被显示在图中(灰迹线)。实验中的(B)中底部对应兴奋(红色),抑制(蓝色)和总(黑)的电流注叺到细胞中尖峰的(C)的形状。(D)的栅格跨越20次试验所产生的尖峰的情节表明神经元可以非常可靠和精确的响应在23看到了同样的意見。
黑色和红色金字塔代表一对同时记录真实的锥体细胞黑色和红色表示突触前和突触后神经元,分别蓝色圆圈代表一个虚拟GABA能interneuron,由嫼色锥体细胞接触这反过来抑制红色锥体细胞
的实突触前锥体神经元的响应,在90赫兹的频率传送脉冲串中由橙色虚线以上的电压跟踪。低于电压跟踪的黑色虚线表示的次动作电位是由突触前细胞射出模拟interneuron由突触前细胞发射尖峰的列车的
叠加来自真实突触后锥体细胞响應于模拟interneuron的激活记录,10电压痕迹突触后细胞受到刺激冷冻
般的背景活动,获得可靠的电压动态低于电压痕迹红色虚线表示的次其中,茬连续的试验中所发射的动作电位的突触后神经元。注意interneuron的活化后增加的精度通过在各试验低级尖峰抖动指示。
在该文本的完整协议嘚实时实施闭环单细胞电生理实验进行了说明,使用膜片钳技术和最近开发的软件工具箱称为LCG要优化录音的质量是至关重要的录音设置正确接地,屏蔽和无振动:这可确保稳定持久的全细胞进入细胞这与自动化的刺激方案整个路段的可能性在一起允许对实验的吞吐量朂大化。
两种情况即LCG可以应用已经提出,一个单元的即在其电生理特性( 图1)包括一个神经元的活性输入输出关系的快速计算方面的表征,并在体内样的娱乐在脑切片的活性( 图2) SUC^ h应用程序演示了如何构建不同的协议和强调了LCG的最突出的特点:它的命令行界面使得它適合的脚本,使一系列协议的自动化应用另外,如已经在图1进行从一个协议提取的值可以用于后续协议裁缝参数。
能够实时监测被分析的细胞的响应的高阶功能( 例如 它的瞬时燃烧率, 如图1D)并通过使用PID控制器计算当前修改刺激因此,比如以保持恒定或随时间变化嘚燃烧率必需的
电导和动态钳位协议与LCG的实现很简单,只需要编写一个文本配置文件可以通过s的使用情况进行自动化的程序imple脚本。 LCG包括可以相互连接以制定新的实验方案30的实体我们描述了如何使用LCG使用命令行界面,但是图形试验发射已被设计为便于起动试验通过让非经验的用户更改参数组合LCG命令来创建自己的图形界面。
现有两个工具箱提供类似于LCG功能:RELACS和RTXI前者是既用于进行电生理实验和用于分析囷注释所记录的数据的平台。 LCG和现有的解决方案之间的主要区别是其基于命令行用户界面这种方法的优点有几个:首先,一个命令行界媔允许通过的可能是复杂的脚本自动化手段和标准化重复的任务;其次它允许嵌入实验性试验为实现更复杂的工作流程在高层次的脚本语訁,如Matlab或Python
综上所述,LCG的模块化特性允许扩大在两个方面现有的实验协议的数量:第一最简单的一种是通过编写使用现有的对象执行新嘚协议特设的配置文件。第二个是通过实施 - 使用C ++ - 可用于进一步扩大LCG的功能和特性的新的基本对象这些示例介绍了该协议的关注单个细胞茬大脑切片的研究。然而类似的协议,也可以成功地用于体内制剂中记录细胞内和细胞外信号,并在体外制剂如神经元培养物,来記录例如,通过多电极阵列外电位而在闭环刺激环4