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重组蛋白包涵体双变性-复性方法的研究
华东理工大学 博士学位论文 重组蛋白包涵体双变性-复性方法的研究 姓名：张F 申请学位级别：博士 专业：生物化工 指导教师：王小宁
华东理工大学博士学位论文第１页重组蛋白包涵体双变性．复性方法的研究摘要大肠杆菌表达系统是目前最常见、最稳定的外源蛋白表达系统，外源蛋白在大肠杆菌中表达时大多数是以无活性的不溶性包涵体（Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｉｅｓ，ＩＢｓ）形式存在，需要经过复杂、费时的变性和复性处理，形成正确的天然结构才能获得预期的生物活性。复性 过程经常发生蛋白质的聚集使得复性产率降低，因此包涵体变复性技术至今仍是应用大 肠杆菌表达系统制备蛋白质的主要瓶颈问题之一。 本研究主要针对包涵体蛋白变复性这一瓶颈问题，首先对课题组开发重组人粒细胞集落刺激因子（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ．ｃｏｌｏｎｙ．ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ，Ｇ．ＣＳＦ）新药过程中发明的一种包涵体双变性．复性技术（中国发明专利ＺＬ９６１０６７７８．０）进行了验证，并与传统的单一 变性．复性方法进行了对比研究。阐明了双变性．复性方法可以通过第一变性剂盐酸胍和 第二变性剂尿素的转换和几步简单的离心洗涤就使目的蛋白质的溶解度和复性收率大 为提高，得到９０％以上的可溶性蛋白收率，而且一步纯化就能使目的蛋白纯度达到９５％， 复性后蛋白生物活性与天然蛋白基本一致。从而证实先后采用两种变性剂进行包涵体蛋 白交替溶解的“盐酸胍．尿素＂双变性．复性体系是一种简单高效的重组蛋白包涵体复性 方法，显示了非常好的应用潜力。 为了考察“盐酸胍．尿素’’双变性．复性体系是否适用于其它包涵体蛋白的变复性过 程，本论文对８８种理化性质各异、来源于不同物种的具有重要生物学意义的重组蛋白 质包涵体样本进行了双变性．复性实验，发现其中有６７％的被试包涵体通过第一变性剂 盐酸胍变性析出和第二变性剂尿素变性，其复性后的可溶性蛋白收率可达到９０％以上， 表明双变性．复性方法具有较好的通用性，具备进行深入研发的价值。 为了发现双变性．复性方法的复性规律，阐明其作用机理，本论文在上述８８个样本中选取以ＥｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２２ｂ进行表达，同时在“盐酸胍．尿素＂双变性．复性体系中其二次变性行为与Ｇ．ＣＳＦ一致的３６个包涵体样本进行了蛋白理化特性与复性收率 的关联分析，应用统计学方法建立了回归模型。该模型提示：在选取的３６个样本蛋白 特性中，等电点可能是影响双变性一复性过程蛋白收率的一个重要因素，等电点每升高 一个单位，相应的复性收率会降低１４．８３％；此外蛋白质的分子量及螺旋，折叠结构的 增加也会对复性过程蛋白的收率产生不利影响，而转角结构的存在对收率的提高产生一 定的促进作用。但这些因素对复性收率的影响不具显著性。基于上述研究结果，针对等 电点与复性收率的关系，本论文进一步对选取的样本进行了等电点与复性收率关系的研 究。结果显示以盐酸胍为第一变性剂、尿素为第二变性剂的双变性．复性体系更适用于 等电点在６．０以下的包涵体蛋白的复性。而对等电点在６．０以上的包涵体蛋白的变复性 则具有不确定性。预示对于这类包涵体（ｐＩ＞６．Ｏ．）变性和复性的突破将是后续双变性．复第１Ｉ页华东理工大学博士学位论文性方法研究的重点。 为拓展双变性．复性体系，增加该方法的应用范围，本研究以重组绿色荧光蛋白（Ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＰ）包涵体为模型，开发了一种新的双变性．复性方法。新方法选取含有精氨酸的碱性溶液作为第一变性剂体系，通过梯度降低变性液的ｐＨ值析 出溶解的包涵体，然后再以尿素为第二变性剂进行变性，随后进行稀释复性。结果显示 新体系与原盐酸胍．尿素的双变性．复性体系相比，绿色荧光蛋白包涵体复性速度与生物 活性均有提高。随后在４个包涵体上的验证证明，该新的精氨酸．尿素双变性体系的建 立拓展并完善了双变性．复性技术，为进一步开发新的双变性．复性体系，研究双变性． 复性技术的机理奠定了基础。 本研究最后还应用双变性．复性技术，对难以获得活性产物的日本血吸虫尾蚴弹性蛋白酶（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ／ａｐｏｎｉｃｕｍｃｅｒｃａｒｉａｌｅｌａｓｔａｓｅ．２ｂ，ｓｊＣＥ一２ｂ）包涵体进行了复性，获得了有活性的酶，并对该酶的性质进行了初步研究。该酶在血吸虫对宿主皮肤的侵入作用、 消化作用和免疫应答等生物过程中发挥着重要作用。活性酶的获得再次证明了双变性． 复性方法在重要蛋白质研究中的应用潜力。 综上，本论文通过大量样本的双变性一复性实验，对双变性．复性技术进行了详细的 研究，初步证明了该技术具有良好的潜在应用价值，并通过建模分析阐明了蛋白质等电 点与双变性．复性方法应用范围的关联度。同时，在双变性．复性思想的指导上，开发了 一种新的精氨酸．尿素双变性体系，完善了双变性一复性技术体系，拓展了双变性．复性方 法的应用价值。本研究涉及的研究方法与技术对于应用大肠杆菌进行重组蛋白质的批量 化制备具有重要价值。 关键词：大肠杆菌；重组蛋白；包涵体；蛋白折叠；双变性．复性华东理工大学博士学位论文第１ｌｌ页ＲｅｓｅａｒｃｈｏｎＢａｃｔｅｒｉａｌ Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｂｏｄｉｅｓ Ｒｅｆｏｉｄｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ＤｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎａＤｏｕｂｌｅＭｅｔｈｏｄＡｂｓｔｒａｃｔ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ ｃｏｌＯ ｉｓ ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ ｄｅｓｉｒａｂｌｅ ｂｅｃａｕｓｅｏｆ ｉｎｅｘｐｅｎｓｉｖｅ ｍｅｄｉａ，ｒａｐｉｄ ｂｉｏｍａｓｓ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ，ｈｉｇｈ―ｄｅｎｓｉｔｙ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｓｃａｌｅ―ｕｐ ｐｒｏｃｅｓｓ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｉｎ ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ ｋｎｏｗｎ ｓｔｅｐｓ ｔｏａｓ ｏｖｅｒ ａｓｉｍｐｌｅｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｆｏｒｅｉｇｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆｔｅｎ ｉｎｃｏｒｒｅｃｔｌｙ ｆｏｌｄ ａｎｄｉｎｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄｉｅｓ（ＩＢｓ），ｗｈｉｃｈｒｅｑｕｉｒｅ ｆｕｒｔｈｅｒ／ｎ ｖｉｔｒｏ ｒｅｆｏｌｄｉｎｇａｒｅｓｕｍｅｔｈｅｉｒ ｎａｔｉｖｅ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｐｅｒ ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ ｉｓｃｒｕｃｉａｌ ｓｔｅｐ ａｎｄｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓｔｈｅ ｗｈｏｌｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｂｅｃａｕｓｅ ｔｈｅ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｆｏｌｄｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｍｉｓｆｏｌｄｅｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔａｌｗａｙｓｒｅｄｕｃｅｔｈｅ ｆｉｎａｌｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｔｏｄａｔｅ ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ ｉｓａｍａｊｏｒｂｏｔｔｌｅｎｅｃｋ ｉｎｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄ ｔｈｅｌａｃｋ ｏｆ ｇｅｎｅｒａｌｌｙ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ａｖａｉｌａｂｌｅ ｆｏｒｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ ｐｒｏｃｅｓｓ ｈａｓ ｈｉｎｄｅｒｅｄ ｔｈｅ ｆｉｅｌｄ．Ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ，ｗｅ ｉｎｖｅｎｔｅｄａｎｏｖｅｌｍｅｔｈｏｄ（ｋｎｏｗｎａｓｔｈｅ“ｄｏｕｂｌｅ 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ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｄａｔａｂａｓｅｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｉｅｓ，ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓｔａｔｉｓｔｉｃ ｍｏｄｅｌｓａｓｖａｌｕｅ ｏｆ ｔｈｅ ｄｏｕｂｌｅ ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄＣａｎ ｂｅｅｌｕｃｉｄａｔｅｄ．Ｔｈｅｗｅｌｌ ａｓ ｔｈｅ ｎｏｖｅｌ ｄｏｕｂｌｅ ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｉｎｖｅｎｔｅｄ ｈｅｒｅ ｗｉｌｌ ｆｕｒｔｈｅｒｏｎｈｉｇｈｌｉｇｈｔｔｈｅ ｒｅｓｅａｒｃｈｔｈｅ ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｉｅｓ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ；ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ；ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｉｅｓ；ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｌｄｉｎｇ；ｄｏｕｂｌｅｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ作者声明我郑重声明：本人恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本 人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的结果。除文中明确注明和引用的 内容外，本论文不包含任何他人已经发表或撰写过的内容。论文为本人亲自撰写， 并对所写内容负责。论文作者签名： ２００９年５月３０日华东理工大学博士学位论文第１页第１章前言１．１包涵体的成因 １．１．１外源基因的表达 以１９７３年第一个外源基因重组质粒在细菌内增殖成功【ｌＪ和１９７５年细胞融合技术的建立【２】为重要标志，重组ＤＮＡ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，ｒＮＡ）技术，即基因工程技术进入了崭新的发展时期。其最大特点是不仅可以在原核生物体之间进行ＤＮＡ遗传信息的转移 和在外来宿主细胞中控制蛋白的生产，而且还具有能力将真核生物的基因在原核生物中（如大肠杆菌，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）进行表达，从而为临床和工业生产提供由于自然原料缺乏而无法大量获得的蛋白质和多肽产品［３－５Ｊ。 １．１．２包涵体的形成 大肠杆菌表达系统是目前最常见、最稳定的外源蛋白表达系统，非常适合用于表达 不经过蛋白质翻译后修饰（如糖基化）就具有生物活性的基因工程蛋白【铺Ｊ。对于大规 模、高通量的蛋白质产品制备以及蛋白质组学、结构基因组学的研究，大肠杆菌表达系 统通常是首选。外源蛋白在大肠菌中表达量可高达细胞蛋白含量的５０％１５］，这种高表达 往往会导致目标蛋白在体内形成不溶性的聚集体亦即包涵体（Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ，ＩＢ），大量关于重组蛋白在Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ ｃｏｌｉ）中的研究表明，包涵体的形成是一个普遍存在着的现象而不是一个特例１９］。包涵体的一级结构完全正确，但由于没有完全正确的天 然态结构，不具有生物学活性，必须经过分离、体外复性、纯化等工艺才能变成有生物 学功能的产品【７，１０?１１】。包涵体体外复性最大的困难在于变复性过程中非天然态的蛋白质 分子之间发生聚集作用析出，所导致复性收率非常低。一般目的蛋白的活性回收率只有 ２０％左右，成为大肠杆菌基因工程生产的主要成本问题与瓶颈所在。 包涵体的形成主要是因为重组蛋白在表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子， 或环境不适合而无法形成正确的次级键等原因。通常认为高水平表达（比菌体蛋白高出 ２％以上）的外源蛋白、高疏水性外源蛋白以及含有二硫键的蛋白更容易形成包涵体。具体为：①表达量过高。重组蛋白在宿主系统中高水平表达时，无论是用原核表达体系或 酵母表达体系甚至高等真核表达体系，都可形成包涵体【１２１。事实上，内源性的蛋白质， 如果表达水平过高，也会聚集形成包涵体【ｌ ３｜，因此，包涵体形成的原因主要是高水平表 达的结果。动力学研究表明，在高水平表达时，新生肽链的聚集速率一旦超过蛋白正确 折叠的速率就会导致包涵体的形成【１４Ｊ。研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越 高越容易形成包涵体【１５，№Ｊ。 ②重组蛋白的氨基酸组成。对含硫氨基酸较多的重组蛋白而言，细菌细胞质内的 还原环境不利于二硫键的形成。一般来说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的第２页华东理工大学博士学位论文含量明显与包涵体的形成正相关１”～９１。 ③重组蛋白所处的环境。发酵温度高或胞内ｐＨ接近蛋白的等电点时容易形成包涵体０６，２０－ｘ３Ｉ。④重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，缺乏一些蛋白折叠过程中所需要的酶和辅助 因子，如折叠酶和分子伴侣等，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。因此有报 道采用共表达分子伴侣的方法以增加可溶蛋白的比例Ｉ：Ｚ４．２５１。 ＠在细菌表达蛋白过程中，蛋白质分子问的离子键、疏水键或共价键等化学作用 导致了包涵体的形成１２６－２８１。 １．２包涵体的形态与结构特征 基因工程菌表达的外源蛋白质由于来不及加工（折叠）而堆积在一起形成致密的颗粒一包涵体。含有包涵体的细菌于显微镜下因有明显折光率差异而可见到包涵体。根据对牛生长激素包涵体的研究可知，包涵体在差相显微镜下呈现为许多个高度折光的颗粒 （图１．１），含有这些个包涵体的大肠杆菌苗体变大，并出现凸起部分．包涵体一般分布 在菌体的两端（图１．２）。在电镜下看到的包涵体无明显的膜存在，直径在Ｏ 间。根据位置的不同呈现出无定形或次晶形的自然状态。５－】３ｐｍ之图１．１高度折光的包涵体颗粒图Ｆｉｇ．１ ｌ Ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅｍｏｒｐｈｏｌ０９３＂ｏｆｉｎｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄｉ岵图１．２古有胞浆包古体的大脑杆菌电子显徽图片ＦｉｇＬ２Ｅｌｅｃｔｎｍｍｉｃｒｏｇｍｐｈ ０ｆ盅ｃｏｌｉｃｅｉｌｓｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｃｙｔｃＢｏｌｉｃｉｎｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄｉｅｓ华东理工大学博士学位论文第３页包涵体的密度（～１．３ｍｇ／ｍＬ）要高于其他的细胞成分，因此在细胞裂解后可以通过 高速离心与其他细胞成分分离【２９，３０１。包涵体表面疏松多孔，不溶于水，其中过表达的目 的蛋白占大部分，其余为核糖体元件、ＲＮＡ聚合酶、外膜蛋白ｏｍｐＣ、ｏｍｐＦ和ｏｍｐＡ 等，环状或缺口的质粒ＤＮＡ，以及脂质体、脂多糖等［３１－３训。 有研究表明包涵体是由聚集体和可溶性蛋白之间的非平衡态动力学结构单元组成 的ｐ引。细胞内部分折叠的过表达蛋白多肽链之间通过非共价的离子或疏水相互作用，或 者更可能是两者的共同作用导致形成聚集。有观点认为导致发生聚集作用形成包涵体的 过表达蛋白分子具有相同的单一结构类型。也有研究表明包涵体含有天然或者类天然态 的二级结构，这种结构可能在复性的启动阶段具有一定的作用【３６１。采用拉曼衍射光谱对 来源于大肠杆菌过表达ｐ．半乳糖苷酶形成包涵体的二级结构分析表明，其肽键与天然态 的蛋白一致１３ ７。。而采用衰减全反射傅立叶变换红外光谱的研究包涵体结构时表明，与天 然态和盐析沉淀蛋白相比，包涵体疏水特性的形成与天然态蛋白无关，是由于非天然态 １３折叠增加的结果。这些不同链的Ｂ折叠通过氢键的连接而形成稳定结构，这就导致了 各多肽链被紧密的包裹在一起，进而形成了具有Ｂ折叠的中间体【３¨２１。富含这种Ｂ折叠 结构的多肽链或多肽区域可以抵制蛋白酶的降解作用，但是在包涵体中存在的天然态结 构依然是对酶敏感的。近期的研究表明包涵体蛋白也存在相对的生物学活性，具体见表 １．１。从以上的研究中可以推论包涵体的结构具有可变动性，是一个由大部分或部分类似 天然结构、富ｐ多肽链结构以及富Ｂ多肽聚集体（带有一定的有活性折叠区）组成的混合体【３７，４３，４４】。在体内，蛋白质折叠异常或错误会引起折叠中止或构象和结构发生变化，从而造成 疾病，现在称为“构象病”或“折叠病”。到目前已经发现有１５一－２０种蛋白质能形成淀粉样 沉淀，从对体内淀粉样折叠病的研究发现，蛋白质骨架之间的聚集受到其自身氨基酸序 列的调节，即有一定的氨基酸序列特异性【４孓４７】。在大肠杆菌表达外源蛋白形成的包涵体 中也有类似的规律Ⅲ】，包涵体的形成可能是细胞自我保护的一种方式１４引。很多研究尝试 着从蛋白质的一级结构来预测外源蛋白形成包涵体的趋势，但都没有得到非常一致的结剁４９１。影响包涵体形成的蛋白质内在因素包括：多肽链的长度；蛋白质家族或者折叠类型家族；平均电荷数；脂肪族氨基酸残基的比例；体外的半衰期；序列中出现一定二肽 或三肽的频率；具有正确的ｐ折叠残基的比例；形成转角的残基片段［２８，５０－５３】。此外发酵 过程的参数也会影响包涵体的形成与结构，包括培养基组成、生长温度、产物生成速率 以及热休克蛋白辅助因子参与度等。