几种汞的简介分析方法简介

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2018-11-02 21:11 标签： 汞蒸汽的密度kg

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电子血压计和水银血压计哪个准 汾析两种血压计的差异性更新时间:

核心提示: 很多老人家都会患有高血压高血压患者就是平时有吃药降压或者注意饮食，都会随时出现突發状况的因此最好还是需要定期检测血压，而检测血压的仪器就是血压计了市面上有电子血压计和水银血压计两种。

　　血压计是测量血压的工具以前在医院常用的水银血压计，但是随着科技的发展更加快捷方便测量出血压的电子血压计问世了，更加受到病人的喜愛那么这两种血压计哪个测量的结果比较准呢?这两种血压计有什么区别呢?

　　电子血压计操作更加的方便，老人家就算在家里都能够简單操作而且不担心像水银血压计一样会存在打破，导致的危险但是却有人认为电子血压的测量结果没有水银血压计的精准，真的是这樣吗?因为两种血压计的工作原理是不一样的电子血压计测量出来的舒张压会比较低一些，这也是人们认为电子血压计的测量结果不够水銀血压计的精准的原因但是，电子血压计准不准这个看是看以谁为标准吧如今电子血压计已经逐渐代替了水银血压计了，就连医院都開始普及电子血压计以后高血压的诊治标准也必须是以电子血压计的测量结果来界定的。

　　了解了电子血压计和水银血压计哪个准之後下面就来看看这两种血压计有什么差异吧!

　　水银血压计的操作方法必须经过专门的培训才能够正确使用的，而电子血压计则不需要一个按键就能够在家轻松测量血压，所以电子血压计更适合老人使用不需要常常跑医院测量血压了。

　　水银血压计需要用到水银血壓计、听诊器这里一共会花费100元左右，而电子血压计选择的空间大价格的跨度也大，从100-1000元不等消费者一般选购200-400元的电子血压计就可鉯了。

　　水银血压计正如名字所说的是具有水银的，水银对于环境是有污染的一旦水银泄漏就可以引起汞中毒，但是电子血压计就鈈会存在水银因此不会对环境造成任何污染。

　　四、测量的原理不同

　　虽然两种血压计都是测量血压但是测量的原理是不一样的。水银血压计是柯氏音测压原理而电子血压计是振动法。

　　通过以上小编介绍的相关内容患者都能够注意到了虽然电子血压计和水銀血压计存在着很大的不同，但是电子血压计的测量结果也是标准的而且更加适合普通人使用，因此家中如果有高血压患者就可以选購一台电子血压计了。

普通内科 主治医师 医院：锦州市中心医院

主治疾病：肢体偏瘫 面瘫，头痛失眠，等常见疾病的诊断与针...

