生命奥秘；5.http://brainwindows.wo；6.TheNobelPrizeinChemist；7.RogerTsien.(2007)Roger；Tsien.InterviewbyRuthWil；二、GFP在生命科学研究中的应用；1.GFP在蛋白质相互作用研究中的应用；在活体内检测蛋白与蛋白相互作用，对我们理解
生命奥秘 5. //2008-nobel-prize-in-chemistry-to-gfp/6. The Nobel Prize in Chemistry 2008, The Royal Swedish Academy of Sciences, 1-7. www.kva.se7. Roger Tsien. (2007) Roger Tsien: bringing color to cell biology. A passion for chemistry, color, and conversations with cells is what drives Roger Tsien. Interview by Ruth Williams, , 179 (1):6-8.二、 GFP在生命科学研究中的应用1. GFP在蛋白质相互作用研究中的应用在活体内检测蛋白与蛋白相互作用，对我们理解生物学过程至关重要。研究蛋白质相互作用的经典技术是酵母双杂交系统。它是一个基于转录因子模块结构的遗传学方法，由Fields和Song等人于1989年首次建立，随后在蛋白相互作用研究领域广泛应用。酵母双杂交系统的实验过程，就是将已知蛋白作为诱饵蛋白，在系统中捕获与其相互作用的蛋白质。来源于水母的GFP在此系统中得到了广泛应用，人们可用它直接监测蛋白质与蛋白质的相互作用。科学家利用两个增强型GFP（EGFP）片段重建功能，从而开发出一种新型的报告系统以应用于酵母双杂交系统。该系统在基因水平上将EGFP片段分别与诱饵蛋白及要捕获的蛋白融合，在体内共表达，从而研究蛋白与蛋白间的相互作用。与现有的酵母双杂交系统相比，EGFP系统中的诱饵、靶蛋白载体的报告基因和复制控制元件均得到了改进。在酵母中，当蛋白与蛋白发生相互作用时，分开的EGFP能够重新结合而发出荧光（图7）。图7 EGFP作为报告蛋白的酵母双杂交系统原理示意图。EGFP的N-末端和C-末端分别与诱饵蛋白（已知蛋白）和靶蛋白融合表达。当诱饵蛋白与靶蛋白发生相互作用，荧光发色团就被拉近，EGFP就发出荧光。图片来源：The Protein Journal1.1 构建分离的EGFP报告质粒以分离的EGFP作为酵母双杂交系统的报告基因有明显的优势，因为它不需要外源底物及辅助因子就能发出荧光。从理论上讲，该报告系统的基础是酵母中蛋白与蛋白间发生相互作用后，被分开的荧光蛋白片段会再次互相结合从而发出荧光。EGFP报告质粒包括pNEGFP和pCEGFP。构建模式见图8。在乙醇脱氢酶1（ADH1）启动子控制下，诱饵蛋白质粒编码的EGFP N-末端（NEGFP, 1-158位氨基酸）及靶蛋白质粒编码的EGFP C-末端（CEGFP, 159-239位氨基酸）能够被组成型表达，其转录被ADH1终4止子序列终止。构建的EGFP报告质粒pNEGFP和pCEGFP分别为色氨酸和亮氨酸选择性，并且它们都是携带有低拷贝数起始位点（CEN6/ARS4起始位点）的着丝粒质粒。这些低拷贝数的质粒降低了蛋白表达水平，从而解决了酵母细胞中的蛋白毒性问题。为了克隆操作的方便，在质粒的多克隆位点（MCS）还引入了BamH I、Sal I及Pst I等其它克隆位点。另外，为了评价周围的结构域会否会产生空间位阻效应，研究人员还分析了由多种不同方法构建的EGFP报告系统，进行构象优化。下文将以酵母GAL4DD与GAL11P的相互作用为例，说明该系统的功能。图8 含有EGFP N-末端的诱饵质粒和含有EGFP C-末端的靶蛋白质粒的构建。这些报告质粒被命名为pNEGFP和pCEGFP。