& “近20年来，PCR技术（多聚酶链式反应）...”习题详情
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近20年来，PCR技术（多聚酶链式反应）成为分子生物学实验室的一种常规实验手段，其原理是利用DNA半保留复制，在试管中进行DNA的人工复制（如图），在短时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，从而使实验室所需要的遗传物质不再受限于活的生物体。 （1）加热使DNA双链间的&键完全打开，称为　&；而在细胞中是在　&酶的作用下进行的。 （2）如果只需要大量克隆模板DNA中间的某个特定区段，应该加入　&种特定的引物。当温度降低至55℃时，引物与两条“舒展”的模板的特定位置结合，在DNA聚合酶的作用下，只能在引物的　&端连接脱氧核苷酸，两条子链的延伸方向都是　&。 （3）PCR技术的必需条件，除了模板、原料、酶之外，至少还有三个条件，即液体环境、适宜的　&和　&，前者由　&自动调控，后者则靠　&来维持。 （4）通过PCR技术使DNA分子大量复制，如果将一个用15N标记的DNA分子放入试管中，以14N标记的脱氧核苷酸为原料，连续复制四次之后，则15N标记的DNA分子占全部DNA分子总数的比例是　&。&
本题难度：一般
题型：解答题&|&来源：2014-陕西渭南市高二下学期期中考试生物试卷
分析与解答
习题“近20年来，PCR技术（多聚酶链式反应）成为分子生物学实验室的一种常规实验手段，其原理是利用DNA半保留复制，在试管中进行DNA的人工复制（如图），在短时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，从而使实验室所需...”的分析与解答如下所示：
PCR中，加热能使DNA双链间的氢键打开，即解旋；而在细胞中，解旋是在解旋酶的作用下进行的。如果只需要大量克隆模板DNA中间的某个特定区段，应该加入两种特定的引物。当温度降低至55℃时，引物与两条“舒展”的模板的特定位置结合，在DNA聚合酶的作用下，只能在引物的3′端连接脱氧核苷酸，两条子链都是从子链的5′端向3′端方向延伸。PCR技术的必需条件，除了模板（已知核苷酸序列的DNA）、原料（脱氧核苷酸）、酶之外，至少还有三个条件，即液体环境、适宜的温度、酸碱度，温度由PCR仪自动调控，而PH靠缓冲液来维持。将一个用15N标记的DNA分子放入试管中，以14N标记的脱氧核苷酸为原料，连续复制四次之后，得到24=16个DNA，根据半保留复制特点，16个DNA中有2个含有15N （一条链为15N，另一条链为14N），所以15N标记的DNA分子占全部DNA分子总数的比例是2/16=1/8。分析：
考点1：生物技术在食品加工及其他方面应用
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近20年来，PCR技术（多聚酶链式反应）成为分子生物学实验室的一种常规实验手段，其原理是利用DNA半保留复制，在试管中进行DNA的人工复制（如图），在短时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，从而使...
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“近20年来，PCR技术（多聚酶链式反应）...”的最新评论
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＞＞＞下列关于PCR的描述，不正确的是[]A．PCR技术的原理是DNA复制B．是酶..
下列关于PCR的描述，不正确的是
A．PCR技术的原理是DNA复制B．是酶促反应，需耐高温的解旋酶和DNA聚合酶C．一个DNA片段经PCR扩增，可形成2n个DNA片段(n代表循环次数)D．PCR利用了DNA的热变性来控制DNA的解聚与结合
题型：单选题难度：偏易来源：期末题
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据魔方格专家权威分析，试题“下列关于PCR的描述，不正确的是[]A．PCR技术的原理是DNA复制B．是酶..”主要考查你对&&多聚酶链式反应扩增DNA片段&&等考点的理解。关于这些考点的“档案”如下：
现在没空？点击收藏，以后再看。
因为篇幅有限，只列出部分考点，详细请访问。
多聚酶链式反应扩增DNA片段
多聚酶链式反应扩增DNA片段：1、PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4中游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。2、PCR反应过程是：变性→复性→延伸
3、结果：上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子，随着重复次数的增多，DNA分子就以2n的形式增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。细胞被DNA复制与PCR技术的比较：
知识点拨：1、DNA分子复制的人工控制解开螺旋：在80～100℃时，DNA双螺旋打开，形成两条DNA单链，称为变性。恢复螺旋：在50～60℃左右时，两条DNA单链重新形成双螺旋结构，称为复性。复制条件：缓冲液，DNA模板、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶、两种引物。控制仪器：PCR仪（温度周期性自动调节仪）。2、PCR的含义是多聚酶链式反应。3、PCR技术反应的条件：①稳定的缓冲溶液环境；②DNA模板；③合成引物；④四种脱氧核甘酸；⑤DNA聚合酶；⑥温控设备4、PCR技术最突出的优点是快速、高效、灵活、易于操作。5、TaqDNA聚合酶的特点是：耐高温。知识拓展：1、DNA含量的测定——分光光度法
2、DNA聚合酶不恩能够从头合成DNA，只能从DNA的3'端开始延伸DNA链，因此DNA复制需要引物。
发现相似题
与“下列关于PCR的描述，不正确的是[]A．PCR技术的原理是DNA复制B．是酶..”考查相似的试题有：
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高中生物 某DNA分子中含有某种碱基a个,则复制n次需要含该碱基的脱氧核苷酸数为?第n次?(>_高中生物
某DNA分子中含有某种碱基a个,则复制n次需要含该碱基的脱氧核苷酸数为?第n次?(>_<)
请详细说明\^O^/
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刚开始有一个,复制一次双链打开变成两个,当然每条链上还是有二条单链,这样复制第二次变成4个,三次8个,复制n次后有2的n次当个,然后开始的那一个不需要核苷酸,所以总共是2的n次方-1个,第n-1次共有2的n-1次方个再减一,那么在这个基础上复制一次也就是第n次,需要的还是2的n-1次方再减去一,因为复制一次,就会变成2倍的第n-1的个数,可是新增的要去掉第n-1次原有的,所以第n次是2的n-1次方再减去1.应该可以看懂吧.
(>_<)真是麻烦你了
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生物复制n次和第n次复制的区别世上说DNA分子复制的规律需要注意：若DNA分子中有某碱基M个,则第N次复制需要添加游离的该碱基（2的N次方-1）*M个.复制N次需要添加游离的该碱基（2的N-1次方）*M个.请问：第N次复制与复制N次有什么区别?最好有图解!
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生物复制n次是指从第一次算起一直到第N次第n次复制是特指这第N次所产生的结果和影响 比如一个细胞复制（有丝分裂,下同）2次变成4个增加了3个 一个细胞第2复制变成了4个,但增加了2个 但还要结合题意,仔细辨一辨,因为有些题目存在陷阱
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这个考虑的是幂函数吧根据题意第N次复制 ： M*(2^n-1)复制N次： M*(2^(n-1))两个数值相比 ，约等于 2即 M*(2^n-1)/(M*(2^(n-1))) = (2^n-1)/(2^(n-1)) = 2^n/(2^(n-1))-1/(2^(n-1)) =2 - 1/(2^(n-1))显然 ，n 足够大是，两个数相差一倍
扫描下载二维码AUTO-IMMUNE DISEASE-RELATED MICRORNA AND USE THEREOF
WIPO Patent Application WO/
Provided is an auto-immune disease-related microRNA. In particular, provided is the miR-23b generally down-regulated in the partially inflamed tissue, and further provided are members of the miR-23 family capable of inhibiting the occurrence and development of auto-immune disease after the members are introduced, comprising miR-23a, miR-23b and miR-23C. Also provided is the use of the microRNA in the treatment and prevention of auto-immune disease. The expression of miR-23b is regulated by IL-17, and targets the genes of TAB2 and TAB3, etc., in the signal pathway of
by inhibiting the expression of TAB2 and TAB3, miR-23b can inhibit the occurrence and development of auto-immune disease and significantly relieve the symptoms and development of the disease.
Inventors:
QIAN, Youcun (319 Yueyang Road, Xuhui District, Shanghai 1, 200031, CN)
SHEN, Nan (319 Yueyang Road, Xuhui District, Shanghai 1, 200031, CN)
ZHU, Shu (319 Yueyang Road, Xuhui District, Shanghai 1, 200031, CN)
PAN, Wen (319 Yueyang Road, Xuhui District, Shanghai 1, 200031, CN)
Application Number:
Publication Date:
