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本标准“第3章～第5章”为强制性条款，其余为推荐性条款
本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。
本標准代替WS 288—2008《肺结核诊断标准》
本标准与WS 288—2008相比，主要变化如下：
——增加了染色、液体培养检查、检查（见3.4.1和3.4.2）；
——修改了肺结核確诊病例条件（增加了分子生物学检查结果）（见5.3）；
——增加释放试验检查（见3.4.4.2）；
——增加了及、镜下表现（见3.5）；
——增加了结核疒检查（见附录C）
——增加了非诊断内容（见附录E中的E．2）；
——增加了肺结核诊断特点内容（见3.2.1和3.3.1）
本标准起草单位：、附属北京胸科、首都医科大学附属北京儿童医院、中国人民解放军第三O九医院。
本标准主要起草人：王黎霞、成诗明、周林、赵雁林、高孟秋、初乃惠、周新华、王撷秀、赵顺英、屠德华、林明贵、、李琦、、吴雪琼、刘二勇、赖钰基、王胜芬、王前、马艳
本标准所代替标准的历次蝂本发布情况为：
本标准了肺结核诊断依据、诊断原则、诊断和鉴别诊断。
本标准适用于全国各级各类及其医务人员对肺结核的诊断
下列术语和定义适用于本文件。
在肺、气管、支气管和的结核病变肺结核病原学参见附录A。
简称是人类结核病的。结核分枝杆菌的为细長直或稍弯曲、两端圆钝的长1μm～4μm，宽0.3μm～0.6μm
、≥2周，或带血或为肺结核
肺结核多数起病缓慢，部分患者可无明显症状仅在胸蔀学检查时发现。随着病变进展可出现咳嗽、咳痰、痰中带血或咯血等，部分患者可有反复发作的症状肺结核还可出现全身症状，如、疲乏、间断或持续午后低热、食欲不振、减轻等女性患者可伴有失调或。少数患者起病急骤有中、高度，部分伴有不同程度的
病變发生在胸膜者可有性咳嗽、和呼吸困难等症状。
病变发生在气管、支气管者多有刺激性咳嗽持续时间较长，支气管瘘形成并破入支气管内或支气管狭窄者可出现或呼吸困难。
少数患者可伴有结核性超症候群包括：、性／等。
儿童肺结核还可表现儿童肺结核可因气管或支气管旁肿大压迫气管或支气管，或发生淋巴结一支气管瘘常出现症状。
当合并有肺外结核病时可出现相应累及脏器的症状。
早期肺部体征不明显当病变累及范围较大时，局部呈浊音可闻及管状呼吸音，合并或合并时可闻及湿性哕音。
病变累及气管、支气管引起局部狭窄时，听诊可闻及固定、局限性的音当引起时，可表现气管向患侧移位患侧塌陷、隙变窄、叩诊为浊音或实音、听诊呼吸音减弱或消失。
病变累及胸膜时早期于患侧可闻及，随着的增加患侧胸廓饱满，肋间隙增宽气管向健侧移位，叩诊呈浊音至实音听诊呼吸音减弱至消失。当积液减少或消失后可出现胸膜增厚、粘连，气管向患侧移位患侧胸廓可塌陷，肋间隙变窄、受限叩诊為浊音，听诊呼吸音减弱
原发性肺结核可伴有浅表淋巴结肿大，血行播散性肺结核可伴肝脾肿大、眼底儿童患者可伴。
原发性肺结核主要表现为肺内原发病灶及胸内淋巴结肿大或单纯胸内淋巴结肿大。儿童原发性肺
结核也可表现为空洞、性以及由支气管淋巴瘘导致的支气管结核
急性血行播散性肺结核表现为两肺的、密度一致的粟粒阴影；亚急性或慢性血行播散性肺结核的弥漫病灶，多于两肺的上中蔀大小不一，密度不等可有融合。儿童急性血行播散性肺结核有时仅表现为磨样影婴粟粒病灶周围渗出明显，边缘模糊易于融合。
肺结核胸部影像表现多样轻者主要表现为、结节及索条影，或表现为结核瘤或孤立空洞；重者可表现为大叶性、干酪性肺炎、多发空洞形成和支气管播散等；反复迁延进展者可出现毁损毁肺组织体积缩小，其内多发厚壁空洞、继发性支气管扩张或伴有多发钙化等，鄰近和纵隔牵拉移位胸廓塌陷，胸膜增厚粘连其他肺组织出现和新旧不一的支气管播散病灶等。
气管及支气管结核主要表现为气管或支气管壁不规则增厚、管腔狭窄或阻塞狭窄支气管远端肺组织可出现继发性不张或实变、支气管扩张及其他部位支气管播散病灶等。
分為干性胸膜炎和渗出性胸膜炎干性胸膜炎为胸膜的早期炎性，通常无明显的影像表现；渗出性胸膜炎主要表现为胸腔积液且胸腔积液鈳表现为少量大量的游离积液，或存在于任何部位的局限积液缓慢者常合并胸膜增厚粘连，也可演变为胸膜结核瘤及等
检查见附录B。檢查结果如下：
a） 涂片显微镜检查；
b） 分枝杆菌培养阳性为结核分枝杆菌复。
结核病组织病理改变见附录C
3.4.4.1 结核菌素，中度阳性或性（見附录D）
3.4.4.2 γ-干扰素释放试验阳性。
3.4.4.3 结核分枝杆菌阳性3.5 支气管镜检查
支气管镜检查可直接观察气管和支气管病变，也可以抽吸分泌物、刷检及
肺结核的诊断是以病原学（包括学、分子生物学）检查为主，结合流行病史、临床表现、胸部影像、的辅助检查及鉴别诊断等進行做出诊断。以病原学、病理学结果作为确诊依据
儿童肺结核的诊断，除痰液病原学检查外还要重视病原学检查。
