题型突破(一) 图表类试题 类型一 坐标曲线类针对训练 1.[2017·达州] 下列图像不能正确反映其对应变化关系的是 ( ) 图T1-3 A.向一定质量的硫酸铜和稀硫酸的混合溶液中逐滴加入氢氧化钠溶液 B.向等质量、等浓度的稀硫酸中分别逐渐加入锌粉和铁粉 C.用等质量、等浓度的过氧化氢溶液在有无催化剂条件下制氧气 D.向┅定质量的稀盐酸中逐滴加入氢氧化钠溶液 2.[2017·通辽] 向一定量硝酸银和硝酸亚铁的混合溶液中加入锌粉,充分反应后所得溶液的质量与加入锌粉的质量关系如图T1-4所示下列说法正确的是 ( ) 图T1-4 A.a点所得固体为银和铁 B.b点所得溶液中的溶质为硝酸银、硝酸亚铁和硝酸锌 C.c点所得溶液Φ的溶质为硝酸亚铁和硝酸锌 D.d点所得固体为银、铁和锌 3.[2018·河北] 图T1-5所示的四个图像,分别对应四种过程,其中正确的是 ( ) 图T1-5 A.①分别向等质量Mg和Cu中加入足量等质量、等浓度的稀硫酸 B.②分别向等质量且足量的Zn中加入等质量、不同浓度的稀硫酸 C.③分别向等质量且 压缩包中的资料: 2019年Φ考化学(鲁教版)二轮专题复习(课件+练习):题型突破9套\题型突破01 图表类试题.docx 2019年中考化学(鲁教版)二轮专题复习(课件+练习):题型突破9套\题型突破01 图表类试题.pptx 2019年中考化学(鲁教版)二轮专题复习(课件+练习):题型突破9套\题型突破02 化学与生活.docx 2019年中考化学(鲁教版)②轮专题复习(课件+练习):题型突破9套\题型突破02 化学与生活.pptx 2019年中考化学(鲁教版)二轮专题复习(课件+练习):题型突破9套\题型突破03 综匼实验题.docx 2019年中考化学(鲁教版)二轮专题复习(课件+练习):
本协议描述了一种新的识别去核紅细胞正色由多光谱成像流式细胞仪以提供红细胞去核过程的可视化的群体的方法。
红细胞生成哺乳动物总结了眼球摘除的戏剧性过程结果在网织红细胞的形成。眼球摘除的机制尚未完全阐明学习去核红细胞显微镜中的关键蛋白和结构的本地化时遇到的一个常见问题昰,观察细胞进行眼球摘除足够数量的难度我们已经开发了一种新的协议分析使用流量多参数高速细胞成像(多光谱成像流式细胞仪),结合免疫荧光流式细胞仪中为了确定有效的一个显著号码去核的事件的方法,它允许获得测量和进行统计分析
首先,我们在这里描述以便用于同步小鼠红细胞和增加捕获眼球摘除在日的概率两人在体外培养红细胞生成方法评估电子时间。然后我们详细描述了为了眼球摘除由多光谱成像流式细胞仪过程中,研究细胞内蛋白质或脂质筏的本地化固定和透后红细胞的染色随着尺寸和它们用来识别正色紅细胞DNA/Ter119染色,我们利用在明视场通道辅助在识别细长细胞和“三角形的质心的XY Ter119/Draq5的小区的参数”纵横比“ “允许的细胞事件,其中TER119染色(噺生网织红细胞)的中心相距甚远DRAQ5染色(细胞核进行挤压)的中心鉴定因而指示一个即将去核细胞。的正色红细胞种群具有高增量的质惢和低纵横比的子集被高度富集在去核细胞
在哺乳动物中红细胞系内终末分化的结论与去核的戏剧性的过程,通过该正色红细胞排出其膜包裹的核(pyrenocyte)1产生一个网织红细胞2。这个过程的确切机制这也是成功的限速步骤,大规模生产的红血细胞在体外 还没有完全阐明。去核红细胞内关键的蛋白质和结构的定位依赖于使用荧光显微镜和电子显微镜3-5这个繁琐的过程通常会导致的眼球摘除活动数量有限的識别,并且不总是允许有意义的统计分析扩大对红细胞鉴定麦格拉思等 6前面所述的方法,我们已经开发了一种新的由多光谱伊马确定和研究眼球摘除事件的方法更改流式细胞仪(多参数高速细胞成像中流动它结合了荧光显微镜与流式细胞术的方法)7,它可以提供的观测足够数量以获得测量值并执行统计分析。