10/24/2013
Filing Date:
04/19/2013
Export Citation:
SHANGHAI INSTITUTES FOR BIOLOGICAL SCIENCES, CHINESE ACADEMY OF SCIENCES (319 Yueyang Road, Xuhui District, Shanghai 1, 200031, CN)
International Classes:
C12N15/113; A61K31/7105; A61K48/00; A61P37/02; A61P37/06
View Patent Images:
&&&&&&PDF help
Domestic Patent References:
WOA1N/AWOA1N/A
Foreign References:
Other References:
DATABASE GENBANK 22 August 2012 Database accession no. JX
DATABASE GENBANK 30 June 2007 Database accession no. EF
Attorney, Agent or Firm:
XU & PARTNERS, LLC. (Room No.106, Building No. 1 Universal High-Tech Plaza,958 Zhen Bei Road, Putuo District, Shanghai 3, 200333, CN)
权 利 要 求
1. 一种药物组合物， 其特征在于， 包括药学上可接受的载体和有效量的选自下组的 一种或多种活性成分：
(a) miRNA-23家族的微小 RNA , 所述 miRNA_23家族的微小 RNA包括： miRNA_23 或经修饰的 miRNA-23衍生物、 和核心序列为 UCACAUU、 长度为 18_26nt、 功能与 miRNA-23b相同或基本相同的微小 RNA或经修饰的 miRNA衍生物；
(b)前体 miRNA, 所述的前体 miRNA能在宿主内加工成（a)中所述的微小 RNA; (c)多核苷酸， 所述的多核苷酸能被宿主转录形成（b)中所述的前体 miRNA, 并加 工形成（a)中所述的微小 RNA ;
(d)表达载体， 所述表达载体含有（a)中所述的微小 RNA、 或（b)中所述的前体 miRNA, 或（c)中所述的多核苷酸；
(e) (a)中所述的微小 RNA的激动剂。
2. 如权利要求 1所述的药物组合物， 其特征在于， （a)中所述的核心序列指微小 RNA第 2-8位的核苷酸序列； 和 /或所述的 "功能与 miRNA-23b相同或基本相同" 是 指保留了 miRNA-23b_3p的 40%, 且 500%的抑制自身免疫的功能。
3. 如权利要求 1所述的药物组合物， 其特征在于， （a)中所述的 miRNA-23为选自 下组的 miRNA: miRNA-23a_3p、 miRNA-23b_3p、 miRNA_23c、 miRNA-23a_5p、 或 miRNA_23b_5p。
4. 如权利要求 1所述的药物组合物， 其特征在于， （a) 中所述的 miRNA-23包 括序列如 SEQ ID NO. ： 1所示的 miRNA-23a_3p、如 SEQ ID NO. ： 2所示的 miRNA-23b_3p、 或如 SEQ ID NO. ： 3所示的 miRNA-23c。
5. 如权利要求 1所述的药物组合物， 其特征在于， 所述的经修饰的 miRNA衍生物， 其修饰选自下组的一种或多种修饰形式： 核苷酸的糖基修饰、 核苷酸之间连接方式的修 饰、 胆固醇修饰、 锁核苷酸修饰、 肽段修饰、 脂类修饰、 卤素修饰、 烃基修饰、 和核酸 修饰。
6. 如权利要求 5所述的药物组合物，其特征在于，所述的核苷酸的糖基修饰包括 2-0- 甲基的糖基修饰、 2-0-甲氧乙酯的糖基修饰、 2-0-垸基的糖基修饰、 2-氟代的糖基修饰、 糖环修饰、 锁核苷酸修饰； 和 /或
所述的核苷酸之间连接方式的修饰包括硫代磷酸修饰、 磷酸垸基化修饰； 和 /或 所述的核酸修饰包括 "TT "修饰。
7. 如权利要求 1所述的药物组合物， 其特征在于， （b) 所述的前体 miRNA的核苷酸 序列如 SEQ ID NO. ： 4、 SEQ ID NO. ： 5、 或 SEQ ID NO. ： 6所示。
8. 如权利要求 1所述的药物组合物， 其特征在于， （c)中所述的多核苷酸具有式 I I所示的结构：
Seq 正向一 X一 Seq 反向
式 I I中， Seq 为能在宿主中被加工成所述的微小 RNA核苷酸序列；
Seq 为与 Seq 基本上互补或完全互补的核苷酸序列； 为位于 Seq <<和 Seq 之间的间隔序列， 并且所述间隔序列与 Seq <<和 Seq & H 不互补； s
并且式 I I所示的结构在转入宿主 , ι π所示的二级结构：
式 I I I，
式 I I I中， Seq 正向、 Seq反向和 X的定义如上述，
I 表示在 Seq <<和 Seq 之间形成的碱基互补配对关系。
9. 如权利要求 1所述的药物组合物， 其特征在于， （d)中所述的表达载体包括： 病毒载体和非病毒载体。
10. 如权利要求 1所述的药物组合物， 其特征在于， （e)中所述 miRNA-23的激动 剂选自下组： 促进 miRNA-23表达的物质、 提高 miRNA-23活性的物质、 抑制 IL-17 表达的物质、 抑制 IL-17活性的物质。
1 1. 如权利要求 1所述的药物组合物， 其特征在于， 所述的药学上可接受的载体 选自下组： 水、 盐水、 脂质体、 脂质、 蛋白、 蛋白-抗体缀合物、 肽类物质、 纤维素、 纳米凝胶、 或其组合。
12. 如权利要求 1所述的药物组合物， 其特征在于， 所述药物组合物用于治疗自 身免疫反应疾病。
13. 一种活性成分的用途， 其中， 所述的活性成分选自下组：
(a) miRNA-23家族的微小 RNA , 所述 miRNA-23家族的微小 RNA包括： miRNA-23 或经修饰的 miRNA-23衍生物、 和核心序列为 UCACAUU、 长度为 18_26nt、 功能与 miRNA-23b相同或基本相同的微小 RNA或经修饰的 miRNA衍生物；
(b)前体 miRNA, 所述的前体 miRNA能在宿主内加工成（a)中所述的微小 RNA; (c)多核苷酸， 所述的多核苷酸能被宿主转录形成（b)中所述的前体 miRNA, 并加 工形成（a)中所述的微小 RNA ;
(d)表达载体， 所述表达载体含有（a)中所述的微小 RNA、 或（b)中所述的前体 miRNA, 或（c)中所述的多核苷酸；
(e) (a)中所述的微小 RNA的激动剂；
其特征在于， 所述活性成分用于制备抑制自身免疫反应的抑制剂、 制备预防或治 疗自身免疫反应疾病的药物。
14. 如权利要求 13所述的用途， 其特征在于， 所述的自身免疫反应疾病选自下 组： 类风湿性关节炎、 多发性脑脊髓硬化症、 系统性红斑狼疮、 强直性脊柱炎、 牛 皮癣、 硬皮病、 慢性溃疡性肠炎、 慢性萎缩性胃炎、 慢性淋巴性甲状腺炎、 胰岛素 依赖型糖尿病、 克罗恩氏病、 干燥综合征。
15. 一种预防或治疗自身免疫反应疾病的方法， 其特征在于， 给需要的对象施用 权利要求 1所述的药物组合物。
16. 如权利要求 15所述的方法， 其特征在于， 所述的自身免疫反应疾病选自下 组： 类风湿性关节炎、 多发性脑脊髓硬化症、 系统性红斑狼疮、 强直性脊柱炎、 牛 皮癣、 硬皮病、 慢性溃疡性肠炎、 慢性萎缩性胃炎、 慢性淋巴性甲状腺炎、 胰岛素 依赖型糖尿病、 克罗恩氏病、 干燥综合征。
17. 一种 miRNA-23拮抗剂的用途， 其特征在于， 用于制备上调自身免疫反应的调 节剂。
18. 一种筛选用于抑制自身免疫的活性成分的方法， 其特征在于， 包括步骤： (a) 将候选物质施用于测试组的细胞或动物， 并测定施用后所述测试组中 miRNA-23的表达水平；
(b)将测试组的 miRNA-23与对照组的 miRNA-23的表达水平进行比较， 所述对照 组中未施用所述候选物质；
其中， 当测试组的 miRNA-23的表达水平显著高于对照组的 miRNA-23的表达水平 时， 则表明该候选物质是抑制自身免疫的活性成分。
19. 一种检测自身免疫反应疾病的方法， 其特征在于， 包括步骤： 分别检测待测 样本和阴性对照样本 miR-23b的表达水平， 如果与阴性对照样本相比， 待测样本的 miR-23b的表达水平降低， 则是潜在的自身免疫反应疾病患病样本。
20. 如权利要求 19所述的方法， 其特征在于， 还包括步骤： 分别检测待测样本 和阴性对照样本 miR-30a、 和 /或 miR- 146a、 和 /或 miR-214的表达水平， 如果与阴 性对照样本相比， 待测样本的 miR-30a的表达水平降低， 和 /或 miR_146a的表达水 平提高、 和 /或 miR-214的表达水平提高， 则是潜在的自身免疫反应疾病患病样本。
21. 如权利要求 19所述的方法， 其特征在于， 所述的自身免疫性疾病选自下组： 类风湿性关节炎、 多发性脑脊髓硬化症、 系统性红斑狼疮、 强直性脊柱炎、 硬皮病、 慢性溃疡性肠炎、 慢性萎缩性胃炎、 慢性淋巴性甲状腺炎、 胰岛素依赖型糖尿病、 克罗恩氏病、 干燥综合征。
22. 如权利要求 19所述的方法， 其特征在于， 所述的降低是指： 与阴性对照样 本相比， 相应 miRNA的表达水平的降低幅度 10%, 较佳地 20%, 较佳地 50%, 更 佳地 80%,最佳地 100%;和 /或 所述的提高是指：与阴性对照样本相比，相应 miRNA 的表达水平的提高幅度 10%, 较佳地 20%, 较佳地 50%, 更佳地 80%, 最佳地 100%。
23.—种微小 RNA即 miR-23b的用途， 其特征在于， 用于制备检测自身免疫反应 疾病的试剂或试剂盒。
Description:
自身免疫性疾病相关的 microRNA及其应用
本发明属于生物技术和医学领域， 具体地， 本发明涉及自身免疫性疾病相关的 microRNA及其应用。 背景技术
自身免疫性疾病是一类机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引 起的疾病， 通常认为异常炎症反应发生在由各类自身免疫性疾病引发的组织损伤处， 如风湿性关节炎（rheumatoid arthriti s , RA)， 多发性硬化症（mult iple scleros is , MS)和系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus ， SLE)。 RA的主要特征为滑 膜炎症伴随有关节骨和软骨损伤， MS是以中枢神经系统的脱髓鞘现象为特征的一种 炎症病变， SLE是一种由免疫复合物沉积。免疫系统慢性激活造成多系统自身免疫性 疾病， 并常常伴随有肾炎的发生。 胶原诱导的类风湿性关节炎（col lagen-induce arthritis , CIA)和实验性变态反应性脑脊髓膜炎（experimental autoimmune encephalomyel iti s , EAE)是由自身抗原诱导产生自身免疫性疾病的小鼠模型， 分别 对应于 RA和 MS。 而腿 L/ r小鼠则是一种可以自发产生 SLE的小鼠模型。
