&& 《》 && 生殖器疱疹
生殖器疱疹
是由（Herpes Simplex Virus ，HSV）I型、Ⅱ型所致性病之一。近年来明显升高。在国内它还属性病中新一代成员，人们对它的危害性没有足够的认识。单纯疱疹病毒可引起、粘膜及多种器官。它可以通过而发生生殖器疱疹（Genital herpes）。生殖器疱疹有两个；HSV-I和HSV-Ⅱ。大多数生殖器疱疹由HSV-Ⅱ引起，本病可呈慢性复发过程，目前尚未有根治的良药。目前HSv 成为不少国家和地区的首要病因，同时还和的发病及病的传染有关。
单纯疱疹病毒属于，直径180nm，是较大的病毒。它可以分为HSV-1和HSV-2两个亚型，它们在、自然属性以及人类对它们的方面存在着不同。但这两个亚型感染引起的生理却相同。HSV的结构为双股线状DNA，每股DNA分长、短两个部分。约为100×106道尔顿，15万硷基对，可编码60个以上的。在DNA病毒中，单纯疱疹病毒结构具有特殊性，因为它的两个独立的两侧有倒置的，这两个核苷酸序列能够互相倒置联系，病毒DNA有四种。HSV-1和HSV-2的有50%左右的。
HSV病毒形态呈球形，病毒表面是由162个组成的对称20面体（100-110nm），其内是由DNA组成的核心，外壳包绕着，外面有一层。在衣壳和之间是一种多组成的。HSV有三类基因，分别为α、β和γ基因。HSV感染但不造成，病毒在感染细胞内处于抑制状态，被感染的存活与功能也不受影响，把这一过程称为潜伏。病毒基因激活后病毒开始复制，有时可形成疱疹性损害，这一过程称为复发。潜伏感染内有大量的两种体，它们与称作ICP-O的直接早期（α）基因产物重叠，这些RNA转录体按“反义”方向编码，表示它们可能是β和γ蛋白转录的，当病毒处于潜伏状态时，其复活能力也被降低，对病毒潜伏的机理的了解可能有助于为预防HSV复发找到新途径。
HSV-2基因组为双链线性DNA分子，含69%G+C，分子量为96×106D。根据基因组两个通过相连的分别被称为L（长）和S（短）的组分的方位不同，HSV-2DNA可有四种异构体。L组分包括82%的病毒DNA，并且有一独特序列“U”，其两侧有一反转重复区域ab或b′a′，分别含6%病毒DNA。S组分占18%的病毒DNA，也有一独特序列（US），其两侧亦有反转重复序列a′c′和ca。a′c′和ca分别含4.3%DNA。彼此相关的L和S序列的倒置衍生于特异性，重组是由末端“a”序列区的病毒基因产物介导的。HSV-2DNA两端可连接成环状，此结构与病毒的致癌与潜伏有关。HSV-2DNA中L和S的序列主要编码特定的即刻早期，而独特序列主要编码特定的早期及晚期和。
HSV-2有三类基因，即α、β、γ。其中α基因在感染中最早表达且不需要前的合成；β基因的感染需要α蛋白的预先合成；γ基因的表达需要病毒DNA的复制。现已证实HSVmRNA可合成三类基本蛋白：急早期（immediate early，α）、早期（early，β）和晚期（late，γ）蛋白，β蛋白在DNA复制中起作用，包括，DNA及大多数DNA，而大部分糖蛋白则多为γ蛋白。HSV-2呈连锁调节，即α基因产物诱导β，而β基因产物（加上一种α蛋白ICOP4）反过来又可终止α基因表达，同时诱导γ基因的表达，γ基因产物则可负调节β基因的表达并且可作为下一轮合成α蛋白的起始信号。
迄今为止，已有6个编码糖蛋白的基因已定位于HSV-2线性位点上，其基因产物分别被命名为gB、gC、gD、gE、gG和gH，编码gB、gC的基因位于UL区，而编码gD、gE、gG和gH的US区。
二、与诱导细胞转化有关的
Aurelian对所有实验中HSV-2感染的（包括肿株）作了分析，发现病毒DNA共有的序列仅两处，一处是Bg1ⅡG片段，位于0.21-0.33图单位,该DNA序列与感染细胞在低中的有关,而与病毒致癌无关;另一处是Bg1ⅡC片段,位于0.45～0.58图单位,能诱导细胞转化.HSV-2诱导转化的DNA区域位于Bg1Ⅱ/Hpal-CD片段,相当于0.44～0.52图单位.HSV-2DNA的Bb1ⅡN片段位于0.58～0.63图单位,为形态学转化区,已知0.58～0.628中无特定的编码功能.L+K-细胞株或3T3tk-细胞株能通过HSV-2感染转化成TK+,导致转化所需的HSV-2DNA序列位于0.28-0.32图单位。