在乙醇脱氢酶1（ADH1）启动子控制下，诱饵蛋白质粒编码的EGFP N-末端及靶蛋白质粒编码的EGFP C-末端能够被组成型地表达，其转录被ADH1终止子序列终止。几个独特的限制性酶切位点已列出。EcoR I的酶切位点为GAA TTC。PADH1：ADH1启动子；NEGFP：编码EGFP N-末端的基因；CEGFP：编码EGFP C-末端的基因；MCS：多克隆位点；TADH1：ADH1终止子；TRP1：编码色氨酸生物合成蛋白的基因；LEU2：编码亮氨酸生物合成蛋白的基因；Col E1 ori：Col E1起始位点；Ampr：氨苄青霉素抗性基因；CEN6/ARS4 ori：CEN6/ARS4起始位点。（图片来源：The Protein Journal）1.2 以分离的EGFP为报告系统的酵母双杂交系统为了验证当酵母中的蛋白间发生相互作用时，被分离的EGFP会互补结合，研究人员以GAL4DD作为诱饵蛋白，GAL11P作为靶蛋白进行了实验。在蛋白与蛋白相互作用的研究中，经常使用这两种蛋白作为对照。实验中，研究人员将含有GAL11P的pCEGFP质粒（pCEGFP:GAL11P）与包含GAL4DD的pNEGFP:GAL4DD质粒一起转入酵母细胞，这样酵母就会含有pCEGFP:GAL11P和pNEGFP:GAL4DD两个质粒，这两个质粒均可用于研究荧光重建。另外，由于EGFP片段（NEGFP和CEGFP）的空间位阻效应可能会影响到荧光发色基团的形成，为了确定合适的融合蛋白空间结构，研究人员构建了不同组合的EGFP报告质粒，它们能够表达不同的EGFP片段组合（图9）。将NEGFP和CEGFP融合载体转入YM4217酵母中（该酵母是ura3-52、his3-200、leu2-3和trp1-901突变株），同时添加Ura、His、Leu和Trp。为了确定酵母细胞是否含有相应的质粒，采用表1中NEGFP和CEGFP融合蛋白特异引物进行PCR扩增。得到的PCR产物经1%琼脂糖电泳分离后，分别得到594bp（1N-5N）、474bp（6N）、513bp（1C-4C, 6C）、243bp（5C）的扩增产物。如图10a所示，相应的594bp（1N-5N）、474bp（6N）、513bp（1C-4C, 6C）、243bp（5C）PCR产物只存在于转入后的酵母中，不存在于用作对照的YM4217酵母中，这说明在酵母双杂交系统中可以使用不同的选择标记。5
生命奥秘 为了确定酵母双杂交系统能否产生荧光，研究人员在共聚焦显微镜下观察表达NEGFP和CEGFP融合蛋白的YM4271酵母。计数发出荧光的酵母细胞后，他们发现在不同的NEGFP和CEGFP构建方式下，荧光重建效率不同，说明空间效应会影响荧光蛋白的互补结合。如图10b所示，以全长EGFP作为阳性对照，荧光重建率（R/E）为67%；而阴性对照，即未转染的酵母细胞根本不发出荧光。表2总结了相关的荧光重建率百分比。设定酵母细胞转染效率为100%，另外还评估了分离的EGFP相对于阳性对照的重建率百分比，数据为三个独立样品的平均值。如图10b和表2所示，以pNEGFP和pCEGFP两个空载体转染作为空白对照，EGFP重建率为14.9%。NEGFP:GAL4DD与CEGFP:GAL11P发生相互作用（图9组合1），与EGFP阳性对照相比，EGFP重建率达到40.1%。与此形成鲜明对比的是，NEGFP:GAL4DD与GAL11P:CEGFP融合蛋白的重建率只有19.4%（图9组合2）。正如预料一样，NEGFP:GAL4DD与pCEGFP空载体（图9组合5）不会发生相互作用，作为非特异性对照，其与空白对照（空载体，NEGFP+CEGFP）重建效率相当。pNEGFP空载体与pCEGFP:GAL11P质粒（图9组合6）共转染的重建效率也相当低，只有17.9%，并且不会发出荧光。此外，GAL4DD: NEGFP融合蛋白无论与CEGFP:GAL11P还是GAL11P: CEGFP（图9组合3、4）的重建效率都很低，分别为19.4%和13.4%，都不会发出荧光。