在这里我们描述了前两个在体外培养红细胞生成为了同步红细胞和增加捕获眼球摘除在评估時的概率使用的方法。然后我们详细描述了为了眼球摘除由多光谱成像流式细胞仪中,研究细胞内蛋白质或脂质筏的本地化固定和透后紅细胞的染色
样品上的成像流运行流式细胞仪和将收集的细胞的门控适当地识别正色红细胞6。正色红细胞然后根据它们的纵横比进行汾析,测得在明场图像进行更改对他们的参数增量的质心的XY TER119-DNA,其被定义为分别染色TER119和DNA的区域中中心之间的距离值。细胞低高宽比和高彡角形质心的XY -遗传背景和多光谱成像流这种新型分析仪的协议我们最近表明,眼球摘除类似于非对称细胞分裂并通过外消旋GTP酶在调节蔀分的肌动球蛋白环的形成是眼球摘除进展7重要。
1长期体外培养红细胞生成( 体外红系分化培养议定书Giarratana 等。8修改和调整鼠标电池)
这昰一个三步骤的长期体外红细胞生成协议。在第一步骤(天0-4)2×10 5个细胞/ ml被放置在补充有干细胞因子(SCF)白细胞介素-3(IL-3),和促红细胞生荿素(EPO)的红细胞的生长培养基在第二步骤(天5-6),将细胞重新悬浮于2×10 5个细胞/ ml和共培养的贴壁基质细胞(MS5)在新鲜红细胞生长培养基Φ只用Epo的补充在第三步骤(天7-9),细胞是在一层的MS-5细胞在新鲜红细胞生长培养基的无细胞因子高达摘除术( 图1A)中培养
所有动物的协議已获的机构动物护理和使用委员会(IACUC)辛辛那提儿童医院医疗中心。
2快速摘除术含量,据Yoshida 等人描述的协议12与修妀(图1B)
3,红细胞的染色对细胞内蛋白质或脂筏的本地化过程中摘除由多光谱成像流式细胞仪
首先,电池是基于他们的明场长宽比(他们的未成年子女与他们的长轴长度之比)和明场区(指示其规模大小)进行分析具有比20一个奣视场角值的情况下和高于200事件大多是碎片和细胞聚集体,分别与被排除在分析( 图2A)单细胞(门“R1”),然后分析了基于他们对梯度RMS參数它表示图像的锐度值。门“R2”是创建一个包含细胞与梯度RMS值超过了50 个百分位以选择对焦( 图2B),以及拍摄的图像细胞,然后根據它们的大小门作为他们的明场区测量并依TER119荧光染色平均像素参数测量他们的积极性的红标记TER119(门“TER119阳性”, 图2C)细胞非常低或非常高TER119,要么非红细胞系或剩余的细胞聚集体分别与被排除在分析之外。在接下来的步骤中细胞根据它们的DRAQ5纵横比强度(轻微的相对于它們的细胞核的长轴强度之比)和DRAQ5( 图2D)的强度选定。 DRAQ5阴性细胞(主要是去核细胞如网织红细胞和红细胞),以及细胞具有低DRAQ5纵横比(主偠是双峰)被排除在分析之外 DRAQ5阳性细胞(栅极“DNA阳性”,主要是红细胞在这一点上)然后进行分析的基础上他们的TER119区域,这表明细胞嘚大小并且他们的TER119平均数像素/区域(TER119表达的密度),这表明该亮度TER119染色正色红细胞(门“OrthoE”)被认定为小,TER119 喜细胞( 图2E)最后,orthochro的亞群马蒂奇红细胞高度富集在去核细胞的特点是低明视宽高比这是一种测定细胞伸长的,通过在明视场通道的细胞图像M01并且通过高德爾塔质心的XY TER119的短轴/长轴的比值计算/ DRAQ5,这是由初始TER119 +网织红细胞和DRAQ5 +核(栅极如图2F“去核细胞”)的中心的中心之间的距离限定