microRNA (miR或 miRNA, 微小 RNA)是一类在较高等的真核生物体内广泛存在的， 长度约 18-26个碱基的单链 RNA分子。它可以通过碱基配对原则特异性地与一些 mRNA 上的靶位点相结合， 引起靶 mRNA降解或翻译抑制， 进而在转录后水平对靶基因进行 调控。
microRNA来源于长度约 lOOObp的长链 RNA初始转录产物（Pri_miRNA)， Pri_miRNA 分子在细胞核中经 Drosha酶剪切形成长度约 60_80 nt的具有茎环结构的 miRNA前 体。 前提 miRNA转运至胞质后， 被进一步切割成长约 18_26nt的双链 miRNA。 双链 miRNA解开后， 成熟的 miRNA进入 RNA诱导基因沉默复合物（RNA_induced si lencing complex, RISC) , 与互补 mRNA完全或不完全配对， 降解靶 mRNA或阻遏其表达。
尽管 microRNA在细胞总 RNA中所占的比重很小， 但由于它可以高效地对所有具 有靶位点的 mRNA产生调控作用， microRNA在生物体的发育乃至肿瘤的发生、 发展过 程所起的作用不可小视。
迄今为止， 本领域对于自身免疫性疾病与 microRNA关系了解甚少， 尽管一些 miRNA, 如 miR- 155， miR_146a和 miR-326主要通过影响 T细胞功能调节自身免疫性 疾病的发病情况， 但原位细胞中的 miRNA是怎样在自身免疫性疾病中发挥功能还不 很清楚。 因此本领域迫切需要对自身免疫性疾病相关的 microRNA及其调节网络进行研
本发明的目的就是提供一类自身免疫性疾病相关的 microRNA及其应用。 在本发明的第一方面， 提供了一种药物组合物， 包括药学上可接受的载体和有效 的选自下组的一种或多种活性成分： (a) miRNA-23家族的微小 RNA， 所述 miRNA_23家族的微小 RNA包括： miRNA_23 或经修饰的 miRNA-23衍生物、 和核心序列为 UCACAUU、 长度为 18_26nt、 功能与 miRNA-23b相同或基本相同的微小 RNA或经修饰的 miRNA衍生物；
(b)前体 miRNA, 所述的前体 miRNA能在宿主内加工成（a)中所述的微小 RNA; (c)多核苷酸， 所述的多核苷酸能被宿主转录形成（b)中所述的前体 miRNA, 并加 工形成（a)中所述的微小 RNA;
(d)表达载体， 所述表达载体含有（a)中所述的微小 RNA、 或（b)中所述的前体 miRNA, 或（c)中所述的多核苷酸；
(e) (a)中所述的微小 RNA的激动剂。
在另一优选例中， 所述的 miRNA-23b为 miRNA-23b_3p。
在另一优选例中， （a)中所述的核心序列指微小 RNA第 2-8位的核苷酸序列；和 / 或所述的 "功能与 miRNA-23b相同或基本相同" 是指保留了 miRNA-23b_3p的 40%， 且 500%的抑制自身免疫的功能。
在另一优选例中， 所述的抑制自身免疫是指抑制炎症因子介导的信号通路和基 因表达。
在另一优选例中， 所述的微小 RNA来源于人或非人哺乳动物； 较佳地所述的非人哺 乳动物为大鼠、 小鼠。
在另一优选例中， （a)中所述的所述的核心序列指微小 RNA第 2-8位的核苷酸序 列。
在另一优选例中， （a)中所述的 "功能与 miRNA-23b相同或基本相同"是指保留 了 miRNA-23b_3p的 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%、 ^ 100%, 且 500% 的抑制自身免疫的功能。
在另一优选例中， （b)中所述的宿主为： 人或啮齿动物（如大鼠、 小鼠）。
在另一优选例中，所述药物组合物的剂型为注射剂、口服制剂 (片剂、胶囊、口服液）、 透皮剂、 缓释剂。
在另一优选例中， 所述的药物组合物还有选自下组的 miRNA: miRNA-23a-5p和 miRNA_23b_5p。
在另一优选例中， （b)中所述的前体 miRNA中还含有对应于选自下组的 miRNA的序 歹 miRNA— 23a— 5p和 miRNA— 23b— 5p。
在另一优选例中， 所述的 miRNA-23为选自下组的 miRNA: miR A-23a_3p、 miRNA_23b_3p、 miRNA_23c、 miRNA_23a_5p、 或 miRNA_23b_5p。
在另一优选例中， 所述的 miRNA-23为选自下组的 miRNA: miR A-23a_3p、 miRNA_23b_3p、 或 miRNA_23c。
在另一优选例中， （a)中所述的 miRNA-23包括序列如 SEQ ID NO.： 1所示的 miRNA-23a_3p、 如 SEQ ID NO.： 2所示的 miRNA-23b_3p、 或如 SEQ ID NO.： 3所示 的 miRNA_23c。
在另一优选例中，所述的经修饰的 miRNA衍生物，其修饰选自下组的一种或多种修饰 形式： 核苷酸的糖基修饰； 核苷酸之间连接方式的修饰， 胆固醇修饰、 锁核苷酸修饰、 肽段修饰、 脂类修饰、 卤素修饰、 烃基修饰、 和核酸修饰。 在另一优选例中， 所述的核苷酸的糖基修饰包括 2-0-甲基的糖基修饰、 2-0-甲氧乙 酯的糖基修饰、 2-0-垸基的糖基修饰、 2-氟代的糖基修饰、 糖环修饰、 锁核苷酸修饰； 和 /或所述的核苷酸之间连接方式的修饰包括硫代磷酸修饰、 磷酸垸基化修饰； 和 /或所 述的核酸修饰包括 "TT "修饰。
在另一优选例中， （a)中所述经修饰的 miRNA衍生物是具有式 I所示结构的化合物 单体或其多聚体：
(X) n- (Y) m 式 I
在式 I中，
各 X为（a)中所述的微小 RNA;
各 Y独立地为促进微小 RNA施药稳定性的修饰物；
n为 1-100的（较佳地 1-20)正整数（较佳地 n为 1、 2、 3、 4或 5) ；
m为 1-1000的（较佳地 1-200)正整数；
各 "-"表示接头、 化学键、 或共价键。
在另一优选例中， 所述的接头是长度为 1-10个碱基的核酸序列。
在另一优选例中， 所述的 Y包括 (但不限于)胆固醇、 类固醇、 醇、 醇、 有机酸、 脂 肪酸、 酯、 单糖、 多糖、 氨基酸、 多肽、 单核苷酸、 多核苷酸。
在另一优选例中， （c)中所述的多核苷酸具有式 I I所示的结构：
Seq 正向一 X一 Seq 反向
式 II中， Seq正向为能在宿主中被加工成所述的微小 RNA核苷酸序列； Seq反向为与 Seq正向基本上互补或完全互补的核苷酸序列； X为位于 Seq正向和 Seq反向之间的间隔 序列， 并且所述间隔序列与 Seq正向和 Seq反向不互补； 并且式 I I所示的结构在转入宿 主细胞后， 形成式 Ι Π所示的二级结构：
Seq正向 ―,
式 I I I，
式 I I I中， Seq正向、 Seq反向和 X的定义如上述， | |表示在 Seq正向和 Seq反向之 间形成的碱基互补配对关系。
在另一优选例中， 所述 miRNA-23的激动剂选自下组： 促进 miRNA_23表达的物质、提 高 miRNA-23活性的物质、 抑制 IL-17表达的物质、 抑制 IL-17活性的物质。
在另一优选例中， 抑制 IL-17活性的物质包括抗 IL-17的抗体。
在另一优选例中， 所述的药学上可接受的载体选自下组： 水、 盐水、 脂质体、 脂质、 蛋白、 蛋白-抗体缀合物、 肽类物质、 纤维素、 纳米凝胶、 或其组合。
在另一优选例中， （d)中所述的表达载体包括： 病毒载体和非病毒载体。
在另一优选例中， 所述的病毒载体为： 腺病毒载体、 腺相关病毒载体、 逆转录病毒载 体、 或慢病毒载体。
在另一优选例中， 所述的非病毒载体为： 质粒或细菌。
在另一优选例中， 所述的前体 miRNA的序列如 SEQ ID NO. ： 4、 SEQ ID NO. ： 5、 或 SEQ ID NO. ： 6所示。 在另一优选例中， 所述药物组合物用于治疗自身免疫反应疾病。
在本发明的第二方面，提供了一种活性成分的用途，其中，所述的活性成分选自下组: (a) miRNA-23家族的微小 RNA, 所述 miRNA_23家族的微小 RNA包括： miRNA_23或经修饰 的 miRNA-23衍生物、 和核心序列为 UCACAUU、 长度为 18_26nt、 功能与 miRNA_23b相同 或基本相同的微小 RNA或经修饰的 miRNA衍生物； （b)前体 miRNA, 所述的前体 miRNA能 在宿主内加工成 (a)中所述的微小 RNA; (c)多核苷酸， 所述的多核苷酸能被宿主转录形 成 (b)中所述的前体 miRNA, 并加工形成 (a)中所述的微小 RNA; (d)表达载体， 所述表达 载体含有 (a)中所述的微小 RNA、 或 (b)中所述的前体 miRNA、 或（c)中所述的多核苷酸； (e) (a)中所述的微小 RNA的激动剂；所述活性成分用于制备抑制自身免疫反应的抑制剂、 制备预防或治疗自身免疫反应疾病的药物。
在另一优选例中， 所述的自身免疫反应疾病选自下组： 类风湿性关节炎、 多发性脑脊 髓硬化症、 系统性红斑狼疮、 强直性脊柱炎、 牛皮癣、 硬皮病、 慢性溃疡性肠炎、 慢性 萎缩性胃炎、 慢性淋巴性甲状腺炎、 胰岛素依赖型糖尿病、 克罗恩氏病、 干燥综合征。
在本发明的第三方面，提供了一种预防或治疗自身免疫反应疾病的方法，给需要的对 象施用本发明第一方面所述的药物组合物。
在另一优选例中， 所述的对象包括人。
在本发明的第四方面， 提供了一种 miRNA-23拮抗剂的用途， 用于制备上调自身免疫 反应的调节剂。
在另一优选例中， 所述的 miRNA-23为 miRNA_23b_3p。
在本发明的第五方面，提供了一种筛选用于抑制自身免疫的活性成分的方法，包括步 骤：
(a) 将候选物质施用于测试组的细胞或动物， 并测定施用后所述测试组中 miRNA-23 的表达水平；
(b)将测试组的 miRNA-23与对照组的 miRNA-23的表达水平进行比较， 所述对照组中 未施用所述候选物质；
其中， 当测试组的 miRNA-23的表达水平显著高于对照组的 miRNA-23的表达水平时， 则表明该候选物质是抑制自身免疫的活性成分。
在另一优选例中， 所述的 "显著高于" 是指测试组的 miRNA-23的表达水平是对 照组的 miRNA-23的表达水平 1. 5倍以上（如 1. 5-5倍， 较佳地 1. 5-3倍）。
在另一优选例中， 所述的方法还包括步骤（c) : 对步骤 (b)中获得的抑制自身免疫 的活性成分， 进一步测定其对炎症因子介导的信号通路或基因表达的抑制作用。
在本发明的第六方面， 提供了一种 TAB2或 TAB3抑制剂的应用， 用于制备抑制自 身免疫反应疾病的药物。
在另一优选例中， 所述的自身免疫性疾病选自下组： 类风湿性关节炎、 多发性脑 脊髓硬化症、 系统性红斑狼疮、 强直性脊柱炎、 牛皮癣、 硬皮病、 慢性溃疡性肠炎、 慢性萎缩性胃炎、 慢性淋巴性甲状腺炎、 胰岛素依赖型糖尿病、 克罗恩氏病、 干燥 综合征。
在本发明的第七方面， 提供了一种检测自身免疫反应疾病的方法， 包括步骤： 分 别检测待测样本和阴性对照样本 miR-23b的表达水平， 如果与阴性对照样本相比， 待测样本的 miR-23b的表达水平降低， 则是潜在的自身免疫反应疾病患病样本。