这些发现表明，分子结构造成的空间位阻效应使得荧光沉积失败。研究证明，如果NEGFP和CEGFP分别在诱饵蛋白和靶蛋白的N-末端就不会产生严重的空间位阻，从而形成荧光团发出荧光。诱饵蛋白ac结合1gd24fh53ik靶蛋白ebmjonlp6图9 NEGFP和CEGFP构建示意图。构建NEGFP和CEGFP六种组合的质粒。灰色框：NEGFP；黑色框：GAL4DD；阴影线框：CEGFP；白色框：GAL11P；1-6，组合1-6。（图片来源：The Protein Journal）6表1 图9所用的引物引物编号abcdefghijklmnop引物序列CCC AAG CTT ATG GTG AGC AAG GGC GAGGGA ATT CCT GCT TGT CGG CCA TGGGA ATT CGG AGG AGG AGG AGA ATC AAG GCT AGA AAGCGG GAT CCT CAA AAT AAT CCT GTT AACCCC AAG CTT ACT AGT GAA TCA AGG CTA GAAGGA ATT CAA ATA ATC CTG TTA ACGGA ATT CGG AGG AGG AGG AAT GGT GAG CAA GGG CGA GCGG GAT CCT TAC TGC TTG TCG GCC ATGCCC AAG CTT AAG AAC GGC ATC AAG GCGG AAT TCC TTG TAC AGC TCG TCC ATGGGA ATT CGG AGG AGG AGG ACC TCA ACA GCA GCA AAT GCGG GAT CCT CAC AAA GCT TGG ATT TTT CCCC AAG CTT ACT AGT CCT CAA CAG CAG CAAGGA ATT CCA ATG CTT GGA TTT TTCGGA ATT CGG AGG AGG AGG AAA GAA CGG CAT CAA GGCGG GAT CCT TAC TTG TAC AGC TCG TC资料来源：The Protein Journalb未传染的酵母细胞
EGFP载体（pNEGFP+pCEGFP）a2N
C图10 （a）PCR法验证酵母转化株。PCR产物用含有0.5ug/ml的溴化乙锭的1%的琼脂糖电泳分离。1-6，含有NEGFP和CEGFP融合蛋白（如图9）的转化株。N：NEGFP融合质粒；C：CEGFP融合质粒；M：分子量标准。（b）EGFP为报告蛋白的酵母双杂交实验。通过检测产生荧光的酵母细胞来确定与NEGFP和CEGFP融合的蛋白间的相互作用。以未转染的酵母细胞作为阴性对照，全长EGFP作为阳性对照，同时转染两个空载体pNEGFP和pCEGFP作为背景对照。1-6为按照图9进行的6种配对组合。（图片来源：The Protein Journal）7
生命奥秘 表2 不同NEGFP和CEGFP融合蛋白组合的相对重建效率百分比组合相对重建效率百分比NT0EGFPVector140.13.0014.9NT：未转染；EGFP：阳性对照；Vector：空白对照；1. NEGFP:GAL4DD+CEGFP:GAL11P；2. NEGFP:GAL4DD+GAL11P:CEGFP；3. GAL4DD:NEGFP+CEGFP:GAL11P；4. GAL4DD:NEGFP+GAL11P:CEGFP；5. NEGFP:GAL4DD+CEGFP； 6. NEGFP+CEGFP:GAL11P。资料来源：The Protein Journal总之，在以EGFP为报告基因的酵母双杂交系统中，当诱饵蛋白与靶蛋白相互作用时，被分开的EGFP就会重建，其原有的荧光特性得以恢复，而且能够快速直接地监测到这种相互作用。该系统有三方面的优势：第一，EGFP报告基因既不需要外源底物也不需要任何辅助因子；第二，该系统采用低拷贝数质粒，减少了细胞毒性；第三，这些转录因子可被用作诱饵蛋白。