目前生殖器疱疹的流行情况在STD中非常引人注意，它已成为欧美最常见的性病之一。如英国自1971年的4000例增至1985年的20000例。在美国，年已增加了15倍。估计美国人群累计病例超过3000万。本病占STD中第5位（7.7%
患者机体对感染HSV的反应如何将直接影响机体是否发病及感染的严重程度、潜伏感染的发展和维持及HSV复发频率。如患者有缺陷和缺陷的HSV感染病情较为严重，说明介导和细胞介导的对HSV患者十分重要。动物实验证明，T，NK细胞和在防止HSV扩散中起主要作用，抗体则有助于减低中病毒的含量。
在一定的条件下，特异性HSV，HSV，已接触HSV的淋巴细胞及针对病毒抗原克隆的T细胞都具有保护不患或潜伏感染。的免疫反应在HSV发病机理方面可能也起一定的作用，HSV抗原的细胞免疫反应涉及多种细胞，如、巨噬细胞、T和由这些细胞产生的。给动物被动输入已接触过HSV抗原的淋巴细胞，再用病毒攻击，动物可得到保护而不发病。最大保护作用需激活多种T细胞。
通过对疱疹病损研究表明，CD8T淋巴细胞参与感染的控制，新生儿感染HSV时，其γ-的表达就显著延缓。干扰素可能有直接的抗病毒效应或者可能激活其他非特异性。
原发感染时，用和抗体依赖，在出现4天可检测到HSv IgG抗体。而不依赖补体中和抗体和CF抗体通常要在症状出现后2-3周才测到。感染早期可测到HSV特异性IgM，IgM持续8周，但在潜伏感染及无症状感染者中则测不到IgM。一般情况下，无症状感染者和将复发疱疹者的HSv IgG、IgM或IgA无差异。
最近IgG亚型抗体的检测，对IgG在生殖器疱疹的初感染、再发等也可检出，而IgG2、3、4，在初感染中却不能检出。另外，有人报道有意思的是IgG4，女性比男性呈高频率的检出，但也有人追试这一测试却得到不同结果。还有由Westernblot法可大量检出。HSV的特异性蛋白质抗体，含有5-6种的糖蛋白，含的蛋白，HSV-1就有23种，HSV-Ⅱ，也有10-15种，但对此类蛋白的抗体在临床上尚无明确意义。
生殖器疱疹复发感染与抗体水平高低无关。在原发感染后，有高Ne抗体的患者反比低滴度者更易复发。敏感的放射免疫测定法证实，病毒再激活时偶尔IgG、IgM和IgA抗体升高，在和生殖器疱疹病人，其HSv IgM抗体出现也不规则，故血清IgM抗体出现或滴度升高不是复发或无症状再激活的可靠判断指标。
HSV主要经过皮肤、粘膜或破损处进入人体内，首先在或细胞内复制。不论有无临床症状，病毒在局部充分复制后感染或未稍。病毒沿进入神经节内的神经细胞中。动物实验发现，从HSV到神经节内的神经细胞发现病毒，大约2天时间，可见其感染速度相当快。
HSV-1通常由、及皮肤粘膜密切接触感染。所以HSV-1常潜伏在根和内。故临床所见主要是颜面部位的疱疹，HSV-2主要因性行为传播，接触而感染，所以HSV-2则常潜伏在内，故临床主要表现为生殖器疱疹。患者均为阳性，可终生有泌尿生殖道HSV间歇性活动。
感染最初阶段，病毒先在神经节及与之相接触的神经组织内复制，然后通过感觉神经到达其未稍而使与之相关的皮肤、粘膜表面发生皮损。病毒从外周感觉神经扩散到皮肤、粘膜，这一情况，可以解释表皮大面积受感染和远离原发部位新病损发生的原因。HSV感染病人常有这些特点，而且从远离接种部位的神经组织中发现病毒。初次发病临床症状消退后，在神经内不再分离到病毒。在细胞表面也检不出病毒蛋白。各种刺激因素，如、劳累、感染、以及皮肤神经节等都可引起病毒复活。
原发感染缓解后，神经节中找不到感染的病毒和病毒，潜伏感染神经细胞中的病毒基因组和不同，前者HSV的DNA是环状的，在潜伏感染的小鼠神经细胞核内和人的中检出的RNA转录物中可与编码早期基因ICPO的区域杂交，此RNA是编码ICPO的DNA互补链转录来的。此“反义”RNA可能参与维持神经内潜伏感染但不参与建立潜伏感染，维持潜伏感染的机制不清楚，似乎潜伏感染的细胞仅有HSV蛋白质的部分转录。
HSV感染是一种全身性，病毒经呼吸道、、生殖器粘膜或破损皮肤进入人体，可潜于人体正常粘膜、、以及局部感觉神经节和多数器官内，几乎所有的和粘膜表皮内都可分离到HSV。
