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槐米中芦丁含量的测定解读.ppt 19页
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BREAD PPT DESIGN 槐米中芦丁含量的测定
槐树原产于中国。它用途广泛，功能大，是一种集药用、食用、保健、观赏于一身的优良树种。槐树自古是治病的重要药源植物，被誉为“金药树”槐树依据其花色分为白、青、黄、金槐等4个类别.除了国槐外，槐树还有龙爪槐、蝴蝶槐、金叶国槐、五色槐、黄金槐、双季米槐、香花槐和金花槐等变种。
它全身都是药，花、叶、枝、根、果实及种子均可入药，以槐花入药最普遍。洋槐五月开花，其花一般食用，国槐七八月才开花，其花入药。故我国药用槐米多出自国槐。 金药树—槐树 槐米 2010年《中华人民共和国药典》规定，槐树的药用部分为干燥的花朵及花蕾。前者习称“槐花”，后者习称“槐米”。
槐米中含有芦丁、槲皮素、皂甙、多糖黏液质等成分，其中,芦丁是主要药用成分,因此对其研究有非常现实的意义。 芦丁
芦丁是一种黄酮类化合物。槐米中的芦丁随槐花的产地及收取时间的不同其含量在10%～28%之间，我国芦丁生产主要以槐米为原料。
芦丁的药理作用 抗炎作用 抗氧化作用 抗菌作用 抗癌作用 对脑缺血损伤的保护作用 对肾脏缺血损伤的保护作用 降血压作用 胃肠粘膜保护作用
芦丁的化学特性
芦丁分子式C27H30O16，分子量610.51，为浅黄色针状结晶，难溶于冷水，可溶于热水、甲醇、乙醇、吡啶，易溶于碱水。
芦丁提取技术概述
5 醇溶剂浸提法 热水提取法 碱提酸沉降法
超声辅助提取法
微波提取法 超声波辅助提取法 利用超声波的空化效应、湍流效应、微扰效应、界面效应和聚能效应等物理作用，加速被破碎物细胞壁的破裂，促进细胞内含物的溶出，从而实现天然产物低温、快速提取的目标。具有杂质含量低、有效成分含量高、提取时间短的优点。 芦丁为细胞中的次生代谢产物，存在于细胞质中；通过粉碎，破坏细胞壁和细胞膜，也就使芦丁易于被提取出来。碱液对芦丁有增溶作用，用碱液浸泡后，能使更多的芦丁溶解出来，同样也有利于芦丁的提取。 水平 因素 A B C 料液比 提取时间 温度 1 1:10 7 15 2 1:15 10 25 3 1:20 13 35 因素设计 查正交实验表，根据L9（34）设计实验 试验号 水平组合 实验条件 料液比 提取时间 温度 1 A1B1C1 1:10 7 15 2 A1B2C2 1:10 10 25 3 A1B3C3 1:10 13 35 4 A2B1C2 1:15 7 25 5 A2B2C3 1:15 10 35 6 A2B3C1 1:15 13 15 7 A3B1C3 1:20 7 35 8 A3B2C1 1:20 10 15 9 A3B3C2 1:20 13 25 实验流程 槐米粉碎 过40筛目 按一定料 液比混合 加入亚硫氢钠、 硼砂,用氢氧化 钠调PH至9 超声提取 酸沉 用盐酸将PH调至3 离心过滤 芦丁粗提产品 滤液静置、干燥 芦丁标准曲线的绘制
精密称取在120℃减压干燥至恒重的芦丁标准品200mg，置100mL容量瓶中，加甲醇70mL，置水浴上微热使溶解，放冷，加甲醇至刻度，摇匀。精密吸取10mL，置100mL量瓶中，加水至刻度，摇匀即得（每1mL中含无水芦丁0.2mg）。精密量取上述标准溶液0mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL与6.0mL分别置25mL容量瓶中，各加水至6mL，加5％亚硝酸钠溶液1mL使混匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液1mL摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10mL，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟；按照分光光度法，在500nm的波长处比色测定吸光度，以吸光度为纵坐标，芦丁浓度为横坐标，绘制标准曲线。