对相同质粒大肠杆菌进行摇瓶培养时发现，诱导以 后不同时间段的包涵体的性质特点存在差别，不同的发酵条件下包涵体的形状与结构也会发生改变【３０１。表１．１包涵体中存在正确折叠蛋白的结构与功能示例髀１Ｔａｂｌｅ １．１Ｓｏｍｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｔｈａｔ ｐｒｏｐｅｒｌｙ ｆｏｌｄｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｐｅｃｉｅｓｂａｃｔｅｒｉａｌ ＩＢｓａｒｅ ａｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｏｆ第４页华东理工大学博士学位论文Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｋｌｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄＩ ａｃｔｉｖ．唧ｆ％ｒｅｌａｔｉｗ ｔｏ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄＩ１１３ ｐｒｏｔｅｉｎＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓｏｌｕｂｌｅ ｃｏｕｎｔｅｆｐａｒｔ。ｗｈｅｎＧｒｅｅｎ?ｅｎｄ ｂｌｕｅ，ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｉｎ．ｉｎｆｕｓｉｏｎｓＨｉｇｈ ＩＢ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｆｎｖｉｖｏＩｂｅｔｗｅｅｎ ２０ ａｎｄ ３∞ｂＩＪ｝ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｅｎｄｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓｐ舶Ｉ∞ｔ∞ｉｄ啪哺ｇｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃｌ ｏｗａｃｔｈ“ｔｙ ｉｎ ｐｕｒｉｆｉｅｄ １日ｓ ｌｆｒｏｍ ａｒｏｕｎｄ ３０ ｕｐ ｔｏ ｍｏｒｏｔｈａｎ １∞％Ｉ ｅｃｔｉｖ时ｉｎ ｐｕｒｉｆｌｅｄ Ｉ良《８％｝ ＨＩａｈ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｌＢｓ ｉ２Ｓ％｝ Ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ ａｃｔｉｖｈ Ｉｎ ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｉ融 ［：）ｅｔ矗：ｔａｂｌｅ ａＣｔｌＶｉｔｖ ｉｎ ｐｕｒｉｆｉｅｃｌ １８ｓ翻－ｈｙｄｒｏｐｈｏｌａｔｅ ｒｅｄｕａａｓｅ Ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ Ｄ ＩＨａｃｔｅｍａｓｅＨｔｒＡｌ ｓｅｒｉｎｅｐｒｏｔｅｉｎＮａｔｉｖｅｌｉｋｅ ｓｅＣＯｎｄａｗ Ｎ８ｔｉｖｏ。Ｉｉｋ ｓｅｃｏｎｃｂｒｙＩｎｔｅｄｅｕｋｉｎ．１￥ Ｓｅｖｅｒａｌ ｉ４１ｅｔｉｘ－ｒｉｃｈ ｈｙｐｅｒｔｆｌｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃｐｒｏｔｅｉｎｓｓｔｒｕｃｔｕｒｅ｛ＦｒｌＲ）＝ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ｛Ｆ１１Ｒ；ＮＭＲ：ＣＤ）”Ｎａｔｉｖｅ Ｉｉｋｅ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ琵Ｍ ｉＹｌｅｃｔａｒｎａｓｏＵｐａｓｅ Ｈｕｍａｎ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ Ｈｕ ｍａｎ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ Ｈｕｍａｎ ｉｍｅｒｆｅｒｏｎ翟２ｂｓｔｒｕｃｔｕｒｅ｛阿ＩＲＩＮａｔｉｖｅ Ｉｌｉｅ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃ１＇ｕｒｅ｛ＦＴＩＲ》Ｎａｔｉｖｅｑｉ虹ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ｛Ｆ１ＩＲ｝Ｎａｔｉｖｅｌｉ虹ｓｅｃｏｎｄａ ｒｙ Ｎａｔｉｖｅ ｌｉｋｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅ｛ＦＴＩＲ｝ｓｅｃｏｒｌ出ｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ｛ＦＴＩＲＩ１．３包涵体的生产优势 目前表达的重组蛋白质已达４０００多种，其中大部分是用大肠杆菌表达的。大肠杆 菌作为外源基因表达系统，其主要优势是具有低廉性、高效性和稳定性等，具体为：对 其遗传学背景和生理学了解较深入，可利用的外源基因载体较多，表达系统较容易构建， 抗污染能力强，培养基条件要求较低，生长速度快，容易实现高（细胞）密度培养，重 组基因表达效率也常常较高，以及有较强的抗剪切能力，对设备条件要求也较易达到等 箜【６，５５－５ｓｌ １寸０ 以包涵体形式表达的有利因素包括：１、可溶性蛋白在细胞内容易受到蛋白酶的攻 击，包涵体表达可以避免蛋白酶对外源蛋白的降解１５９】。２、降低了胞内可溶性外源蛋白 的浓度，有利于表达量的提高１６Ⅲ。３、包涵体密度大，细胞裂解后通过简单的离心就可将其与其它细胞成分分副６１Ｊ。４、包涵体中杂蛋白含量低，且只需要简单的低速离心就可以达到很高的纯度，应用蔗糖梯度离心的方法可以从Ｅ ｃｏｌｉ细胞裂解液中得到纯度很 高的包涵体，利于后期纯化【６２’６３１。５、对机械搅拌和超声破碎不敏感，易于破壁并与细 胞膜碎片分离。因此，在蛋白质工业化生产中，由于以上优点，很多重要重组蛋白是利 用大肠杆菌以包涵体形式进行生产的【川。 １．４包涵体的体外复性 从包涵体中回收有生物活性的蛋白需要经历四个步骤：１．从大肠杆菌中提取包涵体 并洗涤；２．对洗涤后的包涵体进行溶解（变性）；３．对变性的蛋白进行体外重折叠恢复活 性；４．对复性蛋白进行纯化获得高纯度的蛋白。其中也可根据情况先对蛋白进行纯化然 后再复性。在以上这四步操作中对包涵体的溶解与复性是获得活性蛋白高回收的关键性 步骤。因为溶解和复性都涉及到蛋白结构上的变化，两者休戚相关。从培养基中回收重 组蛋白的常规流程见图１．３，其中粗线代表包涵体形式蛋白的回收。华东理工大学博士学位论文第５页ＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｂｒｏｔｈｌＣｅｌｌ一（ｉｒｒｌｒａｃｅｔｌｕｌａｒ ｐｒｏｄｕｃｔ）ＩＣａｌｌ ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ（Ｐｒｓｏｄ―ｕｃｔ一＝ｅｃｒ融ｅｄｌ）Ｐｒｃ；ｄｕｃＩｍｅｍｂｒａｎｅｌＦｌｕｉｄｉｚｅｄ ｂｅｄ 。Ｂｉｇ Ｂｅａｄｓ。Ｃａｐｔｕｒｅｌ扎ｄ淳Ｄｎ ａｓＰｒｄｄｕｃｔｓｏＩｕｂｌｅＰｕｆｉｔ－ｍ＿Ｊｏｎｂｏｄｙ１－ａｃｔｉｏｎｌ毒呷甜州ＥｘｌｒａｃｌＪｏｎ ＥｘｔｒａｃｔｉｏｎｌＰｏｌｉｓｈｉｎｇ：，ｏ妯蛐。ｎｒ一’”””Ｆｉｇ １．３ｌ‘ｉｌＦｏｒｍｕＩ宣瞳ｋ蚋图１．３从培养基中回收重组蛋白的常规流程图１６５｜Ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｓｃｈｅｍｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｒｏｔｈ． Ｂｏｌｄ ｌｉｎｅｓ ｄｅｐｉｃｔａｕｓｕａｌｉｎｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄｙ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｒｏｕｔｅ．１．４．１包涵体的洗涤收集菌体后采用高压匀浆或机械、化学和酶相结合的方法，破碎含包涵体的宿主细胞，再将破碎液通过低速离心或过滤除去可溶蛋白后获得包涵体。包涵体中除了目的蛋 白外还含有脂类、脂多糖、核酸和杂蛋白等成分，而这些成分可能会影响包涵体蛋白的 复性，故去折叠前应洗涤包涵体以尽量去除杂质。常用的洗涤剂为去垢剂ＴｒｉｔｏｎＸ一１００、 脱氧胆酸盐、低浓度的盐和尿素等，经过常规２＂－－３次优化条件的洗涤，可得到纯度为７０％ 以上的包涵体№＇６¨。 实验室规模常采用超声破碎或是利用溶菌酶的作用进行细胞的裂解。在工业生产 上，包涵体的分离常采用高压匀浆的机械性方法实现。高压匀浆后，采用离心分离细胞 碎片和可溶性产物进入上清，包涵体却可以沉淀下来。设计离心的工艺需要对粒度分布 和待分离颗粒的密度有所了解。碟式离心机的分离是基于包涵体和细胞碎片不同折光性 的特性，这种特性非常适合于采用离心工艺进行分离。对于细胞裂解压力进行优化研究 显示，同一操作方法的反复使用会提高包涵体和细胞碎片的分离效果，提高包涵体的纯 度【６引。细胞破碎后，外膜组分被释放出来，可能会与包涵体发生表面吸附１６９１，这些组分 可以通过一系列的清洗步骤除去。然而，溶剂有时会给下游工艺带来一定的问题，工业 上还是考虑尽量避免使用难于去除的洗涤剂（例如ＳＤＳ）。作为替代机械提取的包涵体 化学提取有利有弊：直接从发酵液中提取减少了很多单元操作的步骤，却释放出了高分 子量的ＤＮＡ，这就导致溶液的黏度增加，给目的产物的获得带来了诸多问题【＿硎。另外， 大量的来自宿主细胞的蛋白也混入提取物中，不过这些问题已经通过不同的方法得以部 分解决，如ＤＮＡ可以通过沉降来移除。Ｆａｌｃｏｎｅｒ报导了一种选择性提取重组蛋白包涵 体的方法，并已经成功的进行了中试。