原发感染多为隐性，大多无临床症状或呈亚临床表现，仅有少数（约1-10%）可以出现临床症状。主要见于婴幼儿或严重或有其它感染的儿童，成人罕见。原发感染消退后，病毒可持续潜居体内。正常人中约有半数以上为本病毒的，可通过口、鼻分泌物而成为，由于HSV在人体中不产生永久免疫力，故每当机体抗病能力减退时，如患某种性传染病，、、、病灶感染、、情绪环境改变时，体内潜伏的HSV即被激发而发病。
HSV-1主要引起，，和，而HSV-2感染主要引起生殖器疱疹，但在临床上也有相反情况。
HSV感染的为1-45天，平均为6天，HSV-1感染主要发生于口角、、等皮肤粘膜交界处，亦可见颜面或，开始局部先有灼痒及轻度紧张感，偶有伴发。随即出现，在红斑基础上发生簇集性小丘疹，迅速变为粟粒至绿豆大小的，内容澄清，水疱破裂后出现面，数日后干燥。自觉灼痒，偶有倦怠，不适和轻微发热等，愈合可遗留暂时性。全病程1-2周左右。
HSV-2感染主要发生于生殖器部位，患部先有烧灼感，很快在红斑的基础上发生成群的小水疱，多见男性包皮、龟头、、等处，偶见于；女性常见于阴唇、、、宫颈等处。水疱可逐渐变成，约6天左右破溃而形成糜烂或浅的，自觉疼痛。病人可发生，出现。多数人有肿大疼痛，有的病人可出现发热、及症状。如发于女性宫颈者可形成溃疡，增多，可有下腹痛。应注意有无宫颈癌发生。孕期患生殖器疱疹时易致、或，并易使新生儿感染，发生。本病一般经过3周左右可以痊愈，但常有反复发作，一般原后1-4个月内复发，症状较原发者轻，范围亦小，局限于生殖器部位，有时仅有1-2个疱疹，病程亦短，自发病至愈合8-12天。本病也可伴有生殖器以外部位的感染，如口唇、臂部及等。
皮损为红斑基础上可见成群的水疱或脓疱或成糜烂及溃疡。女性患者约90%伴有HSV，宫颈可见发红、糜烂、溃疡，有脓性阴道分泌物。有的患者可有腹股沟淋巴结肿大或升高。变也可出现在口唇、、臀部、、手臂，甚至眼部与咽喉。并发脑膜炎或横贯性，一般于发疹后3-12天出现颈项等的现象。
三、潜伏感染和复发
HSV感染人体后1周左右，血中出现，3-4周达高峰，可持续多年，这些抗体能清除病毒和使机体，但大多数个体不能彻底消灭病毒，也不能阻止复发，病毒以潜伏状态长期存在宿主体内。不同亚型HSV感染者急性首发生殖器疱疹的临床过程相似，但生殖器病变复发率不同，首发HSV-2感染者约90%，在12个月内会出现一次复发（平均复发4次），而初次感染HSV-1者仅50%出现类似复发（平均复发次数小于1）。不同个体及同一病人一生中生殖器HSV-2感染的复发率变化很大，大多数年复发5-9次，一般在原发疱疹消退后1-4个月内发生，有些患者受到促发因素，如发热、月经、日晒、寒冷、某些等的影响而复发，其特点是每次复发往往发生在同一部位，复发前可有前驱症状如局部，发疹前数小时感染部位有灼烧，麻刺感。
复发生殖器疱疹（）对患者心理影响较大，由于目前尚无预防复发的有效及可能有诱发生殖器恶变的危险性，故给患者带来心理影响，患者多有、恐惧等心理障碍，这又直接影响HSV的复发。我们的治疗经验，只要患者坚持规律治疗，都能治愈。
四、HSV与感染：
HSV常与HIV-1同时感染，并能促进病情发展，引起严重的局部和播散性感染。目前认为HSV是一种调节因素，能激活HIV复制，Heng对6例合并HSV皮肤损害患者进行皮肤活检，发现角化细胞和巨噬细胞均有HIV-1和HSV-1杂交后使HIV-1保留其感染性，而无需与CD4分子结合即能进入细胞内。此外HSV-1能刺激潜伏型HIV-1，而增加HIV-1/HSV-1共同感染和在组织中的复制。
发生，其中可见有嗜酸性。表皮开始为形成的多房性水疱，以后聚合为单房性水疱。真皮有轻度，有轻重不等炎性细胞。反应严重时可有严重表现。
HSV感染的诊断要依据病史、临床表现和结果而定。有不洁史，而且在生殖器部位出现皮肤红斑和原发性水疱，易复发等不难诊断。必要时可作疱液，培养、接种、。抗体测定等，均有助于诊断和确定病毒类型。
对皮损刮片做Wright-Gemsa （Tzanck试验）或Papanicolaou，可检出HSV感染特征的包函体，但不能区别HSV感染或— 感染，敏感性仅为病毒分离的60%。
二、培养法
从水疱底部取材做分离病毒，为目前较敏感、最特异的检查方法，需5-10天，因其技术条件要求高，价格昂贵，不能普遍使用。
三、抗体检测
目前最广泛的是HSV-2抗体检测，如也可用gD2作抗原检测HSV-2抗体，具有敏感性，且能区分HSV-1和HSV-2的优点。