在另一优选例中， 所述的方法还包括步骤： 分别检测待测样本和阴性对照样本 miR-30a、 和 /或 miR- 146a、 和 /或 miR-214的表达水平， 如果与阴性对照样本相比， 待测样本的 miR-30a的表达水平降低， 和 /或 miR_146a的表达水平提高、 和 /或 miR-214的表达水平提高， 则是潜在的自身免疫反应疾病患病样本。
在另一优选例中， 所述的自身免疫性疾病选自下组： 类风湿性关节炎、 多发性脑 脊髓硬化症、 系统性红斑狼疮、 强直性脊柱炎、 硬皮病、 慢性溃疡性肠炎、 慢性萎 缩性胃炎、 慢性淋巴性甲状腺炎、 胰岛素依赖型糖尿病、 克罗恩氏病、 干燥综合征。
在另一优选例中， 所述的降低是指： 与阴性对照样本相比， 相应 miRNA的表达水 平平的的降降低低幅幅度度 1100%%,， 较佳地 20%, 较佳地 50%, 更佳地 80%, 最佳地 100%。
在另一优选例中， 所述的提高是指： 与阴性对照样本相比， 相应 miRNA的表达水 平的提高幅度 10%， 较佳地 20%, 较佳地 50%, 更佳地 80%, 最佳地 100%。
在另一优选例中， 所述的自身免疫反应疾病为选自下组的一种或多种： 风湿性关 节炎、 多发性硬化症、 或系统性红斑狼疮。
在本发明的第八方面， 提供了微小 RNA即 miR-23b的用途， 它被用于制备检测自 身免疫反应疾病的试剂或试剂盒。
在另一优选例中， 上述的试剂是芯片、 引物、 或探针。
在另一优选例中， 上述的试剂盒包括使用说明。 较佳地， 所述使用说明包括对步 骤的描述： 分别检测待测样本和阴性对照样本 miR-23b的表达水平， 如果与阴性对 照样本相比， 待测样本的 miR-23b的表达水平降低， 则是潜在的自身免疫反应疾病 患病样本。
在另一优选例中， 所述的 miR-23b为 miRNA-23b_3p。 应理解， 在本发明范围内中， 本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合， 从而构成新的或优选的技术方案。 限于 篇幅， 在此不再一一累述。 附图说明
下列附图用于说明本发明的具体实施方案， 而不用于限定由权利要求书所界定的 本发明范围。
图 1表明 miR-23b_3p在自身免疫性疾病局部炎症组织中的表达普遍下调； 其中， 图 la显示了在人类自身免疫性疾病以及相关小鼠自身免疫性疾病模型的炎症组织中 筛选到的上调表达前 15位和下调表达前 15位的 miRNA:包括比较四例类风湿性关节 炎患者与两例骨关节炎患者和两例正常人（意外受伤）的关节滑膜组织、 比较两份胶 原诱导的关节炎（CIA)的小鼠样本与两份未处理的对照小鼠样本（每份样本混合了六 只小鼠的关节组织）、 比较八例新经确诊患有狼疮性肾炎且尚未治疗的红斑狼疮患者 的肾脏活检标本同四例肾癌患者的癌旁组织、 比较两份 MRL/lpr小鼠（每份样本混合 了六只小鼠的肾脏组织）和两份正常小鼠样本（每份样本混合了三只小鼠的肾脏组织) 以及两份 M0G免疫 16天的实验性自身免疫性脑脊髓膜炎（Experimental Autoimmune Encephalomye l it i s, EAE)小鼠同两份未处理的对照小鼠样本（每份样本混合了四只 小鼠的脊髓组织）； 图 lb显示了筛选在自身免疫性疾病的炎症组织中普遍调控的 mi croRNA的流程， 列出了两个普遍上调的 mi croRNA和两个普遍下调的 microRNA。 图 l c显示， 类风湿性关节炎患者（以骨关节炎患者及外伤患者为正常对照）的关节滑 膜组织中， 类风湿性关节炎患者炎症组织中的 miR-23b_3p的表达显著下调； 图 I d 显示， 在红斑狼疮患者的肾组织活检标本（以肾癌患者的癌旁肾组织为正常对照）， 红斑狼疮患者炎症组织中的 miR-23b_3p的表达显著下调； 图 le_显示， 在 I I型胶原 免疫的 DBA/ 1小鼠关节（混合 6只小鼠关节样本） miR-23b的表达显著下调； 中图 If 显示， 在 10周龄及 40周龄 MRL/lpr小鼠肾组织混合样本 miR-23b_3p的表达显著下 调（图 If)、图 l g显示六只 M0G免疫 14天或 28天的 C57BL/6小鼠的脊髓混合样本中 的 miR-23b的表达显著下调。
图 2显示 IL-17介导了炎症性自身免疫性疾病中 miR-23b_3p的下调； 其中， 图 2a显示在类风湿性关节炎患者、 骨关节炎患者和正常对照组（意外受伤）的关节滑膜 组织中， miR-23b_3p表达同 IL-17的表达呈现负相关； 图 2b显示在红斑狼疮患者的 肾脏活检标本以及肾癌患者的癌旁组织中， miR-23b_3p表达同 IL- 17的表达呈现负 相关； 图 2c显示类风湿性关节炎患者的滑膜组织中炎症因子的表达水平提高， 其中 样本来自于 17例类风湿性关节炎患者， 19例骨关节炎患者和 3例正常人对照（意外 受伤）的关节滑膜组织； 图 2d显示红斑狼疮患者的肾脏组织中炎症因子的表达水平 提高， 其中样本来自于 18例红斑狼疮患者的肾脏活检样本和 9例肾脏肿瘤患者的癌 旁组织对照样本； 图 2e和图 2f显示， IL-17的刺激下调 miR-23b_3p的表达， 检测 人类原代成纤维样滑膜细胞（图 2e)和小鼠原代培养的肾脏细胞（图 2f)， 在分别接受 人或小鼠重组 TNF a (10 ng/ml)、 IL- 1 β (10 ng/ml)、 IL-17 (50 ng/ml)、 IL- 6 (20 ng/ml)和 IFN (50 ng/ml)刺激后的 miR_23b水平； 图 2g显示 IL-17通过 NF_ κ B调 节 miR-23的表达， 分别检测 WT、 Act l—z—和 IKK 小鼠胚胎成纤维细胞在
IL-17 (50ng/ml)刺激后的 miR-23b_3p水平； 图 2h显示 IL-17可以在体内调节 miR-23b_3p表达， 分别检测感染了表达 IL-17 (Ad_IL_17)的腺病毒和感染了携带空 载体（Ad-EV)的腺病毒的小鼠关节中 miR-23b水平，用 qPCR检测 IL-17和 KC (cxcl l) 的表达水平做为阳性对照。
图 3显示 miR-23家族能抑制炎症因子介导的信号以及基因表达； 其中， 图 3a显 示在各个特定时间点给予转染了 miR-23b_3p模拟物和模拟物对照的 HeLa细胞空白 (Mock) , IL-17 (50ng/ml)、 TNF a (10ng/ml)、 IL-1 β (lOng/ml)刺激、 收集细胞裂 解物进行免疫印迹分析，用抗 p-I B 、1 B 、p-p65、p_p38、TAB2、TAB3和 -act in 的抗体进行检测， 表明 miR-23b_3p能抑制炎症因子介导的信号； 图 3b显示用 miR-23b_3p模拟物和模拟物对照转染 HeLa细胞，在各个特定时间点给予空白（Mock)、 IL-17 (50ng/ml)、 TNF a (10ng/ml)和 IL-1 β (lOng/ml)刺激， EMSA实验验证 miR-23b-3p抑制 NF- κ Β的活化的功能；图 3c_图 3e显示在原代成纤维样滑膜细胞（图 3c)、原代肾上皮细胞（图 3d)、原代星形胶质细胞（图 3e)中转染 miR-23b_3p模拟物， miR-23b_3p抑制物及其模拟物对照， 分别单独或联合使用 IL-17 (50ng/ml)、 TNF a (10ng/ml)、 IL-1 β (lOng/ml)刺激 6小时， 参考管家基因 Rpl 13a进行标准化， 检测 KC和 IL-6的表达；数据整合了四次（图 3c)或三次（图 3d,图 3e)相对独立实验， 结果显示 miR-23b_3p抑制炎症因子介导的基因表达； 图 3f 显示在原代肾上皮细胞 转染 miR-23a-3p模拟物及其模拟物对照， 分别单独或联合使用 IL-17 (50ng/ml)、 TNF a (10ng/ml) , IL_1 β (10ng/ml)刺激 6小时， 参考管家基因 Rpl l3a进行归一化， 检测 KC和 IL-6的表达。
图 4显示 miR-23家族在小鼠模型中可以抑制自身免疫性疾病的发病； 其中， 图 4a显示 miR-23b_3p抑制 CIA发病，分别在 DBA/1小鼠的关节内注射对照组空载腺病 毒（Ad_EV)、 携带编码 miR-23b的腺病毒（Ad_23b)、 携带编码 miR-23b_3p吸附物的 腺病毒（Ad-sponge)以及携带同时编码 miR_23b及其吸附物的腺病毒
(Ad-23b+Ad-sponge) , 在图中所标明的时间点应用 I I型胶原诱导小鼠关节炎， 进行 平均临床评分（士标准差）和发病率的计算。 图 4b显示， 在第二次免疫后 80天将图 3a中小鼠进行后爪 micro-CT扫描， 结果表明 miR-23b_3p的表达抑制了 CIA发病中 的骨损伤， 而 miR-23b_3p吸附物则促进了 CIA发病中的骨损伤。 图 4c和图 4d显示 miR-23b-3p能抑制小鼠自发的狼疮肾炎， 在 MRL/lpr小鼠 6?24周龄期间每三周静 脉注射空载腺病毒（Ad-EV)， 携带编码 miR-23b的腺病毒（Ad_23b)和携带编码 miR-23b_3p吸附物的腺病毒（Ad-sp)， 24周龄的 MRL小鼠注射 Ad_EV作为对照， 处 理组小鼠肾脏组织的损伤程度按照实验方法中的标准进行分级（图 3c) ; 图 4d显示， 取图 4c中处理过的 24周龄的小鼠制作 H&E染色的肾脏切片， 可以看到肾小球细胞 增生（上排、 中排）和外周单核细胞浸润裂隙（下排）； 图 4e显示肾脏局部炎症因子的 诱导在接受 Ad_23b腺病毒的小鼠中受到显著抑制。 图 4f 显示 miR-23b_3p抑制 EAE 发病， 分别对 c57小鼠尾静脉注射不同腺病毒， 包括对照组空载腺病毒（Ad-EV)、 携 带编码 miR-23b_3p的腺病毒（Ad_23b)、携带编码 miR-23b_3p吸附物的腺病毒（Ad_sp) 以及携带同时编码 miR-23b_3p及其吸附物的腺病毒（Ad-23b+sp)， 在图中所标明的 时间点应用 M0G诱导小鼠 EAE发病， 进行 EAE临床评分、 并计算其发病率。 图 4g显 示 miR-23a_3p抑制 EAE发病， 分别对 c57小鼠尾静脉注射对照组空载（Ad_EV)， 携 带编码 miR-23a的病毒（Ad_23a)， 在图中所标明的时间点应用 M0G诱导小鼠 EAE发 病， 进行 EAE临床评分、 并计算其发病率。
图 5显示 miR-23家族可以有效治疗自身免疫疾病； 其中， 图 5a显示 miR-23b_3p 可以有效治疗 CIA, 二型胶原一次免疫后 25天 /二次免疫后 4天起， 待 DBA/1小鼠开 始发病后，每隔两周关节内注射 50nM/只的 Agomir-miR-23b-3p及对照，共注射 3次， 每 5天进行关节炎评分（士 s. e. m. )， *P & 0. 05； 图 5b显示 miR_23b_3p可以有效治 疗 EAE, M0G免疫 c57小鼠发病后， 于 11天和 15天尾静脉注射 ΙΟΟηΜ/只的
Agomir-miR-23b-3p及对照， 共注射 2次， 每天进行脑脊髓炎评分（士 s. e. m. )。