首先，用尿素、ＥＤＴＡ复合溶液体系溶解来自宿 主细胞的杂蛋白，而包涵体则在二硫键促进剂的帮助下通过表面氧化作用保持其不溶第６页华东理工大学博士学位论文性。然后采取膜过滤的低成本方式在高渗透压下去除可溶部分，最后在分子伴侣存在的 还原体系中溶解包涵体【７１１。和传统的机械破碎、离心分离和包涵体溶解相比该法可以得 到相一致的蛋白提取物与纯度。但这种方法的缺点是仅仅当蛋白质中半胱氨酸的含量较高时才可以适用。作为一种新的包涵体洗涤方法其目的依然是通过Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ．１００和ＥＤＴＡ的作用，在保护包涵体的情况下尽量洗去杂蛋白。这种方法应该可以适用于更多 种包涵体蛋白的洗涤，并且很可能随之形成一种相对简洁的包涵体复性纯化工艺流程。１．４．２包涵体的变性溶解溶解是从包涵体中回收活性蛋白的一个关键性步骤，直接影响到后面的复性过程。 细胞裂解后沉降的包涵体密度很大，不能溶解在一般的溶液中，极端ｐＨ、高温、去污剂、 高浓度的无机盐或有机溶剂都可以用于溶解包涵体。变性溶解要使包涵体蛋自在溶液中形成分散的单分子，将分子内或分子间的非天然态相互作用降到最低【７２１。变性剂中溶解包涵体后，溶液澄清，无混浊，但是不排除存在可溶性的寡聚体。目前对变性溶液中寡 聚体形成情况的研究还处于起步阶段，在各种变性剂中，离子型去垢剂剂（ＳＤＳ，胆酸 钠，脱氧胆酸钠）由于具有极强的静电斥力作用，其将包涵体进行溶解转变为单分子结构的能力是最强的。变性剂按照种类可以分为：①去垢剂：ＳＤＳ、ＬｉＤＳ、ＮＰ－４０、ＴｒｉｔｏｎＸ．１００、ＣＨＡＰＳ、 Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ、胆酸钠、脱氧胆酸钠、Ｎ一十二烷肌氨酸等。②离液剂：尿素、硫脲、盐酸 胍等。③混合溶剂：去垢剂和离液剂联合使用。④其他：有机酸等。其中常用的变性剂 为盐酸胍和尿素。盐酸胍和尿素与蛋白分子结合时存在浓度依赖。通常溶解蛋白时要的 要达到最好的结合，需要尿素浓度为６～８ Ｍ，盐酸胍浓度为６～７ Ｍ左右。然而，即使是 在高浓度下，蛋白分子内和分子间的相互作用也是存在的【１７３】，导致形成天然或者非天然 结构倾向。如果天然态倾向的相互作用强，那么当去除变性剂时（盐酸胍或者尿素），蛋白就易形成天然态结构。对于含有二硫键的蛋白，如果在变性状态可以形成正确的二硫键配对，那么复性过程形成正确结构的机会就会大大增加。在过渡态变性剂浓度（尿素４ Ｍ，盐酸胍２ Ｍ左右）下，与蛋白结合的变性剂分子减少，蛋白开始折叠。通过调整变性剂的浓度，就可以调控蛋白复性。尿素在不适当的溶液中很快就会形成异氰酸盐或 者酯从而引起蛋白质中氨基或巯基的不可逆修饰，因此操作过程要非常小心，溶解时间 要尽量短，并且溶液环境要偏碱性。盐酸胍是一种离子型变性剂，它会影响下游的离子 交换纯化，但是，盐酸胍的变性能力是尿素的１．５＂－－２．５倍，适合溶解在尿素中不能溶解 的包涵体１７４，７５Ｊ。过高浓度的变性剂会使蛋白完全变性，严重破坏其二级结构无法恢复活 性，因此一方面采用最低变性剂浓度溶解包涵体以减少杂蛋白含量和使复性过程能获得 最大的生物活性收率，另一方面也应该注重研究其他可替代的包涵体溶解方法。 极端ｐＨｉｄ７’７６１是常用来替代高浓度变性剂溶解包涵体的方法，极端ｐＨ溶解包涵体的 方法简单，低廉。但在使用中，如果蛋白在极端ｐＨ的溶液中时间过长会引起不可逆的化 学修饰，或者发生酸裂解。因此，很多药用蛋白不适于用这种方法溶解。替代方法是采用极端ｐＨ与其他低浓度的变性剂相结合的方法来降低溶解时吲７７１。例如。高ｐＨ（≥１２）华东理工大学博士学位论文第７页结合低浓度的变性剂（如２０－４０％的异丙基乙醇溶液）对生长激素包涵体溶解非常有效。 Ｇａｖｉｔ［‘７８】等人也使用过低ｐＨ（５２．６）结合高温（８５ ｏＣ）的方法溶解抗真菌肽。 此外还可使用去垢剂，如十二烷基硫酸钠（ＳＤＳ）１７９ｌ、十六烷基三甲基溴化铵（ＣＴＡＢ）、Ｎ．十二烷基肌氨酸（ＣＡＰＳ）｛８０１等。Ｍ【８１１等采用ＣＴＡＢ溶解包涵体，发现溶解后蛋白保留了部分二级结构，复性后活性收率达５０％，高于采用尿素（７．５ Ｍ）溶解 的包涵体复性的方法（收率２０％）。对ＳＤＳ溶解的蛋白进行观察表明在ＳＤＳ一蛋白形成的 复合物中有不同程度的ａ．螺旋结构存在ｆ８２，８３ｌ。在ｓａｒｋｏｓｙｌ一蛋白的复合溶液体系中也观察 到天然态与非天然态的分子间相互作用。去垢剂溶解后的蛋白要比在盐酸胍和尿素中溶 解的蛋白更有序１９４ｌ。去垢剂与盐酸胍或者是尿素相比，溶解蛋白的另一个特点是，去垢 剂的溶解存在ＣＭＣ值，也就是存在一个很严格的临界胶束浓度。当去垢剂的浓度在ＣＭＣ 值以上时，去折叠蛋白与去垢剂相结合，高度可溶；当去垢剂的浓度在ＣＭＣ值以下时， 蛋白的溶解度就会大大降低１８５１。因此，折叠要在去垢剂存在的前提下完成。然而需要注 意的是，去污剂会干扰下游过程中的蛋白质层析，应在层析前去除复性混合物中的去污剂。在有还原剂和低浓度变性剂存在的条件下，采用高压的办法（１－２ ｋｂａｒ）也可以实 现包涵体的溶解［８６１。 以上溶解条件均需优化组合使用，必要时还应添加还原剂例如ｐ．巯基乙醇（ｐ．ＭＥ）， 二硫苏糖醇（ＤＴＴ）等【７５１，这样可以打开包括错配二硫键在内的所有二硫键，保持半胱 氨酸残基处于还原态；对于不存在二硫键的包涵体会起到去除可能通过二硫键与目的蛋白缠绕堆积的细胞内源性蛋白，从而促进溶解。总结以上研究可以发现，变性剂在包涵体复性上主要起到了两个功能：其一是有足 够的变性能力，溶解包涵体，打开包涵体中存在的错误折叠的蛋白结构；其二是要在复 性过程能够保持蛋白在溶液中的柔性与溶解性，使复性向形成正确结构的方向顺利进行。虽然有很多方法可以用来溶解包涵体，但不同的溶解方法将极大地影响后续的复性 过程和整个生产的成本。可以说包涵体复性的成功与否是与包涵体的溶解密切相关的。 目前对包涵体复性的研究多集中在复性阶段，依据不同蛋白的复性经验形成了不同复性 方法，但各种复性方法都缺少广泛的适用性。包涵体复性至今仍是一个世界性的难题， 进展相对较慢，缺少适用性广的高效包涵体复性方法。其中有一个问题值得重视，就是 变性方法作为包涵体复性流程中不可或缺的一个重要组成部分，研究却相对较少，未能 受到很大的重视。如果将变性和复性作为一个统一体，进行包涵体复性方法的研究与开 发，有可能打开思路，形成突破。鉴于以上分析，本论文研究的双变性．复性方法兼顾 变性与复性的两个方面，以期通过两个变性体系的转换，实现增强变性剂的变性溶解功 能并利用变性剂与蛋白分子之间的相互作用进而影响后期复性效率。同时，由于变性的 终极目标还是要解决复性的难题。因此，变性后依然离不开对复性过程的深入研究。１．４．３包涵体的复性第８页华东理工大学博士学位论文从包涵体中回收活性蛋白的第二个关键性步骤，也是整个流程中最为重要的一步就 是变性蛋白的复性。复性过程一般是通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的伸展状态 恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂使二硫键正常形成。变性状态的蛋白质分子有 很好的柔性与溶解性，随着变性剂得去除，蛋白分子的碰撞机会增加，逐渐向天然态结 构转变。好的复性过程需要在此结构转变的中间过程保持蛋白的柔性与溶解性。然而， 在实际复性过程中，往往由于中间过程控制不当而引起蛋白聚集，形成刚性结构析出， 降低了蛋白收率。一般说来，蛋白质的复性收率在２０％左右。 复性是一个非常复杂的过程，除与蛋白质复性的过程控制相关外，还很大程度上与 蛋白质本身的性质有关。影响复性收率的因素有蛋白质的复性浓度，变性剂的起始浓度 和去除速度、温度、ｐＨ、氧化还原电势、离子强度、共溶剂和其他添加剂的存在与否等。 包涵体的复性方法包括：稀释复性：透析复性；超滤复性；色谱复性等。对于结构中含 有二硫键的蛋白质来说，半胱氨酸能否形成正确的二硫键是其分子复性的一个重要因 素。大肠杆菌体系中的还原环境抑制二硫键形成，形成包涵体时会形成大量错配的二硫 键。理论上蛋白结构中存在的二硫键越多，就越可能形成更多的不同组合（表１．２），而 其中只有一种结构是正确的天然构象。改变不适宜的氧化还原条件，可使之达到平衡， 恢复正确的结构。最早常使用Ｃｕ２＋诱导的空气氧化法【８１７１，目前最常用的方法是在透析 液中加入氧化还原体系，其中又以加入氧化／还原谷胱甘肽最多，二者的浓度比通常为 １：１～ｌ：１０不等。最近有研究显示，在反应体系中加入Ｓ．磺化相关化合物，加大复性 系统压力也可有利于二硫键的形成。此外，还可以使用氧化／还原二硫苏糖醇、胱胺／ 半胱胺酸、与２．羟乙基二硫化物／ｐ一巯基乙醇等１８８－９２１。复性过程中多采用４一－－８ ｏＣ、生理情 况稍偏碱的ｐＨ值（８．０－９．５）。表１．２半胱氨酸含量与可能形成的二硫键数量关系Ｔａｂｌｅ １．２ Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆｐｏｓｓｉｂｌｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ２ｎ ｃｙｃｔｅｉｎｅｓ ｔｏｎｆｏｍ ｎｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄｓＮｕｍｂｅｒ ｏｆ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓｌ １ ３ １５ １０５ ９４５ １０３９５ １３５１３５１（２ｎ－１）?（２ｎ．３）?…３?１１．５包涵体复性的外界影响因素 １．５．１蛋白浓度华东理工大学博士学位论文第９页复性过程中的聚集反应是导致复性率低的主要因素。当变性剂浓度降低后，变性的 蛋自分子快速折叠形成具有大量二级结构的中间体，中间体之间通过疏水相互作用发生 聚集。在蛋白质折叠过程中，聚集和正确折叠是相互竞争的两个过程。正确折叠是一个 一级反应而聚集属于两个或以上肽链之间的反应，受蛋白浓度的影响很大。为降低聚集 的发生，常将蛋白浓度降到很低（１０，－～５０ｍｇ／Ｌ），这样做的后果就是对于大规模的生产， 效率非常低。