随着抗体抗TER119和DNA染色DRAQ5,细胞也被染色的丝状肌动蛋白(F-肌动蛋白)与荧光鬼笔环肽中幼红细胞眼球摘除7来评估F-肌动蛋白的定位值得注意的是,去核的级數可以可视化在固定的细胞如细 ??胞减少的纵横比( 即逐渐拉长的)和增加增量质心的XY Ter119/Draq5被观察到( 图由图3)。 F-肌动蛋白是观察集中在眼球摘除在分裂沟然后消散,一旦核被挤压此外,共定位的肌动蛋白和肌球蛋白在初期的网织红细胞和细胞核之间的卵裂沟可以通过後流式细胞共染色WT红细胞为pMRLC(磷酸化肌球蛋白调节轻链)和F-肌动蛋白7的多光谱成像流来证明
其它蛋白质和感兴趣的结构也可与合适的抗體或荧光标记物染色以允许去核过程中的作用成像研究。偏振光微管形成可见于WT正色红细胞之前眼球摘除但不与秋水仙素( 图4A)处理红细胞微管蛋白聚合的秋水仙素的抑制作用减弱细胞极化,具体表??现为测量CEN之间的参数三角形质心的XY BF/Draq5之三见于明视信道取得与DRAQ5( 图4B)嘚核染色的中央细胞体。
利用野生型或外消旋-缺陷(遗传或药理操纵后)红细胞在流式细胞仪演示Rac的GTP酶的去核的作用使成像研究多光谱成潒流外消旋GTP酶调节至少部分地形成的肌动球蛋白环,以及在初期的网织红细胞和pyrenocyte 7之间的沟脂筏的汇合处
图1:以生产为研究去核红细胞Φ使用的红细胞在体外协议原理演示。 A.长期体外培养红细胞生成initiat教育署从LDBM或林-细胞B.由脾细胞高度富集红细胞应激诱导红细胞在体内被放血後开始快速眼球摘除法
感兴趣的人群的图2数据使用特定的成像流分析软件流式细胞仪分析。连续浇注显示在面板自动对焦括号中的数芓表示相应的母体的近似百分比,在该实验中R1人口A.初始浇口去除细胞团块和细胞碎片。B.栅极R2出的R1包括已经清楚地成像的细胞不含失焦嘚细胞。C.
TER119阳性细胞(列R2中)被选中不含细胞的,要么是阴性的TER119或者是过于强烈因为他们在聚集存在染色。D.
DNA阳性细胞(出TER119阳性细胞)被選中密谋宽高比强度与核染色强度后(这里DRAQ5读通道5)。E.的DNA和TER119阳性细胞是基于在TER119平均数像素与TER119区域其位置选通到嗜碱嗜多和正色红细胞(这里读入信道3),如先前由麦格拉思等 5所示
F的去核细胞是那些细胞出了正色红细胞,具有低纵横比(细胞elongat的测量离子在明场(BF)信道)和高三角洲质心的XY Ter119/Draq5形成TER119 +网织红细胞和核中心的中心之间(距离)这项研究最初发表于血型:Konstantinidis的DG,Pushkaran S
等信号,并在去核红细胞血细胞骨架的要求 2012,119(25):由美国血液学会
图3去核红细胞与逐步增加三角洲质心的XY Ter119/Draq5。WT鼠标正色红细胞沾上TER119-PECy7,鬼笔环肽-AF488和D 代表图像raq5,按他们的縱横比和增量质心的XY Ter119/Draq5门控细胞被固定显示在眼球摘除的不同,连续的阶段用对应于减小的纵横比,增加三角形心的XY
Ter119/Draq5(黄色栅内绿十字表示成像在右侧的单元格的位置)的级数在细胞图像从上到下,F-肌动蛋白可以眼球摘除集中在卵裂沟然后消散,一旦核被挤压(如显礻在单元格#4782在较低的图像)中可以观察到
图4。形成一个单极微管装配和极化orthochroma的抽动红细胞先摘除术
A.极性微管形成可见在对照WT红细胞(用抗-β-微管蛋白-AlexaFluor-488和核染色DRAQ5),而β-微管蛋白被漫染在6小时孵育秋水仙素(5μM)的红细胞在快速体外去核测定1.2多光谱成像流式细胞仪可鉯通过参数德尔塔质心的XY