取干燥芦丁粗品约1g，精密称定，加甲醇溶解后移入100mL容量瓶，再加甲醇洗涤并入容量瓶，加甲醇至刻度，摇匀。精取10mL置100mL容量瓶，加水至刻度，摇匀。精密量取3mL置25mL容量瓶中，按照标准曲线制备项下的方法，自“加水至6mL”起依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中芦丁的浓度，计算即得槐米中芦丁的提取得率。
芦丁的提取率测定 芦丁的纯化——大孔树脂 减法测定法 树脂的预处理
新鲜树脂先用乙醇浸泡2次，每次12h，滤去浮游物和破碎树脂，再用甲醇浸泡2～3次至上清液澄清，最后用去离子水清洗1～2次.采用湿法上柱，并用和洗脱剂同浓度的甲醇水溶液冲洗2～3柱体积，以达到该浓度下的平衡状态。
用过的树脂，用足量甲醇浸泡使吸附物解吸达到再生的目的。如果反复使用树脂吸附效果下降，可用3%NaOH及10%NaCl混合液浸泡清洗12h，滤去溶剂并用去离子水充分洗涤至呈中性时即可。 提纯方法
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中药槐花米中芦丁的含量不得少于8%含量您所在位置：
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槐米中芦丁和槲皮素含量测定方法研究进展
作者：王立军 曹晓钢 于刚 牛小花&&&&作者单位：西南大学药学院药用资源化学研究所,重庆 400716
【关键词】& 槐米 芦丁 槲皮素 含量测定 综述
槐米中的主要有效成分是芦丁和槲皮素等黄酮类物质。芦丁具有广泛的药理活性,能维持及恢复毛细管的正常弹性,增强其抵抗力,防止血细胞凝聚,临床用于防治脑溢血、高血压等心脑血管疾病[1]；槲皮素具有抗炎、抗氧化、抗过敏、抗菌、抗病毒等多方面的药理作用[2]。我国是芦丁的出口国,槐米是提取芦丁的主要原料,2005版《中华人民共和国药典》(一部)规定,槐米中总黄酮的含量(以无水芦丁计)不低于20%,无水芦丁(C27H30O16)不少于15%[3]。因此,研究槐米中芦丁和槲皮素含量测定方法对槐米质量控制有很重要的意义。现将槐米中芦丁和槲皮素的含量测定方法综述如下。
1& 分光光度法
1.1& 等吸收紫外光度法
李氏等[4]用等吸收紫外光度法同时测定槐米中的芦丁和槲皮素。分别配制槲皮素和芦丁的单组分标准溶液,测定它们在波长240～380 nm的吸光度,经过粗选和细选,分别找出槲皮素和芦丁的等吸收波长&1247、&2266、&3340、&4370。然后分别配制一系列浓度的芦丁、槲皮素溶液,测定其在波长247 nm和266 nm、波长340 nm和370 nm处的吸光度,计算其对应的吸光度差值,分别作出&DA-C校准曲线及线性回归方程。用上述方法测定槐米中芦丁和槲皮素的含量。将槐米的乙醇提取物配制成一系列不同浓度的甲醇溶液,在波长247 nm和266 nm、340 nm和370 nm下分别测定其吸光度值,并计算吸光度差值,据回归方程计算芦丁和槲皮素的浓度。然后分别计算样品中芦丁和槲皮素的含量,6个样品中芦丁平均含量为80.60%,RSD＝1.61%；槲皮素平均含量为9.49%,RSD＝1.53%。
1.2& 荧光光度法