（一）用PCR分型检测单纯疱疹病毒
PCR是一种敏感性高，特异性强的快速检测方法，中含有1fg HSV-DNA就可以检出，其在HSV感染的诊断研究中发展较快，且分型检测HSV是发展的趋势。
1、标本采集和处理
（1）标本采集
①：直接采取患者0.5ml脑脊液标本于无菌送检.如肉眼可见血色,应离心取上清。
②及血清: 同上,应避免.
③脑组织: 脑组织、活检标本,加1ml PBS标本研磨后，待检。
④眼及皮肤病灶分泌物：用预测（半干）棉拭子直接取患处分泌物，置1ml PBS标本缓冲液中送检。
⑤生殖器（宫颈、阴道、外阴、阴茎）标本：先用棉拭子擦去病变部位表面粘液、污垢，再用预潮棉拭子用力擦拭患处分泌物，置1ml PBS标本缓冲液中送检。
（2）标本处理
①：所有液体标本均可直接进行模板制备；可以取100μl标本液，离心5000r/ min×5min后，去上清，取沉淀物进行模板制备。
②模板制备：a: K消化裂解法：沉淀物加100μl蛋白酶K消化裂解液，55℃1h后，煮沸10 min，离心5000 r/ min×5min，收集上清。 b:水煮法：沉淀物加100μl，摇均水煮20 min，离心5000 r/ min×5min收集上清。c:1%Triton　X-100裂解法:取采集的标本液100μl，加入1μl Triton X-100，水煮20 min，5000 r/ min×5min，收集上清。d: 5%NP-40裂解法：取采集的标本液100μl，加5μl NP-40，水煮20 min ，5000r/ min×5min收集上清。e:如标本溶血严重经上述裂解处理后，再加等体积酚-抽提、冷沉淀DNA，加10μlDW溶解待检。
（1）设计。以HSV DNA的高保守区为检测靶序列以确保特异性。设计3个引物，一个上游共同性引物，DNAP5（5′ATGGTGAAAACATCGACATGTACGG3′）：二个下游特异性引物，DNAP3-1（5′CCTCGCGTTCGTCCTCGTCCTCC3′　）和DNAP3-2（5′CCTCCTTGTCGAGGCCCCGAAAC3′），可以分别扩增出HSV-1469bpDNA片段（）、HSV-2 391bp片段（）：从二型PCR扩增产物中设计了一个不分型的特异性HSVP3 5‘GGCGTAGTAGGCGGGGATGTCGCG 3‘）。
（2）PCR实验体系。取模板10μl： DNAP5　0.5（0.2μmol/L）：DNAP3-10.5μl (0.2μmol/L)：DNAP3-2　0.5μl (0.2μmol/L)：4×dNTP 8μl(4×200μmol/L)：10×dNTp 8μl(4×200μmol/L)；10×缓冲液10μl：DMSO 4μl；加DW65.5μl； 30μl.。
水煮（96℃～100℃）7min
加TaqDNA聚合酶1μl；（2.5U）
↓ 65℃60s　→72℃70s
↓33个循环
3．扩增产物的检测和分析
（1）染色法：取扩增产物20μl加样品缓冲液4μl混匀后，点样于2%凝胶板，70V电泳15～20min，溴化乙锭（EB）染色5min，于下观察结果在溴酚蓝后面有一条或二条亮红带为阳性结果，HSV-2带在前，HSV-1带在后，无带则为阴性结果。
（2）XhoI法：取HSV-1型PCR产物50μl加XhoI50U，37℃1h后，置3%琼脂糖凝胶中，70V电泳15～20min，可产生46bp片段带（引物后面）；与正常PCR产物比较，XhoI酶切后的大片段电泳位置前移。
（3）Southern：PCR产物20μl经电泳分离后，用变性液处理60min，再用中和液处理90min，转移至纤维素膜上：80℃烤膜2 h，42℃预杂交（杂交液中）30min，加入32p标记HSVP3探针后,42℃杂交过夜；次日用1%SDS/ PBs pH7.2,　42℃洗15min， 0.5%SDS/PBS pH7.2, 42℃洗15 膜置暗盒内放射性自显影12～15h,显影为阳性, 不显影为阴性。
（二）套式PCR
