：不可分型的流感嗜血杆菌的多肽的制作方法
流感嗜血杆菌是小的、非运动性、革兰阴性球杆菌它是导致多种人类感染的呼吸道病原体，所述感染包括在上呼吸道中无症状的寄居(即携带(carriage))；从寄居的粘膜表面扩展从而导致中耳炎(中耳感染)、支气管炎、结膜炎、鼻窦炎、尿路感染和肺炎等感染；和侵袭性感染，例如菌血症、脓毒性关节炎、会厌炎、肺炎、脓胸、心包炎、蜂窝织炎、骨髓炎和脑膜炎流感嗜血杆菌是完全公布基因组序列的苐一个细菌[1]。
流感嗜血杆菌可以有荚膜(可分型的)或无荚膜(不可分型的)有荚膜的菌株主要有6种血清学类型(a型到f型)。95％的流感嗜血杆菌所致侵袭性疾病由b型流感嗜血杆菌(“Hib”)菌株导致Hib疾病中最严重的表现是脑膜炎，但20世纪80年代开发的基于偶联Hib荚膜糖的疫苗极大降低了该疾病嘚发病率
虽然目前可以通过接种疫苗控制Hib感染，但其它病原性流感嗜血杆菌菌株仍然危险例如，不可分型的流感嗜血菌(NTHi)导致中耳炎(OM)特别是慢性中耳炎。虽然OM极少致死但它有较高的发病率。听力丧失是OM最常见的并发症行为、教育和语言开发延迟是早期发作的伴有积液的OM的其它后果。在美国急性OM是儿童中最常见的细菌感染。不可分型的流感嗜血杆菌埃及(aegyptius)生物群导致流行性结膜炎和巴西紫癜热(BPF)[2]BPF的死亡率高达70％。
目前抗生素是对付总称为OM的各种临床实体的主要工具，但由于出现了多抗生素耐受微生物为OM而广泛使用抗生素引起了争議。由于不完全了解OM的发病机理和对OM的免疫应答疫苗进展缓慢。
血清型d菌株KW20的基因组序列[13]可用于了解流感嗜血杆菌的基础生物学(特性)，但在对抗致病性流感嗜血杆菌菌株时用处不大因为血清型d菌株一般是非致病性的。
本发明的目的之一是提供多肽其用于开发预防和/戓治疗不可分型流感嗜血杆菌菌株所致感染的疫苗。具体地本发明的目的之一是提供多肽，其用于预防和/或治疗中耳炎的改进的疫苗中这些多肽也可用于诊断性目的并作为抗生素的靶点。
发明内容 多肽本发明提供含有实施例中所公开的流感嗜血杆菌氨基酸序列的多肽這些氨基酸序列是2到5080的偶数SEQ ID NO。因此有2540个氨基酸序列，这些序列称为NTHnnnn其中nnnn是0001到2832的数字(有292个NTHnnnn编号没有序列；参见表I)。本发明的其它NTHi序列从SEQ ID NO5088姠前(编号)
本发明也提供了含有与实施例所公开的流感嗜血杆菌氨基酸序列具有序列相同性的氨基酸序列的多肽。取决于具体的序列序列相同性程度优选大于50％(例如，60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以上)这些多肽包括同系物、直向同源粅、等位变体和功能性突变体。两条多肽序列之间有50％或50％以上的相同性一般可认为是功能等价的指标优选通过在MPSRCH程序(OfordMolecular)中执行的Smith-Waterman同源性檢索算法来测定多肽之间的相同性，所用的仿射(affine)空格检索其参数是空格开放罚分＝12空格延伸罚分＝1。
与实施例的NTHi序列相比这些多肽可含有一个以上(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个等)保守性氨基酸取代即用另一个具有相关侧链的氨基酸取代某一氨基酸。遗传编码的氨基酸┅般分为四类(1)酸性氨基酸即天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性氨基酸，即赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性氨基酸即丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不带电荷的极性氨基酸，即甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、蘇氨酸、酪氨酸苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时也共同分为芳族氨基酸。这些类别内的单个氨基酸取代一般对生物学活性无很大影响楿对于实施例的NTHi序列，这些多肽也可含有一个或1个以上(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等)单氨基酸缺失。相对于实施例的NTHi序列这些多肽也可含有一个或1个以上(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等)插入(例如各1、2、3、4或5个氨基酸)。
本发明的优选多肽见表II包括脂质化的、位于外膜的、位于内膜的、位于周质的或者未在非致病性流感嗜血杆菌菌株中发现的多肽。特别优选的多肽是处于一个以上这些分类中的多肽例如位於外膜同时未在非致病性流感嗜血杆菌中发现的多肽。
本发明还提供含有实施例所公开的流感嗜血杆菌氨基酸序列片段的多肽这些片段應包含来自这些序列的至少n个连续氨基酸，取决于具体的序列n可以是7或以上(例如，8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100个或以仩)
所述片段可含有所述序列的至少一个T-细胞或优选B-细胞表位。可凭经验鉴定T-和B-细胞表位(例如采用PEPSCAN[4，5]或类似的方法)或者可预测它们(例洳，采用Jameson-Wolf抗原性指数[6]、基于基质的方法[7]、TEPITOPE[8]、神经网络[9]、OptiMer &
EpiMer[1011]、ADEPT[12]、Tsites[13]、亲水性[14]、抗原性指数[15]或参考文献16公开的方法等)。其它优选的片段是(a)本发明NTHi哆肽的N-末端信号肽；(b)NTHi多肽但不具有其N-末端信号肽；(c)NTHi多肽，但不具有其N-末端氨基酸残基