BF/Draq5,其测量细胞体的中心之间的距离的分布的分析提供了细胞极化的定量评价在明场取得了与DRAQ5(在嵌入示意图)核染色的中心看到。秋水仙素处理后野生正色红细胞三角洲重心BF/Draq5值在统计上比对照三角洲质心BF/Draq5值(P <0.001)显著不同这项研究最初发表在布鲁D:。Konstantinidis的DGPushkaran S,
等信号并在去核红细胞细胞骨架的要求血 。 2012119(25):由美国血液学会
近年来红细胞去核的研究已经获得了越来越多的动力,因為它是在步骤在体外红细胞生成培养物是最困难的以实现成功的,大规模生产的红血细胞在体外有效地重现直到最近,红细胞去核的研究主要是利用荧光显微镜和流式细胞仪的方法荧光显微镜的方法,虽然在确定参与分子有帮助的需要显微镜观察,以确定一个小数目正色红细胞数百个细胞固定于在特定时间点内进行眼球摘除天流式细胞术的方法,在另一方面是在评价眼球摘除在培养的速率,以忣药物或基因操纵特定分子的这个过程的影响非常有帮助的但不能提供对intracellul任何数据这些分子的芳定位。
多光谱成像流式细胞仪结合流式細胞术和免疫荧光显微术的优点因为它允许快速采集两流式细胞仪和数千个细胞的形态学数据。这是一个显著的优势与传统流式细胞仪紅细胞生成研究因为红细胞分化的不同阶段(proerythroblasts,嗜碱性嗜多染红,并正色)一直在使用形态学标准6定义然而,多光谱成像流式细胞儀是最佳??的蜂窝结构而不是在人口数量相对定量比较的可视化。对于这样的比较常规流式细胞术,不需要用于胞内结构的免疫所必需的透化步骤执行得更好例如BasoE的相对百分比:主体的多:OrthoE 图2E中>不对应的2点04分08秒的生理比率,因为成熟的红细胞是透化步骤更敏感并茬染色过程中被优先丢失。
成像数据可与流式细胞术数据关联使用特定的成像流式细胞仪的分析软件使细胞与门中的特定形态特征的集匼来处理。约百去核细胞可内为10,000红细胞具有在快速和有效的方式7以上所述的分析方法的人口被识别从而允许更多有意义的观察和统计评估。
此外图像处理变得容易与特定的成像流分析仪软件允许这样的特性作为德尔塔质心的XY定量分析, 例如细胞核的相对位置通过学习这鈳以被用作偏振的测量细胞质中
协议和故障排除中的关键步骤
这是众所周知的,即使是温和移液可能导致网织红细胞和pyrenocyte 12的分离这有可能严重地限制了成像眼球摘除事件的数目。因此必须小心,起重红细胞结合到MS5细胞在培养时尤为如此
固定用甲醛溶液可引起改动的下降导致特异性抗体结合和/或增加的非特异性抗体结合的表面标志物的细胞外区域。成像流程的一个优点仪是表面染色可视化其质量可以這样进行评估。而不是统一的点缀染色丰富的表面标志物,如TER119表示overfixation应通过降低formalde的组合来解决海德浓度和固定持续时间较短。
下面固定冰上保持细胞至少15分钟是至关重要的,以便在通透过程中以防止多余的细胞破损由于温度的差异。虽然丙酮通透性保持脆弱晚期红细胞系比洗涤剂介导的透化更好其中100%丙酮是必需的步骤会导致明显的,但不是有害的损失的细胞。在结束时用冷FACS缓冲液洗涤后,将細胞在室温下的抗孵育步骤
成像流式细胞仪具有流量的设定速率(细胞/秒),这取决于所使用的透镜(速率降低的放大率增加)以下測量之前最后一次洗涤时,建议该细胞沉淀重新悬浮于小体积(50?60微升)以加速样品的处理。对于大量的重采样QUIRE运行时间长(超过30分钟)样品应保持在冰上。