套式PCR（nested primers-polymerase chain reaction，NP-PCR）是通过“外侧”、“内侧”两对引物，即一对扩增较大DNA片段的“外侧”引物和一对位于扩增产物中再扩增小片段的“内侧”引物，这样两次连续放大可以提高PCR检测的灵敏度，保证产物的特异性。但该方法不能分型，能100%检出HSV-1，50%检出HSV-2，应改进分型检测HSV，更好地在临床应用和基础研究中推广应用。
1、　标本处理：
（1）标本采集同上
（2）DNA 制备：①脑脊液：取100μlCSF 水煮15min,加入250μl，放-30℃10min；离心10000g30 min，去上清，30℃干燥后，加入10μl DW； ②脑组织细胞：取沉淀物加100μl蛋白酶K消化裂解液，56℃作用1h，水煮10min；取上清加入等体积酚一氯仿（V/V），轻摇10 min，离心10000r/min×10取水相，加入250μl DW溶解。
2、PCR扩增
(1)引物设计：选择HSV1糖蛋白D基因为检测靶基因。
NP-PCR 的引物和探针序列
“外”引物
ATCACGGTAGCCCGGCCGTGTGACA
CATACCGGAACGCACCACACAA
“内引物”
CCATACCGACCACACCGACGA
CGTAGTTGGTCGTTCGCGCTGAA
BJHSV-1PRO
TACGAGGAGGAGCTGTATAACAAAGTCTGT
(2) PCR实验体系和程序:　反应体积为50μl；模板10μl；BJHSV1.10.5μl(0.2pmol/L)； BJHSV1.2 0.5μl(0.2pmol/L)； 10×缓冲液5μl； 4×dNTp 4μl(4×200mmol/L)；DW 27μl; 石蜡油30μl。循环参数为95℃30s;55℃30s; 72℃60s; 循环20次, 取其扩增产物1μl加入含有BJHSV1.3和BJHSV1.4反应体系中进行套式扩增,先95℃变性2min，循环参数为95℃30s;55℃30s; 72℃60s; 循环30次后，72℃延伸5。
(3) 扩增产物分析：
①　琼脂糖凝胶电泳染色法：
取扩增产物10μl点样于2%琼脂糖凝胶中， 70V电泳15-20min,溴化乙锭染色5min，于紫外灯下观察结果,在溴酚兰后面有一条，或二条亮红条带为阳性结果,HSV-2带在前，HSV-1带在后，无带则为阴性结果。
② Southern印迹法：
PCR产物20μl 经电泳分离后，用变性液处理60min，再用中和液处理90min，转移至硝酸纤维素膜上，80℃烤膜2h，42℃预杂交（杂交液中）30min，加入32P标记HSV探针后，42℃杂交过夜，次日用1%SDS/PBs pH7。2，42℃洗15min，0.5%SDS/PBS pH7.2，42℃洗15min；膜置X线暗盒内，自显影12-15h，，显影为阳性，不显影为阴性。
（三）、—酶谱法（polymerase chain reaction-endonucleasecleavage PCR-EC）
具有经济广泛等特点；不仅能一次性分型检测HSV-1，HSV-2，EBV，CMV四种病毒，而且方法本身快速、方便、无损伤，易被实验室接受。可检出3个CFU的HSV1，灵敏度高，能检测出第1dCSF中HSv DNA阳性结果，并可用于药物治疗效果的评价。由于病毒的，会出现酶切点丢失现象，从而造成酶切阴性结果。对此可以通过型特异性探针或序列分析解决。
1. 标本处理
（1）　 标本采集，方法同上。
（2）　 DNA模板制备：每份标本取200μl，按200μg/ml加入蛋白酶k，56℃作用1h；
加入等体积的酚—氯仿（v/v）轻摇10min，离心1000r/min×5min；取水相加入500μl(2.5倍体积)无水乙醇，-20℃过夜沉淀DNA，离心15000r/min×5min,吸去液体，30℃干燥后,加蒸馏水25μl溶解,待检。
2. 引物设计：
P1，5′CGACTTTGCCAGCCTGTACC3′
P2，5′AGTCCGTGTCCCCGTAGATG3′
（1）PCR实验体系：
反应体积100μl； 模板10μl ; P1 0.5μl(10pmol/L) ，P20.5μl(10pmol/L); 4×dNTP 4μl(4×200mmol/L); 10×缓冲液10μl, DMSD 5μl, Dw 65μl, 循环参数为94℃60s;60℃60s; 72℃60s；循环40次℃延伸4min。
（2）扩增产物检测与酶切分型.