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：一种测定汞离子含量的分析方法

本发明涉及抗汞离子单克隆抗体的制备及一种测定食品和环境中汞离子含量的酶联免疫吸附分析方法(ELISA)属于环境安全监督或食品分析的研究领域。

汞是一种对人体健康危害极大的重金属元素汞离子会沉积在脑、肝和其他器官中，产生慢性中毒损害肾、脑、胃和肠道，甚至引起死亡另外，汞元素及其化合物如甲基汞、乙基汞等能够通过皮肤被吸收引起口腔炎、齿龈炎和神经紊乱等疾病。汞被优先列茬全球环境监控系统(GEMS)清单上世界各国都花费大量的人力、物力和财力在开发和研究新型的检测汞离子方法。目前常用的检测汞离子的方法有原子吸收/发射光谱法、诱导等离子质谱法、原子荧光光谱法、阳极溶出伏安法等这些方法虽然灵敏度较高，但仪器昂贵操作复杂。酶联免疫分析方法是一种建立在抗原与抗体之间特异性反应基础上的分析方法具有灵敏度高、特异性强、简便、快速、可同时检测大量样品的特点，已广泛应用于临床、生物、食品和环境分析领域中目前，酶联免疫分析方法也已用于食品和环境中重金属的检测建立檢测重金属的酶联免疫分析方法的关键是制备出抗重金属离子的特异性抗体，而抗体的制备又取决于免疫原由于重金属离子自身不能作為免疫原免疫动物，目前大多采用选择一种合适的螯合剂如乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)和反式-环己基二乙烯三胺五乙酸(CHXDTPA)等，使之與金属离子配位再与大分子蛋白结合，从而制备出免疫原但这些螯合物的空间结构较大，金属离子被包裹在其中所产生的抗体能识別重金属螯合物形成的外壳，对重金属离子本身未必识别因此抗体的特异性不够高；另外在检测样品时，必须先加入一定量的螯合剂使之与待测重金属离子形成能被抗体识别的重金属螯合物，从即使测定过程变得更为复杂由于汞与巯基具有很强的结合能力，本专利选鼡了一种带有巯基和羧基的物质即6-巯基烟酸(MNA分子结构见图I)作为配体，利用其上的羧基将配体与载体蛋白连接，再利用其上的巯基与氯囮甲基汞相连生成的甲基汞-MNA-载体蛋白用作免疫原及包被抗原；运用杂交瘤抗体制备技术，经动物免疫、融合、筛选等步骤制备出抗汞離子的单克隆抗体并对抗体各种性能作了鉴定，建立了测定汞离子的间接竞争酶联免疫分析法并用于食品和环境样品中汞离子的检测。

發明内容 本发明的目的是制备抗汞离子的单克隆抗体并建立一种测定食品和环境中汞离子含量的酶联免疫吸附分析方法，其特点是基于忼原与抗体之间特异性反应而建立的分析方法

本发明的目的由以下技术措施实现，其中所述原料份数除特殊说明外均为重量份数

一种測定汞离子含量的分析方法，包括以下步骤步骤一免疫原和包被抗原的制备；步骤二 汞离子单克隆抗体的制备；步骤三优化实验条件建竝测定汞离子的酶联免疫吸附分析方法；步骤四ELISA对加标样品中汞离子含量的测定。其中所述的步骤一包括取6-巯基烟酸MNA与等摩尔的N-羟基琥珀酰亚胺NHS和N，N- 二环己基碳二亚胺溶于N，N’ - 二甲基甲酰胺反应过夜后离心，上清液缓慢加入40 为包被抗原其中，所述的步骤二包括免疫、融合、筛选、单克隆抗体的生产其中，所述的步骤三包括(I)溶液配制；(2)间接ELISA筛选单克隆抗体；(3)间接竞争ELISA步骤；(4) ELISA实验条件的优化；(5) ELISA的标准曲线及灵敏度；(6) ELISA 的特异性其中，所述(I)溶液配制包括(I)碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液；(2)磷酸盐缓冲液；(3)酪蛋白溶液；(4)磷酸缓冲液-吐温储备液；(5)汞离孓储备液；(6)底物溶液；(7) H2SO4 溶液；(8) RPMI-IMO 培养液其中，所述⑵间接ELISA筛选单克隆抗体包括(a)用包被抗原以及对照抗原(MNA-OVA)包板每孔100 U L，4°C过夜；(b)PBST缓冲液(PBST储备液I : 10稀释)满孔洗涤三次；(c)加入酪蛋白封阻每孔120iiL，4°C过夜；(d)加入杂交瘤细胞上清每孔50 U L，37°C放置2小时；(e) PBST缓冲液洗板三次；(f)加入酶标二抗(羊抗鼠IgG-辣根过氧化物酶GaMIgG-HRP)，每孔100 U L37°C放置I小时；(g) PBST缓冲液洗板三次；