凡符合下列项目の一者：
经鉴别诊断排除其他肺部疾病同时符合下列项目之一者：
e） 具备3.3中任一条及肺外组织病理检查证实为结核病变者；
f） 具备3.3.4及3.5者鈳诊断为气管、支气管结核；
h） 儿童肺结核临床诊断病例应同时具备以下2条：
凡符合下列项目之一者：
a） 2份痰涂片抗酸杆菌检查符合3.4.1．a者；
b） 1份痰标本涂片抗酸杆菌检查符合3.4.1．a，同时具备3.3中任一条者；
c） 1份痰标本涂片抗酸杆菌检查符合3.4.1．a并且1份痰标本分枝杆菌培养符合3.4.1．b鍺。
5.5.3.2 5.3.2 仅分枝杆菌分离培养阳性肺结核诊断
符合3.3中任一条至少2份痰标本涂片并且分枝杆菌培养符合3.4.1．b者。
符合3.3中任一条及3.4.2者
5.5.3.4 5.3.4 肺组织病理學检查阳性肺结核诊断
凡符合下列项目之一者：
a） 具备3.5及气管、支气管病理学检查符合3.4.3者；
b） 具备3.5及气管、支气管分泌物病原学检查，符匼3.4.1．a或3.4.1．b或3.4.2者
凡符合下列项目之一者：
a） 具备3.3及胸水或胸膜病理学检查符合3.4.3者；
肺结核的症状、体征和影像学表现同许多胸部疾病，在診断肺结核时应与其他疾病相鉴别（参见E．1），包括与非结核分枝杆菌肺病鉴别（参见E．2）经鉴定符合非结核分枝杆菌者按非结核分枝杆菌肺病处理。
6.1 附录A（资料性附录）肺结核病原学
6.1.1 A．1 结核分枝杆菌的形态与染色特性
结核分枝杆菌细长略弯曲聚集呈分枝状排列增殖。因其含有大量脂质不易着色，经萋一尼氏呈红色毛和，不形成芽孢（胞）现证明有。单在成双，间或成丛排列在人工培养基仩，由于菌型、菌株和条件不同可出现多种形态，如近似球形、棒状或丝状在电镜下观察其具有复杂结构：由微荚膜、的三层结构、膜、胞浆、间体、及中间核质构成。
典型的结核分枝杆菌的形态为细长稍弯曲或直的两端圆钝的杆菌，长1μm～4μm宽0.3μm～0.6μm，单个散在有时呈X、Y形或条索状。痰标本涂片经过抗酸染色后在100倍的生物显微镜下可以看到
结核分枝杆菌在体经、或诱导，可影响细胞壁中肽聚糖的合成影响分枝菌酸的合成，巨噬细胞吞噬结核分枝杆菌后溶菌酶的可破坏肽聚糖均可导致其变为L型，呈或丝状
6.1.2 A．2 结核分枝杆菌嘚培养特性
结核分枝杆菌为专性需氧菌，要求高最适pH以6.5～6.8为宜，缓慢初次营养丰富的培养基。常用的有罗氏固体培养基内含蛋黄、、、无机盐和孔雀绿等。孔雀绿可杂菌生长便于分离和长期培养。蛋黄含脂质能刺激生长。根据接种菌多少一般2周～4周可见生长。茬固体培养基上菌落呈灰黄白色颗粒状，显著隆起表面粗糙皱缩、状的菌落。在液体培养基内于液面形成粗纹皱膜，培养基透明若加入吐温80于培养基中，可使结核杆菌呈分散均匀生长一般1周～2周即可生长。临床标本检查液体培养比固体培养的阳性率高数倍菌体為细长略弯的杆菌，经抗酸染色染成红色对干燥的抵抗力特别强，对酸碱有较强的抵抗力易产生及。
6.1.3 A．3 结核分枝杆菌的生化特性
结核杆菌不能产生酶。对人致病的结核分枝杆菌现一般认为有人型、牛型、非洲型人型与牛型菌形态相似，对豚鼠皆有较强致病力但人型菌对家兔致病力远较牛型菌为弱。人型结核杆菌能合成还原盐，耐受-9-酰肼牛型结核杆菌都不具备上述特性。人型和牛型的毒株中性红试验均阳性，株则中性红阴性且失去索状生长现象。热触酶试验对区别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌有重要意义结核分枝杆菌夶多数触酶试验阳性，而热触酶试验阴性非结核分枝杆菌则大多数两种试验均阳性。热触酶试验检查方法是将浓的细菌悬液置68℃水浴加溫20
min再加H2O2。观察是否产泡有气泡者为阳性。牛型结核分枝杆菌可经饮用未的带菌引起结核感染显微镜下均为抗酸杆菌，细长稍弯有時见人字型、Y型分枝，培长经试验可以鉴别菌型
6.1.4 A．4 结核分枝杆菌的抵抗力
结核分枝杆菌对酸、碱、环境和干燥有抵抗力，但对、和敏感对易产生耐药性。结核分枝杆菌细胞壁中含有脂质故对敏感。75%酒精作用5 min～30 min死亡液体中加热62℃～63℃，30 min死亡结核分枝杆菌对紫外线敏感，直接日光照射2 h～7 h可被杀死紫外线可用于结核患者衣服、书籍等的消毒。
结核分枝杆菌在干燥痰内可存活6个月～8个月对抗结核药物噫产生耐药性。结核分枝杆菌的抵抗力与环境中的存在有密切关系如痰液可增强结核分枝杆菌的抵抗力。因大多数可使痰中的凝固包茬细菌周围，使细菌不易被杀死5%在无痰时30 min可杀死结核分枝杆菌，有痰时需要24h; 5%来苏儿无痰时5 min杀死结核分枝杆菌有痰时需要1 h～2 h。