参考文献1. Kyoungsook Park, So Yeon Yi, Chang-Soo Lee, et al. (2007) A Split Enhanced Green Fluorescent Protein-Based Reporter in Yeast Two-Hybrid System, The Protein Journal, 26(2): 107-116.小词典组成型表达生物只有适应环境才能生存。当周围的营养、温度、湿度、酸度等条件变化时，生物体就要改变自身基因表达状况，以调整体内执行相应功能蛋白质的种类和数量，从而改变自身的代谢、活动等以适应环境。生物体内的基因调控各不相同，仔细观察基因表达随环境变化的情况，可以大致把基因表达分成两类。 (1) 组成型表达（constitutive expression）组成型表达，指基本不因环境变动而改变的一类基因表达。其中某些基因表达产物是细胞或生物体整个生命过程中都持续需要而必不可少的，这类基因可称为看家基因（housekeeping gene），在这些基因中有不少是在生物个体的其它组织细胞，甚至是在同一物种的细胞中持续表达的，也可以把它看成是细胞基本的基因表达。但是，组成型基因表达也不是一成不变的，其表达强弱同样受到一定机制的调控。(2) 适应性表达（adaptive expression）适应性表达，指环境的改变容易使其表达水平变化的一类基因表达。因环境条件变化基因表达水平增高的现象称为诱导（induction），这类基因被称为可诱导型基因（inducible gene）；相反，随环境条件变化而基因表达水平降低的现象则称为阻遏（repression），相应的基因被称为可阻遏基因（repressible gene）。8三亿文库包含各类专业文献、应用写作文书、文学作品欣赏、行业资料、专业论文、高等教育、生活休闲娱乐、78绿色荧光蛋白的应用及其最新研究进展等内容。　
　1.1.2 GFP 研究应用 在生物学研究中, 科学家们更多的是利用这种能自己发光...查阅文献了解并学习了绿色荧光蛋白基因(GFP)相 关特性和研究进展,巩固理论知识的... 　绿色荧光蛋白的应用及其最新研究进展一、 二、 关键词: 背景绿色萤光蛋白、酵母双杂交系统、流式细胞仪、下修村、马丁?查尔菲、钱永健 2008 年 10 月 8 日,... 　绿色荧光蛋白的研究进展及应用姜丽 摘要:源于多管水母属等海洋无脊椎动物的绿色荧光蛋白(GFP),是一种极具应用潜力的标记物,有着极其广泛的应用前景。绿色荧光蛋白... 　作为一种新的报告基因,GFP在生物学研究中得到广泛的应用。利用绿色荧光蛋白独特的发光机原 理,可将GFP作为蛋白质标签,利用DNA重组技术将目的基因与GFP基因构成融合... 　绿色荧光蛋白 GFP 的研究与应用 中国?长春 2013 年 12 月 东北师范大学细胞实验论文 绿色荧光蛋白 GFP 的研究与应用摘要:绿色荧光蛋白(GFP)是一种极具潜力的... 　(GFP)在肿瘤及干细胞研究中的应用――鼓楼医院肿瘤中心 GFP 绿色荧光蛋白的应用前景 绿色荧光蛋白的应用及其最新研究进展 GFP 荧光蛋白的应用概述 现科院生技 1102... 　绿色荧光蛋白在转基因动物中的应用_生物学_自然科学...和胚胎干细胞技术的出现为小鼠基因组操作引进了新的...流行色荧光基因研究进展【J】,生物学杂志,2000 李... 　【实验目的】 研究绿色荧光蛋白(Greed Fluorescent Protein,GFP)基因的基因 克隆...[2] 贾艳华,李国勋,张杰 荧光蛋白及其应用 [3] 魏春红,李毅主编 聚合酶链...生物在线声明：以上所展示的信息由企业自行提供，内容的真实性、准确性和合法性由发布企业负责。生物在线对此不承担任何保证责任。
供应商联系卡
Biovector Co.,LTD
北京市西直门外大街19号BioVector NTCC典型培养物保藏中心
免费电话:400-800-2947 北京分公司:010-.