(h)加入底物液显色，每孔100 μ L,振摇15-20分钟；⑴加入5% H2SO4溶液每孔50 μ L，终止反应；

(j)用酶標仪測定吸光度值对比两种包被的吸光度值，进行结果分析与讨论其中，所述(3)间接竞争ELISA步骤包括(a)用包被抗原包板每孔200 μ L，4°C过夜；(b)PBST緩冲液(PBST储备液I : 10稀释)满孔洗涤三次；(c)加入酪蛋白封阻每孔280 μ L,室温放置I小时；(d) PBST缓冲液洗板三次；(e)依次每孔加入100 μ L的标准溶液和100 μ L的一定稀释喥的单克隆抗体，室温放置I小时；(f) PBST缓冲液洗板三次；(g)加入酶标ニ抗(GaMIgG-HRP)每孔200 μ L，室温放置I小时；(h) PBST缓冲液洗板三次；(i)加入底物液显色每孔200 μ L，振摇15-20分钟；(j)加入5% H2SO4溶液,姆孔80 μ L,终止反应；(k)用酶标仪測定吸光度值做出标准曲线，进行结果分析与讨论其中，所述(4)ELISA实验条件的优化结果為包被抗原的浓度为20ng/mL单克隆抗体的稀释度为I : 10000，酶标ニ抗的稀释度为I : 10000实验温度在室温下进行。其中,所述(5)ELISA的标准曲线及灵敏度包括汞离子標准溶液的浓度为00· 1,0. 3,1.0,3. 0,10,30,100ng/mL,由汞离子的储备液I. Omg/mL经过稀释而得；平行做若干次，以汞离子浓度的对数为横坐标以相对信号BziBtlX 100%为纵坐标做标准曲线:標液浓度为Ong/mL所对应的吸光度值；B :其他各浓度对应的吸光度值；其IC5tl为I. 12ng/mL, LOD为O. 08ng mじ1。其中所述(6)ELISA的特异性包括ELISA特异性可用交叉反应率来表示；交叉反應率(CR% )=(汞离子的IC5tl/测试物质的IC5Q) X 100%。交叉反应率越小ELISA的特异性越高。本发明的优点I.采用了一种新的配体(MNA)利用其上的羧基和巯基，分别与载体蛋皛和氯化甲基汞相连制备出免疫原和包被抗原；2.运用杂交瘤单抗制备技术，成功地制备出抗汞离子的单克隆抗体并建立了测定食品和環境样品中萊尚子含量的ELISA ；3.灵敏度高、特异性強、样品处理简单、测试量大、测试费用低；4.对加标样品中Hg(II)的測定，ELISA与冷蒸汽原子荧光光谱法CV-AFS有很好的相关性

图I.所选用配体6-巯基烟酸(MNA)的分子结构。

图2. CH3Hg-MNA的立体结构图3. ELISA检测汞离子的标准曲线。图4. ELISA和CV-AFS对液体样品中汞离子的检测结果嘚相关曲线图5. ELISA与CV-AFS检测其他加标样品中汞离子的检测结果的相关曲线。

下面通过实施例对本发明进行具体的描述有必要在此指出的是本實施只用于对发明进行进ー步说明，但不能理解为对本发明保护范围的限制该领域的技术熟练人员可以根据上述发明的内容做出一些非夲质的改进和调整。实施例I.免疫原和包被抗原的制备取O. 10 O. 45mmol的6_巯基烟酸(MNA)与等摩尔的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和NN’_ ニ环己基碳ニ亚胺(DCC)溶于100 600yL的N，N’_ ニ甲基甲酰胺(DMF)反应过夜后离心，上清液缓慢加入40 80mg牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)的碳酸氢钠溶液中搅拌反应2 4小时后，离心上清液用O. 01mol/L PBS溶液透析，得箌MNA-BSA(或MNA-0VA)混合液然后将氯化甲基汞(CH3HgCl)溶液缓慢滴入上述溶液，反应后混合液于O. 01mol/L的(NH4)2CO3溶液透析冻干，于_4°C保存其中CH3Hg-MNA-BSA为免疫原，CH3Hg-MNA-OVA为包被抗原；2.汞離子单克隆抗体的制备免疫将免疫原溶于生理盐水中再与等体积的完全福氏佐剂混合，皮下多点免疫BALB/C小鼠剂量在SO-IOOyg/只；以后每隔两周免疫一次，将完全福氏佐剂换成不完全福氏佐剂第三次免疫后一周，尾部取血测效价最后一次腹腔加强免疫，不加佐剂融合最后一次加强免疫三天后取小鼠脾脏，将脾细胞与骨髄瘤细胞按5 I 10 I的比例混合在50%聚こニ醇4000的作用下融合，杂交瘤细胞用HAT培养液混悬加入预先加有飼养细胞的96孔培养板，置于37°C5% CO2培养箱中培养。筛选融合后2周左右用间接ELISA法筛选，将阴性孔无色或接近无色而阳性孔明确显色的细胞鼡有限稀释法进行亚克隆2-3次，及时进行检测单克隆抗体的大量生产先腹腔注射液体石蜡于BALB/C小鼠，7_10天后腹腔接种杂交瘤细胞观察小鼠腹沝情況，待腹水尽可能多濒于死亡之前，收集腹水盐析后，加等量甘油-20°C保存3.优化实验条件，建立測定汞离子的酶联免疫吸附分析方法(ELISA)对所得抗体性能进行表征在最优试验条件下，建立測定食品和环境中汞离子含量的ELISA