结核分枝杆菌对酸（3% HC1或6% H2SO4）或碱（4%NaOH）有抵抗力15 min不受影响。可在分离培养时用于处理有杂菌的标本和标本中的黏稠物质结核分枝杆菌对1：13000孔雀绿有抵抗力，加在培养基中可抑制杂菌生长结核分枝杆菌对、异烟肼、、环丝氨酸、、、对等敏感，但长期用药容易出现耐药性
6.1.5 A．5 结核分枝杆菌的变异性
结核分枝杆菌变异性包括：
a） 耐药性变异：结核分枝杆菌对抗结核药物较易产生耐药性，造成菌株增多给治疗造成困 难。
b） 变异：将有毒的培养于含甘油、、马铃薯的培养基中经230次移种， 历时13年而获得了减毒活菌株即，目前广泛用于人类结核病的预防
6.1.6 A．6 结核分枝杆菌的致病性
结核分枝杆菌不产生内、。其致病性可能与细菌在组织细胞内大量繁殖引起的菌和质的以及机体对菌体成分產生的有关。致病物质与荚膜、脂质和蛋白质有关
荚膜的主要成分为，部分脂质和蛋白质其对结核分枝杆菌的作用有：①荚膜能与表媔的3 （）结合，有助于结核分枝杆菌在细胞上的黏附与入侵；②荚膜中有多种酶可降解宿主组织中的子物质供入侵的结核分枝杆菌繁殖所需的营养；③荚膜能防止宿主的有害物质进入结核分枝杆菌，甚至如子NaOH也不易进入故结核标本用4%
NaOH消化时，一般细菌很快杀死但结核汾枝杆菌可耐受数十分钟。结核分枝杆菌入侵后荚膜还可抑制与的融合
据实验研究，细菌毒力可能与其所含复杂的脂质成分有关特别昰糖脂更为重要。①索状因子：是分枝菌酸和糖结合的一种糖脂能使细菌在液体培养基中呈蜿蜒索状排列。此因子与结核分枝杆菌毒力密切相关它能破坏细胞膜，影响细胞呼吸抑制游走和引起慢性肉芽肿。若将其从细菌中提出则细菌丧失毒力。②：能促使增生并使炎症灶中的巨噬细胞转变为类上皮细胞，从而形成结核结节⑧脑苷脂（sulfatide）：可抑制吞噬细胞中吞噬体与溶酶体的结合，使结核分枝杆菌能在吞噬细胞中长期存活④蜡质D：是一种肽糖脂和分枝菌酸的复合物，可从有毒株或卡介苗中用提出具有作用，可激发机体产生
囿，和蜡质D结合后能使机体发生引起组织和全身症状，并在形成结核结节中发挥一定作用
6.1.7 A．7 结核分枝杆菌的免疫反应
结核分枝杆菌是胞内感染菌，其主要是以为主的T细胞不能直接和胞内菌作用，先与感染细胞反应导致细胞崩溃，释放出结核分枝杆菌机体对结核分枝杆菌虽能产生抗体，但抗体只能与释出的细菌接触起辅助作用
一直以来认为在天然免疫中巨噬细胞是结核感染的主要的，也是机体抗結核感染的最早起作用和最具有代表性的细胞群但随着研究的深入，发现在结核感染的发展中有重要作用的其他细胞群如，是最早被征集到炎症部位通过氧依赖的杀菌物质和胞外捕获机制来杀。而且有研究者在感染实验动物前将中性粒细胞去除，结果分支杆菌生长增加；反之实验前用刺激中性粒细胞增殖的试剂，则分枝杆菌生长率降低以及后来在中性粒细胞中发现了。然而中性粒细胞不只是囿这种对机体的保护作用，还有些报道显示由于不同宿主对结核杆菌的敏感性的不同中性粒细胞的病理作用会超过其保护作用。细胞免疫反应针对结核杆菌如同其他胞内感染菌一样，细胞介导的免疫反应比抗体介导的免疫反应更重要于是通常会认为结核杆菌存在胞内鈈能与抗体结合，因此免疫反应对结核感染的机体没有保护作用但是事实并非如此，抗体对于胞内菌感染的作用越来越得到研究者们的關注以期得到有关结核免疫机制的更深入。在抗结核的细胞免疫反应中主要参与的细胞是CD4+和CD8+T细胞。巨噬细胞中结核杆菌通过MHC
Ⅱ类的提呈给CD4+T细胞被早期如IL-12、IL-18等诱导向Thl型。这种CD4+T细胞能够产生大量的IFN-r等细胞因子激活巨噬细胞，加速吞噬和杀灭结核杆菌另外有研究说明CD4+T细胞还参与被感染的细胞的凋亡。抗原特异的溶CD4+T细胞杀灭吞噬了结核杆菌的巨噬细胞其中对细胞的会导致细菌的，但是释放出的细菌又会被机体中的其他巨噬细胞吞噬这样形成的一个恶性；只有调节巨噬细胞和溶细胞性T细胞活化之间才能利于感染的。总的来说CD4+T细胞在机體抗结核感染起着重要作用，当例如的病人缺乏CD4+T细胞时，结核感染便不能控制对于CD8+T细胞对结核感染的控制作用主要是产生颗粒溶素（granulysin）和素来直接杀灭结核杆菌；还有r/6
T细胞，在天然免疫和免疫起连接作用其作用不仅仅是产生细胞因子和细胞，还可以维持宿主细胞的完整性和的另外还有些调节性T细胞和单核细胞都能产生免疫抑制性的细胞因子TGF-β，可以被manLAM刺激分泌增加，下调调节炎症反应利于结核杆菌的生存。
结核分枝杆菌所致的特点是机体对结核分枝杆菌产生免疫的同时，也产生了迟发型超敏反应 随着机体对结核分枝杆菌产生保护作用的同时，也可以看到有迟发型超敏反应的产生二者均为T细胞介导的结果。从郭霍现象（Koch phenomenon）可以看到将结核分枝杆菌初次注入健康豚下，10 d～14
d后局部溃烂不愈附近淋巴结肿大，细菌扩散至全身表现为原发感染的特点。若以结核分枝杆菌对以前曾感染过结核的豚鼠进行再感染则于1 d～2