利用铝与槲皮素形成荧光配合物,姚氏等[5]采用荧光光度法测定槲皮素。文献中选择测定条件为激发波长365 nm,发射波长498 nm,测定温度为室温,溶液酸度控制为pH＝6,选用2&102 mol/L铝标准溶液。在10 mL比色管中,加入一定量的槲皮素标准溶液,再加入三氯化铝标准液1 mL,用95 %乙醇稀释至刻度,振摇均匀后放置15 min,用1 cm比色皿,在960型荧光光度计上测其荧光强度,同时做空白试验,绘制工作曲线。将槐米乙醇提取物用蒸馏水溶解,过聚酰胺柱,待水解液过完后,再用蒸馏水洗柱3次,用95 %乙醇洗柱,洗至醇洗液加三氯化铝无荧光反应。合并乙醇洗液,测其中样品的含量。方法加标回收率97.8%～100.0%,RSD＝2.58%(n＝6)。
1.3& 催化动力学光度法
在盐酸介质中,微量芦丁对重铬酸钾氧化靛红的反应有明显的催化作用,崔氏等[6]建立了测定芦丁的催化动力学光度法。取2只10 mL具塞刻度试管,其中一只加入一定量的芦丁标准液,另一只不加,再分别依次加入0.60 mL 0.10%靛红溶液、0.90 mL 0.30 mol/L盐酸溶液、1.10 mL 0.010 mol/L K2Cr2O7溶液,然后加水至刻度,摇匀,反应10 min后,以水为参比,用1 cm比色皿于611 nm波长处测量非催化体系的吸光度A0和催化体系的吸光度A并计算&DA。将槐米乙醇提取液按实验方法进行测定,同时做标准加入回收实验。方法的线性范围是0.003～0.09 &g/mL和0.10～100 &g/mL,检出限为0.003 &g/mL,回收率为95.5%～102.5%(n＝4)。
1.4& 固相萃取-分光光度法
李氏等[7]采用固相萃取-分光光度法联用来测定中药槐米中芦丁含量。准确配制不同浓度的芦丁标准溶液,用移液管准确量取溶液置于100 mL量瓶中,加甲醇至5 mL体积,加0.30 mL 5% NaN02溶液,放置6 min；再加0.30 mL 10% Al(NO3)3溶液,放置6 min；再加4.00 mL 4% NaOH溶液,最后加甲醇至刻度,摇匀。室温放置15 min后,在紫外分光光度计上于&＝500 nm处测定吸光度,处理数据得回归方程。样品测试：先用5 mL石油醚洗柱,再用5 mL甲醇洗柱,最后加水5 mL洗柱；加槐米甲醇提取溶液上柱,每2 mL为单位收集流出液。UV测定：以第7～8 mL流出液测试并进行数据处理得原药材样品中芦丁的含量为29.1%。将标准品溶液及原药材样品液定量混合后依上法进行分析,平均回收率为99.98%,RSD＝0.012%(n＝3)。
1.5& 卡尔曼滤波光度法
王氏等[8]采用卡尔曼滤波光度法同时测定槐米中芦丁和槲皮素含量。准确配制芦丁、槲皮素甲醇标准溶液2个系列(每个系列3～5个)溶液。取上述系列标准溶液,在230～300 nm范围内,每间隔2 nm测其吸光度,数据进行线性回归处理,求出各自的吸光系数。取芦丁、槲皮素浓度一定的模拟样品分别测定5次,计算RSD分别为2.54%和1.54%。取已知含量的模拟样品6个,加入芦丁、槲皮素适量,测定其含量,方法的平均回收率分别为：芦丁99.1%(n＝6,RSD＝1.58%),槲皮素99.2%(n＝6,RSD＝1.98%)。槐米提取物中芦丁和槲皮素的测定：准确称取一定量样品,用甲醇提取后,以上述方法测得芦丁含量为82.32%, RSD＝0.45%,槲皮素含量为9.59%,RSD＝1.2%(n＝3)。
1.6& 阻抑动力学光度法