①第一步电泳鉴定: 取10μlPCR产物加4μl样品缓冲液,加入2%琼脂糖凝胶板,70V电泳(5-20min)加EB染色5min后,紫外灯下观察,可初步鉴定扩增产物大小。
②酶切分析：分别取20μlPCR产物于2个Eppendorf管中，加入50μl无水乙醇，-20℃沉淀DNA，再分别用20μlSmal和BamHI反应缓冲液溶解，加入SmaI或BamHi50U于相应Eppendorf 管内，37℃作用1h。
③第二步电泳分型，取10μlPCR酶切物加4μl样品缓冲液，加到2%琼脂糖凝胶中,70V电泳,15-20min后,EB染色5min,与同步加入未酶切的PCR产物相对照。 紫外灯下观察,结果如下:
PCR-EC法检测四种病毒结果
476bp+42bp
100bp+424bp
277bp+247bp
不需酶切,第一步电泳就可以区分
（四）用RT-PCR检测单纯疱疹病毒
RNA的聚合酶链反应（RNA-PCR），可能通过检测HSV不同期的RNA，这不仅可诊断HSV感染，而且有利于HSV的潜伏期感染机制的深入研究。
RT-PCR是以RNA为模板经反应（RT）产生cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增以达到检测目的。因此，RNA-PCR也可称为RT-PCR。
1、标本处理：
组织块细胞总RNA提取，取100mg组织标本，加1ml胍变性液，于中，室温研磨均匀后，移入2.5mlEppendorf 管中。依次加入0.1ml3mol/L(pH4.0)NaAc,1ml水酚和0.2ml氯仿一异混匀,用力振摇10s, 置冰浴15min。10000g4℃,离心20min,取上清水相(上层DNA、下层DNA和质)加入等体积置-20℃1h,沉淀RNA。离心 15000r/min×10min,弃上清, RNA重新用0.3ml硫氰酸胍变性液溶解,再加0.3ml异丙醇沉淀,-20℃1h, 沉淀RNA. 离心15000r/min×10min,去上清, 沉淀RNA用75%冷乙醇洗一次, 。.加10μl TE缓冲液（pH7.4）溶解,保存备用.临用前冰浴溶解。
2、PCR扩增:
（1） 引物设计: 选择HSV-1ICPO基因(极早期)为检测靶基因.设计2个引物，
P1　 5′GGATCCTCACGTGGTTACCCGCGGTCT 3′
P2　 5′AAGCTTCCGGGGCCGTCCCCGCGGGCG 3′可以扩增ICPO 中266bp序列。
1个探针：5′CCGGCTGGAGCCGCCGCACCCTGCT3′。
（2）PCR实验体系：总反应体积为50μl，模板10μl （0.25-1.0μg）P1　1μl (20pmol/L)；P2 1μl (20pmol/L);4×dNTP 4μl（200μmol/L)； 10×缓冲液5μl； AMV()2μl(50U)； DW 26μl； 循环参数, 94℃变性2min后 94℃50s，60℃60,72℃60s，循环40次后72℃延伸5min。
3、扩增产物的鉴定：
（1）琼脂糖凝胶电泳染色法：取10μl PCR扩增产物加4μl 样品缓冲液，混匀后加样2%琼脂糖凝胶板，70V电泳15-20min，EB染色5min。紫外灯下观察扩增条带。
（2）Southern印迹杂交法：用32P标记的特异性探针检测PCR产物，方法同上。
总之，在HSV的中，PCR能对前病毒或潜伏期低复制的HSV特异性靶DNA片段进行扩增检测，远较DNA探针敏感，并能在血清中抗体出现前就可以检出。因此，PCR无论是作为基础研究手段，还是作为临床检验诊断方法，均具有广阔的前景。
五、病理诊断
，形成大水疱，病灶周围有多核巨细胞浸润，特别是与淋巴细胞充斥于病灶中间。