本公司长期眼球摘除法提供了一个扩展的类红细胞的生产效益以产生足够的细胞,它可以在眼球摘除阶段收集潒免疫生化评估和下拉功能快速摘除术测定法给出的时间,只需要2天进行了益处,虽然鼠标需要在实验前4天进行phlebotomized我们并没有观察到這两种方法之间眼球摘除效率有显著差异。值得注意的是流式细胞术评价,它不需要必需的胞内结构的免疫荧光透化步骤如7之前描述嘚,最适合的去核效率的定量评价
该方法描述在这里UTIlizes诱导应力红细胞在体内和培养在含有为了扩增类红细胞群体和他们在去核的阶段同步氢化可的松在体外培养基中。这两个条件可能模仿在压力下红细胞眼球摘除。另外氢化可的松显著增加红细胞产量和存活率。要获嘚类似的收益率从起源于野生型小鼠与稳态红细胞生成和培养无氢化可的松(从而避免同步)的骨髓细胞去核的事件我们需要培养细胞從多个鼠标和运行,并通过多处理更大量的事件光谱成像流式细胞仪虽然多光谱成像流使用放大倍率透镜高达60倍的加速仪极大相比,免疫荧光显微镜采集的形态学数据通过成像所获得的观察结果的比较,与经典的Z堆叠仪流动和共聚焦显微镜图像是有价值的,得到更好嘚细节因为在物镜的显微镜可以提供放大倍数高达100倍和Z堆叠图像得到的结构的三维印象,这是无法实现的通过成像流式细胞仪在同一细胞相对高数量收集在流式细胞术实验中的多光谱成像流类似的细胞,在一个随机的方向部分地补偿这种限制,允许从不同的视点观察
作者宣称没有竞争的财务权益。
致谢研究流式细胞仪核心在辛辛那提儿童医院研究基金会和理查德德马科Sherree朋友,和斯科特末底改从Amnis公司(EMD Milllipore的一部分)的专家技术支持这项工作是由美国国立卫生研究院赞助授予K08HL088126和R01HL116352(TAK)和P30 DK090971(YZ)。
题型突破(一) 图表类试题 类型一 坐标曲线类针对训练 1.[2017·达州] 下列图像不能正确反映其对应变化关系的是 ( ) 图T1-3 A.向一定质量的硫酸铜和稀硫酸的混合溶液中逐滴加入氢氧化钠溶液 B.向等质量、等浓度的稀硫酸中分别逐渐加入锌粉和铁粉 C.用等质量、等浓度的过氧化氢溶液在有无催化剂条件下制氧气 D.向┅定质量的稀盐酸中逐滴加入氢氧化钠溶液 2.[2017·通辽] 向一定量硝酸银和硝酸亚铁的混合溶液中加入锌粉,充分反应后所得溶液的质量与加入锌粉的质量关系如图T1-4所示下列说法正确的是 ( ) 图T1-4 A.a点所得固体为银和铁 B.b点所得溶液中的溶质为硝酸银、硝酸亚铁和硝酸锌 C.c点所得溶液Φ的溶质为硝酸亚铁和硝酸锌 D.d点所得固体为银、铁和锌 3.[2018·河北] 图T1-5所示的四个图像,分别对应四种过程,其中正确的是 ( ) 图T1-5 A.①分别向等质量Mg和Cu中加入足量等质量、等浓度的稀硫酸 B.②分别向等质量且足量的Zn中加入等质量、不同浓度的稀硫酸 C.③分别向等质量且 压缩包中的资料: 2019年Φ考化学(鲁教版)二轮专题复习(课件+练习):题型突破9套\题型突破01 图表类试题.docx 2019年中考化学(鲁教版)二轮专题复习(课件+练习):题型突破9套\题型突破01 图表类试题.pptx 2019年中考化学(鲁教版)二轮专题复习(课件+练习):题型突破9套\题型突破02 化学与生活.docx 2019年中考化学(鲁教版)②轮专题复习(课件+练习):题型突破9套\题型突破02 化学与生活.pptx 2019年中考化学(鲁教版)二轮专题复习(课件+练习):题型突破9套\题型突破03 综匼实验题.docx 2019年中考化学(鲁教版)二轮专题复习(课件+练习):