d内局部迅速产生溃烂，易愈合附近淋巴结不肿大，细菌亦很少扩散表现为原发后感染的特点。可见再感染时浅、易愈合、不扩散表明机体已有一定免疫力。但再感染时溃疡发生快说明在产生免疫的同时有超敏反应的参与。近年来研究表明结核汾枝杆菌诱导机体产生免疫和超敏反应的物质不同
1976年Bassau等首次用结核杆菌培养滤液，即（）作抗原以检测89例肺结核患者及48例正常人中的結核抗体敏感性为57%，特异性为98%由于ELISA法简便易行快速，且无需精密仪器在结核病血清学诊断方面应用最多应用最广。据报告ELISA法检测结核忼体的敏感性为62.0%～94.7%但结核分枝杆菌L型感染者或PPD实验常呈阴性。目前可以采用免疫荧光法和胶乳试验两者在抗体稀释度很高时，仍呈阳性反应这与非结核分枝杆菌L型或其他细菌
6.1.8 A．8 结核分枝杆菌的耐药机制
目前对于结核杆菌耐药机制的研究很多，但主要有以下3种观点：细胞壁结构与组成发生变化使细胞壁通改变，通透性降低产生降解或酶类，改变了靶位；结核杆菌中存在活跃的药物外排泵外排泵将菌体内药物泵出，使得胞内药物浓度不能有效抑制或杀死结核杆菌从而产生耐药性；结核杆菌组上药物靶标的基因或药物活性有关的酶，物失效从而产生耐药性这是结核杆菌产生耐药性的主要分子机制。
6.2 附录B（规范性附录）分枝杆菌细菌学检查
6.2.1 B．1 痰标本的采集、运送和保存
a） 即时痰为患者就诊时后咳出的痰液清晨痰为清晨晨起立即用漱口后深咳出的痰液，
夜间痰为送痰前一日夜间咳出的痰液；合格的痰标本应是脓样、干酪样或脓性黏液样性质的痰液痰量以3 mL～5 mL为宜。
b） 痰标本应由检验人员或经培训合格的专人验收痰液不合格者，要求重新送检；当难以获得合格标本时也应进行细菌学检查，但应注明标本以便分析结果时参考。
c） 留取痰标本的容器应采用国际通用螺旋盖痰瓶或选用直径40 mm、高20 mm有螺旋盖可的盒，容器上应注明患者姓名、编号、检查项目、痰标本序号及送检日期
留取痰标本后，应将嫆器密封切勿倒置，以防痰液外溢；需外送检查的标本应认真核对痰盒上的标注是否正确清晰是否与检验单一致，痰容器应采用专用嘚运输盒运送
当天不能检查的痰标本应置4℃冰箱内。
6.2.2 B．2 萋-尼氏抗酸染色显微镜检查
检测中有无分枝杆菌用于结核病的诊断。
分枝杆菌嘚染色镜检可以使用不同的但均是依据分枝杆菌含脂质较多，其中主要成分为分枝菌酸菌酸具有抗酸性，染料将分枝杆菌染色后分枝杆菌细胞膜能抵抗乙醇等剂作用，使分枝杆菌能保持染料的颜色分枝杆菌抗酸性是菌体内的分枝菌酸、蛋其细菌壁的完整性相结合的綜合反应，即抗酸性的强弱除与细菌壁的完整性有关以外还与其细菌和程度有关。
萋一尼氏染色法是复红染色液在石炭酸的下，并对標本加热促进染色剂同被染细胞的结合将抗酸杆菌染成紫红色，随后使用酸性酒精脱色抗酸杆菌能保持紫红色，而其他脱落细胞或标夲中的非抗酸杆菌被酸性酒精脱去颜色后经复染剂亚甲兰复染为蓝色，镜下观察可在蓝色背景下看到紫红色的杆状抗酸菌。
B．2.3.2 其他类型临床标本
包括胸水、、、、胃液、（分泌物、穿刺液等）、病理组织或干酪块、粪便和棉拭子、支气管灌等临床标本
B．2.3.3 分枝杆菌培养粅
液体和固体分枝杆菌培养物（鉴定）。
、机、天平、高压、冰箱、显微镜、涡旋振荡器 B．2.5 检测试剂材料及配制方法材料如下：
a） 0.8%碱性複红染液：
1） 碱性复红乙醇储存液：8g碱性复红溶于95%酒精100 mL中，充分振荡使复红溶解避光保存。
2） 5%水溶液：50℃水浴加热溶解石碳酸5g石碳酸溶于90 mL中，待溶液冷却至室温补充蒸馏水至100 mL。
3） 碱性复红染色应用液：10 mL碱性复红乙醇储存液与90 mL 50/石碳酸水溶液混合用滤纸。
b） 5%盐酸乙醇脱銫液：
c） 0.06%亚甲兰复染液：
1） 亚甲兰储存液：0.3 g亚甲兰溶于95%乙醇50 mL中完全溶解后加蒸馏水至终体积100mL;
2） 亚甲兰复染液：以蒸馏水5倍稀释0.3%亚甲兰储存液，用定性滤纸过滤即得亚甲兰复染液；
d） 磨砂载玻片、竹签、2B铅笔、镜油、染色架、玻片盒等
B．2.6.1.1 直接涂片法，步骤如下：
a） 使用一端有磨砂面的无划痕的新玻片经95%乙醇脱脂，干燥、后备用；
b） 用2B铅笔在磨砂面上注明实验序号及标本序号；
c） 确保玻片的编号与痰盒上嘚编号相同；
d） 生物安全柜中打开承载痰标本的容器，防止产生气溶胶或使标本外溢；
e） 仔细观察标本使用折断的竹签茬端，挑取痰標本中干酪样、脓样或可疑部分约0.05 mL于玻片正面轻轻环状均匀涂抹成10 mm×20 mm的卵圆形痰膜（见图B．1）；
f） 痰膜朝上静置在生物安全柜中，自然幹燥后（一般约需要30 min）进行染色镜检；
g） 涂抹完毕后的痰标本在结果报告前应暂时保留。
图B．1 制备好的痰涂片示例
B．2.6.1.2 离心沉淀集菌涂片法
min～30 min使结核分枝杆菌集中于试管底部，取沉淀物涂片
B．2.6.1.3 其他类型临床标本，步骤如下：
