HEK细胞Na_v 1.5电流对中药甘松挥发油浓度及电压依赖性阻滞--《第11届中国南方国际心血管病学术会议专刊》2009年
HEK细胞Na_v 1.5电流对中药甘松挥发油浓度及电压依赖性阻滞
【摘要】：临床证明,目前临床广泛使用的抗心律失常中成药(稳心颗粒等),其中主要有效成分甘松具有良好的抗心律失常作用。其确切的细胞电生理、电药理机制及药物直接作用靶点尚不清楚。本实验应用细胞膜片钳技术,研究HEK细胞Na_v1.5电流对中药甘松有效成分甘松挥发油浓度及膜钳制电压依赖性阻滞及其影响。以往的研究均是在心肌细胞中所得到的资料。由于正常的心肌细胞存在钠、钾、钙等多种离子通道。要真正了解单纯的某种离子通道的作用和影响,就得借助一些药物或化学的方法去阻断其他的离子通道,这些方法虽然部分达到研究者的目的,但却存在有时阻断不完全,以及阻断剂本身对细胞的正常生理代谢带来影响,使之得到的结果准确程度受专家们的争议。近年来国外建立分子生物学技术克隆了一种心肌纯钠通道细胞—HEK细胞Na_v1.5,这种细胞的产生是用大鼠心肌钠通道cDNA密码子序列,在人体肾胚胎细胞上表达而产生的一种新型克隆细胞(human embryonic kidney, HEK)。这种纯钠通道细胞的使用,不但使得膜片钳实验中操作的难度大大降低,更使得实验得出的结果更准确,大大促进了该领域的研究工作。目的本实验应用细胞膜片钳技术研究中药甘松挥发油浓度及膜钳制电压对人肾胚胎(HEK)细胞Na_v1.5电流依赖性阻滞及其影响。方法用中药甘松提取物甘松挥发油作为试验药物。用鼠cDNA编码组成的纯钠通道在人胚胎肾细胞(HEK)表达的Na_v1.5细胞。仪器为美国Axon公司的膜片钳仪(Axopatch 200B mplifier/pClamp9/Digidata pack1322A)。细胞外液用正常台氏液成分,记录内部溶液主要成分为:CsF 145mM; NaF 5.6mM;HEPES 5mM。使用全细胞膜片钳记录程序与方法:数控恒温槽在电压钳制模式下,根据钳制电位的不同,分别测量不同浓度甘松挥发油对Na_v1.5细胞Na~+离子通道电流的影响。结果结果发现甘松挥发油对Na电流的阻滞作用受挥发油不同浓度影响,量-效反应量呈"S"曲线型,电压钳制影响表现为膜电位越低(电位上移)阻滞作用越强。当钳制电压在-80mV,EC50位值时的甘松挥发油浓度为4.2 ppm。不同浓度的甘松挥发油对HEK细胞Na_v1.5电流在不同钳位电压下对钠内流阻滞影响不同。结论中药甘松有效成分挥发油对钠电位有明显阻滞作用,其作用随剂量增加而增加,随膜电位越低而作用加强,该结果提示甘松挥发油对膜电位越低时的Na通道具有非常强的阻滞作用。提示临床可用于因心肌缺血导致膜电位降低而诱发的心律失常。
【作者单位】：
【分类号】：R285【正文快照】：
HEK细胞Na_v 1.5电流对中药甘松挥发油浓度及电压依赖性阻滞@葛郁芝$江西省人民医院江西省心血管病研究所!江西南昌330006$Northwestern Medical University Department of Molecular Pharmacology and Biological!Chicago IL USA 60611
@吴志婷$江西省人民医院江西省心血
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大家伙来分析一下用HEK293稳定细胞株表达蛋白药的优势劣势？
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14年FDA批准了293细胞表达的Fc重组八因子，具体的工艺细节未披露。国内据说也有人在做293细胞稳定表达蛋白药物。293细胞表达的糖型理论上应该和人体蛋白的结构更接近，这是优势，但是，劣势之一，应该是培养工艺和表达量。最近几家国际知名培养基供应商(Gibco, Hyclone, Irvine Scientific etc.)都陆续推出了CD 293 的培养基。大家一起讨论讨论，293细胞稳定表达蛋白药会不会成为一个热点？