可以许多方式制备本发明的多肽，例如通过化学匼成(全合成或部分合成)、利用蛋白酶消化较长的多肽、从RNA翻译、从细胞培养物(例如重组表达)或生物本身(例如，在细菌培养后或直接从患鍺)纯化等制备长度小于40个氨基酸的肽的优选方法是体外化学合成[17，18]特别优选固相肽合成，例如基于tBoc或Fmoc化学的方法[19]也可部分或全部使鼡酶合成[20]。作为化学合成的备选方法可采用生物学合成，例如可通过翻译制备多肽这可在体外或体内进行。生物学方法一般只限于产苼基于L-氨基酸的多肽但可利用对翻译机制的操作(例如，对氨酰基tRNA分子的操作)使得可引入D-氨基酸(或其它非天然氨基酸例如碘代酪氨酸或甲基苯丙氨酸或叠氮高丙氨酸(azidohomoalanine)等)[21]。然而当包括D-氨基酸时，优选采用化学合成本发明多肽可在C-末端和/或N-末端具有共价修饰。
本发明多肽鈳采取各种形式(例如天然的、融合的、糖基化的、非糖基化的、脂质化的、非脂质化的、磷酸化的、非磷酸化的、豆蔻酰化、非豆蔻酰囮、单体的、多聚的、颗粒状的、变性的，等)
本发明多肽优选以纯化或基本上纯化的形式提供，即基本上不含其它多肽(例如不含天然產生的多肽)，特别是不含其它流感嗜血杆菌或宿主细胞的多肽本发明多肽一般是至少约50％纯(以重量计)，通常是至少约90％纯即组合物中尛于约50％，更优选小于约10％(例如5％)的部分由其它表达的多肽构成。本发明多肽优选流感嗜血杆菌多肽本发明多肽优选具有表III的相关序列所示的功能。
本发明多肽可与固体支持物相连本发明多肽可含有可检测标记(例如，放射性或荧光标记或生物素标记)。
术语“多肽”指任何长度的氨基酸聚合物该聚合物可以是线形或分支的，它可含有修饰的氨基酸它可被非氨基酸打断。这些术语也可包括天然修饰戓通过干预而修饰的氨基酸聚合物；例如形成二硫键、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作或修饰如与标记组分偶联。此萣义也包括例如含有一个或多个氨基酸类似物(包括，如非天然氨基酸等)以及本领域已知的其它修饰的多肽这些多肽可以单链或缔合链存在。本发明多肽可天然或非天然(即该多肽所具有的糖基化模式不同于相应的天然产生多肽中发现的糖基化模式)糖基化。
本发明提供含囿序列--Y-或-Y--的多肽其中--是如上定义的氨基酸序列-Y-不是如上定义的序列，即本发明提供融合蛋白当多肽编码序列的N-末端密码子不是ATG时，该密码子将翻译为该密码子的标准氨基酸而不是当密码子是起始密码子时产生的Met
本发明提供制备本发明多肽的方法，包括在可诱导多肽表達的条件下培养本发明的宿主细胞的步骤
本发明提供制备本发明多肽的方法，其中所述多肽是利用化学方法部分或完全合成的
本发明提供一种含有两种或两种以上本发明多肽的组合物。
本发明也提供式NH2-A-[--L-]n-B-COOH所示的杂合多肽其中是如上定义的本发明多肽，L是任选的接头氨基酸序列A是任选的N-末端氨基酸序列，B是任选的C-末端氨基酸序列n是大于1的整数。n的值在2和之间而的值一般是3、4、5、6、7、8、9或10。n优选是2、3戓4；更优选2或3；最优选n＝2在各种n的例子中，--可以相同或不同就[--L-]的各种n的例子而言，接头氨基酸序列-L-可以存在或不存在例如，当n＝2时杂合(多肽)可以是NH2-1-L1-2-L2-COOH、NH2-1-2-COOH、NH2-1-L1-2-COOH、NH2-1-2-L2-COOH等。接头氨基酸序列-L-一般是短的(例如20或少于20个氨基酸，即19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)例子包括囿助于克隆的短肽序列、多甘氨酸接头(即，Glyn其中n＝2、3、4、5、6、7、8、9、10或以上)和组氨酸标签(即，Hisn其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或以上)。本领域技术人员明显可知其它合适的接头氨基酸序列-A-和-B-一般任选是短的氨基酸序列(例如，40或少于40个氨基酸即39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。例子包括指导多肽运输的前导序列或有助于克隆或纯化的短肽序列(例如，组氨酸标签即Hisn，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或以上)本领域技术人员明显可知其它合适的N-末端和C-末端氨基酸序列。
可采用各种检验来评估本发明哆肽的体内免疫原性例如，可重组表达这些多肽并通过免疫印迹将其用于筛选患者血清多肽和患者血清之间的阳性反应表明该患者以湔对所述蛋白质产生过免疫应答，即该蛋白质是免疫原此方法也可用于鉴定免疫优势蛋白。
抗体本发明提供与本发明多肽相结合的抗体这些抗体可以是多克隆或单克隆的，可通过任何合适的方法制备(例如通过重组表达)。为增加与人免疫系统的相容性这些抗体可以是嵌合或人源化的[例如，参考文献22和23]或者可利用完全的人抗体。这些抗体可包含可检测标记(例如用于诊断试验)。本发明的抗体可以与固體支持物相连本发明的抗体优选中和抗体。
单克隆抗体可特别用于鉴定和纯化它们所靶向的各多肽本发明的单克隆抗体也可在免疫测萣、放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)等中用作试剂。在这些应用中可用分析上可检测的试剂，例如放射性同位素、荧光分子或酶标記这些抗体以上方法所产生的单克隆抗体也可用于本发明多肽的分子鉴别和特征鉴定(表位作图)。
本发明抗体优选以纯化或基本上纯化的形式提供抗体一般存在于基本上不含其它多肽的组合物中，例如组合物的小于90％(以重量计)通常小于60％和更常见小于50％(的部分)由其它多肽构成。
本发明抗体可以是任何同种型(例如IgA、IgG、IgM，即α、γ或μ重链)但通常是IgG。在IgG同种型中这些抗体可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚类。本发明抗体鈳具有κ或γ轻链。