因此，许多蛋白质复性方面的研究集中在如何在复性的蛋白浓度尽可能高的情况下减少沉淀，获得高的收率【‘７２，‘７６Ｊ。 １．５．２温度和ｐＨｐＨ是影响复性的产率和速率的重要因素。尤其是对含有二硫键的蛋白更是如此。 在不影响正确折叠的前提下，高ｐＨ可以防止自由硫醇质子化对正确配对的二硫键形成 的影响。常用Ｔｒｉｓ缓冲液维持ｐＨ为８．０－－－－９．５。通常来说，当环境的ｐＨ值接近蛋白的等电点时，聚集就会增多‘７２，９３，９４１。复性温度多在０－－．一４０ ｏＣ，在２０－－－，２５ ｏＣ室温范围内，随着温度的升高通常会提高折叠的速度。但超过４０ ｏＣ，折叠的效率反而会下降。也有很多复性过程是在４ ｏＣ下进行的【９５，９６］。因为低温下折叠速度减慢，有利于蛋白形成天然构象。ｌ。５．３稀释倍数稀释倍数也是复性的重要因素。稀释时蛋白浓度和变性剂浓度都在下降。复性时蛋 白浓度通常很低（＜０．１９／Ｌ），但同时，变性剂浓度也应降到不影响蛋白的活性。对牛碳 酸酐酶Ｂ进行复性的过程中发现在１Ｍ的盐酸胍存在的情况下，蛋白能完全恢复其活性，但在２ Ｍ的盐酸胍溶液中，蛋白是完全没有活性的１９７１。 １．５．４辅助因子通过添加不同的化合物也会帮助复性。这些化合物包括低浓度的变性剂、糖、氨基 酸、表面活性剂和多聚物等。 变性剂（如尿素、盐酸胍等）在较高浓度下（＞３ｍｏｌ／Ｌ），可使蛋白质失活变为具有 一定二级结构的松散肽链。但是，在较低的浓度下是一种很好的促溶剂，能够有效防止 变性蛋白分子间疏水相互作用，防止不可逆聚集体的出现【９引。精氨酸可以特异性的结合 于错配的二硫键和错误的折叠结构，使折叠错误的分子不稳定从而推动分子形成正确结 构。这种结合不具有蛋白质种类特异性，所以采用精氨酸帮助复性具有一定的通用性１９９－ｉ０２］ｏ研究发现，聚乙二醇（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ，ＰＥＧ）可以通过疏水和亲水作用与蛋白相 互结合，其具有脂肪链的结构能结合到折叠中间体上的非极性区，从而阻止聚集的发生 【１０３】，抑制蛋白质复性过程中的聚集，提高蛋白质复性率。 分子伴侣是一组在胞内活动中起重要作用的多种蛋白和酶的总称，在蛋白折叠过程 中可识别、捕获错误折叠的蛋白，从而控制折叠过程，包括磷酸二酯酶、脯氨酸异构酶、 ＤｎａＫ和ＧｒｏＥｌ９６－１００］。磷酸二酯酶可防止二硫键的错配和分子间聚合，脯氨酸异构酶可以 催化以脯氨酸异构反应为限速步骤的蛋白质的复性，提高复性速率，ＤｎａＫ可以解聚错第１０页华东理工大学博士学位论文误折叠的聚合体。Ｇ－ｒｏＥ是近年来研究的热点ｆ１悼１０８】，ＧｒｏＥｆｌｊＣｎ＇ｏＥＳ和ＧｒｏＥＬ组成。ＧｒｏＥＬ 可结合蛋白质抑制聚合体的形成，相当于变性蛋白质的亲和配基。固定化ＧＩ＇ｏＥＬ柱（固定 床）相当于变性蛋白质的亲和吸附层析柱，从而可提高样品的处理量，并使蛋白质在复 性的同时得到浓缩和纯化。“小分子伴侣”是指Ｃｎ＇ｏＥＬ的一个片段，分子较小，更适合于 固定化，且不需另加复性辅助因子，实验发现其能有效地促进硫氰酸酶以及芽孢杆菌 ＲＮＡ酶的复性。目前分子伴侣由于使用费用高，并需要与复性蛋白质分离，在实际应用 中较难开展。有研究者联合使用去污剂和环糊精作为人工分子伴侣辅助蛋白质复性。反 相微团是表面活性剂在有机溶剂中形成的水相液滴，可使蛋白在微团中复性为天然构 象。环糊精由淀粉通过环糊精葡萄糖基转移酶降解制得，环糊精具有疏水性空腔，可结 合变性蛋白质多肽链的疏水性位点，抑制其相互聚集失活，从而促进肽链正确折叠为活 性蛋白质ｆ１０９。１１２１。直链糊精能够模拟环糊精在辅助蛋白质复性方面的作用，而且直链糊 精的螺旋结构形成一个疏水性空管，可以结合更多的蛋白质分子；在水中溶解度较高， 有利于提高复性酶浓度和方便实验操作，价格比环糊精便宜。 研究还发现，对于一些金属离子例如：Ｃａ２十，Ｚｎ２＋等对蛋白结构稳定或者活性发挥 起重要作用的金属离子，添加在复性液中也会有助于复性【１１３，１１４１。此外，单克隆抗体具 有协助蛋白质复性的作用。利用去污剂如Ｎ一十二烷基肌氨酸、十二烷基麦芽糖苷；氨 基酸如Ｌ．精氨酸、甘氨酸；还有使用高浓度的＂Ｉｒｉｓ、蔗糖、甘油等也能够抑制聚集，促 进天然构象形成。目前Ｎｏｖａｇｅｎ公司已开发了含有包涵体洗涤液、溶解液、透析液、去 污剂、还原剂的复性试剂盒可供使用。 综合以上的影响因素可以看出，要实现包涵体的高效复性，就要从上诉几个方面综 合考虑，寻找最佳的复性条件。 １．６包涵体的复性方法 １．６．１透析法 利用透析法去除变性剂的驱动力是溶液的渗透压。用变性液将蛋白稀释至较低浓度（Ｏ．０１＂－一０．２ｍｇ／ｍＬ）后装入透析袋中，用含低浓度变性剂复性液低温透析。方法有一步透析和多步透析，如果蛋白结构中含有二硫键，则在复性液中加入适当比例的还原剂，是 实验室中使用较多的方法。１．６．１．１一步透析处在高浓度变性剂溶液中的变性蛋白质放在复性缓冲液中透析，使得原有缓冲液中 的变性剂浓度逐渐降低。随着时间的延长，变性剂浓度将会降至与复性缓冲液中的变性 剂浓度相同。随着原试液中变性剂浓度的降低，变性蛋白折叠成其中间体或天然结构的 速率增大。然而，错误折叠和（或）聚集的速率也会增加。特别是当复性速率很慢时， 聚集的程度会大大增加，因为中低浓度的变性剂不足以使变性蛋白或其折叠中间体溶 解。这种复性方法对那些变性状态，或其中间体属可溶的蛋白具有较好的复性效果。１．６．１．２多步透析华东理工大学博士学位论文第１ １页多步透析法是在复性过程中使用一个逐步降低变性剂浓度的方法实现复性，并已经 成功用于抗体的复性【１１５，¨６１。与一步透析法不同的是，在每一个变性剂浓度条件下需要 建立一个平衡。如果错误折叠或聚集的速率比复性速率快，这个方法将不再适用。此方 法的一个优点是在中等浓度变性时，可能会发生正确折叠途径的返回，特别是对含二硫 键蛋白的氧化二硫键交换反应。在每个变性剂浓度条件下，折叠中间体可能形成错误折 叠或聚集体。然而，中等浓度的变性剂溶液可能使蛋白分子能够自由改变其结构以向其 天然结构转换，并形成正确的二硫键。另外，该方法比较适用于含多种蛋白分子结构域， 而且每一种分子结构域的折叠或者稳定可以不同。在高浓度变性剂条件下，平衡可能会 向最稳定的分子结构域折叠。与在低浓度变性剂下相比，在高浓度变性剂条件下，这种 特殊的结构域的折叠可能更容易形成。 透析的不利之处在于受质量转移的控制，速度很慢，耗时长，容易形成无活性蛋白 质聚集体，因此不适合用于规模化生产，而且复性时局部蛋白浓度过高，容易形成聚集、降低复性产率。 １．６．２稀释法稀释法通过用缓冲液和低浓度的变性液稀释包涵体蛋白溶解液，降低变性剂的浓 度，促进蛋白分子的重新折叠。稀释后扩大了复性系统体积，增加了缓冲液用量以及后 续浓缩工序工作量，在大规模工业化生产中生产成本较高，但由于其操作过程简单，在 众多复性方法中仍然是最常用的方法。本论文双变性后即采用稀释的方法进行复性。 １．６．２．１传统的稀释法 ①将高浓度的变性剂变性样品加入到大体积复性缓冲液中，因变性剂浓度降低使 得变性蛋白质快速折叠【１１７１，其中有一些参数需要考虑【１１８】。首先，随着高浓度变性剂溶 液和变性蛋白的逐步加入，缓冲液中变性剂浓度和蛋白浓度逐渐增大。这意味着在稀释 的开始阶段和后面阶段是很不相同的。将高浓度变性剂变性的蛋自稀释到一个不含低浓 度变性剂的缓冲液中意味着变性蛋白可能会折叠成一个具有刚性结构的中间体，不能自 由转变成天然结构。因此，应该在复性缓冲液中添加一定浓度的变性剂，其浓度取决于 待复性蛋白的稳定性。对寡聚蛋白而言，在稀释的开始阶段，复性过程中的蛋白浓度低， 因此，缓慢稀释会导致在较长时间内复性单体的浓度不足，因此应该采用快速稀释１１１９Ｊ。 例如为了避免聚集，在蛋白浓度较低时，可采用脉冲稀释法【１２０ｌ。 ②反稀释法。将复性缓冲液加入到有含高浓度变性剂的蛋白溶液中，这样变性剂 和蛋白质的浓度同时降低。这使得变性蛋白或折叠中间体在低浓度变性剂中暴露的时间 较长。蛋白浓度在中等变性剂浓度时较高，这与通常的稀释方法是不同的。容易产生聚 集和沉淀。然而，如果中间体在中等浓度变性剂中是可溶的，而且复性需要较慢的分子结构重排时，这种方法所得的结果较好。 １．６．２．４稀释法的新发展尽管操作过程简单，在大规模生产中，稀释复性还是存在一些缺点。工业规模上， 设备的混合时间通常持续几分钟，一般的混合设备是很难达到对大量流入的液体实现快第１２页华东理工大学博士学位论文速均一的混合。由于混合的不好，高浓度的蛋白也可能形成聚集体。已经开发了很多新 式反应方法（设备）来克服传统稀释方法中存在的问题。这些在稀释复性基础上发展起来的新方法包括：①流动型反应器：用稀释法复性蛋白时，变性蛋白迅速与复性液混合，混合时间 过长会影响蛋白质复性的效果。流动型反应器利用一系列串连的小混合单元对蛋白质进 行稀释，避免了一般批式稀释法中不利于蛋白质折叠的长时间混合。实验证明，这样的 设计，可以有效地避免返混，减少聚集体的形成，提高蛋白质复性效率。 ②批式加样稀释复性法和连续批式稀释复性：该法也叫脉冲稀释法、阶段稀释法、 流加稀释复性法。在该方法中添加蛋白质的时间间隔或补加速度在很大程度上依赖于蛋 白质的折叠动力学，变性蛋白质浓度始终保持在较低的水平，避免了一步稀释法中因高 浓度蛋白折叠形成中间体的积累，因而可在较高的蛋白质终浓度条件下获得高的复性率 ｆ１１】。这将有助于折叠而对已经折叠的蛋白质并没有负面影响。 ③温度跳跃复性：由于疏水作用的大小与温度的高低密切相关，在有辅助因子的 存在下，可以利用温度调控促进蛋白质的复性【１２¨。以上这些新方法的开发，为稀释复性方法注入了新的活力，更进一步扩大了稀释复性方法的应用范围。 １．６．３超滤法 超滤复性是选择合适截留分子量的膜，允许变性剂通过膜而蛋白质通不过。伴随变 性剂除去，以相同的速度加入复性液，蛋白浓度保持不变。这种方法较稀释和透析的方 法耗时显著减少，比较适合工业化生产。但是蛋白质在超滤过程中容易在膜上聚集变质， 从而限制了这种方法的应用。通常，用透析法和超滤法复性时产生的聚集体要比用直接 稀释法时产生的多【１２２］。