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其中列出了部分人细胞表达的品种，主要凝血因子类使用HEK293细胞，可能与特定的表达后修饰有关，说到劣势：注册品种不多、临床经验不多、潜在的人病毒污染。另外当时炒的PER.C6表达系统貌似消失匿迹了摘自：
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jackieustc 编辑于
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对于部分品种可能采用293细胞有一定优势，但热需要克服高产、经济、稳定耐用等瓶颈，远超出CHO才会热起来
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据说用他表达作成药性评价的多些，用它来直接商业化的比较少。
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关于丁香园论文:中药甘松挥发油对HEK细胞Nav1.5电流电压及电导电压的影响-中大网校论文网HEK 293F悬浮细胞：一种新的重组蛋白表达方法
表达和纯化大量复杂的重组蛋白是结构生物学研究的基本要求。在过去的20年里，大肠杆菌的原核表达系统的相关文献比成本昂贵表达效率低下的真核细胞系的文献要多得多。尽管细菌在产量和成本方面有明显优势，但没有特殊辅助因子、分子伴侣和翻译后修饰可能会使蛋白丧失功能，引起蛋白错误折叠，而这些因素都会破坏真核系统多亚基复合物，表面受体和分泌蛋白的蛋白与蛋白之间的相互作用。哺乳动物表达系统因为具有真核表达的环境因此可以克服以上问题。然而这种低产量高成本的表达方法最近在结构生物学的应用已经被限制。这篇文章讲述了一种简单可行的方法用于表达和纯化悬浮293F瞬时转染表达的mg级蛋白。
293F悬浮细胞表达重组蛋白
来源：腾讯视频
分子细胞生物学的快速发展和对改良型药物的持续需求迫使结构生物学要更多的着眼于复杂蛋白的结构。这些蛋白需要特别的翻译后的修饰，分子伴侣和辅助因子来完成这种复杂的折叠并获得酶活性。蛋白数据库里的大量结构数据都是通过细菌表达系统获得的，原核蛋白不具有这些复杂修饰且缺乏真核蛋白基本的辅助因子。没有辅助因子对于大的多种亚基的蛋白复合物的研究带来问题，因为这些蛋白复合物是由小信号分子激活，细胞核、细胞表面的分泌蛋白都需要复杂的折叠机制。大量经过工程改造的大肠杆菌克服了一部分限制性的问题。近年来，哺乳动物细胞表达系统的使用越来越多，因为它能生产其它表达系统做不出来的真核蛋白。目前可以通过很多技术获得稳定表达和瞬时转染的细胞系，如化学转染法，电转法还有直接的注射法。然而这三种转染方法都有各自的优缺点，要么昂贵要么耗时。
文章讲述了一种简单、快速、廉价在悬浮293F细胞中获得高产量蛋白的方法用于结构生物学的研究。瞬时共转293F细胞。293F细胞是从HEK293细胞中分离出的一种适应于悬浮细胞培养的细胞。用价格便宜的分支型PEI配制的试剂瞬时转染细胞通过胞吞作用进行表达。这种方法适用于小规模30ml和大规模300ml的细胞转染，可以获得高产量的纯化蛋白。这对于要求复杂折叠机制、辅助因子，特别是翻译后修饰的蛋白研究是很有帮助的。
文章介绍了Sin3A转录抑制复合物 的三种主要骨架蛋白的表达和纯化。这三种蛋白是组氨酸脱乙酰酶（HDAC1），缺陷沉默抑制子（SDS3）和不依赖于转换的抑制子3（Sin3A).纯化出的蛋白复合物用于高通量的结晶化实验。
注释：操作步骤适合任何大规模的表达，因此试剂的体积需要成比例的增加。此操作步骤需要合适的哺乳系统表达载体。这里我们使用的是经过改造的pcDNA3.1表达载体，可以根据克隆的酶切位点方便的添加和去掉标签。以下是大规模转染的过程描述。