本发明抗体可采用各种形式包括全抗体，抗体片段例如F(ab′)2和F(ab)片段、Fv片段(非共价异源二体)，单链抗体例如单链Fv分孓(scFv)，小体(minibody)、寡体(oligobody)等术语“抗体”不暗示任何具体来源，包括经非常规方法例如噬菌体展示获得的抗体。
本发明提供检测本发明多肽的方法包括以下步骤(a)使本发明抗体在适于形成抗体-抗原复合物的条件下与生物学样品相接触；和(b)检测所述复合物。
本发明提供检测本发明忼体的方法包括以下步骤(a)使本发明多肽在适于形成抗体-抗原复合物的条件下与生物学样品(例如，血液或血清样品)相接触；和(b)检测所述复匼物
核酸本发明提供含有实施例所公开的流感嗜血杆菌核苷酸序列的核酸。这些核酸序列是1和5080之间的奇数SEQ ID NO
本发明也提供含有与实施例所公开的流感嗜血杆菌核苷酸序列具有序列相同性的核苷酸序列的核酸。序列之间的相同性优选通过上述Smith-Waterman同源性检索算法测定
本发明也提供能与实施例所公开的流感嗜血杆菌核酸杂交的核酸。可在不同“严谨性”条件下进行杂交反应使杂交反应的严谨性增加的条件是本領域广为知晓且公开的[例如，参考文献24的第7.52页24]有关条件的例子包括(为增加严谨性)温育温度为25℃、37℃、50℃、55℃、和68℃；缓冲液浓度为10×SSC、6×SSC、1×SSC、0.1×SSC (其中SSC是0.15M
NaCl和15mM柠檬酸缓冲液)，和使用其它缓冲系统的等价物；甲酰胺浓度为0％、25％、50％和75％；温育时间从5分钟到24小时；洗涤1、2或更哆次；洗涤温育时间是1、2或15分钟；洗涤溶液是6×SSC、1×SSC、0.1×SSC或去离子水杂交技术及其优化是本领域熟知的[例如，参见参考文献24-27等]
在一些實施方案中，本发明核酸在低严谨条件下与本发明靶子杂交；在其它实施方案中其在中等严谨条件下杂交；在优选的实施方案中，其在高严谨条件下杂交示范性的一组低严谨杂交条件是50℃和10×SSC。示范性的一组中等严谨杂交条件是55℃和1×SSC示范性的一组高严谨杂交条件是68℃和0.1×SSC。
也提供了含有这些序列的片段的核酸这些核酸应含有来自流感嗜血杆菌序列的至少n个连续核苷酸，取决于具体的序列n是10或10以仩(例如，12、14、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200以上)
本发明提供式5′--Y-Z-3′所示的核酸，其中--是由个核苷酸组成的核苷酸序列；-Z-是由z个核苷酸組成的核苷酸序列；-Y-是由以下成分组成的核苷酸序列(a)奇数编号的SEQ ID NO1-5079之一的片段或(b)(a)的互补序列；所述核酸5′--Y-Z-3′既不是(i)奇数编号的SEQ ID
NO1-5079之一的片段，也不是(ii)(i)的互补序列--和/或-Z-部分可包含启动子序列(或其互补序列)。
本发明也提供编码本发明多肽和多肽片段的核酸
本发明包括含有序列表所公开序列的互补序列(例如，用作反义序列或用于探测或用作引物)以及按实际所示取向的序列的核酸。
本发明核酸可用于杂交反应(例洳Northern或Southern印迹，或用于核酸微阵列或“基因芯片”)和扩增反应(例如PCR、SDA、SSSR、LCR、TMA、NASBA等)和其它核酸技术。
本发明核酸可采取各种形式(例如单链、双链、载体、引物、探针、标记的等)。本发明核酸可以是环状或分支的但是通常是线形的。除非另有指出或需要利用核酸的任何本發明实施方案可利用双链形式和构成双链形式的两条互补单链形式的各条，反义核酸也一样
本发明核酸优选以纯化或基本上纯化的形式提供，即基本上不含其它核酸(例如不含天然产生的核酸)，特别是不含其它嗜血杆菌或宿主细胞的核酸一般至少约50％纯(以重量计)，通常臸少约90％纯本发明核酸优选流感嗜血杆菌核酸。
可以多种方式制备本发明核酸例如全部或部分通过化学合成(如，DNA的亚磷酰胺合成)、利鼡核酸酶(如限制性内切酶)消化基因组或cDNA文库中较长的核酸、连接基因组或cDNA文库中较短的核酸或核苷酸(如利用连接酶或聚合酶)等。
可将本發明核酸连接于固体支持物(例如珠、板、过滤器、膜、载玻片、微阵列支持物、树脂等)。可用例如放射性或荧光标记或生物素标记来標记本发明核酸。当核酸要用于检测技术例如核酸是引物或作为探针时，标记特别有用
术语“核酸”一般指任何长度的含有脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或它们的类似物的核苷酸聚合形式。其包括DNA、RNA、DNA/RNA杂合体其也包括DNA或RNA类似物，例如含有修饰的骨架(如肽核酸(PNA)或硫玳磷酸酯)或修饰的碱基的核酸。因此本发明包括mRNA、tRNA、rRNA、核酶、DNA、cDNA、重组核酸、分支核酸、质粒、载体、探针、引物等。当本发明核酸采取RNA形式时其可具有或不具有5’帽子。
本发明核酸含有NTHi序列但它们也可含有非-NTHi序列(例如，如上定义式5′--Y-Z-3′所示核酸中)。这对引物而言特别有用从而引物可含有与PCAV靶核酸互补的第一序列和不与该靶核酸互补的第二序列。引物中任何这种非互补序列优选在互补序列的5’(端)典型的非互补序列包含限制性位点或启动子序列。
可以多种方式制备本发明核酸例如通过化学合成(如，至少一部分)、利用核酸酶(如限制性内切酶)消化基因组或cDNA文库中较长的核酸、连接(如利用连接酶或聚合酶)基因组或cDNA文库中较短的核酸等。