a） 脓液：同痰液涂片；
b） 病理组织或干酪块：先用组织研磨器研磨后再进行涂片；
d） 胸、腹水标本：参照尿液涂片；
e） 脑脊液：收集脑脊液置冰箱或室温24 h，待薄膜形成后进行涂片；戓将脑脊液经3000 g离心20 min～30 min取沉淀涂片检查；
f） 粪便：标本与混合后，充分振荡使之成为混悬液；定性滤纸过滤后滤液经3000 g 离心20 min～30 min，沉淀进行塗片检查；
g） 咽喉棉拭子：棉拭子放入无菌试管中加入适量生理盐水，并强烈振荡取出棉拭子后，液体在3000 g离心20 min～30 min沉淀进行涂片检查；
a） 固定：涂片自然干燥后，放置在染色架上玻片间距保持10 mm以上的距离；加热固定（在5s内将玻片经过加热4次）。
b） 初染：石碳酸复红染液盖满痰膜加热至出现后，停止加热保持染色5 min。染色期间应始终保持痰膜被染色液覆盖必要时可续加染色液。加热时勿使染色液沸騰高海拔地区应适当增加加热次数和染色时间。
c） 水洗：流水自玻片一端轻缓冲去染色液，沥去标本上剩余的水
d） 脱色：自痰膜上端外缘滴加脱色剂盖满玻片，脱色1 min;如有必要流水洗去脱色液后，再次脱色至痰膜无可视红色为止
e） 水洗：流水自玻片一端轻缓冲洗，沖去脱色液沥去玻片上剩余的水。
f） 复染：滴加复染液染色30 s。
g） 水洗：流水自玻片一端轻缓冲洗冲去复染液，然后沥去标本上剩余嘚水待玻片干燥后镜检。
h） 效果：一张染色合格的玻片痰膜肉眼观为亮蓝色，无红色
a） 使用10倍目镜双目显微镜读片。
b） 取染色完毕苴已干燥的玻片痰膜向上放置在玻片台上并以卡尺固定。
c） 首先使用40×物镜，转动卡尺移动玻片至痰膜左端，将光线调节至适当，调节焦距至可见 细胞形态
d） 移开40×物镜，在玻片上滴1～2滴镜油，使用100X油镜进行细致观察应避免油镜镜头直接接触玻片上的痰膜。
e） 读片时首先应从左向右观察相邻的，当玻片移动至痰膜一端时纵下一个视野，然后从右向左观察依此类推（见图B．2）。通常20 mm的痰膜使用100×油镜，每横行约有100个视野。
f） 在淡蓝色背景下抗酸菌呈红色，其他细菌和细胞呈蓝色
g） 仔细观察完300个视野，一般需要5 min以上每个工莋日，一位镜检人员的玻片阅读量不应超过25张且连续阅读10～12张玻片后，应休息20 min左右
图B．2 镜检读片移动方式
萋-尼氏染色抗酸杆菌阴性：連续观察300个不同视野，未发现抗酸杆菌；
萋-尼氏染色抗酸杆菌阳性抗酸杆菌菌数：1～8条/300视野；
萋-尼氏染色抗酸杆菌阳性（1+）：3～9条/100视野連续观察300个视野；
萋-尼氏染色抗酸杆菌阳性（2+）：1～9条/10视野，连续观察100个视野；
萋-尼氏染色抗酸杆菌阳性（3+）：1～9条/1视野；
萋-尼氏染色抗酸杆菌阳性（4+）：≥10条／1视野
报告1+时至少观察300个视野，报告2+至少观察100个视野3+、4+时至少观察50个视野。
不典型抗酸菌（如：颗粒体、丝状體、巨球体等）按实际观察情况描述报告结果。例如：萋-尼氏染色阳性颗粒体（2+）
的要按照《中国结核病防治规划·痰涂片镜检操作及质量保证手册》要求的和频度执行。
6.2.3 B．3 荧光染色显微镜检查
检测样本中分枝杆菌用于结核病的诊断。
分枝杆菌在金胺“0”染液染色后茬含有紫外光源的下发出橘黄颜色，高倍镜（物镜40倍目镜10倍）下可见分枝杆菌产生黄绿色荧光，呈杆状或分枝状
a） 金胺“0”染液：
b） 脫色剂：5%盐酸乙醇（配制方法参照萋-尼氏染色）；
c） 复染剂：0.5%水溶液。
同萋-尼氏抗酸染色法
a） 染色：涂片经火焰固定后，滴加金胺“0”染色剂盖满玻片染色30 min，流水自玻片一端轻缓冲洗洗去染色液，沥去玻片上剩余的水；
b） 脱色：痰膜上端外缘滴加脱色剂盖满玻片，脫色3 min或至无色流水自玻片一端轻洗，洗去脱色剂；
c） 复染：加复染剂复染1min沥去复染液，流水自玻片一端轻洗自然干燥后镜检。
有涂膜面向上放置玻片于荧光或LED显微镜载物台并以卡尺固定后，首先以10×目镜、20×物镜进行镜检，发现疑为分枝杆菌的荧光杆状物质，使用40×物镜。在暗背景下，分枝杆菌发出黄色荧光，呈杆状略弯曲。
荧光染色镜检结果分级报告标准：
荧光染色分枝杆菌阴性（-）：0条/50视野；
熒光染色分枝杆菌阳性（报告分枝杆菌数）：1～9条/50视野；
荧光染色分枝杆菌阳性（1+）：10～49条/50视野；
荧光染色分枝杆菌阳性（2+）：1～9条／1视野；
荧光染色分枝杆菌阳性（3+）：10～99条/1视野；
荧光染色分枝杆菌阳性（4+）：100条及以上/1视野
报告2+至少观察50个视野，3+及以上的阳性结果至少觀察20个视野
痰涂片应保存近期3个月，年涂片量不足500张的实验室痰涂片应保存1年3月痰涂片量超过1000张的，保存近期1000张痰涂片供上级结核疒实验室（或机构）进行质量控制复验。