所在区域：
北京?海淀区
扫一扫，关注我们
产品详细描述
Biovector Science Lab, IncNo.19,Xizhimen,Beijing,ChinaTel:&&&&&&&&& 400-800-2947
Product List
Description
NTCC-YM4271
YM4271strain. 500uL. Storage:4℃
Classification
Saccharomycetes,Saccharomycetidae,Saccharomycetales,Saccharomycetaceae,Saccharomycetaceae,Saccharomyces,cerevisiae
Strain Designations
Alternate State
CandidarobustaDiddensetLodder
Application
transformationhost
transformationhostforselectingDNAbindingsiteswithcolonysectoringassay
MATaura3-52his3-delta200ade2-101lys2-801leu2-3leu2-112trp1-901gal4-delta512gal80-delta538ade5::hisG
Mating Type
Growth Conditions
Temperature:25.0&C
1.Obtain an YPD plate.
2.Usinga sterilepipettetip,touchtheyeastgrowingwithinthepuncturedareaofthestabculture.(Asterilizedwirelooporsteriletoothpickcanbeusedinplaceofasterilepipettetip.)
3.Run this tip lightly over a section of the plate, as shown inthe figure, tocreate streak #1.
4.Usinganothersterilepipettetip,passthroughstreak#1and spread the bacteria over a second section of the plate, tocreate streak#2.
5.Usinga thirdsterilepipettetip,passthroughstreak#2andspreadthebacteriaoverthelastsection of the plate, to create streak#3.
6.Growin a30oC incubator(unlessadifferentgrowthtemperatureisindicatedontheplasmid
datasheet).
7.After 24-48hincubation, single colonies should be visible. If the yeast growth is too dense,re-streak onto a new YPD plate to obtain single colonies.
生物在线声明：以上所展示的信息由企业自行提供，内容的真实性、准确性和合法性由发布企业负责。生物在线对此不承担任何保证责任。
查看 YM4271酿酒酵母菌株酵母单杂交配套菌株 产品的用户还对以下产品感兴趣
&&&&[供应商：上海柯雷生物科技有限公司]
&&&&[供应商：上海柯雷生物科技有限公司]
&&&&[供应商：上海柯雷生物科技有限公司]
&&&&[供应商：上海柯雷生物科技有限公司]
&&&&[供应商：上海柯雷生物科技有限公司]
&&&&[供应商：上海柯雷生物科技有限公司]
&&&&[供应商：上海柯雷生物科技有限公司]
&&&&[供应商：上海柯雷生物科技有限公司]
&&&&[供应商：上海柯雷生物科技有限公司]
&&&&[供应商：上海柯雷生物科技有限公司]
ADVERTISEMENT
找不到您所需的产品，发布求购试试？
