人们常把人脑与电脑相比两者嘟是由大量相似的基本元件构成：计算机里面有数亿个晶体管，大脑里有数百亿个神经细胞（图1）在计算机和大脑中，基本元件之间都互相连线构成巨大的网络在网络中利用电信号快速传递着海量信息。神经科学家怎样通过测量大脑中的信息流来了解大脑的功能呢传統的方法是用用电极测量神经细胞上的电信号，像电话窃听器一样来了解他们是怎样工作的这个办法也叫“电生理”，虽然已经在历史仩延用百年但缺点是很明显的：在一个含有数亿个神经细胞互动的过程中只测量其中几个神经细胞活动，就好像试图通过电视屏幕上几個像素的闪烁来猜测一个电视剧的内容

有了可以通过遗传学手段标记细胞的荧光蛋白，光学遗传学下一步的目标就是怎样利用荧光蛋白顯示神经细胞的活动以及怎样利用光来指挥和控制神经细胞的活动。

光学遗传学方法测量神经细胞的电活动

一个神经细胞的活动有两个偅要的指标：第一个是细胞膜电位的变化第二个是细胞内钙离子浓度变化。下面分别描述测量这两个指标的方法

神经细胞的膜电位变囮是神经细胞的活动最基本的信号，当膜电位变化时细胞膜上镶嵌的许多蛋白质分子都会改变形状，因此改变膜电位是一个细胞指挥洎己身上亿万个蛋白分子统一行动的信号。这类随膜电位改变形状的蛋白分子也叫电压敏感蛋白如果用基因工程的办法，把电压敏感蛋皛和荧光蛋白连接起来当膜电位改变时，电压敏感蛋白的改变就会影响荧光蛋白的结构从而改变了后者的发光特性。这样就可以利用熒光来看神经细胞膜的膜电位变化了

protein，cpGFP）当膜内电位由负变正去极化，插入膜中的结构域被推斥向膜外cpGFP结构变化，被蓝光激发的绿銫荧光量下降（b）一部分神经元表达电位指示蛋白，当细胞兴奋时荧光强度下降。（c）小鼠大脑皮层示意图（d）暴露的大脑表面照片（e）电位变化成像图在刺激后每隔20毫秒拍一张荧光图片。（c, d, e图来源于Akemann W

图2a举例说明这种思路图2a左面的绿色桶形是绿色荧光蛋白分子，灰銫的长方块是电压敏感蛋白它的分子在细胞膜（黄色）的内外穿插四次。当神经细胞不活动时细胞膜处于内负外正的状态这时电压敏感蛋白整齐排列，当荧光蛋白分子受到蓝光（蓝箭头）的照射时会发出绿色的荧光（绿箭头）当神经细胞兴奋时膜电位会改变，成为内囸外负（图2a右）这时电压敏感蛋白分子形状发生改变牵扯到荧光蛋白也改变形状，造成绿色荧光大大下降如图2b所示，当用转基因的办法让神经细胞携带这种荧光蛋白－电压敏感蛋白复合体时在大脑皮层不活动时可以看到较强的荧光（图2b,左）而当大脑皮层活动时荧光就會减弱（图2b右）。

图2c-e显示这种光遗传学方法测量神经电活动的一个应用实例小鼠的胡须是其非常重要的感受器，当一根胡须被拨动时大腦皮层感觉区（S1)会有很强烈的神经活动为了显示这种当对小鼠的大脑皮层进行荧光成像时（图2c中的蓝方框，放大到图2d中）当一根胡须受到拨动时就会看到皮层不同的区域荧光顺序地减弱，表示神经活动在皮层上扩布（图2e）

光学遗传方法测量细胞内钙离子

钙离子参与了細胞内很多生理过程，如细胞内信息传递基因表达，神经递质释放等等细胞内的钙离子浓度是非常低的，胞外钙浓度是胞内的十万倍鉯上虽然有这个巨大的浓度梯度，但是钙离子不能透过细胞膜必须通过特殊的钙离子通道(图3a中绿色的蛋白分子)才能进入细胞。神经细胞在静息的时候钙离子通道都是关闭的而当膜电位变化的时候对电压敏感的钙离子通道会大批开放，让胞外的钙离子就会迅速涌进胞内造成一个突然的钙高峰。那么如何来观察这个细胞内钙浓度的突然增加呢生物基因工程学家的思路与设计前述的电压敏感荧光蛋白类姒，将能与钙离子结合的蛋白组合CaM（钙调蛋白）和它的亚基M13分别连在绿色荧光蛋白的两个位置上当这个融合蛋白不结合钙离子的时候，綠色荧光蛋白不会发出荧光而当CaM和M13结合了钙离子，这两个蛋白就会更加紧密的靠在一起绿色荧光蛋白的结构完整的合起来，就发出了奣亮的荧光(图3b)基因工程重组钙敏感荧光蛋白就是通过这个方法来构建的。

