：用共刺激分子的联合癌症免疫疗法的制作方法
本发明涉及癌症免疫治疗方法。
下面的发明背景的讨论仅被提供以帮助读者理解本发明，并非承认描述或构成本发明的现有技术。
手术、放射疗法和化学疗法是治疗癌症包括白血病、实体瘤和癌转移(metastases)的标准公认方法。免疫疗法(有时称为生物疗法、生物制剂疗法、或生物应答修饰物疗法)，其直接或间接采用机体免疫系统来缩小或根除癌症，已经作为传统癌症疗法的辅助手段被研究许多年。据认为，人免疫系统对于癌症治疗是未被利用的资源，并且一旦免疫系统的组分被适当利用将开发出有效的治疗。当关键的免疫调节分子和免疫信号被鉴定并制备成治疗剂，此类制剂的临床有效性可以用熟知的癌症模型测试。免疫治疗策略包括施用疫苗、活化细胞、抗体、细胞因子、趋化因子、以及小分子抑制物、反义寡核苷酸、和基因治疗(Mocellin，etal.，Cancer
肿瘤的生长和转移很大程度取决于它们逃避宿主免疫监视和攻克宿主防御的能力。大部分肿瘤表达可以被宿主免疫系统不同程度识别的抗原，但在许多情况下，免疫反应不足。无法诱导出强活化的效应T细胞可能是由于肿瘤抗原的弱免疫原性或肿瘤细胞不适当表达或不表达共刺激分子。对于大部分T细胞，在TCR作用(TCR
engagement)期间，增殖和产生IL-2要求共刺激信号，否则，T细胞可能进入功能性无应答阶段，称为克隆无反应性。
经由T细胞上的CD28引导的重要共刺激信号通过与B7和其家族成员相互作用而发生，所述家族成员包括在抗原呈递细胞(APC)上表达的B7.1(CD80)和B7.2(CD86)。B7.1最初被发现为B细胞抗原，其已经显示在小鼠中诱导表达B7的肿瘤的T细胞依赖性排斥并保护不受亲代肿瘤细胞的肿瘤攻击。McHugh et
al.1999证明了使用融合到人B7.1胞外结构域的重组糖脂锚定蛋白在混合淋巴细胞反应中细胞毒性T细胞的增殖。
早先的研究描述了在癌症免疫治疗中利用B7/CD28通路取得的一些成功。然而，大部分研究通过常规手段采用离体遗传修饰肿瘤细胞来提高B7的表达，所述常规手段包括转染或转导(例如参见，Townsend，et al，Science ；Yang，et al.，1995.J.Immunol.0)。Zhou et al.，(Cancer Gene
Singh et al.(2003 Cancer Res.)在用生物素修饰肿瘤细胞膜后使用B7.1-链霉抗生物素蛋白，以快速并持久地在肿瘤细胞上展示B7.1。其它研究者尝试通过物理方法将B7锚定在肿瘤细胞膜上，例如包括人B7.1胞外结构域的重组糖脂锚定蛋白(McHugh，et al.，1995
reg.细胞”或“免疫调节T细胞”)与CD4+CD25+表型相关并构成人和啮齿动物中循环CD4+T细胞的5-10％。CD4+CD25+T-reg细胞参与T细胞介导的免疫自我耐受。具体而言，已经报道，抗CD25抗体的体内注射使动物模型中的白血病和实体瘤退化(Onizuka，1999)。然而，在大多数这些研究中，T-reg耗竭导致不完全的肿瘤缩小或仅导致良好构建的肿瘤植入物生长的延迟。
尽管关于控制和引导免疫应答知识已经了解很多，但仍存在对癌症治疗的更新的和更有效的免疫治疗方法的需求。
发明概述 提供了新的癌症免疫治疗方法，其联合可溶的共刺激分子的施用和降低个体中免疫调节T细胞活性的治疗。
因此，提供了降低个体中肿瘤大小或抑制癌细胞生长或降低或抑制患有癌症的个体中转移癌的发展的方法，其包括施用共刺激分子的可溶形式和降低所述个体中免疫调节T细胞活性。对于本目的有用的共刺激分子的可溶形式来源于抗原呈递细胞表达的共刺激分子。在优选的实施方式中，所述共刺激分子的可溶形式来源于B7、CD137-L、CD134-L、GITR-L或CD40。
在一种优选的实施方式中，所述共刺激分子是B7，更优选B7.1。所述共刺激分子的可溶形式包括共刺激分子的一个或多个胞外结构域。此外，所述共刺激分子的可溶形式作为T细胞活化的共刺激因子起作用。
在另一种实施方式中，所述共刺激分子的可溶形式被连接至另一种蛋白。在共刺激分子的胞外结构域和其它蛋白之间可以存在连接体。
可以被连接到共刺激分子的可溶形式的其它蛋白可以是包含CH2和CH3结构域的免疫球蛋白片段或者包含铰链区、或其部分以及CH2和CH3结构域的免疫球蛋白片段。
在又一种实施方式中，共刺激因子的可溶形式是同型二聚蛋白，其中所述同型二聚蛋白的每一个多肽包括共刺激分子的胞外结构域(一个或多个)和包含铰链区、或其部分以及CH2和CH3结构域的免疫球蛋白片段。
在另一种实施方式中，所述共刺激分子的可溶形式被连接到免疫球蛋白Fc。
在又一种实施方式中，所述共刺激分子的可溶形式被连接到抗体。在一些实施方式中，所述抗体是包含两条重链和两条轻链的四聚体。共刺激分子的胞外结构域(一个或多个)可以被连接到抗体的每一重链的可变区。
所述连接到可溶的共刺激分子的抗体对于肿瘤细胞表面抗原、肿瘤基质成分、胞内抗原、或核内抗原可以是特异的。在后者的情况下，抗体可以是鼠抗体TNT-1、TNT-2或TNT-3的鼠形式、嵌合形式、人源化形式或人形式，或者是NHS76。
降低个体中免疫调节T细胞活性的治疗可以通过离体除去所述个体的免疫调节T细胞实现，或者通过对所述个体施用耗竭(排除，减少，deplete)或失活免疫调节T细胞的药剂来实现。该治疗可以在施用所述共刺激分子的可溶形式之前、之后或基本上同时进行。
在一种方法中，结合免疫调节T细胞的至少一种抗体被用于降低所述个体中免疫调节T细胞的活性。此类抗体优选选自抗CD4、抗CD45、抗神经毡蛋白和抗CTLA4。所述抗体可以是鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
免疫调节T细胞体内活性可以通过施用GITR配体激动剂被降低。
在另一种实施方式中，所述方法进一步包括施用T细胞，所述T细胞具有抗肿瘤或癌细胞的细胞毒性活性。这可以通过从所述个体移出T细胞、活化所述T细胞、然后将所述活化的T细胞施用回所述个体而实现。在一种实施方式中，通过暴露于IL-2和/或抗CD-3抗体实现活化。在另一种实施方式中，通过将T细胞暴露于癌细胞或癌细胞疫苗实现离体活化。T细胞的过继转移可以发生在施用所述可溶共刺激分子和/或降低所述个体中的免疫调节T细胞活性的治疗之前、期间或之后。优选在免疫调节T细胞移除、耗竭或失活之后进行过继转移。
还提供了癌症治疗剂，包括选自B7、CD137-L、CD134-L、GITR-L和CD40的共刺激分子的可溶形式，其中所述共刺激分子的可溶形式是融合蛋白，其包括所述共刺激分子的一个或多个胞外结构域和抗体，其中所述抗体对胞内抗原是特异性的。所述共刺激分子的可溶形式优选是B7.1。
在其它实施方式中，癌症治疗剂抗体的抗体对于核内抗原是特异性的。在进一步的实施方式中，抗核抗原特异性抗体是鼠源抗体TNT-1、TNT-2或TNT-3的鼠源形式、嵌合形式、人源化形式或人形式，或者是NHS76。
图1A-B.1A是说明遗传构建物和得到的B7.1-Fc融合蛋白产物的示意图。B7.1-Fc是二聚体，其中每一多肽包括融合到人IgG1的Fc部分N端的人B7.1的胞外结构域(即铰链区、CH2和CH3结构域)。1B说明考马斯蓝染色的4-20％梯度的SDS-PAGE凝胶，其中泳道1是非还原的B7.1-Fc，泳道2是还原的B7.1-Fc，而泳道3是标准分子量标记物。
图2A-B.说明了联合B7.1-Fc免疫治疗和CD25+T细胞耗竭对(2A)RENCA和(2B)MAD109实体瘤生长的效应。六周龄雌性BALB/c小鼠在肿瘤植入第5天、第10天和第15天注射大鼠抗小鼠CD25(PC-61)抗体。使用5×106RENCA细胞，皮下植入肿瘤。在肿瘤植入后5天当肿瘤直径达到0.5cm时开始用B7.1-Ig治疗。静脉施用治疗5个连续日，如在该图中箭头所示。
图4A-B.在注射后24和48小时在携带Colon-26的BALB/c小鼠中125I标记的B7.1/NHS76的体内生物分布。对于每一只小鼠，结果被表示为(4A)％ID/g(每克器官注射剂量百分比)和(4B)肿瘤/器官比。
图6.对六周龄雌性BALB/c小鼠(每组5只)静脉施用130nM、275nM、500nM或1uM的Fc-mGITRL，所述小鼠具有直径约0.5cm的7天皮下注射(左肋)Colon 26细胞瘤。作为阳性对照，用3uM抗GITR抗体(DTA-1)在3个时刻(用星表示)腹腔内处理一个组。作为阴性对照，用TNT-3抗体每隔5天腹腔内处理一个组。然后，计算肿瘤体积并用标准偏差绘图。