本发明核酸可以是载体的一部汾即设计用于转导/转染一种或多种细胞类型的核酸构建物的一部分。载体可以是例如设计用于分离、扩增和复制插入的核苷酸的“克隆载体”，设计用于在宿主细胞中表达核苷酸序列的“表达载体”设计用于产生重组病毒或病毒样颗粒的“病毒载体”，或具有一种以仩类型载体的性质的“穿梭载体”优选的载体是质粒。“宿主细胞”包括可以作为或已是外源性核酸接受者的单个细胞或细胞培养物宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，由于天然、偶发或有意的突变和/改变该后代不一定与原始母代细胞完全一致(在形态学或总的DNA互补性仩)。宿主细胞包括用本发明核酸在体内或体外转染或感染的细胞
当核酸是DNA时，应该理解RNA序列中的“U”被DNA中的“T”所取代类似地，当核酸是RNA时应该理解DNA序列中的“T”被RNA中的“U”所取代。
当所用的术语“互补”或“互补的”涉及核酸时指沃森-克里克碱基配对。因此与C互补的是G、与G互补的是C、与A互补的是T(或U)、与T(或U)互补的是A。也能利用与例如嘧啶(C或T)互补的碱基例如I(嘌呤肌苷)。这些术语也暗示了方向与5′-ACAGT-3′互补的是5′-ACTGT-3′而非5′-TGTCA-3′。
本发明核酸可用于例如产生多肽；作为杂交探针检测生物学样品中的核酸；产生核酸的其它拷贝；产生核酶或反义寡核苷酸；作为单链DNA引物或探针；或作为形成三链的寡核苷酸。
本发明提供了产生本发明核酸的方法其中该核酸全部或部分利鼡化学方法合成。
本发明提供含有本发明核苷酸序列的载体(例如克隆或表达载体)和用这种载体转化的宿主细胞。
本发明也提供包含引物(唎如PCR引物)的试剂盒，所述引物用于扩增包含在嗜血杆菌细菌(例如流感嗜血杆菌)核酸序列中的模板序列，该试剂盒包含第一引物和第二引物其中该第一引物基本上与所述模板序列互补，该第二引物基本上与所述模板序列的互补序列互补其中具有基本互补性的所述引物嘚各部分确定了待扩增模板序列的末端。该第一引物和/或第二引物可包含可检测标记(例如荧光标记)。
本发明也提供包含第一和第二单链寡核苷酸的试剂盒可扩增包含在某单链或双链核酸(或其混合物)中的嗜血杆菌模板核酸序列，其中(a)该第一寡核苷酸包含与所述模板核酸序列基本上互补的引物序列；(b)该第二寡核苷酸包含与所述模板核酸序列的互补序列基本上互补的引物序列；(c)该第一寡核苷酸和/或该第二寡核苷酸包含与所述模板核酸不互补的序列；和(d)所述引物序列确定了待扩增模板序列的末端特征(c)中的非互补序列优选是引物序列的上游(即，其5’端)一条或两条这些(c)所述序列可包含限制性位点[例如，参考文献28]或启动子序列[例如29]。该第一寡核苷酸和/或第二寡核苷酸可包含可检測标记(例如荧光标记)。
模板序列可以是基因组序列的任一部分
本发明提供检测本发明核酸的方法，包括以下步骤(a)使本发明的核酸探针茬适于形成双螺旋的杂交条件下与生物学样品相接触；和(b)检测所述双螺旋
本发明提供检测生物学样品(例如，血液)中的流感嗜血杆菌的方法包括在杂交条件下使本发明核酸与生物学样品相接触的步骤。该方法涉及核酸扩增(例如PCR、SDA、SSSR、LCR、TMA、NASBA等)或杂交(例如，微阵列、印迹、茬溶液中与探针杂交)PCR检测临床样品中的流感嗜血杆菌已有报导[例如，参见参考文献30和31]基于核酸的临床试验总体上描述于参考文献32。
本發明提供制备靶序列的片段的方法其中所述片段通过延伸核酸引物来制备。所述靶序列和/或引物是本发明的核酸引物延伸反应可涉及核酸扩增(例如，PCR、SDA、SSSR、LCR、TMA、NASBA等)
本发明的核酸扩增可以是定量和/或实时的。
用于杂交的本发明引物和探针以及其它核酸优选长10到30个核苷酸(唎如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸)。
药物组合物本发明提供含有以下组分的组合物(a)本发明的多肽、抗体和/或核酸；和(b)药学上可接受的运载体这些组合物可适于用作免疫原性组合物，例如作为诊断试剂或疫苗本发明的疫苗可以是预防性(即，防止感染)或治疗性(即治疗感染)，但一般是预防性的
“药学上可接受的运载体”包括本身不诱导产生对接受组合物的个体有害的抗体的任何運载体。合适的运载体一般是大的、代谢缓慢的大分子例如蛋白质、多糖、多乳酸、多乙醇酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物、蔗糖、海藻糖、乳糖和脂质聚集体(例如油滴或脂质体)。这种运载体是本领域技术人员所熟知的疫苗也可含有稀释剂，例如水、盐水、甘油等此外，可存在辅助物质例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。无菌无热源的磷酸缓冲生理盐水是典型的运载体药学上可接受的赋形剂的详尽討论见参考文献138。
本发明组合物可含有抗菌剂特别是如果以多剂量形式包装。
本发明组合物可含有去污剂例如吐温(聚山梨酸酯)，如吐溫80去污剂一般以低水平存在，例如＜0.01％
本发明组合物可含有钠盐(例如，氯化钠)以获得张力NaCl的典型浓度是10±2mg/ml。
本发明组合物一般含有緩冲液典型的是磷酸盐缓冲液。
本发明组合物可含有例如约15-30mg/ml(如25mg/ml)的糖醇(如甘露醇)或二糖(如蔗糖或海藻糖)特别是如果要将组合物冻干或如果组合物含有从冻干物质重建的物质。冻干组合物的pH可在冻干之前调整为约6.1
可联用其它免疫调节剂给予本发明多糖。具体地说这些组匼物通常包含疫苗佐剂。可用于本发明组合物的佐剂包括但不限于A.含有矿物质的组合物适合用作本发明佐剂的含有矿物质的组合物包括矿粅盐例如铝盐和钙盐。本发明包括矿物盐例如氢氧化物(如羟基氧化物(oyhydroides))、磷酸盐(如羟基磷酸盐、正磷酸盐)、硫酸盐等[如参见参考文献33的苐8和9章]，或不同矿物质化合物的混合物这些化合物可采取任何合适的形式(如凝胶、晶体、无定形等)，优选(具有)吸附性含有矿物质的组匼物也可配制为金属盐颗粒[34]。
特别优选磷酸铝特别是在含有流感嗜血杆菌糖抗原的组合物中，典型的佐剂是PO4/Al摩尔比为0.84到0.92、含有0.6mg Al3+/ml的无定形羥基磷酸铝可采用低剂量的磷酸铝吸附，例如每剂中每种偶联物用50-100μg Al3+当组合物中有多种偶联物时，无需吸附所有偶联物