张氏等[9]利用在稀硫酸介质中,微量芦丁对高碘酸钾氧化玫瑰桃红R褪色反应有明显的阻抑作用,据此建立了测定微量芦丁的动力学光度法。取2支10 mL具塞刻度试管,分别加入0、0.4 mL芦丁标准溶液,再分别依次加入3 mol/L H2SO4 1.0 mL、 0.5 g/L玫瑰桃红R溶液1.0 mL、0.01 mol/L的KIO4溶液0.7 mL,加水稀释至刻度,混匀。在(94&0.1)℃恒温水浴加热反应4 min后,迅速启开管塞用流水冷却4 min,以水为参比,用1 cm吸收皿在分光光度计上于521 nm波长处测量褪色体系的吸光度A0和阻抑褪色体系的吸光度A,计算&DA＝A－A0的值。分别移取不同量芦丁标准溶液置于一批10 mL具塞刻度试管中,按实验方法操作,根据所得结果绘制工作曲线,芦丁质量浓度在0.02～0.4 &g/mL范围内与&DA呈线性关系,得线性回归方程；对空白溶液进行11次平行实验测定,按3倍标准偏差计算出检出限为5.0&10-9 g/mL。将槐米乙醇提取液按实验方法进行测定,同时做标准加入回收实验,回收率95.5%,RSD＝2.8%(n＝4)。
1.7& 薄层色谱-化学衍生荧光分光光度法
傅氏等[10]采用薄层色谱-化学衍生荧光分光光度法测定槐米中芦丁的含量。实验方法是以95%乙醇为溶剂进行索氏提取,用醋酸乙酯-甲酸-水(4∶1∶1)为展开剂分离,洗脱后以10% AlCl3甲醇溶液作为反应试剂,在激发波长420 nm、发射波长513 nm处测定荧光强度。结果此方法的线性范围为0.2～1.2 &g/mL,平均回收率为98.7%,RSD＝2.71%,利用外标两点法计算样品中芦丁的含量。测定5份槐米市售样品中芦丁的含量,得槐米原药材中芦丁的含量为21.33%,RSD%＝3.78%。
2& 液相色谱法
2.1& 高效液相色谱法
邓氏等[11]用高效液相色谱法来检测槐米中芦丁的含量。色谱条件：分析柱为Nova-Pak C18柱(150 mm&4.6 mm),流动相为甲醇-水(35∶65,v/v),应用前经0.45 &m的过滤膜,超声脱气,流速为1.0 mL/min,AUFS 0.05,进样量为10 &L,柱温为30 ℃,检测波长为261 nm。槐米用乙醇提取,以外标法定量,测得槐米中芦丁的含量为22.67%,平均回收率>96.32%(n＝5)。此法对芦丁的最低检测浓度为0.5 &g/mL,最低检测限(10 &L)5 ng。
2005年版《中华人民共和国药典》中芦丁的测定方法采用高效液相色谱法[3]。色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：甲醇-1%冰醋酸(32∶68)；检测波长：257 nm；进样量10 &L,理论塔板数不低于2 000。样品用甲醇超声提取,甲醇定容,干燥槐米中芦丁含量不得少于15.0%。
2.2& 反相高效液相色谱法
程氏等[12]采用反相高效液相色谱法来测定。色谱柱：HP-HEWL ETT ODS(125 mm&3.0 mm,3 &m)反相柱；流动相：乙腈-四氢呋喃-0.2%枸椽酸溶液(14∶1∶85)；流速：0.4 mL/min；检测波长：360 nm；柱温：30 ℃；进样量：5 &L。用标准加入法测得芦丁、槲皮素平均回收率分别为99.75%(RSD＝0.57%)和99.42%(RSD＝1.19%,n＝5)。槐米用甲醇超声提取,测得槐米样品中芦丁含量24.46%,RSD＝0.18%,槲皮素含量1.41%,RSD＝2.0%(n＝3)。
朱氏等[2]测定了槐米中槲皮素的含量。采用的色谱条件：Shim-Pack CLC-ODS(150 mm&6.0 mm,5 &m)色谱柱；室温；流动相：甲醇-水(用乙酸调pH值为3.3)为55∶45(V/V)；流速：1.0 mL/min；检测波长370 nm；进样量20 &L。槐米用甲醇提取,根据标准曲线得粗制品中槲皮素平均含量为812.0 &g/mg,得精制品中槲皮素平均含量为908.0 &g/mg,槐米中槲皮素的含量为59.8 mg/g。平均回收率99.98%&2.71%,RSD＝2.71% (n＝4)。