图7.对六周龄雌性BALB/c小鼠(每组5只)连续5日静脉施用2.5μg的Fc-m/GITRL(或空白作为阴性对照)，所述小鼠具有直径约0.5cm的7天皮下(左肋)Colon 26细胞瘤。在肿瘤植入的同一天，连续5日静脉施用2.5μg的Fc-m/GITRL的一个组还接受腹腔内注射0.5mg PC61抗体(抗CD25)。然后，计算肿瘤体积并用标准偏差绘图。
发明详述 本发明提供免疫治疗方法，其用于降低肿瘤大小或抑制个体中癌细胞的生长，或者降低或抑制癌症患者中转移癌的发展。通过联合两种治疗进行治疗。第一种是施用共刺激因子的可溶形式，而第二种是降低所述个体中免疫调节T细胞的活性。免疫调节T细胞包括CD4+CD25+T细胞。
已经发现，这两种治疗的联合比任一单独治疗有效得多，并实现肿瘤大小、癌细胞生长的实质性降低、或者在癌症患者中转移癌发展的降低。可以衍生可溶性共刺激分子的合适共刺激分子是抗原呈递细胞表达的那些。在优选实施方式中，共刺激分子的可溶形式来自B7、CD137-L、CD134-L、GITR-L或CD40。更优选地，所述共刺激分子的可溶形式来自B7.1。
共刺激分子的可溶形式是分子缺乏所有或基本上所有疏水跨膜结构域(一个或多个)而使得该分子可溶的形式。因此，所述共刺激分子的可溶形式是全长共刺激分子的片段。例如，所述共刺激分子的可溶形式包括一个或多个胞外结构域和任选包括胞质域(一个或多个)。
术语“共刺激分子(co-stimulatory molecule)”根据其在免疫T细胞活化中本领域公认的意思用在本文中。具体而言，“共刺激分子”是指一组在T细胞和抗原呈递细胞之间起作用并在T细胞中产生刺激信号的免疫细胞表面受体/配体，所述刺激信号与在T细胞中由抗原呈递细胞上的抗原的T细胞受体(“TCR”)识别产生的刺激信号结合(即，“共刺激”)。
如本文中所使用，“来源于抗原呈递细胞”的共刺激分子的可溶形式是指由B细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞和其它此类抗原呈递细胞正常表达的共刺激分子，其如本文所述被工程化处理，使其可溶。来源于抗原呈递细胞的优选的可溶共刺激分子包括B7、CD137-L、CD134-L、GITR-L或CD40的任何一种。来源于抗原呈递细胞的共刺激分子的可溶形式保持天然共刺激分子结合在T细胞上它的同源受体/配体并刺激T细胞活化的能力。
如本文所使用，“T细胞活化的共刺激因子(co-stimulator of T cellsactivation)”是指共刺激配体结合并活化经由TCR活化的T细胞的能力。通过如熟知的细胞因子的产生和通过例如熟知的并在实施例中描述的增殖试验(参见下面的CFSE染色法)，可以测量T细胞的共刺激活化。还可以检测具有生物学活性的可溶形式的共刺激分子与活化T细胞上的同源受体的结合。
通过抗原呈递细胞遗传工程化得到的共刺激分子的可溶形式可以连接到另一种可溶蛋白。其它蛋白添加另外的功能能力和/或增加可溶性共刺激分子的血清半衰期。例如，连接到可溶形式的共刺激分子的免疫球蛋白Fc或抗体可以潜在地提供抗体效应子功能，例如由荷Fc受体细胞的结合或血清补体的活化。基于多肽序列重量(可溶形式的共刺激分子的多肽总重量，包括任何连接的蛋白的重量)的可溶形式的共刺激分子的分子大小通常范围在约60Kd到约260Kd、约60Kd到约170Kd和约80Kd到约130Kd。
所述共刺激分子的胞外结构域(以及任选的胞质域)可以被连接到另一蛋白的氨基末端或羧基末端。将所述可溶形式的共刺激分子连接到其它蛋白的N端或C端的决定取决于若干个因素，包括克隆的容易程度和表达水平。然而，重要的是，任何选择基本上保持天然共刺激分子的生物共刺激性质。在B7的情况下，胞外结构域的氨基末端含有共刺激位点。因此，可以预测并已经确定，B7可以连接到其它蛋白的氨基末端(例如，如果其它蛋白是Fc，则融合蛋白应该是与Fc-B7相反的B7-Fc)。在CD137-L、CD134-L、和GITR-L的情况下，优选连接到其它蛋白的羧基末端(例如，与CD137-L-Fc相反的Fc-CD137-L)。然而，如果活性被保持，则连接到氨基末端是可能的。相同的原则也可以应用于连接到大蛋白例如抗体。例如，B7可以被连接到抗体重链的氨基末端，并且CD137-L可以被连接到重链的羧基末端(在恒定区)。
在一种实施方式中，施用可溶形式的共刺激分子，其融合到免疫球蛋白的Fc例如IgG的Fc或靶向癌细胞的抗体。此类免疫球蛋白Fc优选是人Ig Fc。
重新构建的序列可以被插入合适的表达系统，例如使用表达载体pEE12的Glutamine Synthesis Gene Amplification System，并转染到NS0鼠源骨髓瘤细胞系中。可以通过串联的蛋白A亲合层析和离子交换层析纯化表达的融合蛋白。通过将IgG Fc融合到共刺激分子例如B7分子的胞外结构域的C端，所述共刺激分子的可溶形式以二聚非聚集分子(dimeric
如本文所述制备的可溶性共刺激分子可以结合T细胞并刺激它们的增殖。当与降低免疫调节T细胞活性联合时，此类可溶性共刺激分子的免疫治疗抗肿瘤效应被认为由CD8+细胞介导。例如，已经发现，B7.1-Fc共刺激因子融合蛋白与降低癌症个体中免疫调节T细胞活性的治疗的联合的抗癌效应比单独采用任一治疗的抗癌效应高得多。通过施用耗竭CD4+或CD25+T细胞亚型的抗体，免疫调节T细胞活性的降低被优选实现。
如本文所使用，术语“B7”指B7.1(CD80)、B7.2(CD86)或具有作为共刺激分子的生物学功能的任何其它B7分子，如CD28和CTLA-4的配体，以及与人B7.1或B7.2的序列共有至少80％氨基酸序列同一性的B7分子，优选至少90％氨基酸序列同一性、更优选至少95％氨基酸序列同一性和甚至更优选至少98％氨基酸序列同一性。B7家族成员的氨基酸序列和编码核苷酸序列是已知的并且是公众可得的。
如本文所使用，术语“CD137”(又名4-1BB配体受体)是指与该名称相关的具体分子以及任何具有作为共刺激分子的生物学功能的其它分子，其与如在Swiss Prot Id.no.Q07011中所定义的人CD137共有至少80％氨基酸序列同一性、优选至少90％氨基酸序列同一性、更优选至少95％氨基酸序列同一性和甚至更优选至少98％氨基酸序列同一性。
如本文所使用，术语“CD137-L”(又名4-1BB配体或TNFL9)是指与该名称相关的具体分子以及具有作为共刺激分子的生物学功能的任何其它分子，其与如在Swiss Prot Id.no.P41273中所定义的人CD137-L共有至少80％氨基酸序列同一性、优选至少90％氨基酸序列同一性、更优选至少95％氨基酸序列同一性和甚至更优选至少98％氨基酸序列同一性。
如本文所使用，术语糖皮质素诱导的肿瘤坏死因子受体“GITR”配体(又名GITR-L、TNFSF18(肿瘤坏死因子(配体)超家族，成员18))是指与该名称相关的具体分子以及具有作为共刺激分子的生物学功能的任何其它分子，其与如在Swiss Prot
Id.no.Q9UNG2中所定义的GITR-L共有至少80％氨基酸序列同一性、优选至少90％氨基酸序列同一性、更优选至少95％氨基酸序列同一性和甚至更优选至少98％氨基酸序列同一性。
人GITR-L是II型膜蛋白，其含有177个氨基酸(无信号序列)(参见在Swiss Prot Id no.P9UNG2中的序列)。该蛋白含有在残基1-28的胞质域、在残基29-49的跨膜结构域以及在残基50-177的胞外结构域。GITR-L的核苷酸序列(610bp，其中21至554编码该蛋白)可从公共数据库(参见Genbank登录号NM_)中获得。Kim et
al.Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.45(9)，04)描述了GITR-L。GITR-L结合在抗原呈递细胞上的表面存在的GITR。GITR-L的表达被限制在未成熟的和成熟的脾树突状细胞。该细胞因子是受体TNFRSF18/GITR的配体，所述TNFRSF18/GITR是TNF受体家族的成员并优选在CD25+CD4+调节T细胞上被高水平表达。还发现该细胞因子在内皮细胞上表达，并且T淋巴细胞和内皮细胞之间的相互作用被认为是重要的。
如本文所使用，术语CD134-L(又名OX40配体或TNRSF4)是指与该名称相关的具体分子以及具有作为共刺激分子的生物学功能的任何其它分子，其与如在Swiss Prot Id.no.P23510中所定义的CD134-L共有至少80％氨基酸序列同一性、优选至少90％氨基酸序列同一性、更优选至少95％氨基酸序列同一性和甚至更优选至少98％氨基酸序列同一性。