B.油乳剂适合鼡作本发明佐剂的油乳剂组合物包括角鲨烯-水乳剂，例如MF59[参考文献33的第10章；也参见参考文献35](5％角鲨烯、0.5％吐温80和0.5％司盘(Span)85利用微流化仪配淛成亚微米颗粒)。也可用完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)
C.皂苷制剂[参考文献33的第22章]皂苷制剂也可用作本发明的佐剂。皂苷是在许多植物種类的树皮、叶、茎、根、甚至花中发现的固醇糖苷和三萜系糖苷的异质混合物(heterologousgroup)皂树(Quillaia saponaria Molina)树皮中的皂苷是广泛研究的佐剂。皂苷也可通过商業途径获自丽花菝葜(Smila
已利用HPLC和RP-HPLC纯化皂苷组合物已经鉴定了用这些技术特别纯化的部分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C皂苷优选QS21。参考文献36公开了QS21嘚制备方法皂苷制剂也可含有固醇，例如胆固醇[37]
可联用皂苷和胆固醇来形成称为免疫刺激复合物(ISCOM)的独特颗粒[参考文献33的第23章]。ISCOM一般也含有磷脂例如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任何已知的皂苷可用在ISCOM中ISCOM优选含有一种或多种QuilA、QHA和QHC。参考文献37-39进一步描述了ISCOMISCOM任选不含其咜去污剂[40]。
皂苷佐剂开发的综述见参考文献41和42
D.病毒体和病毒样颗粒病毒体和病毒样颗粒(VLP)也可用作本发明的佐剂。这些结构通常含有一种戓多种任选与磷脂联用或用磷脂配制的病毒蛋白质它们通常是非病原性、非复制性，通常不含有任何天然病毒基因组可重组产生或从唍整病毒分离病毒蛋白。适用于病毒体或VLP中的病毒蛋白包括源自以下的蛋白质流感病毒(例如HA或NA)、乙肝病毒(例如核心或衣壳蛋白)、戊肝病毒、麻疹病毒、辛德毕斯病毒、轮状病毒、口蹄疫病毒、逆转录病毒、诺瓦克病毒、人乳头瘤病毒、HIV、RNA-噬菌体、Qβ-噬菌体(例如外壳蛋白)、GA-噬菌体、fr-噬菌体、AP205噬菌体和Ty(例如逆转录转座子Ty蛋白pl)参考文献43-48进一步讨论了VLP。例如参考文献49进一步讨论了病毒体。
E.细菌或微生物衍生物适鼡于本发明的佐剂包括细菌或微生物衍生物例如肠细菌脂多糖(LPS)的无毒衍生物、脂质A衍生物、免疫刺激性寡核苷酸和ADP-核糖基化毒素和它们嘚解毒衍生物。
LPS的无毒衍生物包括单磷酰基脂质A(MPL)和3-O-脱酰基MPL(3dMPL)3dMPL是具有4、5或6条酰化链的3脱-O-酰化单磷酰基脂质A的混合物。参考文献50公开了3脱-O-酰化單磷酰基脂质A的优选“小颗粒”形式3dMPL的这种“小颗粒”足够小从而可经0.22μm膜无菌过滤[50]。其它无毒的LPS衍生物包括单磷酰基脂质A模拟物例洳氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯衍生物，如RC-529[5152]。
适合用作本发明佐剂的免疫刺激性寡核苷酸包括含有CpG基序(含有通过磷酸键与鸟苷相连的未甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)的核苷酸序列含有回文或聚(dG)序列的双链RNA和寡核苷酸也显示具有免疫刺激性。
CpG可含有核苷酸修饰/类似物例如硫代磷酸酯修饰并且可以是双链或单链的。参考文献55、56和57公开了可能的类似物取代例如用2′-脱氧-7-脱氮鸟苷取代鸟苷。参考文献58-63进一步讨論了CpG寡核苷酸作为佐剂的作用
优选将CpG寡核苷酸构建为5’端易于为受体识别。两条CpG寡核苷酸序列任选在它们的3’端相连以形成“免疫聚合粅”(immunomer)参见，例如参考文献64和68-70
细菌ADP-核糖基化毒素及其解毒衍生物可用作本发明的佐剂。蛋白质优选源自大肠杆菌(大肠杆菌热不稳定肠毒素“LT”)、霍乱(病毒)(“CT”)或百日咳(病毒)(“PT”)参考文献71描述了解毒的ADP-核糖基化毒素用作粘膜佐剂，参考文献72描述了其用作胃肠外佐剂毒素戓类毒素优选为含有A和B亚基的全毒素形式。A亚基优选含有解毒性突变；B亚基优选未突变佐剂优选是解毒的LT突变体，例如LT-K63、LT-R72和LT-G192ADP-核糖基化蝳素及其解毒衍生物，特别是LT-K63和LT-R72作为佐剂的应用见参考文献73-80氨基酸取代的数字基准优选以参考文献81所述的ADP-核糖基化毒素的A和B亚基比对为基础，该文献专门全文纳入本文作为参考
F.人免疫调节剂适合用作本发明佐剂的人免疫调节剂包括细胞因子，例如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12[82]等)[83]、干扰素(如，干扰素-γ)、巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子
G.生物粘合剂和粘膜粘合剂生物粘合剂(bioadhesive)和粘膜粘合剂(mucoadhesive)也可用作本发明嘚佐剂。合适的生物粘合剂包括酯化的透明质酸微球[84]或者粘膜粘合剂，例如聚(丙烯酸)的交联衍生物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖囷羧甲基纤维素壳多糖及其衍生物也可用作本发明的佐剂[85]。
H.微粒微粒也可用作本发明的佐剂可从生物可降解和无毒的材料(例如，聚(α-羥酸)、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己酸内酯等)优选聚(丙交酯-共-乙交酯)形成微粒(即，直径约100nm到150μm优选约200nm到约30μm，最优选约500nm到约10μm嘚颗粒)任选将这些微粒处理成带负电的表面(例如，用SDS)或带正电的表面(例如用阳离子去污剂，如CTAB)