图 6显示 miR-23b_3p控制炎症因子通路中的多个基因； 其中， 图 6a显示通过基 因芯片比较分析转染了 miR-23b_3p模拟物与转染了模拟物对照的人原代成纤维样滑 膜细胞（FLS)的差异表达基因以及联合 TargetScan生物信息学分析， 找到的由 miR-23b_3p调控的 11个可能的与炎性反应相关的基因， Rpl l3a作为阴性对照， 渐 变色和数字表示 11个基因在转染了 miR-23b_3p模拟物和转染了模拟物对照的 FLS 细胞中的相对表达水平； 图 6b显示特定的 3' UTR报告质粒转染到 293T细胞中， 分 别转染 miR-23b_3p或者对照模拟物（NC)， 荧光素酶活性检测的结果， 结果表明转染 miR-23b-3p下调了 IKK α、 ΤΑΒ2和 ΤΑΒ3的表达， 说明 ΙΚΚ α、 ΤΑΒ2和 ΤΑΒ3是 miR-23b_3p作用的目标基因； 图 6c显示用野生型（wt UTR)或者点突变的 3' UTR (mut UTR)报告质粒转染 293T , 转入 miR-23b_3p或者对照模拟物（NC)， 检测荧光素酶活性 的结果； 图 6d显示， miR-23b_3p可以降低其作用基因的蛋白水平， 检测未转染以及 转染了对照 mimic和 miR-23b_3p的原代成纤维样滑膜细胞（FLS)和 293细胞中内源 TAB2 , TAB3和 ΙΚΚ α 水平， β -act in是内参， s代表短曝光， 1代表长曝光。
图 7显示在自身免疫性疾病中， TAB2和 TAB3是 miR-23b_3p的作用靶点； 其中， 图 7a显示免疫印迹方法检测正常人、 骨关节炎患者、 类风湿性关节炎患者的关节滑 膜中 TAB3、 TAB2和 ΙΚΚ α 的蛋白表达水平， 以 β -act in做为内参； 图 7b显示了在 上述样品中 miR-23b_3p的水平与 TAB3、 TAB2和 IKK α 的蛋白表达水平呈现负相关； 图 c显示免疫印迹方法检测红斑狼疮患者及其对照组的肾脏标本中 ΤΑΒ3 , ΤΑΒ2和 ΙΚΚ α 表达水平， 以 β -actin做为内参； 图 7d显示了在上述样品中 miR-23b_3p的 水平与 TAB3、 TAB2和 ΙΚΚ α 的蛋白表达水平呈现负相关； 图 7e_g应用免疫印迹法 显示 TAB2 , TAB3和 ΙΚΚ α 的表达水平在自身免疫性疾病小鼠模性的原位炎症组织中 上调， 包括比较这三种蛋白在 I I型胶原免疫 30周后的 DBA/1小鼠以及未处理对照 组小鼠关节组织中的表达（图 7e)， 比较这三种蛋白在 10周龄， 40周龄 MRL/lpr以 及对照 MRL小鼠肾脏组织中的表达（图 7f)、比较这三种蛋白在 M0G免疫 14天后以及 未处理对照小鼠的脊髓中的表达（图 7g)，这些结果显示作为 miR-23b_3p的作用靶点、 这三种蛋白在人和小鼠的炎症组织中都显著上调了。
图 8显示抑制 TAB2和 TAB3的表达可以抑制自身免疫疾病的发生发展； 其中， 图 8a显示筛选 TAB2和 TAB3的 siRNA序列； 图 8b显示应用 shRNA降低 TAB2和 TAB3表 达水平的效果； 图 8c和图 8d显示降低 TAB2和 TAB3的表达水平能抑制 CIA发病： 图 8c表明在 I I型胶原免疫的 DBA/1小鼠体内， 在箭头所指的时间静脉注射慢病毒 介导的同时敲低 TAB2和 TAB3表达的 shRNA (LV_shTAB2/3)以及对照 shRNA (LV_shNC)， 评估关节炎发病的平均临床评分（士标准差）以及发病率； 图 8d显示第二次免疫完成 后 50天取踝部切片进行 H&E染色结果； 图 8e显示重新表达 TAB2和 TAB3可以逆转 miR-23b_3p抑制炎症因子基因表达的作用；在人原代成纤维样滑膜细胞 (FLS)中转染 miR-23结合位点突变的 TAB2和 TAB3质粒或空质粒， 再用空的或者编码 miR_23b的 腺病毒感染细胞， 用 TNF a (10 ng/ml) 加上 IL-17 (50 ng/ml) 刺激 6小时。 qPCR 检测 KC和 IL-6的基因表达， 参考管家基因 Rpl l3a进行标准化； 图 8f显示重新表 达 TAB2和 TAB3逆转了 miR-23b_3p在 CIA进程中的抑制作用； 在 I I型胶原免疫的 DBA/1小鼠体内静脉注射携带 miR-23b的腺病毒（Ad_miR_23b)或者携带对照质粒的腺 病毒（Ad-EV)以及编码 TAB2、 TAB 3但 miR_23b结合位点突变质粒（LV-TAB2 , LV-TAB3) 或者对照质粒（LV-EV)的慢病毒， 对关节炎的进程进行平均临床评分（士标准差）和发 病率的评估。 注射的过程是分几次完成的， 如箭头所示时间。
图 9显示了制备过表达 miR-23b的腺病毒或者制备过表达 miR-23b_3p吸附物的 腺病毒的方法和效果。 图 9a显示制备过表达 miR-23b的腺病毒（Ad_miR_23b)或者制 备过表达 miR-23b_3p吸附物的腺病毒（Ad-miR-23_sponge)的示意图， Ad_miR_23b应 用的包含 mmu-miR-23b的序列如实验方法中所述； miR-23b_3p吸附物的单个片段的 序列如图 9a所示。 图％显示用 GFP报告荧光显示含有空质粒的腺病毒（Ad-EV)， 含 有编码 miR-23b的腺病毒（Ad_miR-23b)以及含有编码 miR-23b_3p吸附物的腺病毒 (Ad-miR-23-sponge)在小鼠 B16黑色素瘤细胞中的感染效率接近 100%。 图 9c和图 9d显示检测在关节内注射后（图 9c)或者静脉注射后（图 9d)特定组织内 miR-23b_3p 的表达， MicroRNA水平参考 snoRNA202的表达进行了标准化； 图 9e显示用含有 miR-23b-3p结合位点的荧光素酶报告质粒（miR_23b reporter)检测 miR_23b_3p过表 达或抑制对其作用位点的抑制以及去抑制的作用效率。 具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究， 在大量 microRNA中， 发现 miR_23b在局部炎 症组织中普遍下调。 本发明进一步发现导入 miR-23家族成员能抑制自身免疫性疾病 的发生发展， 所述家族成员包括 miR-23a、 miR_23b、 和 miR_23 对于已经发病的 自身免疫性疾病， 导入 miR-23家族成员能显著缓解疾病的症状和进程。 本发明还发 现细胞因子 IL-17调控了 miR-23b的表达； miR_23b以炎症因子信号通路上的 TAB2 和 TAB3等基因为靶点； 抑制 TAB2和 TAB3的表达可抑制自身免疫性疾病的发病和进 展。 在此基础上完成了本发明。 miRNA及其前体
本发明提供了一类涉及自身免疫相关的 miRNA。如本文所用， 所述的 " miRNA" 是 指一类 RNA分子， 从可形成 miRNA前体的转录物加工而来。 成熟的 miRNA通常具有 18-26个核苷酸（nt) (更特别的约 19_22nt)， 也不排除具有其它数目核苷酸的 miRNA 分子。 miRNA通常可被 Northern印迹检测到。
人来源的 miRNA可被从人细胞中分离。 如本文所用， "分离的"是指物质从其原 始环境中分离出来 （如果是天然的物质， 原始环境即是天然环境）。 如活体细胞内的 天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的， 但同样的多聚核苷酸或多肽如 从天然状态中同存在的其他物质中分开， 则为分离纯化的。
miRNA可从前体 miRNA (Precursor miRNA, Pre-miRNA)力口工而来，所述的前体 miRNA 可折叠成一种稳定的茎环（发夹）结构， 所述的茎环结构长度一般在 50-100bp之间。 所述的前体 miRNA可折叠成稳定的茎环结构， 茎环结构的茎部两侧包含基本上互补 的两条序列。 所述的前体 miRNA可以是天然的或是人工合成的。
前体 miRNA可被剪切生成 miRNA,所述的 miRNA可与编码基因的 mRNA的至少一部 分序列基本上互补。 如本文所用， "基本上互补"是指核苷酸的序列是足够互补的， 可以以一种可预见的方式发生相互作用， 如形成二级结构（如茎环结构）。 通常， 两 条 "基本上互补" 的核苷酸序列互相之间至少有 70%的核苷酸是互补的； 优选的， 至 少有 80%的核苷酸是互补的； 更优选的， 至少有 90%的核苷酸是互补的； 进一步优选 的， 至少有 95%的核苷酸是互补的； 如 98%、 99%或 100%。 一般地， 两条足够互补的 分子之间可以具有最多 40个不匹配的核苷酸； 优选的， 具有最多 30个不匹配的核 苷酸； 更优选的， 具有最多 20个不匹配的核苷酸； 进一步优选的， 具有最多 10个 不匹配的核苷酸， 如具有 1、 2、 3、 4、 5、 8、 11个不匹配的核苷酸。
如本文所用， "茎环" 结构也被称作 "发夹" 结构， 是指一种核苷酸分子， 其可 形成一种包括双链区域（茎部）的二级结构， 所述的双链区域由该核苷酸分子的两个 区域（位于同一分子上）形成， 两个区域分列双链部分的两侧； 其还包括至少一个 "环" 结构， 包括非互补的核苷酸分子， 即单链区域。 即使该核苷酸分子的两个区 域不是完全互补的， 核苷酸的双链部分也可保持双链状态。 例如， 插入、 缺失、 取 代等可导致一个小区域的不互补或该小区域自身形成茎环结构或其它形式的二级结 构， 然而， 该两个区域仍可基本上互补， 并在可预见的方式中发生相互作用， 形成 茎环结构的双链区域。 茎环结构是本领域技术人员所熟知的， 通常在获得了一条具 有一级结构的核苷酸序列的核酸后， 本领域技术人员能够确定该核酸是否能形成茎 环结构。
本发明所述的 miRNA是指： miRNA-23家族的微小 RNA, 所述 miRNA_23家族的微 小 RNA包括： miRNA-23或经修饰的 miRNA_23衍生物、 和核心序列为 UCACAUU、 长度 为 18_26nt、功能与 miRNA-23b相同或基本相同的微小 RNA或经修饰的 miRNA衍生物。
在本发明的一个优选例中， miRNA-23家族包括： miRNA_23b、 miRNA_23a、 和 miRNA-23c ; 较佳地， miRNA_23b的核苷酸序列如 SEQ ID NO.： 2所示； miRNA_23a 的核苷酸序列如 SEQ ID NO. : 1 所示； miRNA-23c的核苷酸序列如 SEQ ID NO. : 3所 示。
在另一优选例中， 所述的微小 RNA来源于人或非人哺乳动物； 较佳地所述的非人哺 乳动物为大鼠、 小鼠， 鼠和人的 23家族序列完全一致。 核心序列指微小 RNA第 2-8 位的核苷酸序列。 所述的 "功能与 miRNA-23b相同或基本相同" 是指保留了 miRNA-23b_3p的 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%的抑制自身免疫的功 台匕
本发明还包括 miRNA变体和衍生物。此外，广义上的 miRNA衍生物也可包括 miRNA 变体。 本领域的普通技术人员可以使用通用的方法对 miRNA-23进行修饰， 修饰方式 包括（但不限于）： 甲基化修饰、 烃基修饰、 糖基化修饰 (如 2-甲氧基 -糖基修饰、 烃基- 糖基修饰、糖环修饰等）、核酸化修饰、肽段修饰、脂类修饰、 卤素修饰、核酸修饰（如 " TT "修饰）等。