请填写所需产品描述您是不是在找：
买家还在看：
当前位置：
￥1920 元/个
关注行业资讯
酿酒酵母/毕赤酵母表达载体质粒图谱序列抗性表达菌株感受态现货
detail3e达人选购￥28.00￥30.00￥20.00￥3600.00￥8.00
detail3e周边优质供应商河南省郑州市广东省广州市湖北省武汉市广东省广州市
同参数产品
同参数产品
加工定制：
同参数产品
同参数产品
慧聪网厂家Biovector NTCC质粒载体菌种细胞基因保藏中心为您提供酿酒酵母/毕赤酵母表达载体质粒图谱序列抗性表达菌株感受态现货的详细产品价格、产品图片等产品介绍信息，您可以直接联系厂家获取酿酒酵母/毕赤酵母表达载体质粒图谱序列抗性表达菌株感受态现货的具体资料，联系时请说明是在慧聪网看到的。
detail3e相关商品推荐￥28.00￥30.00￥20.00￥3600.00￥8.00￥11000.00￥6.00￥15.00热门商品推荐 ￥28.00 ￥30.00 ￥20.00 ￥3600.00 ￥8.00 ￥11000.00 ￥6.00 ￥15.00
detail3e店内热门商品￥2930.00￥2930.00面议￥29300.00
detail3e膨松剂相关资源膨松剂热门产品搜索膨松剂相关热门专题更多&热门商机最新商机
提示：您在慧聪网上采购商品属于商业贸易行为。以上所展示的信息由卖家自行提供，内容的真实性、准确性和合法性由发布卖家负责，请意识到互联网交易中的风险是客观存在的。推荐使用，保障您的交易安全！
联系人：郭孝先 & 先生
010 ******
189 ******
请供应商联系我
手机号不能为空
姓名不能为空
请供应商联系我
您对该公司的咨询信息已成功提交请注意接听供应商电话。
detail3e关于酵母
detail3e同类其他品牌
detail3e您是不是在找
您采购的产品：
请输入采购产品
您的手机号码：
请输入手机号码
*采购产品：
请输入采购产品
*采购数量/单位：
请输入采购数量
请选择单位
*采购截止日期：
请输入正确的手机号码
请输入验证码
*短信验证码：
<input id="valid_Code1" maxlength="6" placeholder="请输入验证码" name="VALIDCODE" class="codeInput" onkeyup="this.value=this.value.replace(/\D/g,'')" onkeypress="if(event.keyCode
57) event.returnValue =" type="text">
免费获取验证码
为了安全，请输入验证码，我们将优先处理您的需求！
请输入验证码
发送成功！
慧聪已收到您的需求，我们会尽快通知卖家联系您，同时会派出采购专员1对1为您提供服务，请您耐心等待！
189 ******
联系人：郭孝先&订货QQ：1843…
公司名称：Biovector NTCC质粒载…
备注：点击关注按钮后才可自动收到卖家电话
请输入正确的手机号码
请输入验证码
*短信验证码：
免费获取验证码
为了安全，请输入验证码，我们将优先处理您的需求！
请输入验证码
按字母分类 ：当前位置： >
摘要 : 最近在做龙须菜高温胁迫表达cDNA文库的构建，选择的是CaM做诱饵质粒构建表达载体pGBKT-CaM，利用SMART技术将重组质粒转化到酵母菌Y187中，搜集了部分资料找到了一份比较全的酵母双杂交实验操作步骤。
最近在做龙须菜高温胁迫表达的构建，选择的是CaM做诱饵质粒构建表达载体pGBKT-CaM，利用SMART技术将重组质粒转化到酵母菌Y187中，搜集了部分资料找到了一份比较全的酵母双杂交实验操作步骤。
一.系统的原理