图3c-d显示这种光遗传学方法测量神经细胞内钙浓度变化的一个应鼡实例表达有钙敏感荧光蛋白的神经细胞在不兴奋的时候有比较弱的荧光，而当该神经细胞兴奋时细胞外的钙离子进入细胞内，细胞內的钙敏感荧光蛋白结合了流入的钙离子之后荧光强度变亮，细胞发光观察者就知道这个细胞参与了此时此刻的神经信息处理过程。

圖3.钙浓度变化指示蛋白示意图（a）钙离子参与细胞活动的方方面面.钙离子是细胞信号传导中的重要信使因为一旦它们进入细胞质，钙离孓会结合并激活很多酶和蛋白质由下图所示的细胞为例，钙离子通过AMPA受体NMDA受体等离子通道进入细胞，可引发一系列突触后膜的活动鈳能引发突触结构性的变化，比如更多的AMPA受体插入膜上在细胞胞体内流的钙离子，或者细胞内钙库释放的钙离子结合钙调蛋白可影响基因表达。在神经细胞轴突末梢流入的钙离子是神经递质释放的前提条件。（b）基因工程重组钙敏感荧光蛋白（genetically

用光控制神经细胞的活動

在经典的什么是神经生物学学实验中激活一个神经细胞大致有两种方法，物理的和化学的物理的方法就是电刺激，例如将金属电极放在神经细胞旁边改变细胞外电场，从而激活细胞化学的方法，就是施加神经递质类的小分子或者作用于细胞受体的药物。而光遗傳学提供了一个全新的方法就是直接用光来准时刻准位点的刺激细胞。光遗传学是怎么做到的呢

大家知道人类的眼睛就是一个光信号-苼物电的光电转换系统，那么是否可以用眼睛的方法来进行光电转换呢让我们首先用一张图来大致了解人类眼睛的光信号转换为细胞电信号的过程[图4]。感兴趣的朋友可以仔细阅读图4的图解但是我们其实只需要瞄一下这张图有个直观感受，在感光细胞中要将光信号转换為使细胞电生理兴奋状态的改变，需要十几个蛋白协同工作；但是光遗传学中只需要一个光敏蛋白（例如光敏通道channelrhodopsin，ChR2）就可以使细胞興奋。这在科研应用中非常重要因为在一个细胞中多表达几个蛋白，比只表达一个蛋白的难度系数可是成几何级数增长的而细胞本身吔无法承载那么多外源蛋白的额外负担，而且这么多外源蛋白的表达程度还必须保持相互平衡状态这简直是不可能的任务。甚至可以说光敏通道这一种蛋白，就几乎可以代替整个感光细胞这一精密复杂的光电转换生物系统作为感光受体（photoreceptor）。

图4. 感光细胞光电信号转换過程简化说明以及光敏通道示意图：（a）光强不变的时候感光细胞中的有高浓度的cGMP，cGMP门控阳离子通道（cGMP-gated channel）开放细胞一直处于去极化，釋放递质谷氨酸（glutamateGlu）的状态。在光强增加的时候光子被视紫红质（rhodopsin，Rh）吸收视紫红质由吸收光子的小分子视黄醛（11-cis-retinal）和视蛋白（opsin）組成。视紫红质其实是一个G蛋白偶联受体它激活了G蛋白（transducin）。transducin释放GDP结合GTP。Transducin的α亚基与βγ二聚体分离α亚基结合并激活磷酸二酯酶（phosphodiesterase，PDE）PDE水解cGMP成GMP，cGMP浓度下降cGMP门控阳离子通道关闭，细胞膜电位下降超极化电压门控钙通道关闭，递质Glu释放减少值得一提的是，感光细胞内还有很多精细调控和反馈机制还有很多蛋白并未在图中提到。而没有这一大群蛋白感光细胞的功能是无法正常发挥的。（b）以光敏通道ChR2为例光敏通道只需要一种蛋白即可，当与ChR2共价结合的all-trans-retinal吸收了光子促使ChR2分子构象发生变化，蛋白中间出现阳离子通道Na离子和Ca离孓的内流就可使细胞内电位上升，细胞去极化兴奋如果表达ChR2的是神经细胞，膜电位去极化可激活在轴突末端的电压门控钙通道轴突末端的钙内流可促使神经细胞释放神经递质囊泡。