1、大规模培养/1L摇瓶的转染
根据标准操作手册培养悬浮293F, 一般是250ml的细胞培养摇瓶开始培养30ml~100ml的体积。
（1）按照0.5X10E6 cells/ml 的接种量往1L的摇瓶的300ml培养基中接种细胞。注：1L 摇瓶可装培养基的体积为150ml~300ml。
（2）于37℃，120rpm,5%二氧化碳浓度的摇床培养箱中孵育24h,只到细胞密度达到1X10E6 cells/ml（细胞每24h 需能增殖一倍）。
（3）吸取300ug的DNA（已过滤除菌）加到30ml的PBS中，然后涡旋混合3秒，充分混匀。
（4）将1.2ml过滤除菌的PEI溶液（0.5mg/ml）加入到PBS/DNA的混合液中。
（5）PEI-DNA 混合液室温下静置20min。
（6）将DNA/PEI混合液加到细胞里，细胞密度必须达到1X10E6 cells/ml。
（7）转染后，于37℃，120rpm,5%二氧化碳浓度的摇床培养箱中孵育48h。
（8）3，000 X g ,5min离心收获胞内蛋白，放于-80℃保存。
2、从完整细胞中提取的蛋白复合物的纯化
这个优化的步骤适合带有flag标签的核蛋白复合物的纯化
（1）将解冻的细胞用预冷的细胞裂解液裂解（100mM 乙酸钾，50mM Tris pH7.5,5% 甘油，0.3% Triton X-100,蛋白酶抑制剂），每升的细胞加40ml细胞裂解液。
（2）用枪头吹打细胞使用充分裂解，避免起泡和涡旋。
（3）用玻璃匀浆器使细胞彻底重悬。超声3个循环（工作15s,间隔15s），30，000 X g 4℃离心25min，保留上清。
（4）每升的培养物使用1.25ml的flag抗体柱料，用树脂平衡缓冲液洗三次（100mM 乙酸钾，50mM Tris ph7.5) 。
（5）将（3）得到的细胞提取物与亲和柱料进行孵育，放于一个或者多个50ml离心管中于4℃温和转动30-120min。
（6）4℃ 3，000 X g 离心一分钟，弃上清。
（7）用45ml 预冷的缓冲液（100mM 乙酸钾，50mM Tris pH7.5,5% 甘油，0.3% Triton X-100）洗柱料，3，000 X g 离心一分钟，弃上清。
（8）用高盐缓冲（300mM 乙酸钾，50mM Tris pH7.5,5% 甘油）重复（7），再用低盐缓冲（50mM 乙酸钾，50mM Tris pH7.5,5% 甘油）和TEV酶切缓冲（50mM 乙酸钾，50mM Tris pH7.5，0.5mM TCEP）依次重复（7）。
（9）收集10ul的柱料样本加入2X 蛋白上样buffer用于检测。不要使用变性试剂，防止来自柱料的抗体对结果的影响。
（10）用8-10ml预冷的TEV酶切缓冲重悬柱料，然后转移到15ml离心管。
（11）每升的培养物中加入约40ul的TEV酶（1mg/ml），然后用枪头吹打数次充分混匀。
（12）将管子里充满100%的氮气，防止蛋白的氧化。
（13）4℃ 温和转动过夜。
（14）3，000 X g离心10min,将上清转移至超滤管中浓缩至500ul。
（15）取10ul浓缩蛋白的样品，加入2X蛋白上样buffer做电泳检测（ＴＥＶ洗脱样本作为对照组）。
（16）取10ul柱料样品，加入2X蛋白上样buffer做电泳检测。不要使用变性试剂，防止来自柱料的抗体对结果的影响。（TEV阳性柱料做对照）。
（17）用凝胶过滤buffer（50mM 乙酸钾，50mM Tris pH7.5，0.5mM TCEP）平衡分子筛柱子。
（18）用0.22um滤器过滤蛋白。
（19）将样品上到分子筛的柱子里，收集部分样品。
（20）从以上（9）、（15）、（16）、（19）步中取样做考染检测。
注意：建议在凝胶过滤之前做（9）、（15）、（16）的考染检测以确保目的蛋白的表达。
注意：建议在凝胶过滤之前做（9）、（15）、（16）的考染检测以确保目的蛋白的表达。
一个典型的结果