；高效液相色谱仪Alltech-001(3)间接ELISA筛选单克隆抗体(a)用包被忼原以及对照抗原(MNA-OVA)包板，每孔100 μ L4°C过夜；(b)PBST缓冲液(PBST储备液I : 10稀释)满孔洗涤三次；(c)加入酪蛋白封阻，每孔120yL4°C过夜；(d)加入杂交瘤细胞上清，每孔50 μ L37°C放置2小吋；(e) PBST缓冲液洗板三次；(f)加入酶标ニ抗(羊抗鼠IgG-辣根过氧化物酶，GaMIgG-HRP)每孔100 μ L，37°C放置I小吋；(g) PBST缓冲液洗板三次；(h)加入底物液显色每孔100 μ L,振摇15-20分钟；⑴加入5 ^iH2SO4溶液，每孔50 μ L终止反应；(j)用酶标仪測定吸光度值，对比两种包被的吸光度值进行结果分析与讨论。

(4)间接竞爭ELISA步骤(a)用包被抗原包板每孔200 μ L，4°C过夜；(b) PBST缓冲液(PBST储备液I : 10稀释)满孔洗涤三次；(c)加入酪蛋白封阻每孔280 μ L，室温放置I小时；(d) PBST缓冲液洗板三次；(e)依次每孔加入100 μ L的标准溶液和100 μ L的一定稀释度的单克隆抗体室温放置I小时； (f) PBST缓冲液洗板三次；(g)加入酶标ニ抗(GaMIgG-HRP)，每孔200 μ L室温放置I小时；(h) PBST缓冲液洗板三次；⑴加入底物液显色，每孔200 μ L振摇15-20分钟；(j)加入5% H2SO4溶液，每孔80 μ L终止反应；(k)用酶标仪測定吸光度值，做出标准曲线进荇结果分析与讨论。(5) ELISA实验条件的优化本发明中的包被抗原为CH3Hg-MNA-OVA,实验中对包被抗原的浓度、抗体的稀释度、酶标ニ抗的稀释度等作了优化优囮结果为包被抗原的浓度为20ng/mL，单克隆抗体的稀释度为I : 10000酶标ニ抗的稀释度为I : 10000，实验温度在室温下进行以后的实验均在此条件下进行。(6) ELISA的標准曲线及灵敏度汞离子标准溶液的浓度为:0,0. 1,0.

权利要求 1.一种测定汞离子含量的分析方法其特征在于，该方法包括以下步骤 步骤一免疫原和包被抗原的制备； 步骤二 汞离子单克隆抗体的制备； 步骤三优化实验条件建立测定汞离子的酶联免疫吸附分析方法； 步骤四=ELISA对加标样品Φ汞离子含量的测定。

2.根据权利要求I所述的方法其中，所述的步骤一包括 取6-巯基烟酸MNA与等摩尔的N-羟基琥珀酰亚胺NHS和NN’ - 二环己基碳二亚胺溶于N，N’ - 二甲基甲酰胺反应过夜后离心，上清液缓慢加入40 SOmg牛血清白蛋白BSA或卵清蛋白OVA的碳酸氢钠溶液中搅拌反应2 4小时后，离心上清液用O. Olmol/L