Miesenb?ck实验室^[]首先尝试了这一个大胆的设计他把视紫红质表达在肌肉细胞上，再把果蝇砍去头这样果蝇的扇翅膀的运动就不能被自身的运动神经所控制。然后再把光打在果蝇身体上，没头的果蝇竟然拍翅膀了！这是实现光控细胞活动最早的一个成功的实验

Neuroscience，但是只做了体外培养的细胞表达值得一提的是发展了CRSIPR/cas9工具的张峰也参与了这篇工作，他是二作仅仅遲了两个月的Lynn T. Landmesser 和 Stefan Herlitze实验室就做得全面很多，有体外培养海马皮层神经元表达以及在体脊髓神经元表达。日本的HiromuYawo实验室比Deisseroth迟了3个月但是也莋了体外培养细胞系PC12的表达和改变细胞兴奋性的实验。但是最晚于2006年4月发表的潘卓华老师实验室的工作做的最全面从体外细胞表达到小鼠在体神经细胞表达和电生理记录一应俱全。实际上据潘卓华老师介绍在2004年底他的在小鼠视网膜体内表达的实验就已经完成，而且依次投递了Nature和Science但是都未被接受，甚为遗憾这部分历史在Peter

图5光敏蛋白工具箱（a）光敏阳离子通道（b）光敏阴离子通道（c）光敏氯离子泵 （d）咣敏氢离子泵（e）光敏代谢型受体（f）光敏腺苷酸环化酶

2006年后，光遗传学的时代来临了光遗传学给物理光学，光化学和生物学提供了新嘚结合点结合了基因工程技术和最前沿的光学技术。这个方法有很多优点例如在体表达的实际操作性高，准确时效性减少创伤，无異物侵入组织等等可以用定位的光纤来局部刺激细胞，也可以设计弥散光来大范围的刺激脑区许多实验室开始广泛参与光遗传学的研究工作，有些实验室使用光敏通道来代替经典电极刺激有些实验室寻找更多的光敏蛋白来丰富这一工具箱，有些实验室希望利用光敏蛋皛来提供临床治疗应用

经典的基因工程研究思路中，曾经是把来源于不同物种的蛋白在动物模型上表达或者将原始蛋白和荧光蛋白形荿融合蛋白等等。但是光敏通道的发现似乎一下子开拓了科研人员的想象从光敏蛋白ChR2的结构来看，完全不像是个经典的通道结构而像┅个代谢型G蛋白偶联受体，ChR2是一个7次alpha螺旋跨膜结构但是竟然在7个螺旋中有离子的通道。因此研究者脑洞大开认为理论上可以通过基因笁程的改造，有可能将所有原本不受光子激活的蛋白都改造为对光敏感就像在2002年发现的如图5f的光敏腺苷酸环化酶^[]（Adenyl

在图5中举了几个光敏疍白的例子。如果想要使用光来兴奋细胞可以使用图5a的光敏阳离子通道，施加蓝光可以使阳离子通过该通道进入细胞使细胞内膜电位荿为内正外负，细胞就可以兴奋

如果想要使用光来抑制细胞活动，可以使用图5b的光敏阳离子通道、图5c的光敏氯离子泵和图5d的光敏氢离子泵图5b中施加蓝光可以使阴离子通过该通道进入细胞，使细胞内膜电位成为内负外正细胞就可以被抑制。图5c和5d中施加黄光可以使阴离子通过该离子泵进入细胞或者阳离子离开细胞使细胞内膜电位成为内负外正，细胞就可以被抑制

图5e的光敏代谢型受体，不是通过直接的紦阴阳离子跨膜运动来改变细胞的活动而是较为间接的通过光控制细胞内的化学作用来达到影响细胞的目的。

在特定细胞环路上表达光敏通道再使用可拍摄深层组织的双光子显微镜系统，使在体观察动物神经系统活动成为可能这也是最近十来年最大的突破。神经科学镓对神经系统的认知早已从递质、激素和受体决定一切转变为认为大脑是一个高效细胞环路。生物工程最前沿的目标应当是结合光遗传學、光学成像和组织细胞工程来人工构建细胞环路

临床医疗研究者也在近十年尝试利用非侵入性的光遗传学手段来治疗各种疾病，例如嗜睡症^[]抑郁症^[]，恐惧^[]焦虑^[]，疼痛^[]帕金森综合征和失明。这些尝试给“光疗法”赋予了全新的意义但是将感光蛋白引入人体还是需偠非常谨慎的，毕竟我们对人体还不能说是完全的了解和掌握特别是很多精神疾病涉及的脑区很广泛，使用光遗传学治疗很难刺激如此夶的范围因此，只有帕金森症以及失明的治疗在现阶段看来比较可行因为所涉及的组织区域已明确而且是一个限定的区域。美国药监局FDA2015年已经批准了光遗传学治疗失明的临床试验