这里展示了瞬时共转染2Ｌ（8X 250ml )的293F，纯化得到的蛋白有HDAC1，SDS3和Sin3A三重蛋白复合物。HDAC1和SDS3通过HDAC相互作用的区域（HID）同Sin3A 相互作用。典型的例子为1L培养基的纯化蛋白产量接近1mg。
图1 为改造的pcDNA3.1的骨架图谱。该质粒用EcoRV和EcoRI消化,仍然含有亲和层析的标签，切割位点在Sin3A 的氨基端。该载体用Kpnl和EcoRI酶切，分别连接HDAC1和SDS3,构建了无标签的克隆。
图2 考染图显示了蛋白初步纯化的结果。“结合蛋白”的泳道显示蛋白复合物结合到柱料上的蛋白，第二泳道为经TEV消化处理标签被切割后的蛋白情况，泳道三为复合物从亲和柱料上洗脱下来的蛋白。
图3 液相色谱的分子筛的蛋白纯化色谱图。值得注意的是蛋白在水溶液中会产生二聚体，所以会在最早的洗脱组分中出现。
图4 为图3中经凝胶过滤的蛋白片段的考染图
图5 为台酚蓝染色的293F细胞，密度为2.3X106 cells/ml ，准备转染。细胞转染前最好为单个细胞或者2个聚一起的，约在15秒的时间里大的聚团可在涡旋转动时散开。
表1 问题排查
表2. 主要表达系统的优缺点
我们发展了一种直观高效的方法（PEI法）表达和纯化了大量重组蛋白和多亚基复合物的哺乳动物细胞蛋白。高纯度的质粒可以优化转染和表达效率。细胞在无血清和无抗生素的培养基中培养，传代和转染时注意无菌操作，避免出现费钱费时的污染。转染前细胞活率要达到90%甚至以上，细胞密度不得高于2.5X106 否则会降低蛋白产量。细胞的分散性好，呈单个细胞或者是两个细胞的聚团，才能使得转染尽可能成功。成团的细胞可能会在剧烈的涡旋下20-30秒散开。根据已经研究的复合物的化学计算，用于共转染中的质粒的比例是可以变化的。最适合的表达时间也是可以确定的。纯化的样品需在低温下操作，减少蛋白的降解。标签和纯化缓冲的选择很重要，因为这些会影响某一蛋白的结构基础和活性位点，会导致蛋白可溶性降低和失去酶活性。小规模的转染对于检测大分子量的纯化蛋白复合物不同结构的检测很有帮助。
如今，有很多方法可用于重组真核蛋白的表达。如，昆虫杆状病毒表达系统的广泛应用是由于它转导的高效性以及跟其他病毒系统相比没有细胞毒性。然而产毒的过程耗时且它的不稳定性使得病毒无法保存很长时间。另一方面，酵母表达系统可以在高密度条件下培养获得高蛋白产量。然而这个表达系统缺乏翻译后修饰这是真核表达系统正确折叠和与蛋白伴侣相互作用所必须的。就拿HDAC3来说，可以在大肠杆菌中表达但无法折叠。而在293F中表达就可纯化得到含它的共抑制因子（SMRT）和肌糖四磷酸盐分子的活性酶，这在原核细胞中是不存在的。这种方法使我们纯化得到HDAC1的晶状结构。理想条件下，我们想要在天然的物理条件下得到真核蛋白。哺乳动物细胞表达系统运用293E细胞于生物反应罐中说是可以获得高水平的蛋白产量，但这个运用起来很复杂。
我们的方法简单可行，且作为替代细菌、酵母还有生物反应器的表达方法。此种表达方法快速，且不需要昂贵的仪器特别是摇瓶放置于5% 的二氧化碳摇床培养箱。我们使用这种操作规程共转了多种质粒，纯化复合物的产量大于1mg/L的超过5种.有意思的是，这个表达系统可以帮助鉴定稳定且功能良好的复合物。例如表达二元复合物HDAC1和Sin3A产量有限，但增加了SDS3就产生了5倍的蛋白产量因此指导了结构生物学家选择合适结构和用于结晶的稳定复合物。
参考文献：
Portolano, N., Watson, P. J., Fairall, L., Millard, C. J., Milano, C. P., Song, Y., et al. Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach. J. Vis. Exp. (92), e51897, doi:10. .
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