为了提高基因工程菌的质粒如何整合到基因组稳定性，可采用哪些主要方法

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2018-02-21 13:31 标签： 质粒的稳定性
豆丁微信公众号
君，已阅读到文档的结尾了呢~~
扫扫二维码，随身浏览文档
手机或平板扫扫即可继续访问
第八章 基因工程菌修改2011 (1)
举报该文档为侵权文档。
举报该文档含有违规或不良信息。
反馈该文档无法正常浏览。
举报该文档为重复文档。
推荐理由：
将文档分享至：
分享完整地址
文档地址：
粘贴到BBS或博客
flash地址：
支持嵌入FLASH地址的网站使用
html代码：
&embed src='http://www.docin.com/DocinViewer-4.swf' width='100%' height='600' type=application/x-shockwave-flash ALLOWFULLSCREEN='true' ALLOWSCRIPTACCESS='always'&&/embed&
450px*300px480px*400px650px*490px
支持嵌入HTML代码的网站使用
您的内容已经提交成功
您所提交的内容需要审核后才能发布，请您等待！
3秒自动关闭窗口【图文】生物制药――工程菌的高效表达及稳定性_百度文库
两大类热门资源免费畅读
续费一年阅读会员，立省24元！
生物制药――工程菌的高效表达及稳定性
&&生物制药――工程菌的高效表达及稳定性
登录百度文库，专享文档复制特权，财富值每天免费拿！
你可能喜欢培养过程对基因工程菌稳定性的影响_百度文库
两大类热门资源免费畅读
续费一年阅读会员，立省24元！
培养过程对基因工程菌稳定性的影响
阅读已结束，下载本文需要
想免费下载本文？
定制HR最喜欢的简历
下载文档到电脑，方便使用
还剩1页未读，继续阅读
定制HR最喜欢的简历
你可能喜欢当前位置： >>
(附具体方法)基因工程菌质粒(遗传)稳定性--原创
质粒遗传稳定性目前没有明确的规定，但一般用斜面传代法，一定数量点接抗性和非抗性 板，生长计数（主要证明分裂稳定性） ；更严谨时，可进一步双酶切、测序等验证（证明结 构稳定性--国家药品监督管理局的新生物制品审批） 。 工业用菌确实存在很多问题，免不了质粒丢失严重，高突变等现象，但是一般工业用菌 都是经过 10 代以上稳定筛选之后才用于小试、中试和工业生产的。菌体不稳定造可能成的 损失巨大，所以鲜有工业用菌使用在 2-3 代菌就没有产量或者产量低的菌株。一般来说，一 代菌用一点少一点，一代菌上罐太伤了，工业用菌一般会存储足够量的二代菌（多数是冷冻 干燥安瓿管）用于生产，在生产中需要活化、制作摇瓶种子，如果菌体生长慢，还要进一步 做种子罐，最后才能用于生产。如果菌体稳定性差，几代传下来，发酵的不稳定造成损失是 很难估计的，而且一般不稳定菌都是先做小试、中试，成功后才能用于生产。 质粒在宿主中的稳定性确实需要进行筛选， 实验中遇到的质粒突变能避免尽量避免， 做 好的质粒也不一定一直存放，由于不断的被用于各种改进实验，期间经过的大量筛选，避免 了一代菌用完之后就没有更好的使用。使用高保真酶扩增、保证没有物理化学因素促变，使 用合适的宿主， 还是很容易得到没有突变的质粒的， 后续连续传代培养也可以得到比较稳定 的质粒的。质粒不稳定是重组基因工程菌培养过程中的常见问题， 也是影响外源基因高 效表达的限制因素之一[77~78]。Koch[79]最早对外源基因引入宿主而对细胞产生的 代谢负荷进行考察，研究表明质粒的大小、拷贝数，质粒的维持，抗性基因的表 达，培养环境的变化，都会对宿主细胞产生代谢负荷，当供氧不足或营养物质受 限制时，代谢负荷对细胞生长的影响会更加明显。