主要与，鉴别：硬下疳为单个质硬的溃疡，无疼痛感，无复发史，实验检查（+）或（+），可见。软下疳为质软的溃疡，局部虽有疼痛感但无复发史，实验检查链杆菌阳性。
其他生殖器部位皮肤病如接触性、。有时与生殖器疱疹相似，可以从病史及检查方面相区别。
本病有自限性，约1-2周即可自愈。治疗的目的是防止下次复发。本病目前尚无特效药物，治疗原则为缩短病程，防止，减少复发。
1．局部疗法：原则为干燥、收敛、保护患部，防止继发感染。可外涂2%，或选用10%次铋（代马妥dermatol）、膏或泥膏、油膏、0.5%新霉素软膏、或0.25%~0.1%（IDU）软膏、5%疱疹净溶液（用于皮肤疱疹）等。对颜面部者亦可用10%铝或锌铜合剂。
2．全身治疗：治疗原则其一使感染的HSV不能，甚至消灭病毒；其二调节免疫，防止再发，可用静滴或口服，口服，干扰素肌注，Ⅱ肌注。我们在治疗复发性生殖器疱疹时，使用四医大中心产的干扰素300万单位肌注，每日一次，10次为一疗程，共三个疗程，适当配合使用白细胞介素Ⅱ或利百或，95%的病人不复发。
下面介绍别人治疗疱疹方法供参考：
一、　抗HSV药物
（一）无环乌苷是公认的有效药物：
1．原发和初发感染：ACV200mg，每日5次，连服7天；或ACv 5mg/kg，按体重，8小时一次，连续5-7天。
2．复发感染时，ACV 200mg，每日5次，连服5天，或ACV800mg，每日2次，连服5天；若在刚开始出现前驱症状时或在损害出现后的2天内即开始治疗，则对部分患者可能有效
3．复发频繁时：ACV200mg，每日3次，可连续服用6-12个月。在经常复发的患者中（每年&6次），每日治疗至少可以减少75%的复发次数，在接受长达3年治疗的人群，已确定是安全有效的。从接受治疗的人群中已分离到耐ACV的HSV株，但正常者未见治疗失败者。治疗1年后应停药，以便重新评价患者的复发率。
4．免疫受抑制患者：首发或复发的急性患者：静注ACV（5mg/kg/8h）或口服ACV400mg×4次/日，共7-10天；抑制复发：每天静注ACV（5mg/kg/8h）或口服ACV（400mg×3-5次/天），可预防复发。
5．HSV，ACV 400mg，每日5次，可缩短病程。免疫受抑制或重症者可静注ACV5mg/kg/8h。
6．新生儿HSV：现有资料认为，不应该常规应用ACV治疗通过产道感染的无症状婴儿，治疗仅限于有HSV临床表现及产后阳性的患儿。所有新生儿HSV感染者应接受ACV或治疗。常采用ACV300mg/kg/d，阿糖腺苷30mg/kg/d，共10-14天。
7．合并HIV感染：患者需口服ACV间歇或每日抑制治疗。对合并HIV感染者增加ACV剂量是十分有益的。
ACV400mg，口服，每日-5次，治疗有效，应持续用药直至临床症状消失；对重症者，应用ACV给药，对可疑或已证实的ACV株引起的重症患者，最佳方案可能是：ACV400mg/kg，静脉注射，每8小时一次，直至临床痊愈。
HIV感染者中的皮肤损伤粘膜HSV感染时大剂量ACV治疗无反应者日益增多。大剂量ACV对部分患者有助于损伤的愈合，但不能阻止另外一些患者的病情进展。对复发频繁者长期服用ACV不能制止继续排毒，因此，仍可对性伴感染，此时若改用作用机理不同的如磷甲酸和阿糖腺苷等可能有效。
ACV的抗病毒机理是它很容易被HSV编码的胸苷激酶化，形成ACV-MP，再被细胞作用而形成ACV-。ACV-TP与dGTP竞争而DNA合成。
ACV全身应用治疗首次临床发作或作为抑制治疗药物时，可使疱疹发作的症状和体征得到控制。然而，该药既不能根除潜伏病毒感染，也不能影响以后发作的次数和严重性。该药局部治疗的效果比口服差，故不提倡局部用药。