人CD134-L是II型膜蛋白，其含有183个氨基酸(无信号序列)。该蛋白含有在残基1-23的胞质域、在残基24-50的跨膜结构域以及在残基51-183的胞外结构域。CD134-L的核苷酸序列(3510bp，编码序列为157-708)可从公共数据库(参见Genbank登录号NM_)中获得。Godfry et al.，J Exp
如本文所使用，术语“CD40”(又名TNFRSF5或CD40配体受体)是指与该名称相关的具体分子以及具有作为共刺激分子的生物学功能的任何其它分子，其与如在Swiss Prot Id.no.P25942中所定义的CD40共有至少80％氨基酸序列同一性、优选至少90％氨基酸序列同一性、更优选至少95％氨基酸序列同一性和甚至更优选至少98％氨基酸序列同一性。
如本文所使用，涉及包括B7、CD137-L、CD134-L、GITR-L或CD40的共刺激分子的“可溶形式”，是指保持共刺激活性但缺乏跨膜结构域的分子的任何形式。例如，B7的可溶形式是B7的胞外结构域。共刺激分子的可溶形式还可以是胞外结构域(一个或多个)的片段。共刺激分子的可溶形式还可以包括胞质域或其它结构域，只要其不使该分子不可溶。
使用本发明的方法可以治疗的癌症包括癌、肉瘤、和白血病和淋巴瘤以及其它类型的癌症。癌包括肺癌、乳腺癌、大肠癌、卵巢癌、前列腺癌和类似的癌症。这些癌症可以是原发性或者是转移的。在白血病和淋巴瘤的情况下，可用本发明方法治疗的癌细胞包括实体瘤形式的那些癌细胞以及在骨髓中和循环中的癌细胞。
如此处所使用，术语“抗体”包括免疫球蛋白，其是B细胞的产物和它们的变体，以及T细胞受体(TcR)，其是T细胞的产物，和它们的变体。免疫球蛋白是蛋白质，其包含一个或多个基本上由免疫球蛋白κ和λ、α、γ、δ、ε、和μ恒定区基因，以及多种免疫球蛋白可变区基因编码的多肽。轻链被分类为κ或λ。重链被分类为γ、μ、α、δ、或ε，其反过来定义免疫球蛋白种类，分别为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。重链的亚类也是已知的。例如，人的IgG重链可以是IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚类的任何一种。
已知典型的免疫球蛋白结构单元包括四聚体。每一四聚体由两对相同的多肽链组成，每一对具有一条“轻”链(约25kD)和一条“重”链(约50-70kD)。每一条链的N端限定了约100至110或更多氨基酸的可变区，其主要负责抗原识别。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别指这些轻链和重链。
抗体以全长完整的抗体存在或以许多由用多种肽酶或化学制品消化产生的充分表征的片段存在。因此，例如，胃蛋白酶在铰链区中的二硫键下游消化抗体，产生F(ab′)2——Fab的二聚体，其本身是通过二硫键连接到VH-CH1的轻链。F(ab′)2可以在温和条件下被还原，以断裂铰链区中的二硫键，从而将F(ab’)2二聚体转化成Fab’单体。Fab’单体本质上是具有铰链区的Fab片段(对于其它抗体片段的更详细描述，参见Fundamental
Immunology，W.E.Paul，ed.，Raven Press，N.Y.(1993))。通过用木瓜蛋白酶消化IgG，产生Fab和Fc片段。木瓜蛋白酶正好在牵涉链间S-S键合的残基上面的铰链区内切割，得到一价Fab片段和Fc片段，其包括两个恒定区片段，每一个包含铰链区的较下面的部分，CH2和CH3结构域。Fc的恒定区片段作为二聚体，通过铰链区较下面残基的链间S-S键合而被稳定。
免疫球蛋白“Fc”通常是指用木瓜蛋白酶消化产生的恒定区的部分。包括具有链间二硫键的下游铰链。如此处所使用，术语“Fc”是指二聚蛋白质，其包括一对免疫球蛋白恒定区多肽，每一个含有铰链的较下游部分、CH2和CH3结构域。这样的“Fc”片段在铰链区可以或不必含有S-S链间桥接。应该理解，Fc可以来自任何Ig类型，同样，可以包括CH4结构域例如在IgM的情况下。Fc的突变序列是已知的，例如Wines
尽管各种抗体片段按照完整抗体的消化来定义，但是普通技术人员将理解，抗体片段的任何变体可以通过化学上从头合成或通过使用重组DNA方法学合成。因此，术语抗体，如在本文中所使用，还包括通过修饰完整抗体产生或从头合成的抗体片段，或使用重组DNA方法学获得的抗体和片段。
重组抗体可以是常规的全长抗体、已知来自蛋白水解消化的抗体片段、独特抗体片段例如Fv或单链Fv(scFv)、结构域缺失抗体、以及类似的重组抗体。片段可以包括具有少至一个或几个氨基酸缺失或突变的结构域或多肽，尽管更大量的缺失是可能的，例如一个或多个结构域的缺失。
Fv抗体的大小为约50Kd并包括轻链和重链的可变区。单链Fv(“scFv”)多肽是共价连接的VH::VL异二聚体，其可以由包含VH-和VL-编码序列的核酸表达，所述VH-和VL-编码序列直接连接或通过编码肽的连接体连接。例如参见，Huston，et
al.(1988)Proc.Nat.Acad.Sci.USA，3。许多结构用于将来自抗体V区域的天然聚集但化学上分离的多肽轻链和多肽重链转化成scFv分子——其将折叠成基本上类似于抗原结合位点的结构的三维结构。参见美国专利5,091,513、5,132,405和4,956,778。
抗体可以是非人抗体、人抗体、人源化抗体或嵌合抗体，后者包括人抗体序列和非人抗体序列。如在本领域中所知，通过交换非人恒定区(重链、轻链或两者)与人恒定区抗体，制备嵌合抗体。例如参见Cabilly等的美国专利4,816,567。从非人抗体例如从鼠源抗体制备人源化抗体的方法也是已知的(例如参见Winter的美国专利5,565,332)。
Avenue，Madison，WI53705)。此类软件通过对各种缺失、取代和其它修饰赋予同源性程度值，匹配相似的序列。在两个或多个核酸序列或多肽序列的情况下的术语“同源性”和“同一性”是指，当如使用任意数量的序列比较算法或通过手动比对和肉眼观察所测量，在比较窗或指定区上比较和比对最大对应时，相同的两个或多个序列或子序列或具有特定百分数的相同氨基酸残基或核苷酸的两个或多个序列或子序列。
对于序列比较，通常一个序列作为参考序列，测试序列与参考序列比较。当使用序列比较算法时，测试序列和参考序列被输入计算机，如果必要，指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，或可以指定可选的参数。然后，序列比较算法基于程序参数计算出测试序列相对于参考序列的序列同一性百分数。
hits)作为起始搜索的种子(seed)，以发现包含它们的较长的HSPs。该语句命中沿着每一序列的两个方向延伸，直至累积比对分值可以被增加。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的回报分值(reward
score)；总是＞0)，计算累计分值。对于氨基酸序列，计分矩阵被用于计算累积分值。当累积比对分值从其达到的最大值下降数量X；由于一个或多个负得分残基比对的累积，累积分值达到零或以下；或到达任一序列的末端时，在每一方向的语句命中的延伸停止。BLAST算法参数W、T和X决定比对的敏感度和速度。
BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用语句长度(W)11、期望值(E)10、M＝5、N＝-4和两条链的比较作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用语句长度(W)3、和期望值(E)10、以及BLOSUM62计分矩阵(参见Henikoff
probability)，其提供了两个核苷酸或氨基酸序列将偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果在测试核酸和参考核酸的比较中最小数概率在约0.2以下、更优选约0.01以下、以及最优选约0.001以下，则认为核酸与参考序列相似。
所述共刺激分子的可溶形式可以被连接到另一蛋白或多肽。此类其它多肽可以是免疫球蛋白的Fc部分、白蛋白、或保持所述共刺激分子的溶解性的任何其它类型的血清蛋白或其片段。所述共刺激分子的可溶形式可以通过重链和/或轻链连接至免疫球蛋白，所述重链和/或轻链可以是片段或全长重链或轻链。免疫球蛋白可以是抗体，其可以靶向与癌细胞或肿瘤相关的抗原。