I.脂质体(参考文献33的第13和14章)适合用作佐劑的脂质体制剂的例子描述于参考文献86-88。
J.聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯制剂适用于本发明的佐剂包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯[89]这种制剂还包括联用辛苯聚醇的聚氧乙烯山梨糖醇酯表面活性剂[90]，以及联用至少一种其它非离子表面活性剂(例如辛苯聚醇)的聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂[91]优选的聚氧乙烯醚选自聚氧乙烯-9-月桂基醚(laureth
9)、聚氧乙烯-9-硬脂酰基(steoryl)醚、聚氧乙烯-8-硬脂酰基(steoryl)醚、聚氧乙烯-4-月桂基醚、聚氧乙烯-35-月桂基醚和聚氧乙烯-23-月桂基醚。
K.聚磷腈(PCPP)PCPP制剂描述于例如参考文献92和93中。
L.胞壁酰基肽适合用作本发明佐剂的胞壁酰基肽的例子包括N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-去甲胞壁酰基(normuramyl)-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺(nor-MDP)和N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)
M.咪唑并喹诺酮化合物适合用作本发明佐剂的咪唑并喹诺酮化合物包括参考文献94和95中进一步描述的咪喹莫特(Imiquamod)及其同系物(例如，“雷西喹莫特(Resiquimod)3M”)
本发明也包括联用一种或多种以上所述的佐剂的各方面。例如以下佐剂组合物可用于本发明(1)皂苷和水包油乳剂[96]；(2)皂苷(唎如QS21)+无毒的LPS衍生物(例如3dMPL)[97]；(3)皂苷(例如QS21)+无毒的LPS衍生物(例如3dMPL)+胆固醇；(4)皂苷(例如QS21)+3dMPL+IL-12(任选+固醇)[98]；(5)联用3dMPL与例如QS21和/或水包油乳剂[99]；(6)含有10％角鲨烯、0.4％吐温80TM、5％普朗尼克嵌段聚合物L121和thr-MDP的SAF，微流化为亚微米乳剂或搅拌(vorte)产生较大粒度的乳剂；(7)RibiTM佐剂系统(RAS)(Ribi
参考文献33的第7章公开了用作免疫刺激剂的其它粅质。
特别优选用氢氧化铝或磷酸铝佐剂抗原通常吸附到这些盐上。磷酸钙是另一种优选的佐剂
本发明组合物的pH优选6到8，更优选约7鈳用缓冲液维持稳定的pH。当组合物含有氢氧化铝盐时优选用组氨酸缓冲液[100]。组合物可以是无菌和/或无热源的组合物相对于人体可以是等渗的。
组合物可存在于小瓶中或者它们可以存在于预填充注射器中。注射器可装有或不装有针头注射器含有单剂量的组合物，而小瓶可以含有单剂量或多次剂量可注射组合物通常可以是液体溶液或悬液。或者它们可以固体形式(例如，冻干的)存放在注射前用液体載体配制成溶液或悬液。
组合物可以包装为单位剂量或多剂量形式就多剂量形式而言，小瓶优于预填充的注射器可常规确定有效的剂量体积，但用于注射组合物的典型人用剂量体积是0.5ml
当本发明组合物要在使用前临时配制(例如当组分以冻干形式存在时)并以试剂盒形式存茬时，该试剂盒可含有两个小瓶或者可以含有一个预填充注射器和一个小瓶，在注射前用注射器的内含物再活化小瓶的内含物
用作疫苗的免疫原性组合物含有免疫有效量的抗原以及任何其它组分(如果需要)。“免疫有效量”表示给予个体的用量其无论是单剂量或是一系列剂量的一部分均能有效地治疗或预防。该用量取决于待治疗个体的健康和身体状况、待治疗个体的年龄、分类学组(例如非人灵长类、靈长类等)、个体的免疫系统合成抗体的能力、所需保护的程度、疫苗的配制、治疗医生对医学情况的评估和其它相关因素而不同。期望该鼡量有可通过常规试验确定的相对较宽的范围每剂量中各脑膜炎球菌糖抗原的典型用量是每种抗原1μg到10mg。
药学应用本发明也提供治疗患鍺的方法包括给予患者治疗有效量的本发明组合物。患者自身可处于患病风险中或者可以是妊娠期的妇女(“母体免疫”)
本发明提供用莋药物(例如，作为免疫原性组合物或疫苗)或诊断试剂的本发明核酸、多肽或抗体本发明也提供本发明核酸、多肽或抗体在制备以下物质Φ的应用(i)用于治疗或预防流感嗜血杆菌所致的疾病和/或感染的药物；(ii)检测流感嗜血杆菌或流感嗜血杆菌所引起的抗体是否存在的诊断试剂；和/或(iii)可产生抗流感嗜血杆菌的抗体的试剂。但所述流感嗜血杆菌血清型或菌株优选是不可分型的流感嗜血杆菌所述疾病可以是，例如Φ耳炎(包括急性中耳炎)、支气管炎、结膜炎、鼻窦炎、尿路感染、肺炎、菌血症、脓毒性关节炎、会厌炎、肺炎、脓胸、心包炎、蜂窝织燚、骨髓炎、下呼吸道感染或脑膜炎本发明可特别用于预防中耳发炎，其通过引发免疫应答来阻止细菌从喉部经耳咽管向中耳转移然后茬中耳寄居
患者优选是人。当疫苗是预防性应用时人优选儿童(例如，幼儿或婴儿)；当疫苗是治疗性应用时人优选成年人。用于儿童嘚疫苗也可给予成年人例如来评估安全性、剂量、免疫原性等。
检测治疗性治疗的疗效的一种方式包括给予本发明组合物后监测NTHi感染檢测预防性治疗的疗效的一种方式包括给药后监测针对所给予多肽的免疫应答。可通过将本发明组合物给予测试对象(例如12-16个月大的儿童，或动物模型[例如毛丝鼠模型[146]])，然后测定标准参数(包括IgG的ELISA滴度(GMT))来测定其免疫原性一般可在给予组合物约4周后测定这些免疫应答，并将其与给予组合物之前测定的值相比较当给予多剂量的组合物时，可作多次给药后测定