酵母的转录激活因子GAL4由两个可以分开的、功能上相互独立的结构域(domain)组成，N端有一个由147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain,BD)，C端有一个由113个氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain,AD)。BD可以和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)结合，而AD则能激活UAS下游的基因进行转录。但是，单独的BD或AD不能激活基因转录，它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。酵母双杂交系统主要利用酵母的GAL4的这个特性通过两个杂交蛋白在中的相互结合及对报告基因的转录激活来研究活细胞内蛋白质的相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因敏感地检测到。酵母双杂交技术不仅应用于哺乳动物蛋白质之间的相互作用研究，还可以用来研究高等植物蛋白质之间的相互作用。
二.酵母双系统的组成：
1. 载体质粒：pLexA、pB42AD、p8op-LacZ、pB42AD-文库
2. 株：EGY48、EGY48(p8op-LacZ)、YM4271(EGY48的伴侣菌株)
3. 菌株：E.coli KC8株
pLexA-53，pB42AD-T 阳性对照
pLexA-Pos(LexA/GAL4 AD融合蛋白〕 阳性对照
pLexA-Lam(LaminC蛋白少与其它蛋白相互作用) 假阳性检测质粒
pLexA测序引物及pB42AD测序引物。
三.酵母双杂交系统的实验步骤：
1. 将报告基因p8op-LacZ转化酵母EGY48菌株，用培养基SD/-Ura筛选。
2. 同时构建DNA文库，并纯化足够的质粒以转化酵母细胞。
3. 构建DNA-BD/靶蛋白质粒pLexA-X，作为钓饵(bait)。
4. 将上述钓饵质粒pLexA-X转化EGY48(p8op-LacZ)细胞株，用SD/-His/-Ura筛选;并用固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-His/-Ura检测此DNA-BD/靶蛋白是否具有直接激活报告基因的活性，以及对酵母细胞是否具有杀伤毒性。
转化质粒 选择培养基 克隆生长情况 说 明
(含有Gal/Raf)
pLexA-Pos SD/-His，-Ura 蓝 阳性对照
pLexA SD/-His， -Ura 白 阴性对照
PlexA-X SD/-His， -Ura 白 没有直接激活活性
PlexA-X SD/-His， -Ura 蓝 具有直接激活活性
PlexA-X SD/-His， -Ura 菌落不能生长 酵母细胞毒性
能够自动激活报告基因，则设法去除其激活活性部位、或者将LacZ报告基因整合入基因组，
1.4-1. 如果pLexA-X -半乳糖苷酶的信号作用减少。
4-2. 如果pLexA-X虽然不会自动激活报告基因，但对酵母宿主细胞有毒性，则需要与纯化的文库DNA同时转化酵母。
5. 如果pLexA-X不自动激活报告基因，也不具有毒性，则可以在纯化的文库DNA同时、顺序转化酵母细胞，并检测质粒转化效率。
转 化 质 粒 SD固体培养基 LacZ表型
对照1 pLexA-Pos Gal/Raf/-His/-Ura 蓝
对照2 pLexA-53 Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu 蓝
实 验 pLexA-X Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu 待测
+pB42AD-文库
5-1. 用SD/-His/-Trp/-Ura培养基选择阳性共转化子，并扩增，使宿主细胞中的质粒在诱导前达到最大拷贝数。
5-2. 上述重组子转至含X-gal的固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu，观察LacZ及Leu报告基因的表达情形，蓝色克隆即为阳性。白色克隆为假阳性，说明Leu虽有表达，但b-半乳糖苷酶无表达。
5-3. 同时用LacZ、Leu两个报告基因的目的，是为了尽可能消除实验的假阳性误差，譬如：AD融合蛋白不与目标蛋白结合，而直接与启动子序列结合域结合等情况。由于2个报告基因的启动子不同，出现上述假阳性的几率就大大减少了。