所述共刺激分子的可溶形式可以被连接至抗体，所述抗体在体内靶向癌细胞或肿瘤。在一种实施方式中，所述抗体对于肿瘤细胞表面抗原是特异性的。在另一种实施方式中，所述抗体对于肿瘤的基质组分是特异性的。在还有另一种实施方式中，所述抗体对于细胞内抗原是特异性的，例如核内抗原(一种或多种)。在后者的情况下，所述抗体可以是基于鼠源抗体TNT-1、TNT-2、TNT-3的人源化或人嵌合抗体。人抗体NHS76是TNT-1的遗传工程化对应物。
TNT抗体结合胞内抗原，所述胞内抗原在所有细胞中被发现并被将要死亡的细胞保留以及表现出优选定位于恶性肿瘤中，原因在于存在仅在正常组织中很少存在的异常可通透、退化的细胞。快速分裂的肿瘤包含一部分退化或死亡细胞，但是，注意力集中于杀死分裂细胞的尝试，退化组分很大程度上被忽略。肿瘤细胞丧失的计算显示，和正常组织对比，肿瘤细胞分裂的子代的30-80％立刻经受退化。在肿瘤中，有缺陷的脉管系统和受损的吞噬应答使得退化细胞得以累积，通常伴随形成大面积的坏死，其长期被病理学家认为是恶性肿瘤的典型特征(Epstein，et
Res(-5848)。因此，在肿瘤内高比例的将死亡细胞的累积构成了恶性肿瘤和正常组织之间的主要区别，其中在正常组织中偶尔的细胞死亡以相对低的速度发生并伴随着坏死成分从组织快速(数分钟内)和有序除去。由于退化细胞具有在活细胞中未观察到的可通透细胞表面膜，TNT抗体进入肿瘤的坏死区域并结合它们的胞内抗原。反之，在肿瘤的存活区和正常组织中扩散的TNT抗体不结合并且通过正常的清除机制从循环中除去。因此，TNT抗体提供了特异性靶向肿瘤坏死区的有用方法，并可以被用于将诊断和治疗剂输送至可能位于肿瘤中心深处的这些区域。TNT抗体具有许多区别于其它形式的抗体疗法的独特特征。
如在本文中所使用，“连接(linked)”指在生理条件的pH、离子强度和渗透势下，大部分实体平衡地互相缔合。共价连接可以通过多种化学交联剂的任何一种，包括例如同双功能交联剂或异双功能交联剂，其中许多是商业可得的(例如参见Pierce Chemical Co.或Sigma Chemical
Co)。交联可以通过许多本领域中熟知的化学试剂的任何一种实现，包括，例如活化聚乙二醇、醛、异氰酸酯、马来酰亚胺和类似物。
共刺激分子的可溶形式可以通过遗传融合连接到另一蛋白，并可以在两个实体间包括多肽连接体序列。连接体的组成和长度可以根据本领域中熟知的方法确定并可以检测效率。连接体通常为大约3个至大约15个氨基酸长，更优选大约5个至大约10个氨基酸长，然后，更长或更短的连接体可以被使用或者连接体可以被完全省略。Gly4Ser连接体是示例性的连接体。另外的序列也可以被包括在内，以掺入切割位点，以便在某些在后时刻分离共刺激分子的可溶形式和免疫球蛋白Fc或其它多肽。因此，连接体可以包括酶切底物的序列，例如内肽酶识别序列。
使用例如如本领域所熟知的原核或真核细胞中重组表达的方法(例如参见美国专利5,116,943和6,331,415)，可以制备共刺激分子的可溶形式(包括其融合蛋白)和可以除去、耗竭或抑制免疫调节T细胞活性的制剂。通常而言，编码蛋白的核酸可以被克隆进表达载体，用于高产量表达编码的产物。表达载体可以是质粒、病毒的部分，或者可以是核酸片段。表达载体包括表达盒，编码蛋白的核酸被克隆进该表达盒，与启动子以及任选地与增强子可操纵性连在一起。表达盒还可以包括其它特征例如复制起点、和/或染色体整合元件例如反转录病毒LTRs、或腺相关病毒(AAV)ITRs。如果蛋白的分泌是期望的，编码信号序列的DNA可以被置于编码所述蛋白的成熟氨基酸的核酸序列的上游。编码可被用于促进后期纯化(例如组氨酸标签)或帮助标记蛋白质的短蛋白序列的DNA，可以被包含在编码所述蛋白的核酸内或末端。
共刺激分子的可溶形式可以从其N端或C端被直接或间接融合于另一多肽的C端或N端(例如，Ig Fc的铰链-CH2-CH3)。在一些情况下，共刺激分子的可溶形式优选在其C端融合于其它多肽的N端。
适合复制和支持蛋白的重组表达的细胞在本领域是熟知的。此类细胞可以用特定表达载体适当转染或转导，并且大量的含载体的细胞可以生长，用于接种大规模发酵罐，以获得临床应用足够量的蛋白。此类细胞可以包括原核微生物，例如大肠杆菌、或多种其它真核细胞，例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、昆虫细胞、或类似细胞。在这些系统中表达外来基因的方法在本领域中是已知的。
作为本发明方法的部分，降低个体中免疫调节T细胞的活性可以通过离体除去或通过耗竭或失活所述个体中的免疫调节T细胞而实现。如本文所使用，术语“免疫调节T细胞”是指直接或间接起到抑制宿主抗肿瘤免疫应答的作用的T细胞群。免疫调节T细胞可以是CD4+、CD25+或两种标记都是阳性的。
如本文所使用，涉及免疫调节T细胞时，术语“离体除去(removing ex
vivo)”是指通过离体方法例如流式细胞分离、柱分离或过滤器分离和类似方法，从个体的循环中除去免疫调节T细胞。柱或过滤器可以在其上已结合了可以结合免疫调节T细胞的抗体。结合免疫调节T细胞的抗体还可以被用于鉴定此类细胞，以通过流式细胞设备除去。适于结合免疫调节T细胞的抗体包括CD4抗原的特异性抗体、IL-2受体(即CD25)的α链亚基的特异性抗体、以及类似抗体。还可以使用此类抗T细胞抗体的组合。Daclizumab?——结合CD25的人源化单克隆抗体、或Basiliximab?——该相同抗体的嵌合形式可从Novartis
cells)”，是指抑制宿主抗肿瘤免疫应答的免疫调节T细胞的数量或功能能力的降低，这发生在向宿主施用药剂之后。所述药剂是当施用时导致免疫调节T细胞丧失(即耗竭)或导致免疫调节T细胞的抗肿瘤免疫抑制功能失活的药剂。此类治疗的最终结果是降低治疗接受者中免疫调节T细胞的活性。
耗竭或失活免疫调节T细胞可以通过施用药剂例如CD4抗原特异性抗体、IL-2受体(即CD25)的α链亚基特异性抗体、以及类似抗体来实现，如上所述。此外，γ、δ免疫调节T细胞的抗体可以被用于耗竭此类细胞并刺激抗肿瘤免疫性，如前所述。Seo et al.，J.Immunol.(-249。抗CD40配体也可以用于耗竭或失活免疫调节T细胞。
部分抗体构建物例如CTLA4Ig、CTLA-4和免疫球蛋白(Ig)重链的Fc的融合蛋白，可以被用于抑制完全T细胞活化所必需的共刺激信号，其通过阻断CD28和B7分子之间的相互作用来完成。CTLA4Ig可以作为药物被施用，使调节T细胞无反应性(即失活)。参见Park et al.Pharm
Res.()1239-48。IL-2与假单孢菌外毒素(OnTac)的融合是又一种耗竭或失活调节T细胞的药剂。
在另一方法中，药剂可以被施用，其防止诱导CD8+溶细胞性T淋巴细胞(CTL)肿瘤无反应性。对抗CD137的试剂，例如对抗抗体，可以被用于在再遇到它们的同源抗原后恢复已确定的无反应性CTLs的肿瘤溶细胞性功能。参见Wilcoxet al.，Blood(-184。该方法可以被用于破坏T细胞对肿瘤抗原的耐受性。
神经毡蛋白的抗体(例如Bruder et al.2004)和CTLA4的抗体(例如Leach etal.1996)还可以被体内施用，以耗竭免疫调节T细胞或降低它们的活性。
除去、耗竭或失活免疫调节T细胞的方法可以被使用，即使所述方法不是仅限制于此类细胞。除去、耗竭或失活免疫调节T细胞的努力可以在给定的治疗期间中多次进行。此外，不同的方法可以被一起使用(例如，离体细胞移除和体内耗竭或失活)。所施用的、用于耗竭或失活的抗T细胞抗体的量可以是类似于在移植领域中使用的量。例如参见Meiser et
可以在施用共刺激分子的可溶形式之前、期间和/或之后除去、耗竭或失活免疫调节T细胞。优选在施用共刺激分子的可溶形式之前除去、耗竭或失活免疫调节T细胞。
在进一步的实施方式中，本发明的癌症治疗方法可以包括免疫细胞的过继转移，以增强抗肿瘤免疫性。如本文所使用，“过继转移(adoptive
transfer)”是指施用来自另一个体或来自相同个体的免疫细胞。这些优选是T细胞，其可以被离体活化，以增强它们在支持抗肿瘤免疫应答中起作用的能力。过继转移的免疫细胞可以被许多熟知的试剂的任何一种离体活化，包括例如暴露于IL-2和/或抗CD-3抗体。离体活化还可以包括暴露于癌细胞疫苗。此类癌细胞疫苗可构成活的(但非复制型)、或灭活的来自将被治疗的个体或完全来自另一癌症的癌细胞。所述疫苗还可以是癌细胞提取液或衍生于癌细胞的纯化的疫苗制剂。癌细胞疫苗在本领域中是熟知的，并可以根据熟知的方法制备。