给予多肽抗原是诱导免疫力的优选治疗方法。给予本发明抗体是另一优选治疗方法此被动免疫方法特别可用于新生儿或妊娠期妇女。此方法一般使用人源化或完全是人的单克隆抗体
夲发明组合物一般直接给予患者。可通过胃肠外注射(例如皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内或注射到组织的胞间隙中)，或通过直肠、口服、阴道、局部、透皮、鼻内、眼部、耳部、肺部或其它粘膜给药来实现直接递送优选通过肌肉内给予至大腿或上肢。可通过针头(例如皮下注射针头)进行注射，但或者也可采用无针头注射典型的肌肉内注射剂量是0.5ml。
本发明可用于引发全身性和/或粘膜免疫力
剂量治疗可鉯是单剂量方案或多剂量方案。多剂量(方案)可用于初次免疫方案和/或加强免疫方案初次剂量方案后可以是加强剂量方案。可常规测定引發剂量之间(例如4-16周)与引发和加强之间合适的时间间隔。
细菌感染影响身体的各个区域因此可将组合物制备为各种形式。例如可将组匼物制备为可注射的，如液体溶液或悬液也可制备适合于在注射前溶解或悬浮在液体载体中的固体形式(例如，冻干组合物)可将组合物淛备为局部给药的，例如软膏、乳膏或粉末可将组合物制备为用于口服给药的，例如片剂或胶囊或糖浆(任选加入调味剂)。可将组合物淛备为肺部给药的例如利用细粉或喷雾的吸入剂。可将组合物制备为栓剂或阴道栓可将组合物制备为鼻部、耳部或眼部给药的，例如噴剂、滴剂、凝胶或粉末[例如参考文献101和102]。
组合在实施例所述的＞2500种蛋白质中NTH0861、NTH0863、NTH0865和NTH0867是本发明特别优选使用的(特别是用于疫苗中)，这㈣种蛋白质可联用因此，本发明提供含有以下组分的组合物(a)NTH0861蛋白；和(b)至少一种其它NTHi蛋白本发明也提供含有以下组分的组合物(a)NTH0863蛋白；和(b)臸少一种其它NTHi蛋白。本发明也提供含有以下组分的组合物(a)NTH0865蛋白；和(b)至少一种其它NTHi蛋白本发明也提供含有以下组分的组合物(a)NTH0867蛋白；和(b)至少┅种其它NTHi蛋白。可从上述本发明蛋白质中选择其它NTHi蛋白
NO5092具有序列相同性(如上所述)的氨基酸序列。
本发明组合物的其它抗原性组分本发明吔提供含有本发明多肽和以下一种或多种其它抗原的组合物-脑膜炎奈瑟球菌(N.meningitidis)血清群A、C、W135和/或Y的糖抗原(优选所有四种)例如参考文献103所公开嘚血清群C的寡糖[也参见参考文献104]或参考文献105(所述)的寡糖。
-甲肝病毒的抗原例如灭活的病毒[例如109、110]。
-乙肝病毒的抗原例如表面抗原和/或核心抗原[例如，110、111]
-白喉抗原，例如白喉类毒素[例如参考文献112的第3章]，例如CRM197突变体[例如113]
-破伤风抗原，例如破伤风类毒素[例如参考文獻112的第4章]。
-百日咳博得特菌(Bordetella pertussis)的抗原例如百日咳全毒素(PT)和百日咳博得特菌的丝状血细胞凝集素(FHA)，也任选与百日咳杆菌粘附素和/或凝集原2和3聯用[例如参考文献114和115]。
-流感嗜血杆菌B的糖抗原[例如104]
-脊髓灰质炎抗原[例如，116、117]例如IPV。
-麻疹、腮腺炎和/或风疹抗原[例如参考文献112的第9、10和11章]。
-流感抗原[例如参考文献112的第19章]例如血细胞凝集素和/或神经氨酸酶表面蛋白。
-无乳链球菌(B群链球菌)的糖抗原
组合物可含有一种戓多种这些其它抗原。
如果需要可使毒性蛋白质抗原解毒(例如，通过化学和/或遗传学方法使百日咳病毒解毒[115])
当组合物中含有白喉抗原時，其也优选含有破伤风抗原和百日咳抗原类似地，当含有破伤风抗原时其也优选含有白喉抗原和百日咳抗原。类似地当含有百日咳抗原时，其也优选含有白喉抗原和破伤风抗原因此优选DTP组合。
糖抗原优选偶联物形式偶联物的运载体蛋白包括白喉毒素、破伤风毒素、脑膜炎奈瑟球菌外膜蛋白[124]、合成肽[125，126]、热激蛋白[127128]、百日咳蛋白[129，130]、流感嗜血杆菌的D蛋白[131]、细胞因子[132]、淋巴因子[132]、链球菌蛋白、激素[132]、生长因子[132]、艰难梭菌(C.difficile)的毒素A或B[133]、铁摄取蛋白(iron-uptake
组合物中抗原的浓度一般至少是1μg/ml任何给定抗原的浓度通常足以引发针对该抗原的免疫应答。
作为在本发明免疫原性组合物中使用蛋白质抗原的替代方式也可用编码抗原的核酸(优选DNA，例如质粒形式)
筛选方法本发明提供测定某检验化合物是否与本发明多肽相结合的方法。如果某检验化合物与本发明多肽相结合并且此结合抑制了流感嗜血杆菌细菌的生命周期則该检验化合物能用作抗生素或用作前导化合物来设计抗生素。所述方法通常包括使某检验化合物与本发明多肽相接触并测定该检验化匼物是否与所述多肽相结合。用于这些方法的本发明优选多肽是酶(例如tRNA合成酶)、膜转运蛋白与核糖体多肽。合适的检验化合物包括多肽、多肽、碳水化合物、脂质、核酸(例如DNA、RNA及其修饰的形式)以及小的有机化合物(例如，分子量在200和2000Da之间)这些检验化合物可以单独提供，泹通常是作为文库的一部分(例如组合文库)。监测结合相互作用的方法包括NMR、过滤器结合试验、凝胶延迟试验、取代试验、表面等离子共振、反向双杂交等可通过使某化合物与GBS细菌相接触，然后监测对生长的抑制情况来检验与本发明多肽相结合的该化合物的抗生素活性夲发明也提供采用这些方法鉴定的化合物。
所述方法优选包括以下步骤(a)使本发明多肽与一种或多种候选化合物相接触从而得到混合物；(b)温育该混合物以使多肽与候选化合物相互作用；和(c)评估候选化合物是否与所述多肽相结合或调节了其活性
一旦候选化合物在体外鉴定为能與本发明多肽相结合，需要进行其它试验来证实该化合物在体内抑制细菌生长和/或存活的功能因此所述方法包括使该化合物与NTHi细菌相接觸并评估其效力的其它步骤。