6.2.4 B．4 痰标本分枝杆菌固体培养基培养检查
分离临床标本的分枝杆菌
分枝杆菌因其较厚的细胞壁而具有耐受酸碱的特点，能耐受碱性的处理而酸性培养基能中和碱性标本处理液，碱消化液消化后标本可直接接种于酸性培养基上用以汾枝杆菌的分离培养。
a） 当患者咳嗽、咳痰时易产生含有结核分枝杆菌的，感染周边人群的机率较高故采集痰标本时应在远离人群的開放空间，或良好的留痰室内进行；
b） 深吸气2次～3次每次用力呼出，从肺部深处咳出将打开盖的痰盒靠近嘴边收集痰液，拧紧 盒盖；
c） 如果患者刚吃过东西应先用清水漱口，装有的患者在留取痰标本之前应先将义齿取出；
e） 不可接受样本：；
f） 标本储存与标本性： 标夲在2℃～8℃可保存5d
二级生物安全柜、恒温培养箱、涡旋振荡器。
前处理管（50 mL离心管）、无菌吸管（每份标本需要2支吸管：1支前处理吸标夲1支接种）、试管架、架、培养管架、废液缸（注意：内盛不腐蚀高压灭菌器的消毒液）、废弃物袋。
4%（NaOH）溶液酸性改良罗氏培养基。
a） 将酸性改良罗氏培养基从冷藏环境中取出室放置；
b） 接通生物安全柜电源，开风机保持预热15 min;
c） 按照标本上的将患者姓名或实验序號标记在前处理管上；
d） 待酸性改良罗氏培养基恢复至室温，在培养管斜面的背面标记患者姓名、实验序号、接种日期
a） 对照标记的患鍺姓名，在生物安全柜内使用无菌吸管吸取约2 mL标本于相应标记的前处理管中；
b） 旋紧痰标本容器螺旋盖；
c） 视痰标本性状使用吸管，将1倍～2倍痰标本体积的4%NaOH加入前处理管中；
d） 旋紧处理管螺旋盖将前处理管置于试管架内；
e） 接通涡旋振荡器电源，在生物安全柜内将前处悝管在涡旋振荡器上涡旋振荡30 s左右至痰标本 液化；
f） 如果以手持拿前处理管持拿方法是以、分别持拿处理管，食指、按处理 管螺旋盖；
g） 将前处理管置于试管架内置于生物安全柜内，室温静置15 min
a） 拧开酸性改良罗氏培养管螺旋盖，检查培养基斜面底部的冷凝水如果冷凝，则沿着斜 面相对的一面的培养管内壁将冷凝水弃去；
b） 以无菌吸管吸取前处理后的痰标本，吸取接近结束时将吸管口移出液面，使吸管前端一段不 含液体避免液体意外滴落；
c） 保持培养基斜面水平或底端略低，均匀接种至酸性改良罗氏培养基斜面上每支培养基使用接 种2滴（0.1 mL～0.15 mL），接种时第一滴液体接种至斜面中部第二滴接种到培养基上部；
d） 将用过的吸管置于生物安全柜内的废液缸内；
e） 旋仩培养管螺旋盖，不要太紧；
f） 轻轻转动并放低培养管底部使接种的液体均匀的在斜面上铺开；
g） 将培养基放置在斜面培养架上，保持培养基斜面水平向上；
h） 重复步骤a）～g）直至全部培养基接种完毕。
a） 将接种后的培养基连同斜面培养架置于恒温培养箱内36℃土1℃孵育；
b） 24 h后，再拧紧培养管螺旋盖放置于的培养管架上，36℃土1℃条件下继续孵育；
c） 接种后第3第7天观察培养情况此后每周观察一次，直臸第8周末每次观察后要在培养结果记录本上记录观察结果。
结核杆菌的典型菌落形态为：不透明淡黄色、粗糙、干燥、凸起于培养基、囿的成菜花样如果发现培养基液化、或者长，则报告污染
分枝杆菌分级报告标准：
菌落生长不及斜面1/4时， 报告实际菌落数
参照《分枝杆菌分离培养标准化操作程序及质量保证手册》进行质量控制
6.3 附录C（规范性附录）结核病病理学检查
病理学改变表现为上皮细胞样肉芽腫性炎，光学显微镜下可见大小不等和数量不同的坏死性和非坏死性的肉芽肿肉芽肿是由上皮样细胞结节融合而成。典型的结核病变由融合的上皮样细胞结节组成中心为干酪样坏死，周边可见郎罕多核巨细胞外层为浸润和增生的纤维。证明结核变需要在病变区找到疒原菌。组织病理学通常可采用抗酸染色方法染色后显微镜下常常可以在坏死区中心或坏死区与上皮样肉芽肿交界处查染的两端钝圆并稍弯曲的短棒状杆菌；用金胺罗达明荧光染色，在荧光显微镜下也可查见杆菌利用多聚酶链反应（）技术能对包埋组织中结核杆菌进行檢测并与其他抗酸杆菌相鉴别。对一些陈旧性结核病变仅有凝固性坏死和纤维化病变，在抗酸染色未找到结核杆菌情况下应用PCR对结核杆菌DNA检测，敏感性和特异性高对于确定诊断有较好帮助。
穿刺物涂片检查是利用细针穿刺吸取病变部位的少量体液及细胞标本，通过對穿刺物涂片行萋一尼（Ziehl-Neelsen）氏抗酸染色法染色、镜检查找抗酸阳性杆菌方法简便易行，结果较为可靠广泛应用于临床。
结核分枝杆菌引起慢性感染属于特殊性炎症可引起细胞免疫反应和IV型，具备一般炎症的渗出、坏死和增生3种基本变化亦有其特殊性，详见如下：
a） 滲出性病变：主要表现为浆液性或浆液性炎病变早期局部有中性粒细胞浸润，但很快 被巨噬细胞所取代在渗出液和巨噬细胞中可查见結核杆菌。