本文中所描述的化合物可以作为用药学上可接受载体配制的药剂或药物加以施用。因此，所述化合物可以用在药物或药剂组合物的制备中。本发明的药物组合物可以被配制成溶液或冻干粉末，用于肠胃外施用。在使用前，可以通过添加合适的稀释剂或其它药学上可接受的载体，重构粉末。液体制剂可以是缓冲、等渗、含水溶液。粉末还可以以干燥的形式被喷雾。合适稀释剂的例子是正常的等渗盐水溶液、标准的5％葡萄糖水溶液、或缓冲乙酸钠或乙酸铵溶液。此类制剂特别适合于肠胃外施用，但还可以用于经口施用或包含在用于喷射的计量吸入器或喷雾器中。添加赋形剂例如聚乙烯吡咯烷酮、明胶、羟基纤维素、阿拉伯树胶、聚乙二醇、甘露醇、氯化钠、柠檬酸钠、和类似赋形剂也是期望的。
可选地，化合物可以被胶囊化、片剂化或在乳状液或糖浆中制备，用于经口施用。药学上可接受的固体或液体载体可以被加入，以增强或稳定该组合物，或促进该组合物的制备。固体载体包括淀粉、果糖、二水合硫酸钙、硬石膏、硬脂酸镁或硬脂酸、滑石、胶质、阿拉伯树胶、琼脂或明胶。液体载体包括糖浆、花生油、橄榄油、盐水和水。载体还可以包括缓释材料例如甘油单硬脂酸酯或二硬脂酸甘油酯，单独或与蜡一起。固体载体的量可变，但优选地，将在每剂量单位约20mg到约1g之间。按照常规的制药技术制备药物制剂，对于片剂，包括粉碎、混合、粒化、和当必要时，包括加压；或对于硬明胶胶囊形式，包括粉碎、混合和填充。当使用液体载体时，制剂可以是糖浆、酏剂、乳剂、或含水或无水悬浮剂的形式。对于直肠施用，本发明化合物可以与赋形剂例如可可油、甘油、明胶或聚乙二醇联合并被模压成栓剂。
化合物可以被配制，以包括其它医学上有用的药物或生物制剂。该化合物还可以与对本发明化合物针对的疾病或状态有用的其它药物或生物制剂的施用一起被施用。
如本文所使用，短语“有效量”是指足以提供足够高的浓度以给予其受者有利效应的剂量。对于任何特定对象而言，具体的治疗有效剂量水平将取决于多个因素，包括正被治疗的疾病、疾病的严重程度、具体化合物的活性、给药途径、化合物的清除率、治疗持续时间、与该化合物联合或同时使用的药物、对象的年龄、体重、性别、饮食和一般健康状况，以及医药领域和科学上熟知的类似因素。在确定“治疗有效量”中考虑的各种一般性因素对于本领域普通技术人员而言是已知的，并描述于例如Gilman
Co.，Easton，Pa.，1990。剂量水平通常落在约0.001至100mg/kg/天的范围内，其中约0.05至10mg/kg/天范围内的水平通常是可应用的。化合物可以被肠胃外施用，例如血管内、静脉内、动脉内、肌内、皮下、或类似施用。施用还可以是经口、经鼻、经直肠、经皮、或经由气溶胶吸入。所述化合物可以以丸剂施用，或缓慢输注。
治疗上有效剂量最先可以通过确定IC50的细胞培养试验估计。然后，在动物模型中配制剂量，以获得包括在细胞培养中确定的IC50的循环血浆浓度范围。此类信息可以被用于更精确地确定在人中有用的初始剂量。可以例如通过HPLC，测量血浆中的药物水平。精确的配方、给药途径以及剂量可以由个体医生根据患者的状态予以选择。
将本文所描述的可溶性共刺激分子或其它蛋白施用于免疫活性个体，这可能导致抗所述可溶性共刺激分子或其它蛋白的抗体的产生。本领域中熟知的方法可以用于降低所述可溶性共刺激分子或其它蛋白的免疫原性，例如通过将长链聚乙二醇(PEG)基间隔物或类似物连接于试剂。已知，长链PEG和其它聚合物具有掩蔽外来表位的能力，从而使得展现出外来表位的治疗蛋白的免疫原性降低(Katreet
下面的实施例用于阐述本发明。这些实施例不旨在以任何方式限制本发明的范围。
实施例1材料和方法试剂和小鼠
B7-Fc融合蛋白的构建
构建表达质粒，其含有编码融合蛋白的序列，所述序列从5
′端起包括编码人B7.1信号和胞外结构域(B7.1sig/ex)的DNA，其3′端是编码人IgG1的铰链/CH2/CH3结构域的DNA(后者可以被称为Fc，因为其在表达时将如同天然Fc一样二聚化)。通过从编码cDNA(ATCC来源)进行PCR扩增，产生编码人B7.1的信号结构域和胞外结构域的cDNA。cDNA的扩增片段从编码信号序列中的起始Met的序列延伸到编码Asp241的序列[即M-G-H-T-R...E-H-F-P-D]。
3’序列的一部分，而引物BWD2在3’端包含EcoR1和Bcl1限制性位点。通过使用引物FWD1和BWD2装配片段1和片段2，产生B7.1-Fc融合DNA。
分别用含有Xbal和EcoR1克隆位点的5’和3’DNA获得含有B7.1-Fc基因(编码huB7.1sig/ex-铰链/CH2/CH3)的PCR产物。当由细胞表达时，huB7.1sig/ex-铰链/CH2/CH3编码的多肽导致信号序列的去除。所得到的多肽经由融合蛋白的铰链/CH2/CH3部分形成二聚体。二聚化的多肽因此可以被视为B7.1ex-Fc融合蛋白(在本文中也被称为“B7.1-Fc”)。
根据生产商的方案(Lonza Biologics)，在NS0鼠骨髓瘤细胞中表达B7.1-Fc和B7.2-Fc融合蛋白，以获得长期稳定的表达。最高产率的克隆被扩大，以在8-L搅拌瓶生物反应器中使用5％的热灭活透析胎牛血清温育，并且通过顺序的蛋白A亲合层析和离子交换层析从耗尽培养基(spent culture
medium)中纯化融合蛋白。热灭活(68℃，1h)透析胎牛血清被用于防止诱导内源性蛋白水解酶以及在NS0细胞中产生的融合蛋白的随后切割。在还原条件下通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析所述融合蛋白并用考马斯蓝染色，以证明适当的装配和纯度。
体内淋巴细胞亚型的耗竭
在肿瘤植入前1天施用抗体，之后每5-7天施用，用于T细胞耗竭研究。对于CD4+、CD8+、和CD25+T细胞耗竭，以1ml接种物腹腔内注射0.5mg的抗CD4(GK1.5)、抗CD8(2.43)或抗CD25(PC61)。通过对被处理小鼠的脾细胞的流式细胞分析，确认具体T细胞亚型的耗竭。这些研究的每一个被重复二或三次，并且每一组包含每组5只小鼠。
109细胞的接种物。当肿瘤直径达到～0.5cm时开始治疗。用0.1ml含有B7.1-Fc(20μg)或对照同种型匹配抗体(20μg)的接种物静脉处理具有肿瘤的小鼠组(具有或不具有淋巴细胞亚型耗竭)。所有组被每日治疗，共5天，并每隔1天通过测径器测量三维大小来监测肿瘤生长。通过式子长×宽×高，计算肿瘤体积。结果被表示为平均值±SD，并使用Wilcoxon秩和检验(Wilcoxon
rank-sum test)确定显著性水平(P值)。这些研究的每一个被重复2次。
在初始免疫治疗完成后两个月，用106个Colon 26细胞和MAD 109细胞或Colon 26细胞和RENCA细胞在左肋和右肋分别攻击成功治疗的无肿瘤小鼠和对照未试验过的小鼠(n＝5)。观察注射位点2个月。每周测量肿瘤体积并如前所述计算。为研究不同组中的CD4+CD25+T细胞的存在，肿瘤引流淋巴结(tumor draininglymph
被治疗动物的肿瘤中淋巴细胞分析
在肿瘤植入后第14和21天，在无菌条件下取出对照小鼠和治疗小鼠的肿瘤，并在无菌培养皿中手动切成1mm3的块。然后，用在RPMI 1640中的0.01％的Hyaluranidase和0.1％的胶原酶(Sigma Chemical
Co.)，在连续搅拌下，于37℃消化小的组织切片3小时。然后，用在PBS中的0.1％FCS洗涤得到的单细胞悬浮液两次，并通过标准的流式细胞术进行染色。为检测肿瘤中淋巴细胞浸润的亚群，下面的偶联抗体被用于FACSPE-抗CD8、FITC-抗CD4、PE-抗CD25、APC-抗CD11b、FITC-抗CD11c、和PE-抗Pan NK(BD Bioscience PharMingen，San
PharMingen)的情况下，将细胞转移到抗小鼠CD3e预包被孔中。然后，洗涤细胞，以及在100μl染色缓冲液(PBS中1％FBS)中用每106个细胞1μgFc封闭性抗体(CD16/CD32)于4℃阻断小鼠Fc受体15分钟。然后，在4℃下用PE偶联抗CD3e抗体对细胞进行染色30分钟，在4℃下用100μl
通过CFSE活体染色，测量T细胞的增殖。CFSE是自发性和不可逆结合到胞内蛋白的染料。一旦细胞分裂，CFSE标记相等地分布于子代细胞中，因此，相比于母细胞，子代细胞含有一半的荧光染料(Lyons 2000)。结合细胞表面标记物染色，CFSE测定可以检测CFSE标记群中的特异增殖。
简述之，在肿瘤植入后第14和21天，取出对照小鼠和治疗小鼠的TDLNs。通过在无菌培养皿中切碎淋巴结，获得单细胞悬浮液，并洗涤细胞以及用CFSE活体染料进行标记，如下所述。简而言之，细胞被重悬在1ml含有5μM CFSE(Molecular