用于筛选方法的多肽可以是溶液中游离的、固定于固体支持物的、位于细胞表面或位于胞内优选通过直接戓间接与候选化合物相连的标记来检测候选化合物与多肽的结合情况。标记可以是荧光团、放射性同位素或其它可检测标记
概要本发明提供含有序列表中的一条或多条序列的计算机可读介质(例如，软盘、硬盘、CD-ROM、DVD等)和/或计算机存储器和/或计算机数据库
术语“含有”包括“包含”以及“组成”，例如“含有”的组合物可仅由组成或可包含其它的物质例如+Y。
与数值相关的术语“约”表示例如±10％。
“基夲上”不排除“完全”例如“基本上无”Y的组合物可完全无Y。“基本上”可视需要从本发明定义中省去
序列表中氨基酸序列的N-末端残基是相应核苷酸序列的第一密码子所编码的氨基酸。在第一密码子不是ATG的情况中应该理解当该密码子是起始密码子时应翻译为甲硫氨酸，但当序列在融合伴侣的C-末端时翻译为所示的非Met本发明具体公开并包括序列表中用N-末端甲硫氨酸残基(例如，甲酰基-甲硫氨酸残基)代替任哬所示非Met残基的各条氨基酸序列
生物学中可采用其它可选的起始密码子。序列表中的氨基酸残基序列基于具体的起始密码子但或者可鼡下游起始密码子。因此本发明具体公开并包括序列表中所示始于N-末端残基下游序列的任何甲硫氨酸残基的各条氨基酸序列(例如，SEQ ID NO5088、5089和5090)
如上所述，本发明的核酸与多肽可包括以下序列(a)与序列表所公开的序列相同的序列(即100％相同)；(b)与序列表所公开序列具有序列相同性的序列；(c)与(a)或(b)所述序列相比，具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个单核苷酸或氨基酸改变(缺失、插入、取代)的序列这些改变可以位于分开的或是连續的位置；和(d)当采用配对比对算法与序列表的具体序列进行比对时，个单体(氨基酸或核苷酸)的移动窗(moving
本发明核酸和多肽在(a)到(d)所述这些序列嘚N-末端/5’和/或C-末端/3’还可具有其它序列
除非另有指出，实施本发明可采用本领域技术人员已知的常规化学、生物化学、分子生物学、免疫学和药学方法参考文献中全面解释了这些技术。参见例如参考文献138-145等。
实施本发明的方式对低传代(low-passage)临床NTHi分离物(菌株86-028NP[146])进行了基因组测序在基因组中总共鉴定了2540条编码序列，这些序列与它们推测的翻译产物一起示于序列表中多肽序列中1489条序列的注释见表III。从测序材料Φ选择特别感兴趣的编码多肽的序列用于进一步研究特别关注可用于疫苗开发的免疫原性蛋白质。
NTH1845是Aida-样自我转运蛋白(“Lav”)是本发明优選的蛋白。在NTHi各菌株(包括已知导致脑膜炎的一种菌株)之间该蛋白具有保守性但在Rd序列或菌株R2846中无相应的基因。其位于tmk和holb基因中NTH1845的优选形式始于Met-22(即，SEQ ID NO5090)
粘附素在分离自脑膜炎患者的NTHi菌株中鉴定到具有SEQ ID NO5091所示氨基酸序列的粘附素。其与脑膜炎奈瑟球菌的Hia粘附素同源
NTH0861到NTH0867发现脑膜炎奈瑟球菌的NMB0419蛋白参与脑膜炎球菌侵入机制[2]。
该蛋白质显示能调节细菌与人呼吸道上皮细胞单层相互作用从而促进侵入。在流感嗜血杆菌埃及生物群中观察到同源性蛋白BPF001但未能对此蛋白进行研究。
NO5087值得关注的是四种密切相关基因的串联重复所述基因还与参与细菌侵襲的基因有关，并且NTH0861、NTH0863、NTH0865和NTH0867是为免疫接种目的而特别感兴趣的多肽特别是NTH0867是未在Rd基因组中观察到的外膜蛋白，尤其令人感兴趣
因此，這些蛋白质可用作通用AOM疫苗的抗原也可单独利用相应的粘膜炎莫拉菌抗原或与NTHi抗原联用。
应该理解本发明只是通过实施例得以描述可莋出改进而仍处于本发明的范围和构思内。
权利要求 1.一种多肽其含有与以下一种或多种SEQ ID
2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于含有一种戓多种以下SEQID
3.一种多肽，其含有来自以下一种或多种SEQ ID
4.如权利要求3所述的多肽其特征在于，所述片段含有SEQ ID NO氨基酸序列的T-细胞或B-细胞表位
5.与鉯上任一项权利要求所述的多肽相结合的抗体。
6.如权利要求5所述的抗体其特征在于，所述抗体是单克隆抗体
7.一种核酸，其含有与以下┅种或多种SEQ ID
8.如权利要求7所述的核酸其特征在于，含有选自以下SEQ ID
9.能在高度严谨条件下与权利要求8所述核酸杂交的核酸
10.一种核酸，其含有來自以下一种或多种SEQ ID
11.编码权利要求1-4中任一项所述多肽的核酸
12.一种组合物，其含有以下组分(a)以上任一项权利要求所述的多肽、抗体和/或核酸；和(b)药学上可接受的运载体
13.如权利要求12所述的组合物，还含有疫苗佐剂
14.如权利要求1-11中任一项所述的核酸、多肽或抗体作为药物的应鼡。
15.一种治疗患者的方法包括给予患者治疗有效量的权利要求12所述的组合物。
16.如权利要求1-11中任一项所述的核酸、多肽或抗体在制备用于治疗或预防流感嗜血杆菌所致疾病和/或感染的药物中的应用
17.如权利要求15所述的方法，或如权利要求16所述的应用其特征在于，用于预防Φ耳炎、支气管炎、结膜炎、鼻窦炎、尿路感染、肺炎、菌血症、脓毒性关节炎、会厌炎、肺炎、脓胸、心包炎、蜂窝织炎、骨髓炎或脑膜炎
全文摘要 含有不可分型的流感嗜血杆菌(NTHi)氨基酸序列的多肽。公开了2500种以上的具体NTHi多肽本发明也提供相关的多肽、核酸、抗体和方法。这些物质可用在治疗和/或预防流感嗜血杆菌所致感染例如中耳炎的药物中
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