基因工程菌中质粒稳定性问题是影响基因工程菌实现规模生产的一个重要因素,这种不稳定性主要表现为两种形式: 一种是 重组DNA 质粒的丢失, 称为脱落性不稳定; 另一种是质粒中的基因结构发生突变, 称为结 构性不稳定。 这两种不稳定都能使细胞失去生产能力。 质粒的稳定性与宿主及载体的特性有 关, 也与培养条件有密切的关系。 ?试验一：遗传稳定性验证（斜面活化代时）连续传代实验：将构建好的四个质粒 pBES、pBEF、pBESF 和 pBEG 分别转 化进入 B. amyloliquefaciens TA208，取工程菌的培养液梯度稀释到合适浓度，涂 布于 LB（+） （含 10 μg/mL 卡那霉素）平板，37 ℃培养 16 h 后随机挑取 50 个 单菌落，同一菌落分别接种于 LB（+）和 LB（C） （不含卡那霉素）上，于 37 ℃ 培养 16 h（第 1 代） 。将 LB（+）上的菌落接种于 LB（+）平板上，LB（C）上 的菌落接种于 LB（C）平板上，于 37 ℃培养 16 h（称为第 2 代） 依此进行 。 连续转接 50 次，分别计算两个平板上菌落生长数。 平板传代稳定性实验：在传代过程中，每隔 5- 10 代将 LB（C）平板上的 菌落接种于 LB（+）平板上，菌落计数，计算该基因工程菌在无选择压力下的遗 传稳定性。 将各基因工程菌株分别在 LB（+）和 LB（-）上连续传代培养，在传代过程 中 LB（+）上的菌株长势都非常好，说明在抗生素压力下，菌株稳定性良好，未 发生质粒丢失情况。 但在无抗生素压力下， 如图 3-11 所示 LB （-） 上生长的 50 个 单菌在连续传代过程中，传代 30 次左右质粒开始丢失，到第 50 代 18 % 的菌落 质粒已经丢失，并且各工程菌株的质粒稳定性没有显著性差异。说明工程菌株遗 传稳定性一般，需要在传代及培养过程中加入抗生素，这对工业化生产和菌种保 藏均有重要意义。图 3-11 重组菌株的遗传稳定性测定 Fig. 3-11 The test of heredity stability of recombinant strains ? ?试验二：质粒稳定性研究（分裂代时）分别在摇瓶发酵培养0?h、10?h、20?h、30?h、40?h和50?h时，测定质粒稳定性， 并比较质粒pXMJ19和pXMJ19\ilvA(F383V)稳定性的差异，（具体方法：每个时间 段取样涂布， 挑单*50， 分别接抗性与非抗性板， 计算； 同时转接至下一时间段。 ） 结果如图3\25所示：批注?[g1]:?LB 培养基即可??图 3-25 质粒稳定性研究 Fig. 3-25 The plasmid stability test摇瓶发酵培养 30?h，约有 10%的菌株丢失质粒；培养至 50?h，质粒丢失率约 为 15%， 且质粒 pXMJ19 和 pXMJ19\ilvA(?F383V)的稳定性差异不大， 说明 ilvA?(F383V) 基因的插入不会影响质粒 pXMJ19 的稳定性。同时在发酵生长期？？质粒的丢失 率高于中后期，推测分裂不稳定是此质粒丢失的主要原因。??
更多搜索：
赞助商链接
All rights reserved Powered by
文档资料库内容来自网络，如有侵犯请联系客服。生物技术制药习题答案夏焕章版_百度文库
两大类热门资源免费畅读
续费一年阅读会员，立省24元！
生物技术制药习题答案夏焕章版
阅读已结束，下载本文需要
想免费下载更多文档？
定制HR最喜欢的简历
下载文档到电脑，方便使用
还剩17页未读，继续阅读
定制HR最喜欢的简历
你可能喜欢

我要回帖

更多关于 质粒的稳定性 的文章

 

随机推荐