Probes，Eugene，OR)的PBS中，并在室温下温育5分钟。然后，将1ml预温的在PBS中的20％FCS加到每一个管中，以除去未结合的CFSE。2×106个细胞被洗涤两次并铺板于24孔板中。加入肿瘤裂解液，使肿瘤抗原达到10μg/ml的终浓度。在铺板后第1、2、3和5天收集细胞，并用PE-抗CD3e染色。进行FACS分析，以确定在肿瘤抗原存在下T细胞的增殖。
形态和免疫组织化学研究
在10％缓冲的福尔马林中固定不同组的肿瘤，包埋在石蜡中，切片，并用H&E染色，用于组织学检查。为进行免疫组化染色(IHC)，在浸入用于冷冻切片的O.C.T化合物(Laboratory-Tek
Products，Naperville，IL)中后，肿瘤在液氮中被骤冻。切割恒冷切片(5μm)，风干，并保存在-80℃，直至使用。在室温下，在含有10％过氧化氢的PBS中温育30分钟以封闭内源性过氧化物酶活性之后，用生物素化抗CD4和抗CD8单克隆抗体染色冷冻切片。然后，用HRP偶联的链霉抗生物素蛋白温育切片，并在用苏木精复染之前用DAB(KPL，Gaithersburg，Maryland)显色。
B7.1胞外域的C端在无任何连接体的情况下被融合到铰链-CH2-CH3分子的N端(图1)。在人B7.1信号序列的引导下，融合的B7.1-Fc被翻译，并且表达的融合蛋白是二聚体，如SDS-PAGE所示。使用具有抗人B7.1或人IgG Fc的单克隆抗体的夹心式ELISA，选择表达最高水平的B7.1-Fc融合蛋白的细胞。发现该亚克隆在通气式搅拌瓶培养中产生100μg/ml以上的融合蛋白。
在还原条件下，通过SDS-PAGE，确认表达的融合多肽的预测分子量。用HPLC确认融合蛋白的纯度，其显示出停留时间为大约320s的主峰。当保存在-80℃时，该融合蛋白的活性保持不变一年。
使用小鼠T细胞增殖测定，证明所述融合蛋白的B7.1部分的生物活性。以和阳性对照相同的浓度使用抗CD28抗体(37.51.3克隆)，因为其显示出在促细胞分裂原存在下活化T细胞。在抗CD3存在下，平板结合的B7.1-Fc显著增强T细胞增殖，而单独的融合蛋白则无活性。这证明了B7.1-Fc融合蛋白的B7.1胞外域作为共刺激因子起作用。
26肿瘤模型，在荷肿瘤BALB/c小鼠中，以不同的剂量研究B7.1-Fc的抗肿瘤活性。在肿瘤植入后5天，用40μg、20μg、10μg、5μg、1μg、或0.5μgB7.1-Fc或者同种型匹配抗体对照每日静脉处理各组小鼠，共5天。在40μg/天的浓度下，B7.1-Fc的施用诱导出植入肿瘤的完全退化。在用每天20μg至5μgB7.1-Fc治疗的其它组中的肿瘤也显示出显著的退化，相比于对照组，其肿瘤体积减小76％(P＜0.01)到88％(P＜0.01)的范围。当剂量降低到1μg/天，肿瘤体积无显著减小。这些研究证明了在该肿瘤模型中B7.1-Fc和B7.2-Fc治疗的抗肿瘤效应的剂量阈值，所述肿瘤模型在1至5μg/剂量之间所观察到的肿瘤生长具有显著差异。
如上得出相似的剂量应答，但其中B7.2-Fc被施用，代替B7.1-Fc。B7.2-Fc的抗肿瘤效应比得上B7.1-Fc。两种融合蛋白在5μg/剂量或更高剂量下都显示出显著的活性。
在Colon 26肿瘤模型中B7.1-Fc免疫治疗和T细胞亚型耗竭的联合
用5×106Colon 26皮下植入六周龄雌性BALB/c小鼠，并分成5组(n＝5)。在肿瘤植入前1天，通过腹腔内注射适宜的抗体，使小鼠各组耗竭CD4+、CD8+、或CD25+T细胞亚型。当肿瘤直径达到0.5cm，开始B7.1-Fc治疗(静脉给予20μg剂量)。通过对治疗小鼠的脾细胞进行流式细胞分析，确认特异T细胞亚型的耗竭。
CD8+T细胞的耗竭逆转了B7.1-Fc的抗肿瘤效应，这证明了该T细胞亚型的关键免疫治疗作用。相较之下，在治疗前CD4+T细胞的耗竭基本无效应。B7.1-Fc单独治疗和与抗CD4+耗竭的联合治疗在第19天在60％的小鼠中都产生了完全的退化率(3/5小鼠无肿瘤)。CD25+T细胞耗竭在第19天引起所有小鼠的完全肿瘤消退(5/5无肿瘤)。T细胞亚型耗竭对使用B7.1-Fc的完全肿瘤退化的影响在表1中加以概述。
?对这些组的小鼠进行再攻击试验。
用不同肿瘤模型进行B7.1-Fc的联合免疫治疗研究
对两种另外的实体瘤模型进行相似的研究，包括RENCA肾癌肿瘤和MAD109肺癌。对于这些研究，在肿瘤植入的当天施用抗CD25，并持续施用随后的连续4天。从这些小鼠取出的脾和淋巴结的FACS分析显示了CD25+T细胞的基本上完全耗竭。如图2所示，B7.1-Fc与CD25+T细胞耗竭的联合治疗比任一单独治疗好得多。尽管这些数据类似于上述图4所示的数据，但是在这些更具攻击性的BALB/c小鼠肿瘤模型中，未获得完全的退化。
来自用B7.1-Fc和CD25+T细胞耗竭治疗的RENCA和MAD 109肿瘤组的小鼠——其保持无肿瘤2个月(肿瘤退化小鼠)——和首次用于试验的小鼠在侧肋部植入Colon 26和RENCA细胞、或Colon 26和MAD 109细胞。对于这些研究，在左肋皮下植入106个Colon
26细胞，以及在右肋皮下植入106个RENCA或MAD109细胞。在肿瘤植入后一个月，发现所有的首次用于试验的小鼠在它们的左肋(Colon 26)和右肋(RENCA或MAD 109)都具有实体瘤生长(图6)，而如所述被再攻击的肿瘤退化小鼠排斥Colon 26和RENCA肿瘤，并仅在它们的右肋具有少量的MAD
109肿瘤。这些肿瘤的测径器测量表明，相比于在首次用于试验的小鼠中生长的那些，它们的大小被降低大约86％。
在肿瘤部位中淋巴细胞亚群的FACS分析。
为确定在肿瘤微环境中淋巴细胞和树突状细胞浸润的作用，用抗体标记对在肿瘤植入后14天取出的单细胞悬浮液进行染色并通过流式细胞术(FACS)分析。在具有或不具有CD25+耗竭的B7.1-Fc治疗组中，代表浸润总白细胞的细胞百分数(分别为36.19％对47.04％)高于给予同种型匹配对照免疫球蛋白的对照组和仅CD25+T细胞耗竭的组(分别为22.85％和25.39％)。
在具有或不具有CD25+耗竭的B7.1-Fc治疗组中，代表浸润CD8+T细胞的细胞百分数(分别为4.91％和7.91％)大于对照组或CD25+耗竭组(分别为1.18％和1％)。
对于用抗CD11c和抗CD11b抗体双染而鉴定的浸润树突状细胞，也观察到相似的结果。与同种型匹配组和仅CD25+T细胞耗竭组(分别为4.59％和6.06％)相比，在具有或不具有CD25+耗竭的B7.1-Fc治疗组中发现更大的双阳性(CD11b+CD11c+)树突状细胞浸润百分数(分别为12.73％和11.23％)。
为确定B7.1-Fc治疗是否也活化T细胞以及CD25+耗竭是否影响该活化，使用活体染料CFSE进行肿瘤特异性T细胞增殖测定。用CFSE对来自肿瘤引流淋巴结(TDLN)的单细胞进行染色，并且在用抗CD3e抗体染色之前，作为肿瘤抗原来源的肿瘤裂解液(从相同肿瘤模型制备)被加入到培养基24小时。两个对照组(同种型匹配抗体组和CD25+耗竭组)都未显示出T细胞活化(分别是0.06％和0.22％)。相反，两个B7.1-Fc治疗组(具有和不具有CD25+耗竭)都显示出T细胞活化，所述活化由CFSE活体染料的荧光显著下降所指示。然而，相比于单独的B7.1-Fc治疗，联合治疗展现出显著更高的增殖率(分别为36.62％对4.5％)。
被治疗肿瘤的组织学研究
在治疗完成后第5天，从治疗动物和对照动物收获Colon
26肿瘤。用抗CD4和CD8抗体对每一肿瘤块的冷冻切片进行染色。与对照小鼠相比，在不同时刻从B7.1-Fc治疗小鼠取出的肿瘤的光学显微检查和免疫组化检查，显示出CD4+和CD8+细胞的增加的单核细胞浸润水平。来自B7.1-Fc治疗小鼠的肿瘤在外周肿瘤区和肿瘤内部区域都形成广泛的多发性坏死病灶。此类坏死在早期开始，大小随时间增大，并最终导致肿瘤的最终消失。这种类型的肿瘤退化有别于在对照肿瘤中的那些，其经常被发现在晚期阶段在肿瘤的中心区仅具有一个或两个大的坏死区。
IFN-γ和穿孔蛋白敲除小鼠研究和IL-4抑制
观察到B7.1-Fc诱导的肿瘤退化依赖于CD8+T细胞，这提出了问题是否涉及干扰素γ或CD8+CTL通路的穿孔蛋白效应物臂(effector
arms)。IFN-γ是CTL分化和功能的关键细胞因子，而穿孔蛋白是NK和CTL功能的下游效应物。为说明该问题，在IFN-γ敲除和穿孔蛋白敲除的小鼠中，在具有或不具有CD25+Treg耗竭的情况下进行采用B7.1-Fc的肿瘤治疗。在两种B7.1-Fc治疗组中，IFN-γ缺陷型小鼠无法排斥肿瘤，而在B7.1-Fc(P＜0.05)和联合治疗组(P＜0.05)中，穿孔蛋白缺陷型小鼠显示出肿瘤大小分别减小50％和75％。