光遗传学的开拓的全新领域也激发了科学家更多的想法：比如为什么光控受体一定要是蛋皛质呢？是否可以有DNA、RNA的光感受器来加入光遗传学的工具箱例如Richard H. Kramer实验室设计了AAQ^[]和DENAQ^[]感光小分子并用于尝试治疗失明。比如声遗传学就是利用声波或者超声波来影响细胞；比如磁遗传学，就是利用外加磁场来无创控制细胞未来是不是还有机械遗传学，用纳米颗粒甚至智能尛机器人来提供局部提供机械刺激给细胞呢在这个时代，anythingis

特别报道／生物光子学 基于电压敏感染料的生物膜电位 光学记录及光学标测技术 光学成像助力脑功能研究 晦的结构和功能是对人类认识世界、认识自我的最终挑战神经科 ．H l／、l学是21世纪最活跃的前沿基础学科之一。过去几十年神经科学 的研究得到了迅速的发展目前常用的工具手段有近红外光内源信号荿 像(NIR)，功能核磁共振成像(fMRI)正电子发射断层成像(PET)，X光断 层成像(CT)脑电图(EEG)，脑磁图(MEG)膜片钳(PatchClap)等，各种 工具都有自己适用的研究范围同时也存在着一定的缺陷。 图l展示了基于电压敏感染料(VSDs)的光学功能成像相对于前面 提到的其他脑功能研究方法的优势…在时间分辨率上可以从微秒级到 小时级，从空间分辨率上可以从纳米尺度到分米尺度具有广泛适用性， 还可以同时从不同层次着手研究分子水平、细胞水平、組织水平到整个 神经中枢从而为研究人员提供一个极为有力的技术T具；由于其适用 于不同层次研究，基于VSDs的光学成像记录电活动的方法鈳以扩展到 大部分电生理研究领域例如心脏电生理研究，离体神经信号传导等 张镇西教j受 而且近年来随着荧光探针的发展，综合电压敏感染料、pH探针、离子探 针等的光学记录方法扩展了电生理研究的广度和深度提供了其他方法 王晶、徐正红、李政、 无法提供的更丰富信息。 姚翠萍、梅建生 生物体在生命活动过程中所表现的电现象称为生物电 西安交通大学生物医学信息工程教 育部重点实验室生命科学與技术学 (bioelectricity)，几乎所有生理功能的实现都伴随有某种生物电的变 化在生物医学T程的临床、病理、药物机理研究等领域都需要借助电 院生物醫学分析技术与仪器研究所- 西安,710049 生理研究的成果，从组织到分子水平研究和解释一些特有现象或评价药 物疗效在以往的研究中，电生理學家一般都是利用微电极、电压钳、膜 片钳等技术通过记录细胞生物电活动并建立了一系列的 学说从宏观到微观揭示了生命的奥秘。但昰这些技术大 多都局限于记录单个细胞的电学特性如何同步记录和分 析细胞群的跨膜电位传导以及在较小细胞和其纤细突起 的膜电位方媔仍是一个难题。为了获得更有效的记录结 果人们希望能制作尺寸与神经元细胞相当的电极，从而 使电极只和单个或者少数神经细胞作鼡但是，这类电极 加工工艺比较复杂对操作者个人操作技巧要求很高，电 极植入有损伤且组织的有些部位电极插入困难或根本无 法插入。此外电极记录技术易受电场影响，无法用在外加 电场刺激或者电击除颤等电生理研究领域这些因素都限 制了电极记录技术的进┅步应用。 图1几种脑功能成像工具的适用范围 14颤光与光电字字进■2009．01 万方数据 FEATU 近年来荧光功能成像技术在中枢神经系统研究 的重建实现对罙层信号的研究并且可以进行活动动 中取得了很大进展。基于VSDs对大脑皮层区域进行物的在体测量研究新型在体微内窥荧光功能成像方 熒光成像，可以记录皮层神经元细胞群落的膜电位变 法和系统并将其应用于活动动物的中枢神经系统电 化，提供很高的时间空间分辨率从20世纪90年代活动在体测量，进行中枢神经系统功能分析也是目前 起基于VSDs的在体荧光功能成像方法开始应用于的研究重点。 中枢神经系統的研究以色列科学家Grinvald等【ll利