5-4. 将蓝色阳性克隆进行1次以上的划种，尽可能分离克隆中的多种文库质粒。
6. 阳性克隆的筛选
6-1. 随机选取50个阳性克隆，扩增、抽提酵母质粒，电转化E.coliKC8宿主菌，抽提大肠杆菌中的质粒，酶切鉴定是否具有插入片段及排除相同的文库质粒。
6-2. 如果重复的插入序列较多，可另取50个阳性克隆来分析。最后得到数种片段大小不同的插入序列，再转化新的宿主细胞，检测是否仍为阳性克隆。
7. 用质粒自然分选法(Natural Segregation)筛除只含有AD-文库杂合子的克隆
7-1. 将初步得到的阳性克隆接种SD/-Trp/-Ura液体培养基，培养1-2天，含有HIS3编码序列的BD-靶质粒在含有外源His培养基中，将以10%-20%左右的频率随机丢失。
7-2. 将上述克隆，转铺固体培养基SD/-Trp/-Ura，30&C孵育2-3天。
7-3. 再挑取生长的单克隆，转入SD/-Trp/-Ura和SD/-His/-Trp/-Ura培养基中，筛选His表型缺陷的克隆，即得到只含有AD-文库杂合子的重组子。
7-4. 将His表型缺陷的克隆转化固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-Trp/-Ura，以验证AD-文库能否直接激活报告基因的表达，弃去阳性克隆，保留阴性克隆。
8. 酵母杂合试验(Yeast Mating)确定真阳性克隆
如下表所示，在酵母EGY48及其对应的YM4271宿主细胞中分别转入相应的质粒或文库DNA，通过杂合实验确筛选pLexA-靶DNA与pB42AD-文库确实具有相互作用的真阳性克隆。
(in YM4271) 质粒2
(in EGY48) LacZ表型 Leu表型
pLexA pB42AD 白 不能生长
pLexA-靶DNA pB42AD 白 不能生长
pLexA pB42AD-文库 白 不能生长
pLexA-靶DNA pB42AD-文库 蓝 真 阳 性
pLexA-Lam pB42AD-文库 白 不能生长
9. 阳性克隆的进一步筛选和确证
9-1. 扩增初步确定的阳性克隆，提取酵母DNA。它既含有酵母基因组DNA，也含有3种转化的质粒DNA。
9-2. 将上述DNA电转化E.coli KC8。由于在大肠杆菌中，具有不同复制起始调控序列的质粒不相容;同时利用营养缺陷型筛选。因此，在M9/SD/-Trp培养基上，只有含有AD-文库质粒的转化菌才能生长，将其扩增、并提取质粒DNA，酶切鉴定。
9-3. 用pLexA-靶DNA与pB42AD-库DNA一一对应、共转化只含有报告基因的酵母菌EGY48中，先到SD/-His/-Trp/-Ura板扩增，并与后面的诱导板形成对照，说明报告基因的表达与诱导AD融合蛋白的表达有关，再确证LacZ、Leu报告基因的表达。
9-4. 扩增与靶DNA相互作用的文库DNA，进行序列分析及进一步的结构、功能研究。
10. 对双杂交系统阳性结果的进一步研究
10-1. 用不同的双杂交系统验证
10-1-1. 将载体 pLexA与pB42AD互换后进行双杂交实验。
10-1-2. 选择不同的双杂交系统，如：以GAL4转录激活子为基础的双杂交系统。
10-1-3. 将文库质粒移码突变后，再与靶质粒作用，报告基因是否仍能被激活。
10-1-4. 去除或突变特定结合位点，定量检测b-半乳糖苷酶水平，比较作用强度变化。
10-2. 用试剂盒提供的引物测定插入片段的DNA序列，证明其编码区域。
10-3. 用其它的检测方法，如：亲和色谱法或免疫共沉淀法来证明双杂交系统筛选的蛋白之间的具有相互作用。
10-4. 进一步研究靶蛋白与筛选蛋白之间的功能关系
四.酵母双杂交系统的应用
可研究已知蛋白间的相互作用、寻找在蛋白&蛋白相互作用中起关键作用的结构域、寻找与靶蛋白相互作用的新蛋白。相信随着分子生物学技术的发展与推广，酵母双杂交技术在今后的蛋白质组学研究中将发挥更大的作用。
心得体会：酵母双杂交技术主要是用于研究蛋白质之间的相互作用，核心关键步骤是酵母细胞的培养，它关系到酵母细胞的浓度和生长状态，一定要严格控制酵母细胞的培养时间。
作者：青岚 点击：次
热门文章TOP