为测试IL-4在B7.1-Fc免疫治疗中的作用，通过腹腔内施用抗小鼠IL-4抗体11B11，抑制IL-4。IL-4抑制不改变B7.1-Fc治疗或抗Treg联合治疗的抗肿瘤功效。
实施例3B7.1/NHS76融合蛋白的克隆和测试B7.1/NHS76融合蛋白的构建、表达和纯化
HC基因的N端。B7.1在其C端被连接到抗体可变区，以保持B7.1的活性，该活性取决于其氨基端。根据制造商的方案(Lonza Biologies)，通过电穿孔，将所得到的表达载体pEE12/B7.1/NHS76 HC和pEE6/NHS76λ共转染进NS0细胞中，用于长期稳定表达。
如前所述(Hornick，et al.，1998)，使用粗DNA作为抗原，通过对培养物上清液的间接ELISA测定，选择最高产率的克隆。如上面对于B7.1-Fc的描述进行表达和纯化。纯化后，通过0.22μm Nalgene一次性过滤器对融合蛋白进行过滤，等分，并在-80℃下在无菌5ml玻璃瓶中长期储存。
使用CFSE，通过改进的流式细胞法测量B7.1部分的生物活性。简述之，从健康BALB/c小鼠中无菌取出脾，并通过梯度离心分离单细胞悬液。通过与抗小鼠Ig抗体包被的培养皿的阴性黏附，从单核细胞悬液富集T细胞。FACS分析确认T细胞群的纯度，为大约95％。在PBS中两次洗涤后，T细胞在室温下在5μg/mlCFSE中温育5分钟，随后加入预温的10％FBS，以中和未结合的CFSE。在存在1ug/ml结合板的抗CD3的情况下，在24孔板中培养2×106个CFSE标记的T细胞，所述24孔板用3μg/ml
B7.1/NHS76预包被(17A2克隆)。在温育72小时后，收集106个细胞，并用PE-抗CD4和抗CD8抗体的混合物进行染色。用FACS分析CFSE强度，它的降低反映T细胞增殖。此外，通过夹心式ELISA(Pepro Tech Inc.)确定在上面的培养液上清中IL-2的产生。
PBS中，用10到110ng125I标记的融合蛋白温育含106个细胞/ml的多聚甲醛固定的Raji淋巴瘤细胞1小时。然后，用含1％的BSA的PBS洗涤细胞3次，除去未结合的抗体，并在γ计数器中计数。通过每一管中剩余的细胞结合放射活性(cpm)和放射标记抗体的比活(cpm/ng)，确定结合的融合蛋白的量。进行标准的作图分析，获得斜率，并通过下面的等式计算亲合常数KaKa＝-(斜率/n)，其中n是抗体的效价(IgG为2)。
药物动力学和生物分布研究
对于全身性清除研究，在施用放射性碘之前和期间，用饮用水中的碘化钾处理六周龄雌性BALB/c小鼠组(n＝5)1周，以抑制甲状腺摄取。每一组接受静脉注射125I标记的融合蛋白(30μCi/10μg/小鼠)。然后，在从注射期后立即开始的不同的时间间隔下，使用CRC-7微剂量仪(Capintec
26细胞的接种物。肿瘤被允许生长，直到直径达到大约1cm。然后，每一只小鼠接受静脉注射0.1ml125I标记的融合蛋白(30μCi/10μg/小鼠)。在注射后24小时和48小时，通过过量戊巴比妥钠，处死小鼠，切开肿瘤和正常组织，称重，并用γ计数器测量放射性同位素活性。对于每只小鼠，数据被表示为注射剂量/组织克数的％(％ID/g)以及肿瘤对正常器官的比率。从这些数据计算出每一组的平均值±标准偏差。使用Wilcoxon秩和检验，确定显著性水平(P值)。
26细胞、RENCA细胞或MAD109细胞的接种物皮下注射六周龄雌性BALB/c小鼠。在肿瘤植入后大约第5天，当肿瘤直径达到0.5cm时，用0.1ml含有B7.1/NHS76(30μg)或对照抗体NHS76(30μg)的接种物静脉注射小鼠组(n＝5)。所有组的小鼠都被每日治疗，共5日，并且每隔一天通过测径器测量三维大小来监测肿瘤生长。通过式子长×宽×高，计算肿瘤体积。对用不同剂量的B7.1/NHS76治疗的荷Colon
淋巴细胞亚型的体内耗竭
在肿瘤植入的当天(第0天)施用抗体，用于CD25+T细胞的耗竭，或者在肿瘤植入后第5天施用，用于其它T细胞亚型(CD4+和CD8+)的耗竭。为耗竭这些T细胞亚型，使用1ml在PBS中的接种物，腹腔内注射0.5mg抗CD4抗体(GK1.5)、抗CD8抗体(H35)或抗CD25抗体(PC61)，此后，每5天重复一次。使用与用于耗竭的抗体不同的抗体，通过FACS分析治疗小鼠的淋巴结，确认特异T细胞亚型的耗竭。
在肿瘤植入后第5、12和19天，取出治疗小鼠和对照荷Colon 26小鼠的肿瘤，并如上面对于B7.1-Fc所述地，通过CD4的H&E染色或CD8 IHC染色来评价肿瘤。
实施例4使用B71/NHS76融合蛋白的免疫治疗结果B7.1/NHS76的构建、表达和纯化
哺乳动物细胞NS0表达系统被用于产生可溶性融合蛋白。在亚克隆两次后，发现产生最高B7.1/NHS76的克隆产生大约15μg/ml/106个细胞/24h。还原性SDS-PAGE和蛋白质印迹分析表明，B7.1/NHS76包括100kD和35kD的多肽，分别基本对应于融合B7.2的Ig重链和非融合轻链的预测大小。高于B7.1/NHS76的预测大小被认为是由于B7.1分子的糖基化。
B7.1的胞外域融合到NHS76重链的可变区，这似乎不改变完整装配的H2L2四聚体形式的抗体的分泌。在图3B中示意性地示出了表达的B7.1/NHS76的结构。
融合蛋白的B7.1部分的生物活性
与单独的抗CD3e相比，在抗CD3e存在下，B7.1/NHS76增强T细胞增殖和IL-2的产生。相反，在抗CD3e存在下，NHS76抗体不增加增殖。这表明该融合蛋白的B7.1胞外域是功能性的。
体内药物动力学和生物分布研究
在健康BALB/c小鼠中进行全身性清除研究，以确定B7.1/NHS76的体内半衰期。在注射后24小时和48小时，每克肿瘤的融合蛋白吸收(％ID/g)显著高于正常器官(P≤0.01)。125I-B7.1/NHS76的快速清除与血液、肝和肾中放射活性水平随时间显著下降有关，导致肿瘤-器官比增加。图4中的结果表明，相比于正常器官和血液，B7.1/NHS76靶向肿瘤，具有良好的保留。
在Colon 26和MAD 109肿瘤植入后5天或在RENCA植入后12天，用30μg B7.1/NHS76或对照NHS76每日治疗小鼠，共5日。在治疗后第14天，在不同的肿瘤模型中，相比于用NHS76治疗的小鼠，B7.1/NHS76治疗小鼠显示了35％-55％的肿瘤生长降低(P≤0.05)。用融合蛋白或对照NHS76治疗的小鼠都未表现出毒性迹象，例如体重下降、昏睡、或皱皮。
用从5μg至120μg的B7.1/NHS76剂量，对荷Colon 26 BALB/c小鼠进行剂量应答研究(参见图5A)。在该剂量范围，B7.1/NHS76治疗导致肿瘤体积减少35-43％，其中在各剂量间无统计学上显著的差异(P＞0.05)。在每剂量30μg下，增加施用频率到每天2次，得到相似的结果。用任何剂量的融合蛋白治疗的小鼠未表现出毒性迹象。
与Treg细胞耗竭的联合治疗研究
如图5B所示，与抗CD4或抗CD25和B7.1/NHS76治疗的联合疗法产生已建立的皮下肿瘤的完全退化。在肿瘤植入后第5天，开始使用抗CD4抗体(GK1.5)，而在肿瘤植入的同一天开始使用抗CD25抗体(PC61)。单独CD25细胞耗竭不诱导显著的肿瘤退化。此外，B7.1/NHS76的抗肿瘤效应被显示为CD8+T细胞依赖性的，因为CD8+耗竭废除了该抗肿瘤效应。
评价治疗肿瘤的浸润淋巴细胞
在治疗后5天，取出荷Colon
26小鼠的肿瘤块，并经受组织学检查，所述荷Colon26小鼠已经被如下治疗每日注射B7.1/NHS76，共5天。被治疗肿瘤的免疫组化染色表明，在用B7.1/NHS76治疗的肿瘤中CD4+和CD8+细胞浸润适度增加，特别是CD8+细胞。与CD25+细胞耗竭的联合治疗进一步增加肿瘤中CD8+T细胞浸润。注意到，T细胞浸润增加直到在后面的时间点才是明显的。相比于对照组，其它细胞群，包括多形核细胞、B细胞、NK细胞和树突状细胞，在肿瘤中并不增加。
因为B7.1对于T细胞上的CTLA-4具有高亲合性，所以B7.1-Fc阻断CTLA-4信号，而不是交联CTLA-4，从而维持肿瘤特异性T细胞的活化或阻止它们的下调。此外，因为对识别肿瘤抗原的活化T细胞的刺激需要较少的共刺激，交联CD28可以比阻断CTLA-4较不重要。由于B7.1-Fc被发现能够体外和体内活化T细胞，因此其可以具有引发刺激信号和抑制负信号的双重功能。可溶的B7.1-Fc也可以起到保护树突状细胞不受负信号影响的作用。