ACV可缩短生殖器疱疹病程，加速愈合及缓解症状，长期应用可减少复发，曾有人对11000例免疫正常的GH连续治疗5年，在此期间复发率明显降低。
但是长期口服ACV不能清除骶神经节的潜伏病毒，停药后生殖器疱疹仍可复发，对ACV有的越来越多，几乎所有耐药性都发生于曾经进行多个病程治疗的免疫受损害者。
ACV静脉应用的主要是由于药物在内结晶而引起的暂时性。若缓慢给药一小时以上或大量饮水则可避免此副作用。
（二）、（，Ribavin RBV）：抑制病毒多种DNA及RNA复制，合成。
用量：原发GH及AIDS合并HSV感染，15mg/kg/d，肌注；复发GH，0.4g,口服,每日4次,3天后改为0.4g,每日2次,共5天,疗效肯定,用于耐药病毒株。
（三）、磷甲酸（TrisodiumPhosphonoformate，PFA）；选择性抑制疱疹病毒诱导的DNA依赖的DNA聚合酶，主要用于耐ACV病毒株的感染。
用量：40-60mg/kg/d，静脉注射，每8小时1次，连用4次，可用于AIDS合并HSV感染。外用0.3%-1%PFA霜。副使用有肾及钙。
（四）、双羟丙氧甲基乌苷（，Ganciclovir，DNPG）：是ACV的，通过抑制病毒DNA复制，导致RNA合成受阻，感染细胞DNA多聚酶是作用的靶部位。
用量：5-10mg/kg/d，分3次静注，连续14天，副作用有抑制及。
（五）、氟阿糖碘（FIAC）：对HSV-1和HSV-2有同样作用，选择性作用于被病毒感染的细胞，其产物5-碘、5-均有抗病毒作用。阿糖腺苷磷酸抑制病毒DNA合成，有抗病毒活性，副使用少，不能防止潜伏感染的建立，但防止病毒进入中枢神经系统有一定保护作用。抗HSV单克隆抗体局部外用，对GH有治疗作用，国外有人报道治疗HSV-2总有效率92.6%，基本治愈率44.1%。
（六）、（Indomethacin）：作用为抑制合成，有助于减少GH的复发，促进conA及PHA（）刺激所发生的细胞增殖作用，加强NK细胞的杀伤能力，可用于复发GH的治疗，用量：25mg口服，每日3次。
（七）、（PolyZIC）：是人工合成的，能刺激，增强抗体形成，对起调节使用。用量2mg，肌注，2-3次/周。
二、对妊娠GH的处理
对孕妇使用的安全性尚未肯定，但研究发现，用ACV的孕妇畸胎发生率与正常人相比，并无增高，但ACV对妊娠及的危险性尚未得出可靠结论。
对威胁母亲生命的HSV感染，如，及，应采用ACV静脉用药，但无威胁生命的HSV感染，不必全身用ACV治疗。
依照美国学会建议，对反复发作的GH处理方案如下：
（一）时如无活动性生殖器损害，则无需剖腹产；
（二） 妊娠未3个月，症状性复发是短暂的，只要分娩时无活动性损害，可经阴道分娩。
（三）临产时有活动GH者，可作如下处理：①未破，孕妇不发热，胎儿尚未成熟，应延缓分娩；②如系足月妊娠，羊水已破，胎儿肺已成熟，应行剖腹产。
（一）避免不洁性交及不正当的性关系，活动性生殖器疮疹患者绝对禁止与任何人发生性关系；
（二）治疗期间禁行房事，必要时配偶亦要进行检查；
（三）对局部损害的护理，应注意保持清洁和干燥，防止继发感染。
（四）治愈后或有复发者，要注意预防，受凉，劳累等诱发因素，以减少复发。
目前尚无特异性预防方法，动物实验表明，接种HSV或，均有，因此病毒与某些的关系密切，故不作常规预防使用。最近用的疱疹病毒作，可避免疱疹病毒DNA的致癌危险性。
ACV也有预防作用。阴茎套可能减少疾病的传播，尤其是在无症状排毒期，但出现生殖器损害时，使用阴茎套也不能避免传播。
出自A+医学百科 “基因诊断与性病/生殖器疱疹”条目
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