使用与文献[2]一样的色谱柱,徐氏等[13]测定了槐米中槲皮素的含量。色谱条件：流动相为甲醇-0.4%磷酸溶液(7∶3)；流速为0.8 mL/min；检测波长为375 nm；柱温为30 ℃；进样量为5 &L。该方法的线性范围为10.03～100.3 ng,r＝0.999 7；平均回收率为99.06%,RSD＝2.07%(n＝9)。槐米用甲醇盐酸回流提取,测定分析了4批样品中槲皮素的含量分别为12.62% (RSD＝0.66%)、9.66%(RSD＝1.07%)、9.13%(RSD＝O.74%)、11.19% (RSD＝O.42%)(n＝3)。
2.3& 毛细管电泳法
周氏等[14]探讨了毛细管电泳法测定槐米中槲皮素和芦丁的含量。背景缓冲液为30 mmol/L硼砂溶液(pH＝9.0),3 000 Pa压力下进样30 ms,分析电压20 kV,254 nm检测,温度25 ℃。将干燥的槐米微波萃取后,测得槐米中槲皮素含量3.0 mg/g(RSD＝2.1%,n＝5),芦丁含量211.0 mg/g(RSD＝1.6%,n＝5)。
张氏等[15]自制微型碳糊电极,采用高效毛细管电泳-安培检测法对芦丁水解常数进行了研究,并用于芦丁和槲皮素的检测。在恒温杯中注入芦丁溶液；另将装有盐酸溶液的容量瓶同时置于恒温槽中。15 min后,迅速将盐酸溶液倾入恒温杯中并加以搅拌,同时记录时间。然后每隔相应的时间,移取1.0 mL上述水解混合液,迅速加入9.0 mL 20 mmol/L磷酸钠(pH＝8.0)溶液,冷却,以终止水解反应,并记录水解时间。电泳分离条件：电泳液的酸度为pH＝8.0的磷酸盐缓冲液(20 mmol/L),分离电压为15 V,电动进样时间为10 s。末端检测,工作电位+1000 mV,检测限分别为0.6 mg/L和2.0 mg/L,平均回收率97.6%。
陈氏等[16]使用自组装的毛细管电泳-电化学检测(CE-ED)装置,电化学检测池为三电极体系：碳圆盘电极为工作电极,饱和甘汞电极(SCE)为参比电极,铂丝为辅助电极。通过三维定位调节器使工作电极与毛细管出口在一条直线上,并尽可能靠近毛细管末端。采用电动进样,条件为在12 kV下从毛细管阳极端进样6 s,检测池为阴极电泳槽。100 mmol/L硼酸盐缓冲液(pH 9.0)为运行缓冲液。在槐米样品溶液中准确加入芦丁和槲皮素的标准溶液,5次测得平均回收率为97.89%(芦丁)和96.83%(槲皮素),RSD分别为2.06%和2.42%。
李氏等[17]自组装CE-ED,同样使用电化学检测方法,用Ag/AgCl做参比电极,铂丝为辅助电极。扫描时间2 min,电压-0.5～1.5 V,工作电位100 mV,测定时间3 min。电泳测定的最佳条件：测定电位1.2 V,分离电压12 kV,15 kV下进样5 s,缓冲液为20 mmol/L含40 mmol/L SDS和10%乙腈的硼酸盐溶液(pH＝8.8)。芦丁和槲皮素的最低检测下限分别为0.001 mg/mL和0.000 5 mg/mL,样品中两物质含量分别为3.63%和2.59%。
Qingcui Chu等[18]的电泳条件及检测方法与文献[17]基本一致。样品处理：分别称取大约2 g生槐米和炒制槐米,研碎后精密称取,然后用10 mL无水乙醇-水(4∶1)混合溶液超声提取30 min,过滤后测定。芦丁和槲皮素的检测下限分别为2.0&10-7、2.8&10-7 g/mL,RSD分别为2.3%、2.2%。
3& 薄层扫描法
王氏[19]用薄层扫描法来测定槐米中芦丁含量。自制薄层板(硅胶G-硼酸-枸橼酸＝100∶0.9∶0.3；用0.3% CMC-Na水溶液湿法铺板；10 cm&20 cm,厚0.5 mm),展开剂为乙酸乙酯-丁酮-正丁醇-甲酸-水(10∶6∶1∶2∶2),检测波长为360 nm,单波长锯齿扫描,狭缝0.2 mm&0.3 mm,Sx＝5。槐米用甲醇提取,外标两点法测定供试品中芦丁的平均含量,为25.75%,RSD＝1.05%(n＝3)。平均加样回收率为98.52%,RSD＝1.76%(n＝5)。