本发明所述的 miRNA还包括： miR-30a、 miR_146a、 miR-214及其变体和衍生物。 多核苷酸构建物
根据本发明所提供的 miRNA序列， 可设计出在被导入后可被加工成可影响相应的 mRNA表达的 miRNA的多核苷酸构建物， 也即所述多核苷酸构建物能够在体内上调相 应的 miRNA的量。 因此， 本发明提供了一种分离的多核苷酸（构建物）， 所述的多核 苷酸（构建物）可被人细胞转录成前体 miRNA ,所述的前体 miRNA可被人细胞剪切且表 达成所述的 miRNA。
作为本发明的一种优选方式， 所述的多核苷酸构建物含有式 I I所示的结构：
Seq 正向一 X一 Seq 反向
式 I I 式 I I中，
Seq E ft为可在细胞中表达成所述的 miRNA-23的核苷酸序列， Seq反向为与 Seq E ft 基本上互补的核苷酸序列； 或者， Seq ^为可在细胞中表达成所述的 miRNA的核苷酸 序列， Seq 为与 Seq 基本上互补的核苷酸序列； X为位于 Seq <<和 Seq 之间的 间隔序列， 并且所述间隔序列与 Seq <<和 Seq 不互补；
式 I所示的结构在转入细胞后， 形成式 Π Ι所示的二级结构：
式 I I I中， Seq E向、 Seq fi向和 X的定义如上述；
I I 表示在 Seq <<和 Seq 之间形成的碱基互补配对关系。
通常， 所述的多核苷酸构建物位于表达载体上。 因此， 本发明还包括一种载体， 它含有所述的 miRNA，或所述的多核苷酸构建物。所述的表达载体通常还含有启动子、 复制起点和 /或标记基因等。 本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的 表达载体。 这些方法包括体外重组 DNA技术、 DNA合成技术、 体内重组技术等。 所述 的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因， 以提供用于选择转化的宿主细 胞的表型性状， 如卡拉霉素、 庆大霉素、 潮霉素、 氨苄青霉素抗性。 药物组合物
本发明提供了一种药物组合物， 包括药学上可接受的载体或有效量的选自下组的一 种或多种活性成分： （a) miRNA-23家族的微小 RNA, 所述 miRNA-23家族的微小 RNA包 括： miRNA-23或经修饰的 miRNA-23衍生物、和核心序列为 UCACAUU、长度为 18_26nt、 功能与 miRNA-23b相同或基本相同的微小 RNA或经修饰的 miRNA衍生物； （b)前体 miRNA, 所述的前体 miRNA能在宿主内加工成（a)中所述的微小 RNA; (c)多核苷酸， 所述的多核苷酸能被宿主转录形成（b)中所述的前体 miRNA, 并加工形成（a)中所述的 微小 RNA; (d)表达载体， 所述表达载体含有（a)中所述的微小 RNA、 或（b)中所述的前 体 miRNA、 或（c)中所述的多核苷酸； （e) (a)中所述的微小 RNA的激动剂。 在本发明的 另一优选例中， 所述的药物药物组合物还包括 TAB2或 TAB3抑制剂。
在本发明的另一优选例中， 所述的 miRNA-23来源于人或非人哺乳动物。 人源和属源 的 miRNA-2核苷酸序列完全一致。 所述的 miRNA-23为序列选自下组的 miRNA: SEQ ID NO. ： 1、 SEQ ID NO. : 2、 或 SEQ ID NO. ： 3。
在本发明的另一优选例中， 所述的经修饰的 miRNA衍生物是具有式 I所示结构的 化合物单体或其多聚体：
(X) n- (Y) m 式 I
在式 I中， 各 X为（a)中所述的微小 RNA; 各 Y独立地为促进微小 RNA施药稳定性的 修饰物； n为 1-100的（较佳地 1-20)正整数（较佳地 n为 1、 2、 3、 4或 5)； m为 1-1000 的 (较佳地 1-200)正整数； 各 " -"表示接头、 化学键、 或共价键； 在另一优选例中， 所 述的接头是长度为 1-10个碱基的核酸序列。 所述的 Y包括 (但不限于)胆固醇、 类固醇、 甾醇、 醇、 有机酸、 脂肪酸、 酯、 单糖、 多糖、 氨基酸、 多肽、 单核苷酸、 多核苷酸。 在本发明的另一优选例中， （c)中所述的多核苷酸具有式 I I所示的结构：
Seq 正向一 X一 Seq 反向
式 I I中， 8^ <<为能在宿主中被加工成 miRNA-23的核苷酸序列； Seq 为与 Seq 基本上互补或完全互补的核苷酸序列； X为位于 Seq <<和 Seq 之间的间隔序列， 并且所述间隔序列与 Seq <<和 Seq ^不互补； 并且式 I I所示的结构在转入宿主细胞 后， 形成式 Ι Π所示的二级结构：
式 I I I，
式 I I I中， Seq E向、 Seq 反向和 X的定义如上述， | | 表示在 Seq 正向和 Seq 反向之间 形成的碱基互补配对关系。
在本发明的另一优选例中，所述的前体 miRNA的序列如 SEQ ID NO. ： 4、 SEQ ID NO. ： 5、 或 SEQ ID NO. ： 6所示， 更佳地， 如 SEQ ID NO. ： 5所示。
如本文所用，术语 "有效量"或 "有效剂量" 是指可对人和 /或动物产生功能或 活性的且可被人和 /或动物所接受的量。
如本文所用， "药学上可接受的"的成分是适用于人和 /或哺乳动物而无过度不 良副反应 （如毒性、 刺激和变态反应） 的， 即具有合理的效益 /风险比的物质。 术语 "药学上可接受的载体" 指用于治疗剂给药的载体， 包括各种赋形剂和稀释剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的 载体。 这类载体包括（但并不限于）： 盐水、 缓冲液、 葡萄糖、 水、 甘油、 乙醇、 及 其组合。 通常药物制剂应与给药方式相匹配， 本发明的药物组合物的剂型为注射剂、 口服制剂 (片剂、 胶囊、 口服液）、 透皮剂、 缓释剂。 例如用生理盐水或含有葡萄糖和 其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。 所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。
本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等 而变化。 优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定（例如 通过临床试验）。 所述的因素包括但不限于： 所述的活性成分的药代动力学参数例如 生物利用率、 代谢、 半衰期等； 患者所要治疗的疾病的严重程度、 患者的体重、 患 者的免疫状况、 给药的途径等。 通常， 当本发明的活性成分每天以约 0. 00001mg-50mg/kg动物体重（较佳的 0. 0001mg-10mg/kg动物体重）的剂量给予， 能 得到令人满意的效果。 例如， 由治疗状况的迫切要求， 可每天给予若干次分开的剂 量， 或将剂量按比例地减少。
本发明所述的药学上可接受的载体包括 (但不限于）： 水、 盐水、 脂质体、 脂质、 蛋 白、 蛋白-抗体缀合物、 肽类物质、 纤维素、 纳米凝胶、 或其组合。 载体的选择应与 给药方式相匹配， 这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。
本发明还提供了所述药物组合物的用途， 用于制备抑制自身免疫反应的抑制剂、 制备预防或治疗自身免疫反应疾病的药物。 所述的自身免疫反应疾病选自下组： 类 风湿性关节炎、 多发性脑脊髓硬化症、 系统性红斑狼疮、 强直性脊柱炎、 牛皮癣、 硬皮病、 慢性溃疡性肠炎、 慢性萎缩性胃炎、 慢性淋巴性甲状腺炎、 胰岛素依赖型 糖尿病、 克罗恩氏病、 干燥综合征。 诊断方法
本发明还提供了一种检测自身免疫反应疾病的方法。
在一个优选例中， 包括步骤： 分别检测待测样本和阴性对照样本 miR-23b的表达 水平， 如果与阴性对照样本相比， 待测样本的 miR-23b的表达水平降低， 则是潜在 的自身免疫反应疾病患病样本。 较佳地， 所述的方法还包括步骤： 分别检测待测样 本和阴性对照样本 miR-30a、 和 /或 miR- 146a、 和 /或 miR-214的表达水平， 如果与 阴性对照样本相比， 待测样本的 miR-30a的表达水平降低， 和 /或 miR_146a的表达 水平提高、和 /或 miR-214的表达水平提高，则是潜在的自身免疫反应疾病患病样本。
所述的自身免疫性疾病选自下组： 类风湿性关节炎、 多发性脑脊髓硬化症、 系统 性红斑狼疮、 强直性脊柱炎、 硬皮病、 慢性溃疡性肠炎、 慢性萎缩性胃炎、 慢性淋 巴性甲状腺炎、 胰岛素依赖型糖尿病、 克罗恩氏病、 干燥综合征。
所述的降低是指：与阴性对照样本相比，相应 miRNA的表达水平的降低幅度 10%, 较佳地 20%, 较佳地 50%, 更佳地 80%, 最佳地 100%。 所述的提高是指： 与阴 性对照样本相比， 相应 miRNA的表达水平的提高幅度 10%, 较佳地 20%, 较佳地 ^ 50%, 更佳地 80%, 最佳地 100%。 本发明的主要优点包括：
(1)本发明提供了局部炎症损伤中存在着一类普遍下调的 miR-23b，导入 miR23家 族， 包括 miR-23a、 miR_23b、 和 miR_23c， 可以预防和治疗多种自身免疫性疾病； (2)细胞因子 IL-17与 miR-23b的表达密切相关， miR_23可以同时抑制多种炎症 因子信号通路上的相关基因， 从而抑制各类自身免疫性疾病的发病。 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明本发 明而不用于限制本发明的范围。 下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按 照常规条件如 Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（New York： Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。 材料与方法
疾病患者标本
RA或者 0A患者发生关节炎的关节组织标本是在关节整形手术中获得的， RA和 0A 的诊断参考美国风湿病学院（ACR)的标准； 正常的关节组织样本来自于膝关节外伤的 健康人； 人原代成纤维样滑膜细胞 (FLS)从上述 RA和 0A患者的关节滑膜组织中分离 获得。
本发明搜集了 18位 SLE患者的狼疮性肾炎标本， 同时获得 9例肾癌患者癌旁组 织做为对照， 这些 SLE患者涵盖了美国风湿病学院分类标准的各个类型。 使用 SLE 临床活动性指数（SLEDAI)评定 SLE的临床活动性， 研究排除了并发感染的影响。
小鼠 C57BL/6, DBA/1 J， MRL/MpJ和腿 L/MpJ-
3/4 ^ j (MRL/^or)小鼠购买自中国科学院 上海斯莱克实验动物中心。 所有小鼠均饲养于无特异性病原体 (SPF)条件下。 一切动 物实验均遵循实验动物福利和使用标准， 并得到上海生物科学学会（中国科学院）生 物医学伦理委员会的批准。
MiRNA芯片和 DNA芯片
