单独把不含载体的几个外源基因注入细胞核的载体会发生同源重组吗

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【摘要】：为了探索基因敲除猪嘚生产方法,本研究采用同源重组技术和体细胞核的载体移植技术相结合的方法,生产肌肉生长抑制素(MSTN)基因敲除猪和α1,3半乳糖基转移酶(GGTA1)基因敲除猪,为猪转基因育种和人类异种器官移植研究提供基础资料结果如下: 1.生产MSTN基因敲除猪。采用正负筛选打靶载体pLOXP -MSTN -KO通过同源重组敲除大白猪胎儿成纤维细胞MSTN基因的第3外显子以打靶阳性细胞克隆为供体细胞进行核移植,克隆胚胎经融合激活后进行体外培养。1-细胞期和2-4细胞期MSTN~(+/-)克隆胚胎分别移植10头和5头受体母猪,35d B-超妊娠检测移植1-细胞期克隆胚胎的受体母猪有7头妊娠,妊娠率为70%,移植2-4细胞期克隆胚胎有2头妊娠,妊娠率为40%妊娠足月后分别产仔27头和4头,Southern杂交鉴定均为MSTN单等位基因敲除猪,基因敲除体细胞的克隆效率分别为1.0%和0.4%。胚胎移植结果表明,1-细胞期克隆胚胎有利于受體母猪妊娠,同时可提高克隆效率季节影响基因敲除克隆仔猪的出生成活率。春季移植夏季出生克隆仔猪16头,8月龄时存活12头,成活率为75%夏季迻植秋季出生克隆仔猪15头,8月龄时存活5头,成活率为33%,表明夏季有利于克隆仔猪的出生成活。 基因敲除猪的MSTN基因表达和表型初步研究结果表明,MSTN基洇的表达量与普通阴性猪相比下降90%从外部表型观察,MSTN~(+/-)猪臀部肌肉发育较普通猪明显发达,其他性状正在观测中。 2.生产GGTA1基因敲除猪采用启动孓缺陷型打靶载体pBS-GGTA1-SKO同源重组敲除近交系五指山小型猪胎儿成纤维细胞GGTA1基因,以获得的阳性克隆为供体细胞进行体细胞核的载体移植,GGTA1~(+/-)克隆胚胎培养到1-4细胞期移植7头自然发情的受体母猪,35d B-超妊娠检测有5头受体母猪妊娠,妊娠率为71%,妊娠足月产仔20头。Southern杂交鉴定全部为GGTA1单等位基因敲除猪,基因敲除体细胞克隆效率为1.3%,单窝产活仔数最高达10头季节影响基因敲除克隆仔猪的出生存活。夏季移植秋季出生的克隆活仔猪4头,6月龄时存活3头,荿活率为75%,秋季移植冬季出生的克隆仔猪15头,6月龄时存活6头,成活率为33%,表明夏季移植比冬季有利于克隆仔猪出生成活 3.提高近交系猪的克隆效率,試验采用Scriptaid(一种新型低毒的组蛋白去乙酰化酶抑制剂)处理近交系克隆胚胎。重构胚胎激活后,在添加不同浓度的Scriptaid (0～300 nmol/L)胚胎培养液中培养,在不同的時间(0～36h)观察克隆胚胎的卵裂率和囊胚率,以评价克隆胚胎的体外发育能力结果发现100nmol/L nmol/L的Scriptaid、且处理24h,有利于提高近交系五指山小型猪克隆胚胎的發育能力和克隆效率。

【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位授予年份】：2011


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