Ｗｅｓｔ等将超滤和透析方法结合，使５９／Ｌ的牛碳酸酐酶（ｂｏｖｉｎｅ ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ）复性率达到４２％ｔ１２引。 １．６．４色谱法 近年来，色谱技术对蛋白质复性的作用得到了【１２２，１２４。３０ｌ应用。常用的色谱方法有： 体积排阻色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法、疏水色谱法。疏水色谱柱形成局部疏 水环境以利于蛋白质分子形成疏水核，并由此开始折叠复性；使用Ｎｉ亲和色谱柱可对 带有组氨酸标记的蛋白质特异结合；离子交换树脂将变性蛋白质吸附于所带电荷不同的 固定相表面。在色谱操作中，线性洗脱（盐梯度、ｐＨ值梯度等）是一种常用的方式， 通过线性洗脱使变性剂的浓度逐渐降低，复性条件比较温和，层析介质的空间隔离，降 低了蛋白相互作用产生的聚集，可同时实现蛋白的复性和纯化，耗时少。短处是很难避 免在交换溶液时变性蛋白聚集形成少量沉淀，并强烈吸附在凝胶介质上，造成复性率和 柱子载量降低。 １．６．５高压法 一种替代的新方法是使用压力釜作为折叠反应器，这对于有强聚集趋势的蛋白质折 叠甚至是纯化来说都是很有价值的。在净压强１ ５０．２００ ｌＶ［Ｐａ时，折叠反应可以进行，而华东理工大学博士学位论文第１３页聚集反应却不易进行，或者是被完全的逆转Ｉ”１１。由稀释复性过程搅拌引起的聚集，分 子伴侣缺乏诱发的聚集和细菌包涵体都可以在无变性剂条件下进行高压操作复性【蚓。即 使是在蛋白质的浓度高于８．７ ｍｇ／ｍＬ的时候，仍然可以使蛋白达到较高的回收率。增高 压力处理包含体，活性蛋白的含量会显著增加，Ｐ２２蛋白能够实现折叠１１３列。通过对不同 压力条件下进行折叠和聚集的研究发现，即使是处理很短的时间，通过压力操作也能避 免天然态蛋白的聚集Ｉｌ圳。这种方法使得折叠反应在高浓度下进行，因而，减少了处理 体积，并且也显著降低了对伴侣的依赖性。但由于反应器的特殊性，还不能广泛使用。 １．６．６双变性．复性方法 本研究组在进行重组人粒细胞集落刺激因子（ｒＨＧ．ＣＳＦ）包涵体复性时，开发了一 种简单、高效的Ｇ．ＣＳＦ“重组蛋白提取纯化新工艺”，获得国家发明专利授权 （ＺＬ９６１０６７７８．０）。该工艺的技术核心是一种新的包涵体复性方法，我们将其定义为“双 变性．复性方法（Ｄｏｕｂｌｅｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ）”。双变性．复性方法将变性与复性视为整体，通过变性．稀释．二次变性．稀释复性的系列连续变性溶解复性操作，使目的蛋白质 （Ｇ―ＣＳＦ）的纯度、溶解度大为提高，可以得到９０％以上的复性收率，而且纯度可通过 离子交换色谱技术一步达到９５％，完全可以满足抗体制备和活性筛选的需求。该工艺已 在苏州中凯成功产业化，为企业创造了巨大的经济价值。双变性．复性方法的应用性还有待进一步开发验证。根据蛋白质复性数据库ＲＥＦＯＬＤ（ｈＲｐ：／／ｒｅｆｏｌｄ．ｍｅｄ．ｍｏｎａｓｈ．ｅｄｕ．ａｕ）２００６年统计， 最常用的复性方法是简单易行的稀释复性方法，其比例在统计数据中占４０％。其次是透 析复性以及稀释复性与透析复性的联合使用，然后是柱复性【１３４１。各具体数值见图１．４Ａ。 此外，在复性后各纯化蛋白中，有６８％的蛋白是不带标签的，而带标签的蛋白则以带组 氨酸（Ｈｉｓ６）为主，具体见图１．４Ｂ。本文结合对以上各主要复性方法的综述，对各方法 的优缺点进行了总结（表１．３）。由于稀释复性的方法操作简单，对实验室和工业生产都 适用。在进行大量样本包涵体复性实验时，存在一定的优势。因此，本论文主要针对稀 释复性过程，以已有的双变性．复性专利方法为基础，希望通过包涵体蛋白的二次变性 过程，改变复性前变性蛋白的特性，从而有助于克服后续稀释复性过程中蛋白聚集引起 的收率降低，最终期望研究和发展一套高效、简便、适用范围广的包涵体变．复性方法。表１．３不同复性方法比较Ｔａｂｌｅ １．３ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ复性方法优点 透析法 操作简单局限性 速度慢、耗时长、易聚集、效率低， 只适用于实验室稀释法操作简单、易于放大、实验室和工业都适用、 使用比较多体积大、蛋白浓度低、收率低超滤法操作简单、耗时少、实验室和工业都适用蛋白易在膜上聚集变质，降低了效率第１４页华东理工大学博士学位论文蛋白浓度高、复性和纯化可同时进行 蛋白聚集易堵塞柱子，带来操作困 难，造价比稀释法高色谱法高压法蛋白浓度高、聚集少反应条件要求高，不易实现 发展时间较短，需要时间检验双变性法操作简单、耗时少、实验室和工业都适用， 可减少蛋白聚集，效率高体积大、发展时间较短，需要时间检 验ＡＤｂ～ｔ曙矾ＢＯｔｈｅｒ件知ｍｔ∞ｌＯＳＴ岫２％图１．４Ｆｉｇ １．４ＲＥＦＯＬＤ数据库统计图Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｄａｔａ ｉｎ ＲＥＦＯＬＤＰｉｅ ｃｈａｒｔｓ ｓｈｏｗｉｎｇ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｂｒｅａｋｄｏｗｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｔｅｒｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｄａｔａｂａｓｅ．Ａ：ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．Ｂ： ｕｓｉｏｎ ｔａｇ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ．１．７包涵体复性的理论基础１．７．１蛋白质折叠机理Ａｎｆｉｎｓｅｎ在研究ＲＮａｓｅ Ａ时发现一种蛋白质的结构、稳定性和功能的全部信息来源华东理工大学博士学位论文第１５页于其氨基酸组成和排列，多肽链的折叠是一个自发的过程，主要取决于给定氨基酸的序 列１１３５Ｊ。这一规律被称作生物体内的第二遗传密码。Ａｌｌｆ＇ｌｎｓｅｎ等提出经典的“热力学假说”（ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ），即一级结构决定三级结构。他们认为天然蛋白质多肽链所采取的构象是在一定环境条件下热力学上最稳定的结果，拥有天然构象的多肽链和它 所处的一定环境条件（如溶液组分、ｐＨ、温度、离子强度等）整个系统的总自由能（Ｇｉｂｂｓｆｒｅｅｅｎｅｒｇｙ）最低，所以处于变性状态的多肽链在一定的环境条件下能够自发折叠成天然构象。而动力学上Ｂａｋｅｄｌ３６］等认为，如果多肽链所选择的所有构象中仅有一个低自由能 状态即天然构象，那么所有非天然构象多肽链将遵循热力学假说由高能态向低能态转变， 最终形成天然构象（图１．５）。但是，对某些蛋白质而言，多肽链采取的某些非天然构象也 很稳定。若某一多肽链具有两种低能量状态：一种是天然构象，一种是非天然构象，而 且处于这两种低能量状态的多肽链的相互转变由于要克服较高的能垒（ｅｎｅｒｇｙ ｂａｒｒｉｅＯ而 难以实现（图１．５），那么在蛋白质折叠过程中就会有两种途径相互竞争，一种是正确折叠 形成天然构象的途径（ｏｎ．ｐａｔｈｗａｙ），另一种是错误折叠成稳定的非天然构象的途径 （ｏｆｆ－ｐａｔｈｗａｙ）。后来又有学者提出了多维能量景观学说（ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｅｎｅｒｇｙｌａｎｄｓｃａｐｅ）或折叠漏斗（ｆｏｌｄｉｎｇ ｆｕｎｎｅｌ）。多维能量景观学说认为：去折叠分子是一组 具有不同结构状态的分子群，在折叠过程中各个分子沿着各自途径进行折叠，不存在单 一的、特异的折叠途经。在折叠早期，去折叠分子结构松散、自由能大、可选择的构象 自由度也大，随着折叠的进行，所形成的构象越来越稳定即自由能越来越小，构象熵也 越来越小，折叠中间体数目不断减小，最终形成自由能最小、唯一的天然构象，这一系 列逐步收敛的变化呈漏斗状【１３ ７’１３ｓ】，如图１．６。拘乐图１．５蛋白质折叠的热力学和动力学控制Ｆｉｇ １．５ Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ ａｎｄｄｙｎａｍｉｃｃｏｎｔｒｏｌｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｌｄｉｎｇ ｐｒｏｃｅｓｓ第１６页华东理工大学博士学位论文图１．６蛋白质折叠能量景观示意图Ｆｉｇ １．６ Ｔｈｅ ｅｎｅｒｇｙ ｌａｎｄｓｃａｐｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｌｄｉｎｇ１．７．２蛋白质折叠模型根据以上原理，研究人员总结自己的研究成果，提出了许多蛋白质折叠的模型。 ①成核／快速生长模型（ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ／ｒａｐｉｄｇｒｏｗｔｈｍｏｄｅｌ）［１３９１：伸展多肽链开始折叠时，多肽链上先形成许多小的“核’＇（ｎｕｃｌｅｕｓ），这些小核由８．１８个氨基酸残基组成，它们随机 波动，很不稳定。多肽链的其它部分以“核”为模板，快速折叠“生长”，最终形成天然构 象。在这个模型中，成核阶段（ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ）是限速步骤。 ②拼图模型（ｊｉｇ．ｓａｗ ｐｕｚｚｉｅ ｍｏｄｅｌ）１１删：多肽链可以沿多条不同的途径进行折叠，在 沿每条途径折叠的过程中都是天然结构越来越多，最终都能形成天然构象，而且沿每条 途径的折叠速度都较快。与单一途径折叠方式相比，多肽链速度较快。另一方面，外界 生理生化环境的微小变化或突变等因素可能会给单一折叠途径造成较大的影响，而对具 有多条途径的折叠方式而言，这些变化可能给某条折叠途径带来影响，但不会影响另外 的折叠途径，因而不会从总体上千扰多肽链的折叠，除非这些因素造成的变化太大以致 于从根本上影响多肽链的折叠。 ③扩散一碰撞．缔合模型（ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ．ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ．ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｄｅｌ）［１４Ｉ】：多肽链在折叠起始 阶段迅速形成一些类天然结构或称“微结构域”（ｍｉｃｒｏ．ｄｏｍａｉｎ），如ａ．ｈｅｌｉｃｅｓ，ｐ－ｓｔｒａｎｄｓ等， 这些结构在伸展的多肽链中不稳定，它们之间相互碰撞相互作用而结合在一起时，这些 “微结构域”就稳定下来，多肽链进一步折叠形成天然构象。 ④框架模型（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｍｏｄｅｌ）１１４２】：在多肽链折叠过程中，首先迅速形成二级结构。 这些二级结构也是不稳定的，称为“ｆｌｉｃｋｅｒｉｎｇ ｃｌｕｓｔｅｒ＇’。多肽链在二级结构的基础上再进 行组装，形成三级结构。这个模型认为即使是一个小分子的蛋白也可以一部分一部分的 进行折叠，其间形成的亚结构域（ｓｕｂ．ｄｏｍａｉｎ）是折叠中间体的重要结构。 ⑤快速疏水折叠模型（ｒａｐｉｄ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｃｏｌｌａｐｓｅｍｏｄｅｌ）ｔ１４３］：伸展多肽链处在极性的水溶液环境中，其疏水侧链基团为避开极性环境而导致多肽链快速折叠，形成“溶球华东理工大学博士学位论文体”（ｍｏｌｔｅｎ ｇｌｏｂｕｌｅ），然后再进一步折叠形成天然构象。第１７页⑥动力学模型（ｋｉｎｅｔｉｃ ｍｏｄｅｌ）：多肽链折叠分为三个阶段，在多肽链折叠的起始阶段 类似“拼图模型”，多肽链沿多条途径迅速形成许多具有一些局部结构的中间体，折叠的 中间阶段类似“成核／快速生长模型”的快速生长阶段，多肽链在第一阶段形成的局部结构 的基础上进行快速折叠“生长”形成具有较多天然结构的中间体，复性的最后阶段是中间体向天然构象的转变，这是整个折叠过程中的限速步骤。虽然针对不同蛋白质的研究产生了不同的折叠模型假说，并且在促使蛋白质进行折 叠的驱动力问题上也存在着分歧，但是有一点却得到了科学界普遍认同，即蛋白质是在 历经了数量不同，结构不同的不稳定构象后才形成最终的天然结构。在缺少促溶剂的情 况下，中间体可能产生分子间的相互作用从而导致发生聚集和沉淀，包涵体蛋白折叠复 性的效率实际上取决于正确折叠过程与聚集过程之间的竞争。具体步骤可用下式描述： 伸展态一中间体Ｈ天然态ｌ 聚集体其中，聚集体生成反应被视为形成天然态的折叠反应的竞争副反应，它是一个高阶 折叠反应而折叠反应本身近似是为一级反应【１４４１。通常折叠反应的目的是减少副反应以 提高正确折叠蛋白质的最终产率。人们把主要注意力都放在影响折叠过程的理化条件研 究上，因为折叠和聚集的过程受这些因素影响很大。折叠过程中动力学常数对于设计复 性参数比如稀释速率、蛋白终浓度和复性时间等非常重要。一旦找到了最优的折叠条件， 由于聚集是一个浓度驱动过程，所以在理想的稀释操作中，产量就仅仅与蛋白质的浓度 有关。但是，折叠动力学常数对于折叠条件的依赖性很大，对于使用的某种缓冲剂来说，必须重新测定。１．８复性效果的检测与评价 研究蛋白质的复性，必须建立适当的检测方法，以鉴定复性蛋白质的生化、免疫学、 物性以及蛋白变性状态与天然态的区别，从而对复性方法进行评价和条件优化。主要的 检测方法有： １）凝胶电泳其中最为常用的是还原和非还原的ＳＤＳ．ＰＡＧＥ，适于鉴定产物的纯度及 复性蛋白质的聚集状态。 ２１光谱学方法。主要有圆二色谱，红外光谱、荧光光谱等，这些方法可用来研究蛋 白质分子复性过程中构象的变化，特别用于鉴定折叠中间体和复性蛋白质的构象： 许多生物大分子，如蛋白质、核酸、多糖等都是手性分子，具有旋光活性。１９８６ 年科顿效应（Ｃｏｔｔｏｎ ｅｆｆｅｃｔ）的发现为旋光色散（ｏｐｔｉｃａｌｒｏｔａｔｏｒｙｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ，ＯＲＤ）和圆二色（ｃｉｒｃｕｌａｒ ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ，ＣＤ）的出现奠定了理论基础。远紫外区（１８０＂－＇２５０ｎｍ）圆二 色谱对于评估蛋白质的各种二级结构含量及相关的变化是一种有效且便捷的方法。在一 般情况下，试验中得到的谱线可以看作一定百分比的ａ一螺旋、Ｂ．折叠和无规卷曲构象的第１８页华东理工大学博士学位论文圆二色谱的线性迭加。近紫外吸收波长范围（２５０＂－－３２０ｎｍ）的蛋白质圆二色谱可提供蛋 白质三级结构中的苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸残基的局部环境信息。熔球态或部分折叠 的蛋白质结构通常显示非常微弱或没有芳香族圆二色谱带，没有近紫外ＣＤ谱带，而对 应于完全折叠蛋白质的远紫外ＣＤ谱带保持不变，这是熔球态或部分折叠结构形成的有 利证明。通常会利用近紫外ＣＤ光谱和色氨酸荧光光谱互为补充研究蛋白质结构的变化。 由圆二色谱推测蛋白质二级结构的方法有很多，比如ＳＶＤ（ＳＩＮＧＵＬＡＲ ＶＡＬＵＥ）ＤＥＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮ，ＣｎＷＥＸ ＣＯＮＳＴＲＡｎ寸Ｔ ＡＮＡＬＹＳＩＳ，ＶＡＲＩＡＢＬＥ ＳＥＬＥＣＴｌ０Ｎ方法等ｆ１４５－１４引。 傅立叶变换红外吸收光谱（ＦＴＩＲ）是近１０年来才发展起来的一种新的分析测试技 术，用于蛋白质结构研究具有以下优点：①所需材料少，不受分子量大小的影响；②适 合各种状态的样品；③不受光散射，荧光的影响；④适合各种不同环境；⑤以测定蛋白 质的瞬间结构特征，说明蛋白质在生理状态下结构与功能的关系；⑥操作简便，测量速 度快。一般蛋白质的ＩＲ光谱的谱带归属主要有３大类：①所有蛋白质谱中均有氢键化 的胺基或羧基等活性基团的特征吸收带；②由组成蛋白质的氨基酸性质所决定的各类吸 收；③位于１７００＂－１５００ｃｍ＂１的酰胺带，其中，在１７００＂－－＂１６００ｃｍ以的酰胺Ｉ带及１６００＂－＂ １５００ｃｍ。１处的酰胺ＩＩ带可用于归属蛋白质的二级结构并探讨其内部氢键结合的情况。蛋白质分子红外光谱的另一个区域―一酰胺ⅡＩ区（１２２０～＇１３３０ ｃｍ＂１），对蛋白质二级结构的变化十分敏感，不受水分子的干扰，而且酰胺ⅡＩ带的振动能明显区分ａ．螺旋与无规卷 曲两种结构。在蛋白质二级结构研究中，利用酰胺ＩＩＩ区对蛋白质的二级结构进行定量分 析已成为一种有用的方法，并成为酰胺Ｉ区分析的补充。常用的分析方法包括去卷积法， 二阶导数法，曲线拟合法等。最近国外又新发展了二维ＦＴＩＲ技术，为进行蛋白质结构 分析，折叠与聚集的分析提供了更为精确的方法１１４弘１５¨。 荧光光谱法是研究蛋白质分子构象的一种有效方法【１５２】。它能提供包括激发光谱、 发射光谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏振等许多物理参数，这些参数从 各个角度反映了分子的成键和结构情况。蛋白质的内源荧光来源于三个有近紫外吸收的 氨基酸色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸，个别蛋白质分子含有的黄素腺嘌呤二核苷酸（Ⅳ山） 也能发射荧光。其中色氨酸和酪氨酸残基在荧光检测中具有较大的贡献，它们可以提供 蛋白质所处环境的信息，以及环境变化所引起的蛋白质结构变化。荧光方法的应用主要 由荧光共振能量转移【”３１、荧光相图法和荧光偏振法【１５４１。荧光共振能量转移可以求出两 个生色团之间的距离从而得到生物大分子较高分辨率结构信息【１５５１。 ３）色谱学方法。近几年人们利用蛋白质天然态和变性态下色谱行为的差异来研究复 性过程，并用于复性蛋白质的检测，例如天然态、变性及复性蛋白质、折叠中间体等在 尺寸排阻色谱保留体积上的差异；反相色谱检ｉ９ｌｆｌ－－硫键的构象，监测折叠过程中二硫键 的形成情况等１１５６，１５７１。 ４）粘度与浊度。蛋白质折叠状态不同，其溶解性存在一定差异，从而影响其粘度的 变化。测定溶液的浊度（常以６００或４００ ａｍ的光吸收值表示）可反映蛋白质聚集的快慢与程华东理工大学博士学位论文度１１５８，１５９１。第１９页５）免疫学方法。利用酶联免疫、蛋白印迹法可以测定不同状态蛋白质的抗体一抗原结合力的差异，从而说明其空间构象状态。６）生物学活性及比活性测定。这是作为对最后的折叠状态评价的一个重要指标，一 般是通过采用动物或细胞模型直接测定复性蛋白质所具有的生物学效价。 此外，随着Ｘ射线晶体衍射分析，核磁共振技术，显微学技术的发展与成熟，这些 技术越来越多的应用于蛋白质结构的检测中，为复性后蛋白的状态提供了更加精确的分析方法。１．９本课题的研究意义及内容 目前作为研究热点的功能基因组学、抗体组学、蛋白质组学、结构基因组学均需要 高通量基因克隆、高通量蛋白表达、复性及纯化的基础技术作为支撑。从技术成熟度、 操作便利性及成本经济程度等方面的考虑，目前各种组学研究所需原料蛋白的表达和后 续有价值的基因产品的大规模生产依然首选以大肠杆菌为主的原核基因表达系统。 大肠杆菌作为外源基因表达系统具有低廉、高效、稳定、易于构建、易于工程化的 优势，是目前重组蛋白质表达的主要系统。虽然大肠杆菌表达系统在表达长度在５００以 上氨基酸残基的外源蛋白时较为困难，但根据ＳＷＩＳＳ．ＰＲＯＴ和ＴｒＥＭＢＬ两大蛋白质序 列数据库的统计信息，在ＳＷＩＳＳ―ＰＲＯＴ的４０万多条蛋白质序列中，有８ｌ％的蛋白长度 在５０－－５５０个氨基酸残基之间，在ＴｒＥＭＢＬ的近５７７万种蛋白质序列中，有８３％的蛋 白长度在５０．５５０个氨基酸残基之间，这些长度在５０－－５５０个氨基酸残基的蛋白理论上 都可以通过大肠杆菌表达系统进行表达，从而较为方便快捷低成本地获得所需目标蛋 白，进行后续的蛋白结构和蛋白功能研究。 外源蛋白在大肠杆菌中表达时绝大多数是以不溶的包涵体形式存在，根据目前国际 公共数据库中唯一的蛋白重折叠数据库ＲＥＦＯＬＤ的统计信息，在该数据库收录的总共 ６７８种采用大肠杆菌表达系统表达的重组蛋白中，有８ｌ％是以不可溶形式表达的。