总 RNA使用 TRIzol试剂（购于 Invitrogen公司）抽提， 应用 Agi lent2100生物分 析仪评估质量，只有完整性大于 8的样本才被采用。在 miRNA表达实验中，通过 Taqman 低密度芯片 v3. 0 (Appl ied Biosystems)检测了总计 754个人类 miRNA和 641个小鼠 miRNA, 该实验在 Appl ied Biosystems real-t ime仪上按照相关产品的操作步骤完 成。 检测转染 miR-23b和对照细胞中各种 mRNA的表达是通过 Affymetrix GeneChip(R) Human Genome U133 Plus 2. 0 Array完成的， 后续结果由 Agi lent GeneSpring(TM) GX 10芯片数据分析软件进行处理。
293T细胞、 HeLa细胞、 人类原代成纤维样滑膜细胞（FLS细胞）、 小鼠胚胎成纤维 细胞（MEFs)、小鼠原代肾细胞等，购自美国 ATCC或者使用本领域通用方法进行纯化， 在含有 10% (vol/vol) FBS (Hyclone) , lOO g/ml青霉素和 lOO g/ml链霉素的 DEM培 养基中进行培养。
EAE诱导及评分
取 6?8周龄的市售 C57BL/6小鼠， 在背部皮下注射含有 300μ8 M0G (35_55)肽端 的完全弗氏佐剂（CFA) (Difco) o 在免疫当天以及 48小时后在小鼠体内注射 200μ8溶 于 PBS之中的百日咳毒素。 每天检査小鼠的发病情况， 使用 ΕΑΕ的分级标准按照疾 病严重程度进行评分： 0级， 没有临床特征； 1级， 尾部张力降低； 2级，轻度瘫痪（虚 弱， 1?2后肢不完全瘫痪）； 3级， 下身瘫痪（双后肢完全瘫痪）； 4级， 后肢瘫痪伴 随前肢虚弱或麻痹； 5级： 濒死状态或死亡。
CIA诱导及评分
取 8?10周龄的市售 C57BL/6小鼠， 将 100μ8鸡 I I型胶原（购于 Sigma-Aldich 公司）乳化于 CFA中， 分别在第 1天和第 21天在小鼠尾根部选取几处进行皮内注射。 再取 8?10周龄的雄性 DBA/1J小鼠，在第 1天皮内注射 100μ8乳化于 CFA中的鸡 I I 型胶原， 第 21天注射乳化于不完全弗氏佐剂（IFA) (Difco)中的胶原。 每 2?5天检 査关节炎症并按照以下标准进行评分： 0级， 正常无红肿现象； 1级， 踝关节内部轻 度肿胀； 2级， 轻度肿胀， 从踝部延伸到掌关节或跖关节； 3级， 中度肿胀， 从踝部 延伸至掌指关节或跖趾关节； 4级， 重度肿胀， 从踝部延伸至指端或趾端， 可见关节 僵硬关节运动消失。 4级为每只脚掌关节炎评分的最高级， 每只小鼠的最高评分为 16分。
组织化学以及肾脏形态学分析
用于组化分析的标本分别取自 M0G免疫的 C57小鼠、 CI I免疫的 DBA小鼠或 MRL/ r小鼠， 标本采集后立即用 4%多聚甲醛固定。脊髓标本在石蜡包埋后制成 5μηι 厚的切片进行苏木素 -伊红（Η&Ε)染色和 Luxol坚牢蓝染色， 在光学显微镜下进行观 察。 小鼠踝部标本首先在 10%的甲酸水溶液中脱钙处理 2周， 再进行石蜡包埋， 制成 5μηι厚的切片进行 Η&Ε染色。肾脏组织在石蜡包埋后制成 2μηι厚的切片进行坚牢蓝染 色， 再在光学显微镜下进行观察。 肾脏形态参考通用的人类狼疮性肾炎的分类标准， 根据小鼠肾脏的损伤程度将狼疮性肾炎分为 0?3四个等级（正常、 轻度、 中度和重 度）。 从肾脏形态学角度上来说， 小鼠狼疮性肾炎可以按照人类狼疮性肾炎根据活动 性和严重程度分为 0级到 3级（分别表示正常， 轻度， 中度和重度）。 每只小鼠至少 选取 10处包含有肾小球肾小管及其间质的视野并根据对肾小球细胞结构、 淋巴细胞 浸润情况、 系膜基质伸展， 新月体形成， 皮质和髓质中单个核细胞浸润， 透明沉积 物等指标来计算每个视野下的评分情况， 其中坏死与新月体形成的部分系数为 2。
Micro - CT
使用 GE Healthcare eXplore CT 120 MicroCT扫描仪对踝关节进行无损三维成 像。 使用中等分辨率（ x， y，和 z轴上均为 43. 5 μ ηι像素分辨率）扫描标本。 在扫描 过程中使用水、 空气和标准骨做校正， 使观察到的 micro-CT图像拥有一致的灰度。 扫描完每只小鼠的踝关节骨的图像后使用相关软件形成正中矢状切面图像。 使用 MicroView软件观察并分析 microCT的结果。
腺病毒介导的基因表达
携带 miR-23b或其吸附物的腺病毒的构建方法和效果如图 9所示。 具体来说， 为 了构建腺病毒载体（Ad- miR- 23b)， 将 genome序列上， mmu- miR- 23b的 precursor序 列及其前后各约 100bp的序列（序列如 SEQ ID NO. : 7所示）通过酶切构建到 pAdEasy vector (购自 Qbiogen)质粒中， 转染市售 293A细胞来包装病毒。 用 PBS稀释至每毫 升 101? - 1011个病毒， 通过静脉或者关节内注射来感染小鼠。 为了构建
Ad- miR- 23b- sponge , 合成的 7个重复吸附物序列（序列如 SEQ ID NO. : 8所示）： 被 构建到相同载体中。 应用相同的原理和方法构建了 Ad-miR-23a， Ad_miR_23a及 Ad-IL-17 o
MiRNA及其抑制物
MiR-23b-3p模拟物、 miR-23a_3p模拟物和 miR-23b_3p抑制剂（发夹形抑制物）购 自 Dharmacon公司 (Thermo Fi sher Scientifi c)。 MiRNA模拟物是双链 RNA寡聚核苷 酸， 而 miRNA发夹形抑制物则是单链寡聚核苷酸。 无论是发夹形抑制物， 还是模拟 物， 均使用秀丽隐杆线虫中的 cel-miR-67序列做为阴性对照， 该序列已被证实同人 类、 小鼠和大鼠均有最低的序列同源性。
Ago- miRNA
Ago-miR-23a_3p、 Ago-miR-23b_3p、 Ago-miR-23c_3p为胆固醇修饰的 microRNA, 购自广州市锐博生物科技有限公司。 这些 RNA的序列分别如 SEQ ID NO.： 1、 SEQ ID NO.： 2、 SEQ ID NO.： 3所示， 它们的修饰形式为： 所有核苷酸的糖基经 2_0_甲基 化修饰， 3'末端连接胆固醇， 5'末端两个位点（核苷酸之间连接方式）经硫代磷酸（PS) 修饰， 3'末端 4个位点 PS修饰。
使用 IL-6和 KC的 ELISA试剂盒（购自 R&D Systems公司）， 按照说明书的方法检 测血清中细胞因子和趋化因子的量。 使用已知浓度的纯的重组小鼠细胞因子或趋化 因子绘制标准曲线。 免疫印迹
细胞裂解物在电泳后被转印到 PVDF膜上， 分别用针对 ΙΚΚα、 ΤΑΒ2、 ΤΑΚ1、 ρ_Ι κ Βα、 ρ- ρ65、 ρ-ρ38 (购自 Cell Signaling)、 TAB 3 (购自 Abeam)、 p- ERK、 TRAF6、 β -actin (购自 Santa Cruz) .Flag (M2) (购自 Sigma-Aldrich)，或 HA (购自 Covance) 的抗体来进行检测。
慢病毒介导的基因表达和敲低
将小鼠体内编码 TAB2和 TAB3的序列克隆到 pLVX-IRES_ZsGreenl (购自 Clontech 公司）质粒上。 用于敲低 TAB2基因的两条序列为如 SEQ ID NO. :9和 SEQ ID NO. :10 所示； 用于敲低 TAB3基因的两条序列如 SEQ ID NO.： 11和 SEQ ID NO.： 12所示。 这些 shRNA序列被克隆至市售的 pLSLG慢病毒质粒。 再分别将这些质粒和辅助质粒 一起转染 293FT细胞来包装病毒。 转染 60小时后收集病毒并浓缩， 加入 10p g/ml 聚凝胺（Sigma-Aldrich)来感染细胞或小鼠。
使用 TRIzol (Invitrogen公司）试剂按照制造商说明的方法抽提细胞和小鼠组织 中的总 RNA。 cDNA由 PrimeScript RT reagent kit (Takara公司生产）得到。 小鼠 TNFa、 IL-1 β、 IL_6、 IFN γ、 IL - 17a、 II - 17f、 CXCLU CXCL5, CCL2、 CCL5、 CCL20、 GM_CSF、 MMP3、 MMP13、 RANKL, S100A8、 I κ B ζ、 以及人 TNFa、 IL_1 β、 IL_6、 IFNy , IL_17a、 I κ B ζ、 p65、 pri_miR_23b的表达水平由 SYBR Premix ExTaq kit (Takara公司生产）进行定量实时 PCR检测。 所有的基因表达均参考管家基因 Rpll3a 的水平进行了标准化处理。 cDNA的扩增在 AbiPrism 7900 HT cycler (Applied Biosystems)上完成的的。 使用 Applied Biosystems公司的 Taqman试剂盒检测成熟 miR的表达。
凝胶迁移滞后实验（EMSA)
分别选取 KC(cxcll)和 IP-lO(cxcllO)基因上 NF-κ B的结合位点设计探针。 合成 5'端含有生物素标记的双链寡聚核苷酸（Takara公司合成）。 核抽提物使用核抽提试 剂盒（Active Motif)获得。 使用 Gelshift化学发光 EMSA试剂盒（Active Motif)检 测 NF-κ B的活化。
在对两组监测数据进行统计学分析时选用双侧 Student' s t检验， 在进行较复杂 的比较时运用双因素方差分析， 再用邦弗朗尼（Bonferroni)事后检验法进行分析。 对于非参数统计数据的分析， 使用 Mann-Whitney检验。 取 P值为 0.05或者更低做 为判断结果显著性的标准。 实施例 1 自身免疫性疾病中 miRNA-23b的表达普遍下调
为了确定在各类自身免疫性疾病的炎症损伤部位是否有某种普遍存在的 miRNA发 挥作用， 本实施例取 RA和 SLE患者以及相关小鼠（CIA对应 RA， MRL/ r对应 SLE, EAE对应 MS)的炎症组织进行了比较 miRNA芯片分析。 人类 miRNA芯片包含 754个 miRNA, 检测样本包括 RA患者以及对照组的滑膜组织， SLE患者及对照组的肾活检组 织；小鼠 miRNA芯片包括了 641个 miRNA,分别检测了 CIA以及对照小鼠的关节样本， 雌性 MRL/ r和对照小鼠的肾组织以及 EAE和对照小鼠的脊髓标本。
检测结果如下： 同对照组相比， 在所有的自身免疫性疾病样本， 包括 RA、 SLE、 CIA、 MRL/7 /^和 EAE中， miR-23b_3p (核苷酸序列如 SEQ ID NO.： 2所示）和 miR_30a 普遍下调， 而 miR-146a和 miR-214则普遍上调， 而 miR_23b和 miR_30a相比下调现 象更为明显（图 la-lb)。 因此选择 miR-23b_3p来进行一步实施例。 接下来对大批的 RA、 SLE患者以及对照组标本， CIA、 MRL/lpr、 EAE以及对照的小鼠样本进行了定量 实时 PCR (qPCR)的检测， 结果确认了 miR-23b_3p在自身免疫性疾病的炎症组织中普 遍下调（图 lc_lg)。