传统地，高度响应性的CD8+记忆T细胞的发展取决于分泌细胞因子例如IL-2和IL-4的CD4+T辅助细胞。然而，如本文所述使用B7.1-Fc的结果表明，CD4+辅助性T细胞对于有效免疫治疗的诱导可以是非必要的。
在体外共刺激T细胞增殖中，B7.1/NHS76比B7.1-Fc更有效，然而，B7.1-Fc作为体内抗肿瘤剂更有效。
T细胞，尤其是CD8+CTLs，在肿瘤免疫治疗中是主要的效应细胞。B7.1-Fc不仅在量上诱导T细胞浸润的显著增加，而且在它们的增殖状态上诱导T细胞浸润的显著增加，如在TDLN研究中所见到的。观察到，来自具有或不具有Treg耗竭的B7.1-Fc治疗小鼠的TDLNs在大小上显著大于来自对照小鼠的那些。此外，B7.1-Fc治疗小鼠的肿瘤表现出在肿瘤中显著的普遍细胞死亡，这不同于在对照治疗小鼠中观察到的，其被发现具有一个或两个大的中心坏死区。这些结果进一步表明效应T细胞导致所观察到的B7.1-Fc治疗的肿瘤退化。
al.2002)。此外，单独的Treg耗竭不产生非常显著的肿瘤退化。
System，采用电穿孔，转染进NS0细胞。使用包被的山羊抗小鼠IgG/IgM和HRP偶联的抗小鼠IgG(Fc特异性的)来捕获培养液上清中的Fc融合蛋白，通过夹心式ELISA测定，选择表达最好的克隆。
为产生大量的融合蛋白，在通风的3-L搅拌瓶中，在含有5％热灭活透析胎牛血清的选择性培养基中培养高表达的克隆，以消除温育期间NS0细胞对蛋白水解酶的诱导、以及消除融合蛋白的断裂。然后，通过串联蛋白A亲合层析和离子交换层析步骤，从澄清的细胞培养上清液纯化分泌的融合蛋白。通过HPLC分析，该融合蛋白以单一的峰出现。
实施例6使用Fc-GITR-L的免疫治疗剂量免疫治疗研究
26细胞的0.2ml接种物在左肋皮下注射六周龄雌性BALB/c小鼠各组(n＝5)。肿瘤生长7天，直到它们的直径达到大约0.5cm。然后，用含130nM、275nM、500nM、或1uM的Fc-mGITRL的0.1ml接种物静脉治疗荷肿瘤小鼠组。作为阳性对照，一个组用3uM抗GITR抗体(DTA-1)每5天腹腔内处理(用星表示)。每隔1天通过测径器测量来监测所有组的肿瘤生长。然后，通过长×宽×高相乘，计算肿瘤体积。用它们的标准偏差对平均肿瘤体积进行绘图。图6中的结果显示了在所有剂量时的清楚的免疫治疗益处。
用含有大约107个Colon 26细胞的0.2ml接种物在左肋皮下注射六周龄雌性BALB/c小鼠组(n＝5)。在肿瘤植入的同一天，一个组还接受0.5mg腹腔内注射的PC61抗体。使肿瘤生长7天，直到它们的直径达到大约0.5cm。然后，用含2.5μg
Fc/GITRL的0.1ml接种物静脉治疗荷肿瘤小鼠组，进行5个连续日。每隔1天通过测径器测量来监测所有组的肿瘤生长。然后，通过长×宽×高相乘，计算肿瘤体积。用它们的标准偏差对平均肿瘤体积进行绘图。图7中的结果显示，给予2.5μg Fc/GITRL和抗CD25抗体的组的肿瘤生长比仅给予两种治疗之一的组更加显著得多。
在说明书中提及的所有专利和出版物指示了本发明所属技术领域内的普通技术人员的水平。所有专利和出版物被并入本文作为参考，参考的程度如同每一个单独的出版物被具体地和单独地指出并入作为参考的程度一样。
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of)”的任何一个可以用其它两个术语的任一个替换。已使用的术语和表达被用作描述性术语，而非限制性术语，并且不意图在此类术语和表达的使用中排除所示出和描述的特征的任何等价物或它们的部分，但应该认识到，在所要求保护的发明范围内各种改变是可能的。因此，应当理解，尽管已经通过优选的实施方式和任选的特征具体地公开了本发明，但是本领域普通技术人员可以采取本文所公开的概念的改变和变化，并且此类改变和变化被认为在如所附权利要求所限定的本发明的范围内。其它实施方式在下面的权利要求中加以阐述。
权利要求 1.一种降低个体中肿瘤大小或抑制癌细胞生长或降低或抑制患有癌症的个体中转移癌发展的方法，其包括a)施用来源于抗原呈递细胞的共刺激分子的可溶形式，所述可溶形式包括所述共刺激分子的一个或多个胞外结构域，所述可溶形式作为T细胞活化的共刺激因子起作用；和b)治疗所述个体，以降低免疫调节T细胞活性。
3.权利要求2所述的方法，其中所述共刺激分子是B7。
4.权利要求3所述的方法，其中所述B7共刺激分子是B7.1。
5.权利要求2所述的方法，其中所述共刺激分子是GITR-L。
6.权利要求1所述的方法，其中所述共刺激分子的所述可溶形式被连接到另一蛋白。
7.权利要求6所述的方法，其中所述共刺激分子的所述可溶形式通过肽连接体被连接到其它蛋白。
8.权利要求7所述的方法，其中所述连接体是免疫球蛋白铰链区或其部分。
9.权利要求1所述的方法，其中所述其它蛋白是免疫球蛋白。
10.权利要求6所述的方法，其中所述其它蛋白是免疫球蛋白Fc。
11.权利要求6所述的方法，其中所述共刺激分子的可溶形式是同型二聚蛋白，其中所述同型二聚蛋白的每一个多肽包括所述共刺激分子的所述一个或多个胞外结构域和免疫球蛋白的铰链区、CH2和CH3结构域。
12.权利要求6所述的方法，其中所述其它蛋白是抗体。
13.权利要求12所述的方法，其中所述抗体包括两条重链和两条轻链。
14.权利要求13所述的方法，其中所述共刺激分子的所述一个或多个胞外结构域被连接到每一条重链的可变区。
15.权利要求12所述的方法，其中所述抗体对于肿瘤细胞表面抗原是特异性的。
16.权利要求12所述的方法，其中所述抗体对于肿瘤的基质成分是特异性的。
17.权利要求12所述的方法，其中所述抗体对于胞内抗原是特异性的。
18.权利要求17所述的方法，其中所述抗体对于核内抗原是特异性的。
19.权利要求18所述的方法，其中所述抗体是鼠抗体TNT-1、TNT-2或TNT-3的鼠形式、嵌合形式、人源化形式或人形式，或者是NHS76。
20.权利要求12所述的方法，其中所述共刺激分子是B7.1。
21.权利要求1所述的方法，其中通过从所述个体离体除去免疫调节T细胞而实现降低免疫调节T细胞的活性。
22.权利要求1所述的方法，其中通过向所述个体施用耗竭或失活所述个体中的免疫调节T细胞的试剂而实现降低免疫调节T细胞的活性。
23.权利要求1所述的方法，其中使用至少一种结合免疫调节T细胞的抗体而实现降低免疫调节T细胞的活性。
24.权利要求23所述的方法，其中所述抗体选自抗CD4、抗CD25、抗神经毡蛋白和抗CTLA4。
25.权利要求1所述的方法，其中通过施用GITR配体激动剂而实现降低免疫调节T细胞的活性。
26.权利要求23所述的方法，其中所述抗体是鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
27.权利要求1所述的方法，其中降低免疫调节T细胞的活性在施用所述共刺激分子的所述可溶形式之前进行。
28.权利要求1所述的方法，其中降低免疫调节T细胞的活性在施用所述共刺激分子的所述可溶形式之后进行。
29.权利要求1所述的方法，其中降低免疫调节T细胞的活性基本上与施用所述共刺激分子的所述可溶形式同时进行。
30.权利要求1所述的方法，进一步包括施用对所述肿瘤细胞或癌细胞具有细胞毒性活性的T细胞。
31.权利要求30所述的方法，其中所述施用T细胞包括从所述个体移出T细胞、活化所述T细胞、然后将所述活化的T细胞施用于所述个体。
32.一种癌症治疗剂，包括选自B7、CD137-L、CD134-L、GITR-L和CD40的共刺激分子的可溶形式，其中所述共刺激分子的可溶形式是融合蛋白，该融合蛋白包括所述共刺激分子的一个或多个胞外域结构域和抗体，其中所述抗体对胞内抗原是特异性的。
33.权利要求32所述的癌症治疗剂，其中所述抗体对于核内抗原是特异性的。
34.权利要求33所述的癌症治疗剂，其中所述抗体是鼠抗体TNT-1、TNT-2或TNT-3的鼠形式、嵌合形式、人源化形式或人形式。
35.权利要求34所述的癌症治疗剂，其中所述抗体是NHS76。
36.权利要求32所述的癌症治疗剂，其中所述共刺激分子是B7.1。
全文摘要 提供了降低个体中肿瘤大小或抑制癌细胞生长或抑制转移癌发展的方法，其通过施用有效量的来自抗原呈递细胞的共刺激分子的可溶形式和通过降低所述个体中免疫调节T细胞的活性而进行。降低免疫调节T细胞活性的方法包括离体除去它们或体内使它们耗竭或失活。还提供了癌症治疗组合物，其包括来自抗原呈递细胞的共刺激分子的可溶形式和对胞内抗原特异性的抗体。
A·L·爱泼斯坦, P·胡 申请人:南加州大学