这些 蛋白通过简单的离心洗涤就可以去除其中大部分的杂蛋白、核酸、脂和多糖成分，成本 极为低廉，而且目的蛋白以包涵体形式保存，非常稳定。因此，对于高通量、大规模的 蛋白制备，以包涵体形式表达的重组蛋白质具有独特的优势。然而，包涵体内的重组蛋 白质需要经过体外折叠复性形成正确的高级结构才能获得预期的生物活性。而复性过程 经常发生蛋白质的聚集使得复性产率降低，因此包涵体复性长期以来被看作原核表达体 系研究和制备蛋白质的技术瓶颈和限制因素。现在已经发展了很多有效的复性技术，但 大多数复性技术随着被复性蛋白质的不同而具有相当大的差异，因此，研究和开发复性 效率高、适用范围广、通量高的包涵体蛋白质的复性方法具有很高的价值与意义。 我们在进行重组人粒细胞集落刺激因子（ｒＨＧ．ＣＳＦ）包涵体复性时，开发了一种简 单、高效的Ｇ―ＣＳＦ“重组蛋白提取纯化新工艺”，获得国家发明专利授权 （ＺＬ９６１０６７７８．Ｏ）。该工艺已在苏州中凯成功产业化，为企业创造了巨大的经济价值。第２０页华东理工大学博士学位论文该新工艺可以通过两个变性剂的转换和几步简单的离心洗涤就使目的蛋白质的溶解度 大为提高，可以得到９０％以上的复性收率，而且纯度可通过离子交换色谱技术一步达到 ９５％，完全可以满足抗体制备和活性筛选的需求。由于该工艺简单高效的特点使其适合 于进行高通量复性实验，对该方法的深入研究可能为实现复性效率高、适用范围广、通 量高的包涵体蛋白质复性方法提供新思路，解决原核表达体系研究和制备蛋白质的技术 瓶颈。鉴于此，本课题进行了以下几个方面的研究： １．首先，以Ｇ．ＣＳＦ包涵体复性为模型，对“新工艺”使用的复性方法与传统稀释复性方 法进行了全面的比较研究，充分发掘了“新工艺”的技术核心为双变性．复性的方法， 由此提出双变性．复性假说，为后期进一步开发并完善双变性一复性方法提供依据。 ２．其次，在以上两个包涵体蛋白高效复性的基础上，作为对双变性．复性方法的高通量 和普适性检验，本论文应用双变性．复性方法对８８种来源于人与动植物，具有重要生 物学意义，结构功能各不相同的重组蛋白质的包涵体进行了双变性一复性实验，考察 双变性．复性方法在不同包涵体重组蛋白质复性中的普适性，区分复性类型，评判该 方法进行深入研究开发的价值并为后期分析提供数据。 ３．第三，对已经采用双变性．复性的包涵体，建立分析数据群，采用统计学模型分析寻找蛋白特性与复性收率之间的关系，指导双变性．复性方法的应用与开发。４．第四，基于双变性．复性的观点与模型分析的结果，以绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）包涵体 为模型蛋白进行新复性方法的开发与检验，拓展并完善了双变性．复性方法，验证了 双变性论假说。 ５．最后，作为双变性．复性方法在包涵体复性中应用的一个案例，应用双变性．复性方法对来源于日本血吸虫的重要蛋白Ｊ‘尾蚴弹性蛋白酶”包涵体进行了复性，并对目标蛋白进行了分离纯化与重组产物酶学性质的研究。解决了日本血吸虫弹性蛋白酶 研究中的一个技术难点。华东理工大学博士学位论文第２１页第２章单变性．复性与双变性一复性方法的比较２．１综述 ２．１．１包涵体的单变性与双变性．复性 变性溶解和复性是从包涵体中回收活性蛋白的两个关键性步骤。复性过程就是去除 变性剂恢复蛋白结构的过程，因此，变性剂与蛋白间的相互作用不可避免的要影响复性 过程。多数情况，复性效率是比较低的，这是由于复性过程蛋白易发生聚集作用而析出， 降低了最后活性蛋白的收率。传统的变复性方法（图２．１）一般是对包涵体进行单一变 性剂变性之后就直接进入去除变性剂的复性操作。虽然在后一过程针对不同蛋白的特点 采取了不同的变性剂去除方法，例如稀释法、各种色谱柱法、透析法等等。但到目前为 止，各方法仍然是存在蛋白依赖性，适用范围局限，而且不可避免的在复性过程要形成 一定程度的蛋白聚集。双变性．复性方法（图２．１）将变性与复性做为整体考虑，充分利 用了在变性剂中析出的聚集体可能发生的变化（例如结构、纯度、溶解性等），将其在 另一变性剂中进行再次溶解然后复性，取得了比传统方法高的蛋白收率，比较好的解决了复性过程的蛋白聚集析出。图２．１单变性，双变性．复性方法示意图Ｆｉｇ ２．１ Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ ｄｒａｗｉｎｇ ｏｆｔｈｅ ｓｉｎｇｌｅ／ｄｏｕｂｌｅ ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ Ａ：ｄｏｕｂｌｅ ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ．Ｂ：ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｓｉｎｇｌｅ ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ第２２页华东理工大学博士学位论文２．１．２重组人粒细胞集落刺激因子（Ｏ．ＣＳＦ） 粒细胞集落刺激因子（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ－ｇｏｌｏｎｙ―ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ，Ｇ－ＣＳＦ）是一种多肽链的 细胞生长因子，可特异地调节粒细胞的增殖与分化，并能增强成熟粒细胞的功能，对机 体应撤防御系统有重要意义ｌｌ删。研究还发现Ｇ￡ｓＦ与白血病细胞的掏亡有一定关系。 Ｇ－ＣＳＦ功能的发挥有赖于与效应细胞表面的特异性受体的结合。随着基因克隆技术的发 展，Ｇ―ＣＳＦ重组产品已广泛用于临床，为血液病及其他疾病的治疗提供了有力的手段。 人类Ｇ－ＣＳＦ由单个基因编码，其基因位于１７号染色体的ｑ２１－２２区，约长２．５ｋｂ， 有４个内含子和５个外显子，分别编码１２、５６或（５３）、３６、４９和５４个氨基酸。成熟 的人Ｇ―ＣＳＦ有两种异构体：１７７个氢基酸（８型）和１７４个氨基酸（ｂ型）。前者除了在 成熟分子Ｎ端３５位处插入了３个氨基酸外．其余的序列与含１７４个氨基酸的分子相同。 人Ｇ－ＣＳＦ相对分子量为１９ｋＤａ。已有研究表明人Ｇ正ｓＦ一级结构中舍有两个色氨酸 （仃Ｄ５８；ｔｒｐｌｌ８）、５个半胱氨酸（ｃｙｓ），其中ｃｙｓ３６与４２，７４于６４之问形成两对二硫 键，Ｃｙｓｌ７为不配对半胱氨酸，二硫键对维持其生物学功能是必需的因素。对来源于大 肠杆菌的重组人Ｇ－ＣＳＦ的ｘ射线和核磁共振（Ｆｉｇ ２．２）研究表明Ｇ－ＣＳＦ的构型中螺旋 含量高达６９％，４个＊螺旋中第一个螺旋位于第１ｌ和４ｌ残基之间，第二个螺旋位于第 ７１和９５之间，第三个螺旋位于第１０２和１２５残基之间，第四个螺旋位于第１４５和１７０ 之间，其中第一个和第二个螺旋平行排列（上．上），并由位于第一个二硫键后的一短小 螺旋连接；第三个和第四个螺旋平行排列（下．下），由一长环连接。其中第２０～４６位 的氨基酸残基和Ｃ－末端氨基酸残基与其结合受体的能力及活性有关。天然的Ｇ－ＣＳＦ有 糖基，糖基化位点位于Ｔｈｒｌ３３，无Ｎ糖基位点。糖基对Ｇ－ＣＳＦ的生物学活性没有贡献， 在大肠杆菌中表达的Ｇ－ＣＳＦ无糖苷，但其功能与天然Ｇ－ＣＳＦ无明显差别””Ｊ。天然的 Ｇ－ＣＳＦ在中性溶液中稳定性差，易形成聚集析出，在ｐＨ６ ０以下的缓冲液中，主要以单 体形式存在，聚集程度可以得到缓解。活性形式以单体显现。蛋白的理论等电点为５ ８。圈２．２ＮＭＲ检测的Ｇ－ＣＳＦ三雏空闻结构图‘城Ｉ。４条螺旋主链以蓝色表示，环结构以紫色表示。左右分别表示１８０。旋转。Ｆｉｇ ２．２ Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎｏｆｔｈｅｔｈｔｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉ珈＇ａＩ ｓｔｒｔｍｔｕｒｅｏｆｔｈｅｍａｉｎ ｃｈａｈ］ｏｆＧ－ＣＳＦ越ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙＮＭＲ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ． Ｔｈｅｆｏｕｒｍａｉｎｈｅｌｉｃｅｓｗｅｍ ｓｈｏｗｎｉｎｂｌｕｅ ａｎｄｔｈｅｌｏｏｐｓｉｎｐｕｒｐｌｅ华东理工大学博士学位论文第２３页本章针对开发人Ｇ．ＣＳＦ时形成的一项“重组蛋白提取纯化新工艺”，即双变性一复性 方法展开研究，充分比较了该方法与传统单一变性复性方法对Ｇ―ＣＳＦ包涵体进行复性 时的差异。展示了双变性．复性方法的优越性，总结了双变性一复性方法的特点，在此基础上提出了双变性一复性假说。２．２材料与方法２．２．１实验材料２．２．１．１实验仪器和试剂实验仪器：ＳＨＪ．ＪＰ超净工作台，上海净化设备厂；ＨＳ．９００Ｄ电热恒温水浴锅，太仓 市科教器材厂：电热挑手提式高压蒸汽灭菌锅，上海医疗器械制造厂安亭分厂；５４１５Ｄ台式离心机，Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ；高速冷冻离心机，Ｅｐｐｅｎｄｏ吒Ｇｅｒｍａｎｙ；ＪＡｌ００４电子天平，上海精科天平公司；垂直板蛋白电泳槽，北京六一科技有限公司；Ｕ．１ １００紫外 可见分光光度计，Ｈｉｔａｃｈｉ，Ｊａｐａｎ；ＥＰＳ．６０１型电泳仪，Ｐｈａｍａｒｃｉａ；脱色摇床，上海西巴 斯生物技术开发有限公司；ＺＤ．９５５６水平恒温摇床，太仓市教科器材厂；９０．１恒温磁力 搅拌器，上海强运科技有限公司；ＤＭＦ．Ｕ７１Ｖ超低温冰箱，Ｓａｎｙｏ；ＡＦ．１００制冰机， ＳＣＯＴＳＭＡＮ；生物电泳图像分析系统，上海复日科技公司；ＬＲＨ．１５０恒温生化培养箱， 上海一恒科技有限公司；ｐＨＳ．３ＴＣ精密酸度计，上海天达仪器厂。ＡＫＴＡ蛋白纯化系统， 美国ＧＥ公司。ＳＣＱ２５．１２超声波清洗器，上海声浦超声设备厂；ＸＹＪ．１４５０超净工作台， 吴江市净化设备总厂；酶标仪（５５０型），Ｂｉｏ．Ｒａｄ公司；Ｃ０２培养箱（ＢＢ ５０６０型）， 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