发明人同时还检测了 miR-23家族其他成员， 包括 miR-23a_3p、 miR_23c， 在 RA、 SLE患者以及对照组标本， CIA、 MRL/lpr、 EAE以及对照的小鼠样本中的表达， 结果 显示 miR-23a_3p (SEQ ID NO.： 1)和 miR_23c (SEQ ID NO.： 3)在某些自身免疫性疾 病的炎症组织中也呈现显著下调。
该实施例表明 miR-23家族在自身免疫疾病的炎症组织呈现下调趋势。 实施例 2 IL-17下调 miR-23b的表达
炎症性自身免疫性疾病有一个共同点是局部的慢性炎症， 具体表现为炎症因子如 TNF a、 IL-Ι β 的产生增加， 两者在细胞培养中都可以调节 miRNA的表达水平。 MiR-23b-3p在 RA和 SLE患者的局部炎症组织中显著下降，而这些组织中的炎症因子 包括 TNF a、 IL- 1 β、 IL-17, IL-6和 IFNy则明显增加（图 2c， 2d)。
发明人将 miR-23b_3p的转录水平和以上这些细胞因子进行线形相关分析， 结果 表明， miR-23b_3p的表达水平同 IL-17水平成反向相关， 无论是在 RA患者及其对照 组（P〈0. 001)， 还是在 SLE患者及其对照组（P〈0. 05)之间都是如此（图 2a， 2b) , 提示 炎症组织中 IL-17的表达可能调控了 miR-23b_3p的下调。
为了进一步确定 miR-23b_3p和这些细胞因子之间的关系， 发明人分别用 TNF a、 IL-Ι β , IL-17, IL_6和 IFNY刺激人原代成纤维样滑膜细胞（FLS)和小鼠原代肾脏细 胞， 然后对 miR-23b_3p水平进行 qPCR检测（图 2e， 2f )。 结果表明， 在两种细胞中， IL-17的刺激都显著下调了 miR-23b_3p的表达。 IL-17通过结合 Act l和 I κ B激酶 (ΙΚΚ)复合物介导 NF- κ Β的活化， 发明人发现 Act l或者 ΙΚΚγ的缺失可以抵消 IL-17 对于 miR-23b_3p的调控作用（图 2g)，表明 IL-17介导的 NF- κ B激活对于 miR-23b_3p 的调控非常重要。 同原代细胞中得到的实验结果类似， 体内实验中 IL-17可以抑制 小鼠关节 miR-23b_3p的表达（图 2h)。
以上结果表明， 在自身免疫性疾病中 IL-17可下调 miR-23b_3p的表达。 实施例 3 MiR-23家族抑制炎症因子介导的信号通路和基因表达
炎症因子介导的 NF- κ B信号通路的激活在自身免疫性疾病的发病中起重要作用。 发明人发现过表达 miR-23b_3p显著抑制了 TNF a 和 IL_1 β 介导的 NF- κ Β的活化以 及 IL-17介导的 NF- i B的活化（图 3a， 图 3b)。 接着， 发明人在人 FLS细胞（图 3c)、 小鼠原代肾细胞（图 3d)和小鼠原代星形胶质细胞（图 3e)中均发现 miR-23b_3p模拟 物可以抑制炎症因子（TNF a、 IL-Ι β 和 IL_17)对其下游炎症基因如 KC和 IL_6的诱 导表达， 而 miR-23b_3p抑制物则提高了这种作用。 上述结果说明 miR-23b_3p抑制 了炎症因子介导的信号通路和基因表达。
发明人进一步检测了 miR-23家族其他成员， 包括 miR-23a_3p、 miR_23c对炎症 因子介导的信号通路的抑制作用。 结果表明， miR-23a-3p (图 3f)和 miR-23c也抑制 了炎症因子（TNF a、 IL-Ι β 和 IL-17)诱导的 KC和 IL-6的表达， 说明 miR-23家族 具有抑制炎症因子介导的信号通路和基因表达的作用。 实施例 4 MiR-23家族抑制自身免疫性疾病的发生发展
上述实施例发现 miR-23在各种自身免疫性疾病中普遍下调， miR-23的下调会导 致促进炎症因子介导的信号通路和基因表达， 从而加剧炎症反应。
首先， 发明人发现导入 miR-23b_3p可以显著抑制自身免疫性疾病的发生。 发明 人构建了携带 miR-23b的腺病毒（Ad_23b)以及携带 miR-23b_3p吸附物的腺病毒 (Ad-sponge) , 通过导入小鼠体内分别提高或降低 miR_23b的水平。 使用腺病毒将 miR-23b或者它的吸附物转入小鼠体内， 进一步诱导 CIA, 结果发现（图 4a， 4b) : 小 鼠踝部外源表达 miR-23b显著减少了 CIA的发病率、 延迟了发病时间、 减轻了病情 严重程度以及骨损伤； 而 miR-23b吸附物则抵消了 miR-23b过表达带来的抑制作用； 单独注射表达 miR-23b_3p吸附物的腺病毒则显著提升了 CIA发病的严重程度和骨损 伤。 发明人使用腺病毒将 miR-23b_3p或者它的吸附物转入 MRL/ r小鼠体内， 结果 发现（图 4c-e) : 过表达 miR-23b_3p显著降低了 MRL/ r小鼠的肾损伤程度， 而转入 miR-23b_3p吸附物则增加了肾损伤， 说明导入 miR-23b_3p能抑制红斑狼疮的发病、 缓解病情。 发明人使用腺病毒将 miR-23b或者它的吸附物转入小鼠体内， 进一步诱 导 EAE, 结果发现（图 4f) : 导入 miR-23b_3p能显著延迟 EAE发病时间， 降低临床评 分， 而转入 miR-23b_3p吸附物则加重 EAE的病情。 上述实验说明 miR-23b_3p能显 著预防和减缓自身免疫性疾病的发病和进程。
考虑到 miR-23家族成员在序列上高度相似， 进一步研究了 miR-23家族的其它 两个成员， miR-23a-3p和 miR-23c对自身免疫性疾病的抑制作用。 研究表明， 应用 腺病毒在小鼠体内导入 miR-23a-3p能显著抑制 EAE的发病、 缓解病情（图 4g)， 导入 miR-23a-3p也能抑制 CIA、 SLE的病情。研究表明导入 miR_23c也能在小鼠模型上抑 制多种自身免疫性疾病的发生和发展。
上述实验说明 miR-23能预防自身免疫性疾病的发生发展。 实施例 5 MiR-23家族治疗自身免疫性疾病
本实施例中， 发明人进一步研究了对于已经发病的自身免疫性疾病， 导入 miR-23 家族是否能起到有效的治疗作用。
发明人首先发现 miR-23b_3p具有治疗自身免疫性疾病的显著效果。 如图 5所示， 诱导小鼠 CIA和 EAE发病后， 导入 Ago-miR-23b-3p能显著缓解病情。 在自发红斑狼 疮的 MRL/ r小鼠中导入携带 miR-23b的腺病毒也能起到显著治疗作用（图 4c_e)。
考虑到 miR-23家族成员在序列上的高度相似性，发明人进一步研究了 miR-23a-3p 和 miR-23c对 CIA、 EAE、红斑狼疮小鼠的治疗作用，结果表明 miR_23a_3p和 miR_23c 对自身免疫性疾病也具有显著治疗作用。
本实施例表明 miR-23家族成员对自身免疫性疾病有显著治疗效果。 - 实施例 6 MiR-23b的靶基因存在于多种促炎因子信号通路中
为了确认 miR-23b_3p可能的作用靶点， 在本实施例中， 发明人应用基因芯片表 达分析过表达 miR-23b_3p的 FLS细胞中下调表达的基因， 同时结合结合
" target scan "革巴点预测软件（http： //www. targetscan. org)和信号通路分析， 找到 可能受 miR-23b_3p调控的 11个炎症相关基因（图 6a)。 其中 ΤΑΒ3， ΙΚΚ α 和 ΤΑΒ2这 三个基因的 3' UTR报告活性受到了 miR-23b_3p的显著抑制， 而 miR-23b_3p对于其 它八个基因的 3' UTR活性影响很小或是没有影响（图 6b)。 将 TAB3， IKK α 和 ΤΑΒ2三 个基因的 3' UTR进行突变， 结果证实它们是 miR-23b_3p的作用位点（图 6c)。在原代 FLS或 293T细胞中过表达 miR-23b_3p可以抑制内源 ΤΑΒ3、 ΙΚΚ α 和 ΤΑΒ2的蛋白水 平， 这与报告基因分析的结果是一致的。
本实施例表明 ΤΑΒ3， ΙΚΚ α 和 ΤΑΒ2是 miR_23b_3p的作用位点。 实施例 7 在自身免疫性疾病中， TAB2和 TAB3是 miR-23b的作用靶点。
为了验证在自身免疫性疾病中 miR-23b_3p是否可以在体内靶向调节 TAB2和 TAB3 的功能， 发明人检测 RA或者 SLE患者体内 TAB2和 TAB3的表达水平。 同正常或者 OA 患者的样本相比， RA患者滑膜组织内 TAB2和 TAB3的水平显著提高， 而 miR-23b_3p 则显示出明显的下调， miR-23b_3p的另外一个作用靶点 IKK α 也在 RA患者组织中升 高（图 7a， 7b) o SLE患者标本中这些蛋白的水平同对照组相显著上升， 而 miR-23b_3p 的水平显著下降（图 7c， 7d)。在自身免疫性疾病的小鼠模型中， TAB2、 TAB3和 ΙΚΚ α 的水平在 CIA小鼠的关节， URL/lpr小鼠的肾脏和 EAE小鼠的脊髓中都比对照组小鼠 有所增加， 同 miR-23b_3p的表达水平呈反向相关（图 7e_g)。
本实施例表明在自身免疫性疾病的发病炎症组织中， TAB2和 TAB3是 miR-23b_3p 的作用靶点。 实施例 8 抑制 TAB2和 TAB3的表达可以抑制自身免疫疾病的发生发展
为了研究 TAB2和 TAB3可能的生理功能， 考虑到这两者的功能存在重叠， 我们使 用慢病毒表达 shRNA来同时沉默 TAB2和 TAB3。我们在小鼠 B16细胞中从一系列 siRNA 中筛选能够有效沉默 TAB2和 TAB3的 siRNA。 最后我们选择了 siTAB2_4、 siTAB2_5、 siTAB3_l和 siTAB3_3进行下一步的体内实验（图 8a)。我们将可以同时表达抑制 TAB2 和 TAB3的 shRNA的慢病毒注射入小鼠的关节之中（图 8b)。结果表明，尽管同 miR_23b 过表达的效果相比略显微弱，但敲低 TAB2和 TAB3还是显著抑制了 CIA的发病程度（图 8c)。 H&E染色的结果显示无论是淋巴细胞的浸润还是骨损伤都有所减轻（图 8d)。
为了进一步证明 TAB2和 TAB3是 miR-23b_3p在自身免疫性疾病中发挥功能的靶 点， 我们设计了一个回复实验， 在过表达 miR-23b_3p的 CIA小鼠模型中利用慢病毒 表达缺少 miR-23作用位点的 TAB2和 TAB3 (图 8e)。 强制性表达的 TAB2和 TAB3显著 的降低了 miR-23b_3p对于 CIA的抑制作用， 说明 TAB2和 TAB3是 miR_23b_3p在自 身免疫性疾病中的重要作用靶点（图 8f)。
本实施例表明 TAB2和 TAB3是 miR-23b_3p在自身免疫性疾病中的重要作用靶点， 抑制 TAB2和 TAB3的表达可以抑制自身免疫疾病的发生发展。 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考， 就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。 此外应理解， 在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技 术人员可以对本发明作各种改动或修改， 这些等价形式同样落于本申请所附权利要 求书所限定的范围。
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