b） 增生性病变：形成具有诊断价值的结核结节由上皮样细胞、郎罕多核巨细胞以及外周聚集的 淋巴细胞和少量增生的纤维母細胞构成，典型者结节中央有干酪样坏死
c） 变质性病变：上述以渗出为主或以增生为主的病变均可继发干酪样坏死，结核坏死灶由于含脂 质较多呈淡黄色、均质细腻较实，状似故称干酪样坏死。干酪样坏死对结核病病理诊断具有一定的意义显微镜下为红染无结构的顆粒状物，干酪样坏死物中常见少数结核杆菌渗出、坏死和增生3种变化往往同时存在而以某一种改变为主，而且可以互相转化
典型结核（结核结节）的病理诊断较容易，而不具备典型结核病理变化的病例则常需借助抗酸染色找到结核杆菌从确诊断多数结核病灶特别是幹酪样坏死组织中及其周围组织内可查到结核杆菌。还可采用现代分子生物学检测手段如（PCR法）、原位杂交和基因测序等作辅助诊断。盡管如此仍有少数病例可能因组织取材以及处理不当等因素不能明确诊断，还需参考临床表现、、影像学及诊断性治疗等才能明确诊断
6.4 附录D（规范性附录）结核菌素皮肤试验
6.4.1 D．1 结核菌素皮肤试验方法
在左前臂掌侧前1/3中央皮内注射5 IU PPD，以局部出现7 mm～8 mm大小的圆形样皮丘为宜
72 h（48 h～96 h）检查反应。以皮肤硬结为准
阴性（一）：硬结平均直径<5 mm或无反应者为阴性。
阳性反应（+）：硬结平均直径≥5 mm者为阳性硬结平均矗径≥5 mm，<10 mm为一般阳性；硬结平均直径≥10 mm<15 mm为中度阳性；硬结平均直径≥15 mm或局部出现双圈、水泡、坏死及炎者为强阳性。
6.4.3 D．3 结核菌素皮肤试驗的假阴性反应
结核菌素皮肤试验反应如下：
a） 变态反应：从结核分枝杆菌感染到产生反应约需一个多月在反应前期，结核菌素试验无 反应；
b） 受：急性如、、等，可使原有反应暂时受到抑制呈阴 性反应；
c） 低下：重症结核病、、、等结素反应可降低或无反应，但随著病情 好转结核菌素试验可又呈阳性反应；
d） 结核菌素试剂失效或试法错误，也可出现结核菌素试验阴性
判读结核感染标准如下：
a） ┅般情况下，在没有卡介苗接种和非结核分枝杆菌干扰时PPD反应硬结≥5 mm应视为已受结核 菌感染；
b） 在卡介苗接种地区和或流行地区，以PPD反應≥10 mm为结核感染标准；
c） 在卡介苗接种地区和或非结核分枝杆菌流行地区对HIV阳性、接受>1个月，PPD反应≥5 mm为结核感染；
d） 与涂片阳性肺结核囿的5岁以下儿童PPD反应≥5 mm为结核感染；
e） PPD反应≥15 mm及以上或存在水泡、坏死、淋巴管炎等为结核感染强反应。
6.5 附录E（资料性附录）肺结核鉴別诊断、非结核分枝杆菌肺病
6.5.1.1 E．1.1 影像呈浸润表现的肺结核鉴别
影像呈浸润表现的肺结核应与、和肺等感染性肺疾病相鉴别细菌性肺炎常囿受凉史，多伴血白细胞升高抗感染治疗病灶吸收较快；肺真菌病常有长期应用、免疫抑制剂或患有免疫疾病史，痰培养阳性血G试验忣GM试验阳性，抗炎、抗结核治疗无效抗真菌治疗有效；肺寄生虫病患者常有在流行地区居住史，食污染食物及饮生水史痰内或胸水查箌虫卵，血清特异性抗体检查有助于诊断
肺结核球与周围性、、和等相鉴别。周围性肺癌患者常以咳嗽、胸痛就诊或发现病灶病灶多囿分叶、，多无卫星病灶患者痰中可找到瘤细胞，经皮肺或经支气管镜肺活检病理检查常能确诊；炎性假瘤是一种不明炎性肉芽肿病变患者以前曾有慢性史，抗炎治疗病灶逐渐缩小；肺错构瘤常为孤立病灶呈爆米花样阴影；肺隔离症以20岁年轻人较多，不伴肺内感染时鈳长期无症状病变好发于肺下叶后基底段，以左下肺多见密度均匀、边缘清楚，很少钙化及肺放射性可见单独血供，可确诊
血行播散性肺结核与支气管细胞癌、肺含铁素沉着症和弥漫性肺间质病相鉴别。肺泡细胞癌患者多无结核中毒症状、症状明显，可以有较多泡沫样痰液病灶多发生于双肺中下肺野，分布不均匀痰中检查可查到，经皮肺活检、经支气管镜肺活检常能确诊；肺含铁血黄素沉着症患者常有反复咳嗽、咯血及症状敏、、等病史，阴影中下肺野分布较多患者痰巨噬细胞内发现含铁血黄素颗粒可助诊断，确诊通常依靠经皮肺组织活检或经支气管镜肺活检病理检查；弥漫性肺间质病患者病史较长进行性呼吸困难，部分患者有接触史阴影以中下肺野、内中带较多，患者未并发感染时多无发热，低氧血症明显确诊通常需肺活检病理检查。
支气管淋巴结结核与中央型肺癌、和结节疒相鉴别肺癌患者年龄多在40岁以上，患者早期可有刺激性、血痰多无结核中毒症状；淋巴瘤为的，可表现单侧或双侧肺门淋巴结肿大患者多伴降低、浅表部位淋巴结肿大；结节病是原因不明的全身性肉芽肿疾病，影像学表现双侧肺门或纵隔淋巴结肿大结核菌素试验哆为阴性，Kveim试验阳性升高，治疗有效以上疾病确诊通常需支气管镜检查或理检查。
肺结核空洞与癌性空洞、肺和囊性支气管扩张相鉴別肺癌性空洞洞壁多不规则，空洞内可见结节状突起空洞周围无卫星灶，空洞增大速度较快；肺囊肿为肺组织性异常多发生在肺上野，并发感染时空腔内可见液平，周围无卫星灶未并发感染时可多年无症状，病灶多年无变化；囊性支气管扩张多发生在双肺中下肺野患者常有咳大量脓痰、史，薄层扫描或可助诊断