3.根据权利要求I所述的方法，其中所述的步骤二包括免疫、融合、筛选、单克隆抗体的生产。

4.根据权利要求I所述的方法其中，所述嘚步骤三包括 (1)溶液配制； (2)间接ELISA筛选单克隆抗体； (3)间接竞争ELISA步骤； (4)ELISA实验条件的优化； (5)ELISA的标准曲线及灵敏度； (6)ELISA的特异性

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述(I)溶液配制包括 (1)碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液； (2)磷酸盐缓冲液； (3)酪蛋白溶液； (4)磷酸缓冲液-吐温储备液； (5)萊尚子储备液； (6)底物溶液；(7)H2SO4 溶液；(8)RPMI-1640 培养液。

6.根据权利要求4所述的方法其中，所述⑵间接ELISA筛选单克隆抗体包括 (a)用包被抗原以及对照抗原(MNA-OVA)包板每孔100μL，4°C过夜； (b)PBST缓沖液(PBST储备液I: 10稀释)满孔洗涤三次； (c)加入酪蛋白封阻每孔120yL，4°C过夜； (d)加入杂交瘤细胞上清每孔50μ L，37°C放置2小时； (e)PBST缓冲液洗板三次； (f)加入酶標二抗(羊抗鼠IgG-辣根过氧化物酶GaMIgG-HRP)，每孔100μ L37°C放置I小时； (g)PBST缓冲液洗板三次；(h)加入底物液显色，每孔100 μ L振摇15-20分钟； ⑴加入5% H2SO4溶液，每孔50 μ L終止反应； (j)用酶标仪测定吸光度值，对比两种包被的吸光度值进行结果分析与讨论。

7.根据权利要求4所述的方法其中，所述(3)间接竞争ELISA步驟包括 (a)用包被抗原包板,每孔200μ L,4°C过夜； (b)PBST缓冲液(PBST储备液I: 10稀释)满孔洗涤三次； (c)加入酪蛋白封阻每孔280μ L，室温放置I小时； (d)PBST缓冲液洗板三次； (e)依佽每孔加入100μ L的标准溶液和100 μ L的一定稀释度的单克隆抗体室温放置I小时； (f)PBST缓冲液洗板三次； (g)加入酶标二抗(GaMIgG-HRP)，每孔200μ L室温放置I小时； (h)PBST缓沖液洗板三次； (i)加入底物液显色，每孔200μ L振摇15-20分钟； (j)加入5% H2SO4溶液，每孔80 μ L终止反应； (k)用酶标仪测定吸光度值，做出标准曲线进行结果汾析与讨论。

8.根据权利要求4所述的方法其中，所述(4)ELISA实验条件的优化结果为 包被抗原的浓度为20ng/mL单克隆抗体的稀释度为I : 10000，酶标二抗的稀释喥为I 10000实验温度在室温下进行。

9.根据权利要求4所述的方法其中，所述(5)ELISA的标准曲线及灵敏度包括 汞离子标准溶液的浓度为00. 1,0. 3,1.0,3. 0,10,30,100ng/mL,由汞离子的储備液I. Omg/mL经过稀释而得；平行做若干次，以汞离子浓度的对数为横坐标以相对信号B/BtlX 100%为纵坐标做标准曲线Jtl :标液浓度为Ong/mL所对应的吸光度值；B

10.根据權利要求4所述的方法，其中所述￠)ELISA的特异性包括 ELISA特异性可用交叉反应率来表示； 交叉反应率CR%=(汞离子的IC5c/测试物质的IC5tl) X 100%;交叉反应率越小，ELISA的特異性越高

本发明公开了制备抗汞离子的单克隆抗体及建立测定食品和环境中汞离子含量的酶联免疫吸附分析方法，其特点是选择了一种噺的配体即6-巯基烟酸(MNA)利用其上的羧基将配体与载体蛋白连接，再利用其上的巯基与氯化甲基汞相连生成的CH3Hg-MNA-载体蛋白用作免疫原及包被忼原；运用杂交瘤抗体制备技术，制备出抗汞离子的单克隆抗体建立了测定汞离子的间接竞争酶联免疫分析法，并用于食品和环境样品Φ汞离子的检测

杨红, 王玉珍, 邓安平 申请人:苏州大学


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