4& 电化学分析法
4.1& 单扫示波极谱法
马氏等[20]采用单扫示波极谱法测定槐米中芦丁含量。pH＝3.5的0.1 mol/L NaAc-HAc溶液为底液,分别取不同量的1.0 mol/L芦丁标准溶液于10 mL容量瓶中,加支持电解液至刻度,摇匀。在JP3-1型示波极谱仪上单扫记录二阶导数还原波。扫描电位：-1.10～-1.60 V。样品中芦丁的测定：槐米加乙醇回流提取后,然后将提取液于10 mL电解杯中,加入10 mL pH＝3.5的0.1 mol/L NaAc-HAc溶液,用单扫示波极谱法测定。结果槐米中芦丁含量为21.41%&0.16%(n＝6),RSD＝0.74%。
4.2& 伏安法
Jing-Lin He等[21]测定原理基于&-环糊精对芦丁的作用,采用&-环糊精膜电极为工作电极,用循环伏安法测定了槐米中芦丁的含量。膜电极的制作：将2 mg的多壁碳纳米管(MWNT)和1 mL&-环糊精混合,超声搅拌,得2 mg/mL的黑色悬浮物；将玻璃电极刨光后,分别用蒸溜水和乙醇超声清洗2次,然后将6 &L上述悬浮物滴到玻璃电极上,在室温下,空气中干燥24 h。测定方法：将电极插入含芦丁的0.1 mol/L磷酸缓冲溶液(pH 3.0)中搅拌4 min,工作电位+0.8～0.1 V,扫描速度20 mV/s,检测下限为2.0&10&7 mol/L。
5& H-point法
陈氏等[22]H-point法在灰色体系中的应用,利用标准加入系列光谱数据测定了槐米中芦丁的含量。扫描区间200～450 nm,速度为10 nm/min,狭缝宽度为2 nm。测定方法：精密量取不同体积的芦丁标准溶液,分别置于25 mL不同量瓶中,加入样品1.0 mL,并加水至刻度,摇匀,在200～450 nm扫描各标准加入样品的光谱。样品中芦丁含量为16.17%,RSD＝3.37%(n＝5),平均回收率100.6%,RSD＝3.11%(n＝7)。
6& 讨论
分光光度法是一种比较经济的测定方法,但在分光光度法中,其它黄酮类化合物干扰芦丁和槲皮素的测定,影响测定结果。因此,众多学者对新的分光光度法应用于槐米中芦丁和槲皮素含量测定研究较多,如文献[4]等吸收紫外光度法和文献[8]卡尔曼滤波光度法,芦丁和槲皮素不需要预先分离可直接同时测定两者含量,方法简便、快速,相对标准偏差小于2%。文献[5,10]利用芦丁、槲皮素与铝形成荧光配合物进行含量测定,方法的灵敏度较高。文献[6,9]利用芦丁的催化作用建立的动力学光度法选择性和重现性较好,灵敏度较高。文献[2,11-13]中的高效液相色谱法可对槐米中的芦丁、槲皮素等成分进行有效分离和准确的含量测定,具有效率高、灵敏度高、重现性好、操作自动化等优点,现在已经成为国家药典槐米中芦丁含量的法定测定方法,但检测时间较长,仪器和试剂较贵。文献[19]薄层扫描法测定槐米中芦丁的含量,操作简便、快速、分离度好,但误差较大。文献[20-21]应用电化学分析方法对槐米中芦丁和槲皮素含量测定进行了探讨,分析结果较好,并且具有分析速度快、操作成本低及试剂用量小等优点,但是稳定性较差,误差较大。文献[14-18]应用CE-ED法,不但分离效率好,而且灵敏度高。文献[22]将H-point法应用于槐米中芦丁的测定,能消除干扰组分的影响和基底误差,方法简便、快速。综合上述测定方法,虽然高效液相色谱法费用较高,但从稳定性、重现性、准确度、灵敏度等方面来看,高效液相色谱法要优于其他测定方法。
【参考文献】
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