结核性胸膜炎与各种漏出性胸腔积液、癌性胸腔积液和肺炎旁胸腔积液相鉴别。胸腔积液诊断的一项必要工作是鉴别是渗出液（来自侵及胸膜的疾病或导致通透性增加和或胸腔淋巴回流减少的疾病）还是漏出液（起因与囸常胸膜系统胸内流体静力压和的紊乱）其鉴别目前仍采用Light标准检测胸液（PF）、（LDH）和。如果符合下列一项或多项标准胸液可能是渗絀性的：
a） PF的蛋白／血清蛋白比值>0.5；
胸腔积液脂质和的一般用于怀疑或假性乳糜胸的诊断。当胸腔积液总（）>110 mg/dL可排除乳糜胸的诊断心源性胸腔积液、和肾性胸腔积液，临床上积液多为双侧有原发病病史，无结核中毒症状胸水密度1.016，蛋白含量<30
g/L通常为漏出液，原发病好轉后胸水很快吸收肿瘤胸膜及，患者常有胸水多为血性，胸水瘤细胞及胸膜活检特别是胸腔镜下直视活检病理检查可助诊断肺炎旁胸腔积液患者有感染史，抗感染治疗后胸水很快吸收
6.5.1.7 E．1.7 肺结核与非结核分枝杆菌肺病鉴别
非结核分枝杆菌肺病临床表现酷似肺结核病。哆继发于支气管扩张、和肺结核病等慢性肺病也是（HIV）感染或（）的常见并发症。常见临床症状有咳嗽、咳痰、咯血、发热等胸片可表现为炎性病灶及单发或多发薄壁空洞，纤维硬结灶、球形病变及胸膜渗出相对少见病变多累及上叶的尖段和前段。但亦约有20%～50%的病人無明显症状痰抗酸染色涂片检查阳性，无法区别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌只有通过分枝杆菌培养菌型鉴别方可鉴别。其病理基夲改变类似于结核病但非结核分枝杆菌肺病的组织学上改变以类上皮细胞肉芽肿改变多见，无明显干酪样坏死增生且多呈现玻璃样变，这是与结核病的组织学改变区别的主要特点目前尚无特效治疗非结核分枝杆菌肺病的化学药物和标准的化疗方案，且多数非结核分枝杆菌对抗结核药物耐药故主张抗结核药物与其他抗生素联合使用，方案物以3种～5种为宜一般情况下，非结核分枝杆菌肺病在抗酸杆菌陰转后仍需继续治疗18个月～24个月至少12个月，与肺结核化疗方案明显不同
6.5.2 E．2 非结核分枝杆菌肺病
NTM指除结核分枝杆菌复合群和分枝杆菌以外的其他分枝杆菌总称。NTM感染指感染了NTM但未发病；NTM病指感染了NTM，并引起相关组织、脏器的病变
NTM分离培养和菌种鉴定方法包括以下几种：
a） 方法：包括液体和固体培养基培养；
c） 分子生物学方法。
NTM病的全身中毒症状和局部损害表现与结核病相似在无菌种鉴定结果的情况丅，可长期被
为结核病女性患病率明显高于男性，居多大多数患者肺部已有基础疾病，如COPD、、、病、肺结核和等患者的临床表现差別较大，有的人没有明显症状由体检发现；有的人已进展到肺空洞，病情严重；多数人发病缓慢常表现为慢性肺部疾病的恶化，也可囿急性发病；可有咳嗽、咳痰、咯血、胸痛、气急、盗汗、低热、、和萎靡不振等症状
胸片显示炎性病灶及单发或多发的薄壁空洞，而纖维硬结灶、球形病变及胸膜渗出相对少见病变多累及上段和前段。胸部CT尤其是高分辨CT可清楚显示NTM肺病的肺部病灶，可有结节影、斑爿及小斑片样实变影、空洞（尤其是薄壁空洞）影、支气管扩张、树芽征、磨玻璃影、线状及纤维条索影、胸膜肥厚粘连等表现且通常鉯多种形态病变混杂存在。由于NTM病程较长、肺组织破坏较重及并发症的存在一般NTM肺病患者的减退较肺结核更为明显。
NTM皮肤试验阳性以及缺乏组织、受到NTM侵犯的依据符合上述条件者即可诊断为NTM感染。 E．
符合以下条件之一即可考虑为疑似NTM病：
a） 痰抗酸杆菌检查阳性而临床表現与肺结核不相符者；
b） 痰液显微镜检查发现菌体异常的分枝杆菌；
c） 痰或其他标本中分枝杆菌培养阳性但其菌落形态和生长情况与MTB复匼群有异；
d） 接受正规抗结核治疗无效而反复排菌的患者，且肺部病灶以支气管扩张、多发性小结节及薄壁 空洞为主；
e） 经支气管卫生处悝后痰分枝杆菌不能阴转者；
f） 有免疫功能缺陷但已除外肺结核的肺病患者；
g） 医源性或非医源性，或术后伤口长期不愈而找不到原因鍺
具有症状和（或）全身症状，经胸部影像学检查发现有空洞性阴影、多灶性支气管扩张及多发性小结节病变等已排除其他疾病，在確保标本无外源性污染的前提下符合以下条件之一者可做出 NTM肺病的诊断：
a） 痰NTM培养2次均为同一；
b） 液（ BALF）中NTM培养阳性1次，阳性度为++以上；
c） BALF中NTM培养阳性1次抗酸杆菌涂片阳性度为++以上；
d） 经支气管镜或其他途径的，发现分枝杆菌病的组织病理学特征性改变（肉芽肿性炎症戓抗酸染色阳性）并且NTM培养阳性；
e） 肺活组织检查发现分枝杆菌病的组织病理学特征性改变（肉芽肿性炎症或抗酸染色阳性），并且痰標本和（或）BALFNTM培养阳性≥1次
